Neurale stamcellereaktivering i dyrkede Drosophila hjerne explants

Summary

En metode til at genaktivere stillestående neurale stamceller i dyrkede Drosophila hjerne explants er blevet etableret. Ved hjælp af denne metode kan systemiske signalers rolle afkobles fra vævs-iboende signaler i reguleringen af neurale stamceller quiescence, ind- og udgang.

Abstract

Neurale stamceller (NSC'er) har evnen til at sprede sig, differentiere, gennemgå apoptose og endda komme ind og ud af stilhed. Mange af disse processer styres af det komplekse samspil mellem NSC's indre genetiske programmer med NSC's ydre faktorer, lokale og systemiske. I den genetiske modelorganisme skifter Drosophila melanogaster, NSC'er, kendt som neuroblaster (NB'er), fra quiescens til spredning under den embryonale til larveovergang. I løbet af denne tid kommer larver ud af deres æggeskaller og begynder at kravle og søge kostnæringsstoffer. Som reaktion på dyrefoder producerer fedtlegemet, et endokrint organ med lipidlagringskapacitet, et signal, som frigives systemisk i den cirkulerende hæmolymfe. Som reaktion på det fede kropsafledte signal (FBDS) produceres og frigives Drosophila insulinlignende peptider (Dilps) fra hjernens neurosekretoriske neuroner og glia, hvilket fører til nedstrøms aktivering af PI3-kinase vækstsignalering i NB'er og deres glial- og trakeal niche. Selv om dette er den nuværende model for, hvordan NB'er skifter fra quiescens til spredning, forbliver arten af FBDS-ekstrinsisk cue undvigende. For bedre at forstå, hvordan NB ydre systemiske signaler regulerer udgang fra quiescence, blev der udviklet en metode til dyrkning af tidlige larvehjerner in vitro før dyrefoder. Med denne metode kan eksogene faktorer leveres til kulturmedierne og NB-udgang fra quiescence assayed. Vi fandt ud af, at eksogent insulin er tilstrækkeligt til at genaktivere NB'er fra stilhed i helhjerneeksplanter. Da denne metode er velegnet til store skærme, sigter vi mod at identificere yderligere ydre signaler, der regulerer NB-quiescens versus spredningsbeslutninger. Fordi de gener og veje, der regulerer NSC-spredningsbeslutninger, er evolutionært bevaret, kan resultaterne fra dette assay give indsigt i forbedring af regenerative terapier i klinikken.

Introduction

Stamceller er af stor interesse på grund af deres potentiale til brug i regenerativ medicin ^1,2. Mange dyr, især dem, der er langlivede, opretholder stamceller i deres voksne væv. Disse hjemmehørende stamceller fungerer til at opretholde vævshomeostase og bruges til reparation efter fysisk skade eller sygdom ^3,4. De fleste stamceller hos voksne dyr er stillestående, en relativt sovende tilstand karakteriseret ved cellecyklusstop og inaktivering af vækstsignalering⁵. Som reaktion på ydre signaler forlader stamceller fra stilhed, går ind i cellecyklussen og begynder at generere datterafkom, der er specifikke for deres vævstype. For eksempel, for at montere et effektivt immunrespons, inducerer antigenpræsenterende celler quiescent naive T-celler til at komme ind i cellecyklus og klonalt udvide⁶. Som reaktion på skeletmuskelskader kommer muskelsatellitstamceller ind i cellecyklussen og genererer datter myoblaster til erstatning for beskadigede myofibriller ^5,7. Selvom det er klart, at stillestående stamceller reagerer på ydre signaler, forbliver arten af det ydre signal i mange tilfælde uklart såvel som mekanismen for cue-induceret stamcelleaktivering. At få en bedre forståelse af, hvordan stillestående stamceller reagerer på ydre signaler og kommer ind i cellecyklussen, vil hjælpe med udviklingen af bedre stamcelleterapier i klinikken og øge den videnskabelige viden.

I årtier er modelorganismer blevet brugt til at afdække de gener og cellesignalveje, der regulerer stamcelleproliferation under udvikling og i voksenalderen. I Drosophila deler neurale stamceller (NSC'er), kendt som neuroblaster (NB'er), sig gennem hele udviklingen for at generere alle neuroner og glia, der i sidste ende integreres og danner det neurale kredsløb, der kræves til hjernefunktion ^8,9. Ligesom andre stamceller deler NB'er sig asymmetrisk for at forny sig selv og i nogle tilfælde symmetrisk for at udvide stamcellepuljen. NB'er specificeres under embryogenese, og de fleste går ind i stilhed mod slutningen, sammenfaldende med faldende maternelle næringsstoflagre (figur 1). Efter embryogenese er afsluttet, lukker larverne og begynder at fodre. Som reaktion på dyrefodring genaktiverer NB'er fra stilhed og genoptager celledelinger 10,11,12,13,14,15,16. Fordi Drosophila CNS er relativt enkel, og fordi NB'er går ind og ud af quiescence på definerede tidspunkter, viser det sig ideelt at bruge Drosophila til at undersøge reguleringen af quiescence, ind- og udrejse.

Figur 1: Relativ spredning af CB NB'er (centrale hjerneneuroblaster, rød) og MB NB'er (svampekropsneuroblaster, blå) over udviklingstid. Ved afslutningen af embryogenese ophører de fleste NB'er (rød linje) med spredning og går ind i quiescence. Quiescence fortsætter, indtil friskklækkede larver spiser deres første komplette måltid. Tidspunkterne for denne metode betegnes i røde cirkler (1, quiescence og 2, reaktivering). MB NB'er (blå) er en delmængde af centrale hjerne-NB'er, der opdeles kontinuerligt gennem hele udviklingen (4 pr. Hjernehalvdel). Klik her for at se en større version af denne figur.

Som reaktion på dyrefoder bliver PI3-kinase og TOR vækstsignalveje aktive i NB'er og i deres glial- og trakealniche 10,11,15,16. Når næringsstoffer i kosten trækkes tilbage, eller når niveauet af PI3-kinase reduceres, undlader NB'er at genaktivere, og væksten af glia og luftrør reduceres også 10,11,15,16. Den nuværende model postulerer, at NB-reaktivering er koblet til larvevækst af fedtlegemet, som frigiver et systemisk signal som reaktion på dyrefoder 12,17,18. Dette signal, som forbliver undvigende, fremmer sandsynligvis ekspressionen og frigivelsen af Drosophila insulinlignende peptid (Dilps) i hjernen, hvilket fører til nedstrøms aktivering af PI3-kinase i NB'er og deres glial- og trakeal niche. For bedre at forstå arten af de systemiske signaler udviklede vi en metode til at genaktivere quiescent NB'er i dyrkede hjerneforplantninger. Med denne metode kan reaktivering af NB'er analyseres i fravær af hele dyrs systemiske signaler. Eksogene faktorer kan genforsynes på kulturmedierne og NB-reaktiveringsassayed baseret på inkorporeringen af thymidinanalogen, EdU. Ved hjælp af denne metode fastslog vi, at eksogent insulin er tilstrækkeligt til at genaktivere quiescent NB'er i hjerneeksplanter. Fremtidigt arbejde vil være rettet mod at identificere yderligere faktorer, der, når de tilføjes tilbage, enten positivt eller negativt regulerer NB-quiescens i hjerneforplantninger.

Protocol

1. Drosophila larver samling

BEMÆRK: Forbered gærpladen, druepastaen og Fly-lejligheden, inden du starter:

1. Gærpasta: Bland 5 g aktiv tør gær i en lille beholder med 10 ml vand for at danne en pasta, der har konsistensen af jordnøddesmør. Dæk gærpastaen med plastfolie og brug et gummibånd til at fastgøre det fast til beholderen.
   BEMÆRK: Frisk gærpasta udvides i beholderen og springer af låget, medmindre den er fastgjort. Gærpasta vil vare i flere dage ved stuetemperatur (RT).
2. Drueplader: Følg opskriften på fremstilling af drueplader (tabel 1). Hvis du bruger plader, der opbevares ved 4 ° C, skal du sørge for at forvarme pladerne inden brug ved at placere dem ved RT i 1 time.
   1. Vand (750 ml) og agar (18,75 g) blandes i en 4 L kolbe, hvirvler og autoklave i 20 minutter (flydende cyklus).
   2. Druesaften (250 ml) og saccharose (25 g) blandes i en 1 L kolbe med en stor omrøringsstang på en opvarmet tallerken (lav varme). Når saccharose er opløst, skal du slukke for varmen, vente, indtil kolben kan røres, før der tilsættes Tegosept (10%, 4 ml) og propionsyre (5 ml). Hold omrøringsstangen tændt.
   3. Når autoklaven er afsluttet, lad den køle af, indtil kolben kan røres (~60 °C), og bland derefter druesaftblandingen i.
   4. Kombiner alle opløsninger i en kolbe og lad det røre på pladen.
   5. Pipette opløsningen i låg af små petriskåle (35 mm). Pipette ca. 9 ml pr. låg eller indtil der opnås en konveks kuppel.
   6. VALGFRIT: Flamme lågene for at slippe af med bobler.
   7. Når pladerne størkner, stables druepladerne i en kasse med et lufttæt låg og placeres æsken ved 4 °C. Plader kan opbevares i op til 1 måned.
3. Fly condo: Stans ~ 20 huller i en 6 ounce firkantet bund polypropylen Drosophila flaske ved hjælp af en 18 G nål.
4. Overfør voksne fluer (~ 100 OregonR eller en hvilken som helst genotype) til en fluelejlighed og cap lejligheden med en drue agar plade toppet med en dab gærpasta. Placer dab'en mod midten af pladen, og anbring pladen på lejligheden med laboratorietape.
5. Omvendt beholderen, så drue agarpladen er på bunden, og læg den i en 25 °C inkubator i 24 timer (figur 2).

Figur 2: Visuel repræsentation af omvendt flueflaske (lejlighed) med mandlige og kvindelige Drosophila voksne. Plastflasken har små punkteringer, genereret med en 18 G nål, til iltudveksling. Flaskens mund er forseglet med en agar druesafthætte og vendes om og opbevares i en 25 °C inkubator. Klik her for at se en større version af denne figur.

6. Efter 24 timer skal du skifte drue agar plade og erstatte den med en ny plade toppet med gærpasta. Skift hurtigt de to plader, mens du kontinuerligt banker let på lejligheden på bænken, så de voksne fluer ikke slipper ud.
7. Undersøg pladen med øjet og vurder antallet af embryoner på pladen. Drosophila embryoner er aflange og hvide med to strenglignende vedhæng.
8. Hvis der er meget få embryoner på pladen (mindre end 100), skal du kassere pladen (skrab agaren ud i flueskraldespanden og gem plastlåget til genbrug). I mange tilfælde vil voksne kvinder ikke lægge mange embryoner den første nat i en ny lejlighed. Hvis dette er tilfældet, skal du give de voksne fluer yderligere 24 timer til at akklimatisere.
9. Hvis der er et stort antal embryoner på pladen (mindst 100), skal du holde det og forsigtigt fjerne gærpastaen ved hjælp af en flad bundspatel.
10. Når gærpastaen er fjernet, skal du bruge et metalvalg til manuelt at fjerne alle larver fra druepladen under et dissekerende mikroskop. Når man ser på pladen under et dissekerende mikroskop, skal krybende larver observeres såvel som embryoner.
11. Fjern alle larver ved at børste metalpluklet mod siden af en larve. Larver er klæbrige og vil holde sig til plukningen. Når en larve er på plukket, kan yderligere larver let afhentes ved at bruge larven på værktøjet til at fastgøre mere.
    BEMÆRK: Larver kan lide at holde sig til hinanden. På dette tidspunkt er det ligegyldigt, om larver bliver beskadiget. Disse larver vil blive kasseret.
12. Når du har plukket og fjernet alle larver, skal pladen placeres tilbage i 25 °C-inkubatoren. Sørg for at placere pladen i en større beholder, der kan forsegles. Læg våde køkkenrulle i bunden af den større beholder for at holde på fugt.
13. Efter 30-60 min skal du tage pladen tilbage til dissekeringsmikroskopet og nu omhyggeligt plukke ~20-25 larver fra den samme drue agar plade for at sikre, at de plukkede larver er friskklækket inden for et 30-60 minutters tidsvindue.
14. Dyk spidsen af værktøjet ned med de 20-25 friskklækkede larver i en petriskål (60 mm) fyldt med 1-2 ml 1x fosfatbufret saltvand (PBS) i 2 min.
15. Efter 2 minutter tippes fadet i en vinkel for at samle væsken i bunden. Brug en lille pensel til at børste larverne ud af væsken op i bunden af petriskålen.
16. Saml alle larver på penslen og overfør larverne til en ny petriskål (60 mm) indeholdende 1-2 ml 70% ethanol. Gentag trin 1.15 for at samle larver med en pensel og overfør dem til en ny petriskål med 1-2 ml 1x PBS.

2. Kulturmedier og værktøjsforberedelse

1. Sprøjt bænken og arbejdsområdet med 70% ethanol og lad det tørre.
2. Sprøjt dissektionsværktøjerne, tangen og to glasurfade med 70% ethanol og lad dem tørre på bænken.
3. Lav det supplerede Schneiders medie (SSM, tabel 2) og læg det på is.
4. Pipette 1 ml SSM ind i hver af glasurfadene.
5. Brug en mikropipette med en steril spids til at overføre de friskklækkede larver fra PBS-pladen til SSM i den første glasurskål. Brug en mikropipette med en steril spids til at overføre de friskklækkede larver til SSM i den anden glasurskål.

3. Dissektioner og hjernekulturer

1. Når larverne er i den anden glasurskål med SSM, dissekeres hjernen ud af larverne ved hjælp af tang og et dissekeringsmikroskop. Juster forstørrelsen efter behov.
2. Brug en tang til at gribe fat i mundkrogene, og med den anden skal du forsigtigt gribe kroppen halvvejs ned og trække i den modsatte retning (figur 3) for at opdele larven i to stykker.
   BEMÆRK: Hjernen vil være placeret lige bag mundkrogene. Bemærk, at der kan være andre væv omkring hjernen. Vær meget forsigtig, når du fjerner disse væv, da det kan resultere i at skade hjernen

Figur 3: Drosophila larver i et glasurfad med SSM. Tang er korrekt placeret til dissektion. Larvehjernens placering (mørkegrå) er bagud til mundkrogene (sort), og begge er vist inde i larven. Klik her for at se en større version af denne figur.

3. Når 15-20 hjerner er blevet dissekeret, tilsættes 1 ml SSM i en brønd i en steril 12-brønds kulturbakke. Overfør de frisk dissekerede hjerner til SSM ved hjælp af en mikropipette og en steril spids (figur 4A).
4. Anbring hjernerne i SSM-medierne i kulturbakken med 12 brønde i en inkubator ved 25 °C i 24 timer (figur 4A).

Figur 4: Hjernekultur og immunfarvning. (A) Hele hjerner i en 12-brønds kulturskål indeholdende 1 ml SSM. Kulturskålen placeres derefter i en 25 ° C inkubator i 24 timer. (B) 72-brønds minibakke, der holder hjerneudslæder under immunstaining. Hjerner vaskes og opløsninger overføres ved hjælp af en P20 mikropipette indstillet til 10 μL. Klik her for at se en større version af denne figur.

4. Proliferationsassay, hjernefiksering og antistoffarvning

1. Den følgende dag fremstilles 1 ml EdU SSM-opløsning. Pipette 10 μL af en 10 mM stamme af 5-Ethynyl-2′-deoxyuridin (EdU) med 990 μL SSM (endelig EdU-koncentration er lig med 0,1 mM) i et sterilt mikrocentrifugerør og blandes. Når inkubationen på 24 timer er afsluttet, pipetteres 1 ml EdU SSM i en brønd i den sterile 12-brønds kulturbakke.
2. Overfør hjernerne ved hjælp af en mikropipette med en steril spids fra brønden, der kun indeholder SSM, til den nye brønd, der indeholder EdU SSM-opløsningen. Inkuber i 1 time ved 25 °C.
3. Overfør derefter de EdU-mærkede hjerner til en anden brønd i samme kulturbakke indeholdende 1 ml fikseringsmiddel (4% paraformaldehyd, se tabel 3 for opskrift) i 20 minutter.
   FORSIGTIG: Paraformaldehyd er en biologisk fare og skal bortskaffes korrekt.
4. Efter fiksering skal du hurtigt overføre hjernerne til brøndene i en 72-brønds minibakke ved hjælp af en mikropipette. Hver brønd kan rumme 10 hjerner og 10-15 μL væske (figur 4B). Når hjernerne er overført til minibakken (højst 10 hjerner pr. Brønd), skal du fjerne fixet og skylle hjernen 3 gange i 10 μL 1x PBT (fosfatbuffer, pH 7,4 indeholdende 0,1% Triton-X 100).
   BEMÆRK: Skylning betyder pipettering af 10 μL 1x PBT på hjernen, fjernelse og gentagelse 3 gange.
5. Vask derefter hjernen 3 gange i 10 minutter hver, igen i 10 μL 1x PBT. Sørg for, at hjernen altid er dækket af noget væske.
6. Når vaskene er afsluttet, pipette 10 μL blokerende opløsning (1x PBT med 10% normalt gedeserum) på hjernen. Dæk bakken og forsegl den ved hjælp af en strimmel parafilm rundt om kanten.
7. Når minibakken er forseglet, skal du placere den i en forseglet kasse med våde håndklæder for at give et fugtigt miljø for at forhindre fordampning. Anbring æsken med bakken ved 4 °C natten over.
8. Den følgende dag laves en primær antistofopløsning.
   BEMÆRK: I denne protokol blev kanin-anti-skrible brugt til at mærke cellemembraner og rotte anti-deadpan for at mærke neuroblaster, selvom et hvilket som helst antal andre primære antistoffer kunne anvendes.
   1. For at fremstille den primære antistofopløsning skal du først foretage fortyndinger af primære antistoffer i blokeringsopløsningen. For eksempel anvendes kanin anti-scribble i en endelig koncentration på 1:1000. Fortynd derfor først kaninanti-skrible-antistoffet ved 1:100 (1 μL antistof plus 99 μL blokerende opløsning). Rat-deadpan anvendes i en endelig koncentration på 1:100. Fortynd derfor først rotte-deadpan-antistoffet ved 1:10 (1 μL antistof plus 9 μL blokerende opløsning).
      BEMÆRK: Disse fortyndinger kan opbevares på lang sigt ved 4 °C, hvis natriumazid (0,05 %) også tilsættes for at hæmme bakterievæksten.
   2. Tæl derefter antallet af brønde, der indeholder hjerner. Antallet af brønde bestemmer mængden af primær antistofopløsning, der skal fremstilles. For eksempel, hvis der er 2 hjernebrønde, skal du forberede 20 μL primær antistofopløsning (til 10 brønde, 100 μL osv.). For at fremstille en 20 μL primær antistofopløsning tilsættes 2 μL af hver primær antistoffortynding og 16 μL af den blokerende opløsning.
      BEMÆRK: Den endelige koncentration af hvert af de primære antistoffer er henholdsvis 1:1000 og 1:100. Kort sagt, lav den første fortynding af primære antistoffer i en koncentration, så den anden fortynding altid er 1:10 for at nå frem til de respektive endelige koncentrationer. I dette tilfælde 1:1000 for kanin anti-scribble og 1:100 for rotte anti-deadpan.
9. Blokeringsopløsningen med mikropipetten indstillet til 10 μL og pipette 10 μL primær antistofopløsning i hver brønd.
10. Dæk og forsegl bakken ved hjælp af parafilm og læg den tilbage i den forseglede kasse med våde håndklæder. Inkuber natten over ved 4 °C.
    BEMÆRK: Rystelser er ikke påkrævet og frarådes kraftigt. Antistoffer vil trænge ind i hjernen uden at ryste eller blande.
11. Den følgende dag fjernes den primære antistofopløsning ved hjælp af en mikropipette og skylles hjernen 3 gange med 10 μL 1x PBT. Vask derefter hjernen 4 gange med 10 μL 1x PBT i 10 minutter hver. I løbet af de 10 minutters vask skal du forberede den sekundære antistofopløsning.
12. For at fremstille den sekundære antistofopløsning skal du vælge sekundære antistoffer, der genkender de primære antistoffer. I denne protokol blev ged anti-kanin Alexa Fluor 488 og ged anti-rotte Alexa 555 brugt.
    1. Pipette 1 μL af hvert af de sekundære antistoffer i et mikrocentrifugerør med 298 μL af den blokerende opløsning for at gøre den endelige koncentration 1:300 for hvert sekundært antistof.
13. Efter den sidste 10 minutters vask fjernes 1x PBT og pipette 10 μL af den sekundære antistofopløsning i hver brønd. Forsegl bakken ved hjælp af parafilm og læg den tilbage i kassen med fugtige håndklæder. Inkuber natten over ved 4 °C.
    BEMÆRK: Du skal ikke bekymre dig om at fjerne hver eneste μL i brøndene mellem skylninger, vask eller ved tilsætning af primære og sekundære antistofopløsninger. Hjernerne vil altid forblive nedsænket i et par μL væske, hvilket er helt fint.
14. Den følgende dag fjernes den sekundære antistofopløsning ved hjælp af en mikropipette og skylles hjernen 3 gange med 10 μL hver på 1x PBT. Vask derefter hjernen 4 gange med 10 μL hver på 1x PBT i 10 minutter hver.
15. I løbet af de 10 minutters vask skal du forberede EdU-reaktionsblandingen til at detektere EdU-inkorporering. Forbered EdU-reaktionsblandingen i henhold til producentens retningslinjer.
16. Efter den sidste vask skal du fjerne 1x PBT og pipette 10 μL af EdU-reaktionsblandingen i hver brønd med hjerner. Forsegl mikrobrøndpladen med parafilm og dæk med aluminiumsfolie. Lad tallerkenen stå på bænken i 30 min.
17. Efter 30 min skylles hjernerne 3 gange med 10 μL hver af 1x PBT og vaskes hjernen 3 gange med 10 μL hver på 1x PBT i 5 min hver.
18. Efter den sidste vask fjernes 1x PBT og pipette 10 μL af en glycerolbaseret monteringsmedieopløsning. Forsegl pladen og læg den ved 4 °C natten over.

5. Montering og billeddannelse af hjernerne

1. Den følgende dag skal du forberede mikroskopdias (25 mm x 75 mm x 1 mm): Lim (f.eks. Superlim) et 22 mm x 22 mm x 1 mm firkantet dækglas til hver ende af mikroskopets dias for at skabe en 'bro', over hvilken den større 22 mm x 50 mm x 1 mm dækseddel placeres for at skabe et mellemrum mellem diaset og det større dækslip (figur 5A). Dette rum vil gøre det muligt for hjernen lige nok bevægelse at være korrekt orienteret, samtidig med at den forhindres i at blive knust.

Figur 5: Skematisk visning af mikroskop dias, orientering og celletyper i larvehjernen. (A) Visuel repræsentation af mikroskop dias, hvorpå en larvehjerne er monteret og er klar til at blive afbildet. (B) Det er også påvist, at en retningslinje anvendes til vævsorientering. (C) Mikroskop dias klar til billeddannelse på et konfokalt mikroskop. (D) Tegneserie, der viser nogle af celletyperne i larvehjernen. Klik her for at se en større version af denne figur.

2. Efter limning af 22 mm x 22 mm x 1 mm dækglassene på mikroskopet glider pipetten 9,3 μL af den glycerolbaserede monteringsmedieopløsning indeholdende en hjerne fra en brønd i mikrobrøndpladen og placerer den på midten af diaset (figur 5A).
   BEMÆRK: Larvehjerner kan klæbe til pipettespidsen, så vær forsigtig. For at undgå vedhæftning skal du begynde med at aspirere antifaden og derefter aspirere den enkelte hjerne mod slutningen af 9,3 μL volumenet.
3. Når hjernen er på rutsjebanen, skal du forsigtigt placere 22 mm x 50 mm x 1 mm dækslen ovenpå. Placer hjernen som vist i figur 5B. Flyt forsigtigt dækslippen rundt for at orientere hjernen. Prøven er derefter klar til billeddannelse.
4. Brug et konfokalmikroskop udstyret med høj forstørrelse og et højt numerisk blændemål (figur 5C) til at få de bedste billeder. For eksempel: 60x eller 63x, 1,4 NA olie-nedsænkningsobjektiv.
   1. Forestil dig hjernerne med den dorsale overflade tættest på dækskortet (og objektivt). Anskaf Z-stakkene gennem hele hjernehalvkuglen startende ved den ventrale overflade (længst væk fra målet) med 1 μm intervaller eller Z-trinstørrelse.
      BEMÆRK: Anvendte lasere afhænger af de sekundære antistoffer. I denne protokol var de anvendte laserlinjer 488 nm til at detektere Scribble-farvning, 555 nm til at detektere Deadpan og 633 nm til at detektere EdU.

6. Analyse af data

1. Brug Fiji open source-software til at analysere hjernehalvkugler og bruge Fiji-celletæller-pluginet til at tælle cellerne.

Representative Results

Nyklækkede OregonR-hjerner af vildtypen blev dissekeret og dyrket i 24 timer i suppleret Schneiders medier (SSM) med insulin. Væv blev fastgjort og farvet i henhold til protokollen. Primære antistoffer genereret mod Deadpan (Dpn) til påvisning af NB'er og Scribble til mærkning af cellemembraner blev anvendt. Den thymidinanaloge 5-ethynyl-2′-deoxyuridin (Edu) blev tilsat for at detektere S-faseindgang og NB-reaktivering. Vi fandt store Edu-positive og Dpn-positive NB'er efter 24 timer i kultur (figur 6A-C). Dernæst blev nyklækkede OregonR-vildtypehjerner dyrket i 24 timer i supplerede Schneiders-medier uden insulin. Efter 24 timer i dyrkning fandt vi ingen store Edu-positive og Dpn-positive NB'er bortset fra de fire svampekroppene NB'er og en ventrolateral NB (figur 6D-F). Svampekroppen og de ventrolaterale neuroblaster er en delmængde af de centrale hjerneneuroblaster, der deler sig kontinuerligt under overgangen fra embryonale til larver. Vi konkluderer, at eksogent insulin er tilstrækkeligt til at genaktivere neuroblaster fra quiescens i hjerneeksplanter dyrket i Schneiders medier.

Under konfokal billeddannelse blev nogle hjernehalvdele med skade lejlighedsvis observeret. Den skade, vi fandt, bestod af små til store huller i det udplantede hjernevæv (figur 6G,H). Disse væv blev udelukket fra analysen. Ud over 24 timers tidspunktet blev hjerner også med succes dyrket i 48 timer (data ikke vist). Efter 48 timer i dyrkning fandt vi en yderligere stigning i antallet af Dpn-positive EdU-positive CB NB'er og en stigning i antallet af hjerner med vævsskade. Dette tyder på, at dyrkning af hjerner på lang sigt sandsynligvis er mulig; Der skal dog udvises stor omhu for at undgå vævsskade.

Figur 6: Konfokal billeddannelse. (A-C) Eksogent insulin er tilstrækkeligt til at genaktivere quiescent NB'er. (A) En maksimal intensitetsprojektion af en hjernehalvdel, der viser Deadpan (Dpn) og Edu-positive NB'er efter 24 timers dyrkning i nærvær af insulin. (B) Et enkelt Z-skivebillede af den samme hjernehalvdel med Scribble (Scrib) immunstaining, der markerer cellemembraner. (C) Høj forstørrelse af NB i indsætningen i panel B. Enkeltkanals gråtonebilleder med farvefletning nederst til højre. (D-F) NB'er forbliver stillestående i fravær af eksogent insulin. (D) En maksimal intensitetsprojektion af en hjernehalvdel, der viser Dpn- og Edu-positive NB'er efter 24 timers dyrkning i fravær af insulin. (E) En enkelt Z-stak af den samme hjernehalvdel med Scrib-immunstaining. (F) Høj forstørrelse af NB i indsætningen i panel E. Enkeltkanals gråtonebilleder med farvefletning nederst til højre. Pilespids betegner en af de 4 MB NB'er, som deler sig kontinuerligt og ikke går ind og ud af stilhed (se figur 1). (G,H) Eksempler på beskadigede hjerneeksplanter, der ikke anvendes i analysen. (G) En enkelt Z-skive af en hjernehalvdel med store huller i vævet. (H) En enkelt Z-skive af en hjernehalvdel viser små huller i vævet. Vægtstang: 10 μm. Den hvide stiplede linje angiver midterlinjen. Anterior er op, og posterior er nede. Klik her for at se en større version af denne figur.

Ingrediens/ mængde	1 L (~ 125 drueplader)
Druesaft	250 ml
Saccharose	25 g
Vand	750 ml
Bacto Agar	18,75 g
Tegosept (10%)	4 ml
Propionsyre	5 ml

Tabel 1: Opskrift på fremstilling af drueplader. Følg de trin, der er beskrevet i afsnit 1.2.

Ingrediens (startkoncentration)	At lave 5 ml	Endelig koncentration
Schneiders Drosophila medier	3,89 ml
Føtalt kvægserum (100%)	500 μL	10%
Glutamin (200 mM)	500 μL	20 mM
Penicillin (5000 enheder/ml), Streptomycin (50.000 μg/ml)	100 μL	1000 U/ml Pen, 1 mg/ml Strep
Insulin (10 mg/ml)	10 μL	0,02 mg/ml
glutathion (50 mg/ml)	5 μL	0,05 mg/ml
I en steril hætte tilsættes alle ingredienser sammen i et 14 ml konisk rør ved hjælp af steril teknik. Læg det på is indtil brug.

Tabel 2: Opskrift på at lave suppleret Schneiders medier (SSM). Tabellen viser mængden af alle ingredienser, der kræves til fremstilling af 5 ml SSM.

Opskrift på at lave fikseringsmiddel
Ingrediens (startkoncentration)	At lave 40 ml	Endelig koncentration
EM-klasse formaldehyd 16%	10 ml	4%
PEM-buffer pH 7,0	29,96 ml
Triton X-100	40 ml	0.10%
Bland alle ingredienser sammen. Aliquot 1 ml i mikrocentrifugerør og opbevares ved -20 °C. Genfrys ikke aliquoterne efter optøning.
Opskrift på PEM-buffer
Ingrediens (startkoncentration)	At lave 100 ml	Endelig koncentration
RØR pH 6,8 (500 mM)	20 ml	100 mM
EGTA (500 mM)	2 ml	10 mM
MgSO4 (1 m)	100 ml	1 mM
Vand	77,9 ml

Tabel 3: Opskrift på fremstilling af fikseringsmiddel og PEM-buffer. Tabellen viser kemikalierne og deres respektive koncentrationer til fremstilling af fikseringsmiddel og PEM-buffer.

Discussion

Den her beskrevne metode til dyrkning af hjerneudsendelser kan udføres i de fleste laboratoriemiljøer. De nødvendige værktøjer samt proceduren og dataindsamlingen er enkle og ligetil. Med denne metode kan man teste en række hypoteser, herunder dem, der er relateret til cellesignalkaskader og ydre faktorer, der regulerer NB-reaktivering og proliferation. Her fandt vi ved hjælp af vildtype OregonR-dyr, at eksogent insulin var tilstrækkeligt til at genaktivere NB'er fra quiescens uafhængigt af andre dyrespecifikke systemiske signaler. Ved hjælp af GAL4 / UAS-systemet kunne man også slå ned eller overudtrykke insulinvejskomponenter på en celletypespecifik måde for bedre at forstå PI3-kinase-signaleringens rolle i NB-reaktivering. Ud over at bruge genetik kan komponenterne i medierne også manipuleres til yderligere at teste ydre signaler eller signaler, der fremmer NB-reaktivering og spredning. For eksempel kunne man teste hypotesen om, at tilsætningen af steroidhormonet ecdyson ville øge procentdelen af NB-reaktivering og spredning i kultur.

Selvom denne metode er ligetil, oplevede vi tidligt flere tekniske vanskeligheder. Den første tekniske vanskelighed var skader på dissekerede, ufikserede hjerner under medieændringer. Vi fandt ud af, at overførsel af hjerner til en ny brønd i kulturskålen i stedet for at ændre medierne i brønden resulterede i mindre vævsskade, fordi huller i hjernen opstod, da medier blev fjernet fra brønden, og eksplantanterne sad fast i bunden af brønden. For at løse dette problem blev hjerner overført i opløsning ved hjælp af en pipette og forblev derfor kontinuerligt nedsænket. Et andet teknisk aspekt, der blev ændret, var sterilisering af dissekeringsværktøjer. En maske og handsker blev båret på alle tidspunkter. Ethanol (70%) blev brugt til at sprøjte dissektionsværktøjerne og dissektionsbakkerne. Dette gjorde det muligt at holde bakteriebelastningen på et minimum. Trinene før fiksering skal udføres i et miljø så sterilt som muligt, helst en steril hætte og med præcise og ekstremt blide bevægelser. Det sidste problem, vi stødte på, var, at hjernerne var klæbrige. Ofte ville hjerner klæbe til pipettespidsens indre vægge, når vi forsøgte at placere dem på mikroskopets dias til billeddannelse. For at løse dette problem ændrede vi hjerneoverførselsmetoden mellem mikrobrøndsminibakken til mikroskopets dias som beskrevet ovenfor og fyldte pipettespidsen med monteringsmedier, inden hjernen aspirerede ind i pipettespidsen. Denne metode smurte pipettespidsen med det glycerolbaserede monteringsmedie og reducerede i høj grad klæbningen.

Metoder til dyrkning Drosophila hjerneudplantninger er blevet offentliggjort tidligere 12,19,20,21,22. En metode udgivet af Prithviraj et al. rapporterer dyrkning af sen larve og tidlige puppehjerner. I dette tilfælde blev steroidhormonet ecdyson tilsat til kulturmedierne, og hjerner blev opretholdt i kultur i op til 10 timer²⁰. Bobstock et al. rapporterer dyrkning af hjerner fra sene L1 / tidlige L2-dyr og levende billeddannelse NB'er i flere timer i den ventrale nerveledning. De rapporterer også om vanskeligheder med at håndtere hjerner fra unge larver²¹. Siller et al. rapporterer dyrkning af larvehjerner og brug af levende cellebilleddannelse til at analysere spindeldynamik under neuroblastdelinger i midten til sen larvestadier¹⁹. Alle tidligere offentliggjorte metoder fokuserer på tidspunkter efter det nyklækkede larvestadiet før dyrefoder, med en enkelt undtagelse. I Britton et al. er det rapporteret, at NB'er genaktiveres fra quiescence, når hjerneudplantninger dyrkes sammen med fedt krop¹². Overraskende nok rapporterer Britton et al. også, at eksogent insulin ikke var tilstrækkeligt til at genaktivere quiescent NB'er, i modsætning til hvad der rapporteres her. Derfor lægger grundlaget for ideen om, at en FBDS er nødvendig for NB-reaktivering. På tidspunktet for Britton-papiret var NB-specifikke molekylære markører endnu ikke tilgængelige, og det er klart, at hjernemorfologi er kompromitteret efter 3 dage i kultur. Her giver vi en enkel metode til at genaktivere NB'er i hjerneeksplanter ved blot at tilføje eksogent insulin til kulturmedierne. En vigtig bemærkning om forsigtighed er, at mængden af insulin, der tilsættes til kulturen, langt overstiger fysiologiske forhold. Høje niveauer af insulin kan føre til højere niveauer af PI3-kinase pathway aktivitet i hjernecelletyper in vitro sammenlignet med in vivo betingelser.

Fordi kulturmedierne let kan manipuleres ved at tilføje forskellige faktorer, kan denne teknik bruges til at adressere fremtidige hypoteser vedrørende ydre signalering og NB-quiescens, ind- og udgang. Denne metode kan også bruges til screening i stor skala, enten RNAi eller lægemiddelbaseret. Til screening i stor skala ville det være bedst at anvende transgene dyr, der udtrykker fluorescerende journalister. Dette kan gøre det muligt for en at omgå antistoffarvning, hvilket er tidskrævende. Generelt kunne man efter øvelse oprette 10 kulturer med 3 hjerner hver på 30 minutter. På en uge kan det være rimeligt at screene 150 forskellige forhold.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 µL Pipette tips	Denville Sci	P2102
1000 µL Pipette tips	Denville Sci	P2103-N
1000 µL Pipettor	Gilson	P1000
16% paraformaldehyde (10 x 10 mL)	Electron Microscopy Sciences	2912.60.0000	Used for Fixation of Larval Brains
20 µL Pipette	Gilson	P20
200 µL Pipette tips	Denville Sci	1158U56
24-well multiwell culture plates	Fisher Scientific	50-197-4477
35 mm Petri dishes	Fisher Scientific	08-757-100A	Grape Plate Ingredients
4 °C refrigerator	Fisher Scientific		Provides an ideal temperature for >24 h incubations in antibody solution
63x Objective	Lecia
Active dry yeast	Most supermarkets
Agarose	Fisher Scientific	214010	Grape Plate Ingredients
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye	Thermo Fisher Scientific	C10340	to label proliferating cells
Confocal Microscope	Leica	SP8
Coverslips 22 mm x 22 mm x 1 mm , 10 pack of 4 oz	Fisher Scientific	12-544-10	Two Coverslips are super glued to the ends of the microscope slide. This creates a space that allows for the brains to float in antifade while being imaged.
Coverslips, 22 mm x 50 mm x 1 mm	Fisher Scientific	12-545E	The coverslip is placed on two square coverslips on the microscope slide ensuring that the brain in the antifade does not move while imaging.
Dissecting microscope	Zeiss	Stemi 2000
Ethanol 200 proof (100%), Decon Labs, 1 gallon bottle	Fisher Scientific	2701	Used to wash off the larvae before the 24 hr hold in culture medium
Fetal Bovine Serum (10%)	Sigma	F4135-100ML	Supplement for cell culture media.
Fine forceps for dissection	Fine Science Tools	11295-20	Forcepts used in disections. They work best when sharpened.
Fly Bottles for Crossing	Genessee Scientific	32-130	This bottle is used as a container that lets the flies lay eggs on the grape plate.
Glass Dissection Dish (3 well)	These are no longer available
Glutathione	Sigma	G6013	Provides oxidative protection during cell culture.
Goat Serum	Sigma	G9023- 10ML	Blocking Agent
Grape Plates	Made in house	Made in house	Grape juice/agarose plates for collecting freshly hatched eggs
Image J	Imagej.net/fiji/downloads	Free Download:  https://fiji.sc	Imaging platform that is used to count cells and Edu reactivation
Incubator	Thermo Fisher Scientific		Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment.
Insulin	Sigma	I0516	Independant variable of the experiment
Laminar flow hood			For aliquoting culture media
L-Glutamine	Sigma	G7513	Provides support during cell culture
Nunc 72-well Microwell Mini Trays	Fisher Scientific	12-565-154	Immunostaining steps are performed in this tray
Parafilm	Fisher Scientific	S37440	Film used to seal plates in order to prevent evaporation
Pen-Strep	Sigma	P4458-100ml	Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture.
Phosphate Buffer, pH7.4	Made in house	Made in house	Solvent used to wash the brains after fixing and staining steps
Pick	Fine Science Tools	10140-01	Used to pick larvae off of the grape plate
Propionic acid	Fisher Scientific	A-258	Grape Plate Ingredients
Rabbit 405	Abcam	ab175653	Antibodies used for immunostaining
Rat 555	Abcam	ab150166	Antibodies used for immunostaining
Rb Scribble	A Gift from Chris Doe		Antibodies used for immunostaining
Rt Deadpan	Abcam	ab195173	Antibodies used for immunostaining
Schneiders Culture Medium	Life Tech	21720024	Contains nutrients that help the cells grow and proliferate
SlowFade Diamond Antifade (5 x 2 mL)	Life Tech	S36963	Reagent that provides protection against fading fluorophores
Sterile Water	Autoclave Milli-Q water made in house		Needed for Solutions
Sucrose	Fisher	S2-12	Grape Plate Ingredients
Superfrost Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-7
Superglue	Most supermarkets
Tegosept	Genesee Scientific	20-259	Grape Plate Ingredients
Triton-X 100	Sigma	T9284-100ML	PBT
Welch's 100% grape grape juice	Most supermarkets		Grape Plate Ingredients