Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

एक क्षणिक अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करके स्तनधारी कोशिकाओं में पूर्ण लंबाई वाले मानव हंटिंगटिन वेरिएंट का कुशल और स्केलेबल उत्पादन

Published: December 10, 2021 doi: 10.3791/63190
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Discovery Biology, Curia Global Inc.

Summary

हम एचईके 293 कोशिकाओं में पूर्ण लंबाई वाले मानव हंटिंगटिन प्रोटीन वेरिएंट के निर्माण डिजाइन, क्षणिक अभिकर्मक और अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण को कवर करने वाले स्केलेबल प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

Abstract

पूर्ण लंबाई हंटिंगटिन (एफएल एचटीटी) एक बड़ा (एए 1-3,144) है, जो सर्वव्यापी रूप से व्यक्त, पॉलीग्लूटामाइन (पॉलीक्यू) युक्त प्रोटीन है जिसमें लगभग 350 केडीए का द्रव्यमान है। जबकि एफएल एचटीटी का सेलुलर फ़ंक्शन पूरी तरह से समझा नहीं गया है, ~ 36 दोहराव से ऊपर पॉलीक्यू पथ का एक उत्परिवर्ती विस्तार हंटिंगटन की बीमारी (एचडी) से जुड़ा हुआ है, जिसमें पॉलीक्यू लंबाई लगभग शुरुआत की उम्र के साथ सहसंबंधित है। उत्परिवर्ती एचटीटी (एमएचटीटी) के कार्य पर संरचना के प्रभाव को बेहतर ढंग से समझने के लिए, बड़ी मात्रा में प्रोटीन की आवश्यकता होती है। स्तनधारी कोशिकाओं में एफएल एचटीटी का सबमिलिग्राम उत्पादन डॉक्सीसाइक्लिन-इंड्यूसेबल स्थिर सेल लाइन अभिव्यक्ति का उपयोग करके हासिल किया गया था। हालांकि, स्थिर सेल लाइनों से प्रोटीन उत्पादन की सीमाएं हैं जिन्हें क्षणिक अभिकर्मक विधियों से दूर किया जा सकता है।

यह पेपर एफएल एचटीटी के कम मिलीग्राम मात्रा उत्पादन और पॉलीथाइलेनिमाइन (पीईआई) का उपयोग करके क्षणिक अभिकर्मक द्वारा कोडन-अनुकूलित प्लास्मिड से इसके वेरिएंट के लिए एक मजबूत विधि प्रस्तुत करता है। विधि स्केलेबल (>10 मिलीग्राम) है और लगातार अत्यधिक शुद्ध एफएल एचटीटी के सेल कल्चर के 1-2 मिलीग्राम / एल का उत्पादन करती है। पिछली रिपोर्टों के अनुरूप, एफएल एचटीटी की शुद्ध समाधान स्थिति अत्यधिक गतिशील पाई गई; प्रोटीन में डिमर और उच्च क्रम के ऑलिगोमर्स बनाने की प्रवृत्ति होती है। ऑलिगोमर गठन को धीमा करने की कुंजी आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी के दौरान डिमेरिक और उच्च-क्रम ऑलिगोमेरिक अंशों से मोनोमेरिक अंशों को अलग करने के लिए जल्दी से काम कर रही है।

मल्टीएंगल लाइट स्कैटरिंग (एसईसी-एमएएलएस) के साथ आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी का उपयोग शुद्ध एचटीटी की डिमर और उच्च-क्रम ऑलिगोमेरिक सामग्री का विश्लेषण करने के लिए किया गया था। एफएल एचटीटी पॉलीक्यू लंबाई (क्यू 23, क्यू 48, और क्यू 73) और ऑलिगोमर सामग्री के बीच कोई संबंध नहीं देखा गया। एक्सॉन 1-हटाए गए निर्माण (एए 91-3,144) ने एफएल एचटीटी (एए 1-3,144) के लिए तुलनीय ऑलिगोमेराइजेशन प्रवृत्ति दिखाई। एमएएलएस-अपवर्तक सूचकांक (आरआई), सोडियम डोडेसिलसल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज), वेस्टर्न ब्लॉट, नेटिव पेज और ब्लू नेटिव पेज द्वारा उत्पादन, शुद्धिकरण और लक्षण वर्णन विधियों को यहां वर्णित किया गया है।

Introduction

हंटिंगटन रोग (एचडी) एक दुर्लभ न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारी है जो मुख्य रूप से अस्थिर और अनैच्छिक मोटर आंदोलन, साथ ही संज्ञानात्मक और मनोवैज्ञानिक परिवर्तन, जैसे व्यक्तित्व परिवर्तन और उदासीनता 1,2 की विशेषता है। एचडी हंटिंगटिन जीन (एचटीटी) के एक्सॉन 1 में स्थित सीएजी रिपीट ट्रैक्ट के विस्तार से 35 से अधिक दोहराव से जुड़ा हुआ है, जिसमें सीएजी दोहराव की उच्च संख्या बीमारी की शुरुआत 3,4 के साथ सहसंबंधित है। एचटीटी, हंटिंग्टिन प्रोटीन (एचटीटी) का ट्रांसलेशनल उत्पाद, न्यूरोनल व्यवहार्यता और मस्तिष्क के विकास 5,6,7,8,9 में फंसा हुआ है।

एचटीटी एक मचान प्रोटीन है जो सेलुलर प्रक्रियाओं, पुटिका परिवहन, कोशिका विभाजन, सिलियोजेनेसिस और ऑटोफैगी10,11 की एक विस्तृत श्रृंखला में भाग लेने के लिए रिपोर्ट किया गया है। हालांकि, एचडी का आणविक रोगजनन पूरी तरह से स्पष्ट नहीं है, और पॉलीक्यू-विस्तारित एमएचटीटी के पैथोलॉजिकल प्रभाव की मध्यस्थता करने वाले प्रमुख प्रोटीन इंटरएक्टर्स की पहचान की कमी है। कुछ शोध विस्तारित एचटीटी प्रोटीन की ऑलिगोमेराइजेशन प्रवृत्ति द्वारा संचालित एमएचटीटी से विषाक्त कार्य के लाभ का सुझाव देते हैं, क्योंकि एचडी रोगियों और रोग के पशु मॉडल में न्यूरॉन्स और ग्लिया में एचटीटी समुच्चय की पहचान की गई है 12,13,14,15,16,17 . एफएल एचटीटी और एमएचटीटी वेरिएंट के कार्य और संरचना की जांच को बढ़ावा देने और परख विकास के लिए उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटीन मानकों के साथ शोधकर्ताओं की आपूर्ति करने के लिए, समरूप पुनः संयोजक प्रोटीन की एक मजबूत और स्केलेबल आपूर्ति की आवश्यकता होती है।

इसके आकार (एए 1-3,144, पॉलीक्यू लंबाई क्यू 23 के आधार पर संख्या), प्रोटियोलिटिक अस्थिरता और कुल की प्रवृत्ति के कारण, एफएल एचटीटी एक घुलनशील प्रोटीन के रूप में व्यक्त करना और अलग करना मुश्किल साबित हुआ है। इससे पहले, एचटीटी के एक्सॉन 1 क्षेत्र (एए 2-90) को विभिन्न टैग का उपयोग करके बड़े पैमाने पर व्यक्त और शुद्ध किया गया है जो एस्चेरिचिया कोलाई 18,19,20 में प्रोटीन की घुलनशीलता को बढ़ा सकते हैं। एफएल एचटीटी को पहली बार बैकुलोवायरस21,22 का उपयोग करके एक कीट सेल अभिव्यक्ति प्रणाली में व्यक्त और शुद्ध किया गया था, और रासायनिक रूप से क्रॉसलिंक किए गए एफएल क्यू 23-एचटीटी और क्यू 78-एचटीटी की कम-रिज़ॉल्यूशन 30 ए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) संरचनाओंकी सूचना दी गई थी। एचटीटी संरचना की जांच को और उन्नत किया गया जब स्थिर सेल लाइनों या एडेनोवायरस अभिव्यक्ति प्रणाली 24 का उपयोग करके मानव कोशिकाओं में देशी पोस्टट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएम) के साथ एफएल क्यू 17, क्यू46 और क्यू 128-एचटीटी का उत्पादन हासिल किया गया। इन अध्ययनों से पता चलता है कि हालांकि शुद्ध एचटीटी मुख्य रूप से मोनोमेरिक अवस्था में मौजूद है, यह उच्च क्रम के ऑलिगोमर्स और समुच्चय भी बनाता है।

एफएल क्यू 128-एचटीटी के विश्लेषणात्मक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन, एक अत्यधिक विस्तारित पॉलीक्यू क्षेत्र के साथ, गैर-विस्तारित पॉलीक्यू क्षेत्र24 के साथ प्रोटीन की तुलना में अधिक ओलिगोमेरिक और कुल अंश प्रदान करता है। एक स्थिर सेल लाइन का उपयोग करते हुए, इंटरैक्शन पार्टनर एचएपी 40 के साथ सह-अभिव्यक्ति द्वारा एफएल एचटीटी को स्थिर करने के लिए एक रणनीति को सफलतापूर्वक अनुकूलित किया गया है। एफएल एचटीटी और एचएपी 40 कॉम्प्लेक्स की एक क्रायो-ईएम संरचना को शुद्ध प्रोटीन कॉम्प्लेक्स (पीडीबी: 6ईजेड 8) 25 का उपयोग करके औसत 4 ए रिज़ॉल्यूशन पर हल किया गया है। इस सह-अभिव्यक्ति रणनीति को एक बैकुलोवायरस प्रणाली के लिए सफलतापूर्वक अनुकूलित किया गया है, और विभिन्न पॉलीक्यू लंबाई के साथ उच्च गुणवत्ता वाले एचटीटी वेरिएंट की एक श्रृंखला व्यक्त की गई है और कीट कोशिकाओं से शुद्ध की गईहै। तब से, चर पॉलीक्यू लंबाई और एचएपी 40 और उच्च रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं के साथ एचटीटी के परिसर की अधिक क्रायो-ईएम संरचनाओं को हल किया गया और प्रोटीन डेटा बेस 27,28 (पीडीबी: 7 डीएक्सके, 7 डीएक्सएच, 6 एक्स 9 ओ) में जमा किया गया।

हमने एफएल एचटीटी की तेजी से क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए पॉलीइथाइलेनिमाइन (पीईआई) का उपयोग करके एचईके 293 कोशिकाओं में एक अभिकर्मक और अभिव्यक्ति विधि का अनुकूलन किया। सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, 23 ग्लूटामाइन (एफएल क्यू 23-एचटीटी) युक्त एफएल एचटीटी वेरिएंट को पहले शुद्ध किया गया था और पहलेवर्णित शुद्धिकरण विधि के संशोधन का उपयोग करके विशेषता दी गई थी। यह क्षणिक अभिकर्मक विधि सुविधाजनक, अत्यधिक कुशल और स्केलेबल है; यह 1-2 मिलीग्राम / एल की पैदावार के साथ शुद्ध एचटीटी का उत्पादन कर सकता है, जो स्थिर सेल लाइन विधि केबराबर है। चूंकि प्रोटीन का उत्पादन मानव कोशिका रेखा में होता है, इसलिए उत्पादित एचटीटी में मूल मानव पीटीएम होने की अधिक संभावना होती है जब मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटिओमिक्स विश्लेषण 11,29,30,31 के अधीन होता है। एफएल एचटीटी के एफएल क्यू 48-एचटीटी, एफएल क्यू 73-एचटीटी, और एक्सॉन 1-डिलीट किए गए (एएक्सॉन 1-एचटीटी) वेरिएंट की मिलीग्राम मात्रा का उत्पादन किया गया था, यह दर्शाता है कि क्षणिक अभिव्यक्ति विधि उत्पादन के लिए स्थिर सेल लाइनों को स्थापित करने के लिए आवश्यक समय लेने वाले प्रयास पर निर्भर किए बिना एचटीटी के वैकल्पिक वेरिएंट के तेजी से उत्पादन में विशेष रूप से उपयोगी है।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल 2 एल सेल संस्कृति से एफएल क्यू 23-एचटीटी का उत्पादन करने के लिए सेल कल्चर, अभिकर्मक, प्रोटीन शुद्धिकरण और पोस्टप्यूरिफिकेशन प्रोटीन लक्षण वर्णन के लिए इन लेखकों की प्रयोगशाला में उपयोग की जाने वाली मानक विधि का उदाहरण देता है। प्रोटोकॉल को बड़ी संस्कृतियों तक बढ़ाया जा सकता है या अन्य एचटीटी वेरिएंट को शुद्ध करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। एफएल एचटीटी की 10 एल सेल संस्कृतियों तक और एचटीटी और एचटीटी होमोलॉग के विभिन्न साइट या ट्रंकेशन म्यूटेशन को एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्रयोगशाला में सफलतापूर्वक किया गया है। शुद्ध एफएल एचटीटी में डिमर और उच्च-क्रम ऑलिगोमर्स के साथ मोनोमर्स का उच्च प्रतिशत होता है। उत्पादित वेरिएंट (Q23, Q48, Q73, और हटाए गए एक्सॉन 1) के बीच एक ही समग्र प्रोफ़ाइल देखी जाती है। चूंकि एकत्रीकरण तब हो सकता है जब उचित देखभाल नहीं की जाती है, प्रोटीन हैंडलिंग के लिए सर्वोत्तम स्थितियों की पहचान करने के लिए एक सूत्रीकरण और फ्रीज-पिघलाव स्थिरता अध्ययन आयोजित किया गया था। ब्लू नेटिव पेज और एसईसी / एमएएलएस-आरआई जैसे तरीकों को गुणवत्ता नियंत्रण प्रक्रिया के हिस्से के रूप में एचटीटी ऑलिगोमर सामग्री का विश्लेषण करने के लिए भी वर्णित किया गया है। एचडी अनुसंधान समुदाय को लाभ पहुंचाने के लिए, इस अध्ययन में वर्णित प्लास्मिड और एचटीटी प्रोटीन को कोरिएल इंस्टीट्यूट (www.coriell.org/1/CHDI) में एचडी कम्युनिटी रिपॉजिटरी में भी जमा किया जाता है।

Protocol

1. फ्लैग-टैग किए गए एचटीटी स्तनधारी अभिव्यक्ति के लिए निर्माण का डिजाइन और उत्पादन

  1. नेशनल सेंटर फॉर बायोटेक्नोलॉजी इंफॉर्मेशन (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) से पूर्ण लंबाई वाले मानव एचटीटी प्रोटीन अनुक्रम (पी 42858) को पुनः प्राप्त करें।
    नोट: शोधकर्ताओं को एचटीटी के डोमेन संगठनों से परिचित होने और एचटीटी उत्परिवर्ती के लिए निर्माण डिजाइन करते समय एचटीटी कोर 3 डी संरचना को बनाए रखने की आवश्यकता है।
  2. पी 42858 के अनुक्रम के आधार पर मानव कोशिका अभिव्यक्ति के लिए कोडन अनुकूलन करने के लिए जीन संश्लेषण सेवा का अनुरोध करें। पॉलीक्यू संख्या को क्यू 16 से वांछित क्यू लंबाई में बदलें (क्यू 23 को यहां पहले निर्माण के रूप में चुना गया था) और पूर्ण लंबाई एचटीटी जीन को संश्लेषित करें।
    नोट: संश्लेषित कोडन-अनुकूलित पूर्ण लंबाई क्यू 23-एचटीटी निर्माण इस अध्ययन में पीयूसी 18 प्लास्मिड में एक सम्मिलित के रूप में वितरित किया गया था।
  3. वैकल्पिक: संरचनाओं में विभिन्न क्यू लंबाई और शुद्धिकरण की क्लोनिंग की सुविधा के लिए सुविधाएँ जोड़ें।
    नोट: निर्माण के सी-टर्मिनल छोर पर एक तंबाकू कैच वायरस (टीईवी) दरार साइट और फ्लैग शुद्धिकरण टैग (एएएएनएलवाईएफक्यूजीडीवाईकेडीडीडीके) जोड़ा गया था। पॉलीक्यू क्षेत्र को शामिल करने के लिए निर्माण में दो हिंद III साइटों को डिजाइन किया गया था (हिंद III साइटों को पेश करके अनुवादित प्रोटीन अनुक्रम को नहीं बदला जाता है)। यह शोधकर्ता को पूर्ण एचटीटी जीन को पुन: संश्लेषित किए बिना एंजाइम पाचन और बंधाव को प्रतिबंधित करके एचटीटी की क्यू लंबाई को बदलने की अनुमति देता है।

2. संश्लेषित एचटीटी संरचनाओं को पीसीडीएनए 3.1 में क्लोन करें।

  1. 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर NHEI और PmeI के 2 μL का उपयोग करके pUC18-Q23-HTT के 5 μg और pcDNA3.1 के 5 μg को पचाएं।
  2. 0.5% डब्ल्यू / वी अगारोस जेल चलाएं और एक अगारोस जेल निष्कर्षण किट का उपयोग करके क्यू 23-एचटीटी टुकड़े और पचे हुए पीसीडीएनए 3.1 वेक्टर को शुद्ध करें। यूवी स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके ओडी280 द्वारा शुद्ध डीएनए की सांद्रता की मात्रा निर्धारित करें जो नमूनों के माइक्रोलीटर को माप सकता है।
    नोट: ओडी260/280 1.8 से 2.0 तक आमतौर पर देखा जाता है। संश्लेषित एफएल एचटीटी को पीयूसी 18 प्लास्मिड में दोनों सिरों पर एनएचईआई और पीएमईआई के साथ एक सम्मिलित के रूप में आपूर्ति की जाती है। यदि एचटीटी को अलग तरह से संश्लेषित किया जाता है तो अन्य प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग करें।
  3. प्रतिक्रिया में पचे हुए पीसीडीएनए 3.1 वेक्टर के 10 एनजी का उपयोग करें। टी 4 डीएनए लिगेज का उपयोग करके 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 10 μL प्रतिक्रिया में 1: 1 (एचटीटी: पीसीडीएनए 3.1) मोलर अनुपात में शुद्ध डीएनए को सूचीबद्ध करें।
  4. लिगेज निर्माता द्वारा निर्दिष्ट प्रोटोकॉल का उपयोग करके लिगेटेड उत्पाद को सक्षम ई कोलाई कोशिकाओं ( सामग्री की तालिका देखें) में बदलें।
  5. 6 एकल कॉलोनियों को उठाएं और 37 डिग्री सेल्सियस पर 100 μg / mL कार्बेनिसिलिन के साथ पूरक 4-6 एमएल एलबी में रात भर संस्कृतियां बनाएं।
  6. प्रत्येक रात की संस्कृति से 1 एमएल आवंटित करें। ग्लिसरॉल को 25% v/ v में जोड़ें और ग्लिसरॉल स्टॉक को -80 डिग्री सेल्सियस पर सहेजें। उपयोगकर्ता के मैनुअल में निर्दिष्ट चरणों के अनुसार मिनी-प्रेप किट का उपयोग करके शेष रात भर की संस्कृति को शुद्ध करें।
  7. प्लास्मिड के प्रतिलेखन क्षेत्र में फैले अनुक्रमण प्राइमरों का उपयोग करके सभी प्लास्मिड को अनुक्रमित करें। एक ग्लिसरॉल स्टॉक चुनें जिसमें मास्टर ग्लिसरॉल स्टॉक के रूप में सही अनुक्रम हो और बाकी को त्याग दें।
  8. वैकल्पिक: विभिन्न क्यू लंबाई (क्यू 48, क्यू 73, और एक्सॉन 1) के साथ डीएनए को संश्लेषित करने के लिए जीन संश्लेषण सेवा का अनुरोध करें जो पीसीडीएनए 3.1-क्यू 23-एचटीटी प्लास्मिड में दो हिंद III साइटों को फैलाते हैं। पीसीडीएनए 3.1-क्यू 23-एचटीटी और हिंद III का उपयोग करके नए संश्लेषित डीएनए को डाइजेस्ट करें, और पीसीडीएनए 3.1 प्लास्मिड में अलग-अलग पॉलीक्यू लंबाई के साथ एफएल एचटीटी बनाने के लिए चरण 2.2-2.7 में उन्हें टी 4 लिगेज के साथ पुन: व्यवस्थित करें।
    नोट: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्लास्मिड निर्माण सीधे कोरिएल इंस्टीट्यूट (www.coriell.org/1/CHDI) में एचडी सामुदायिक रिपॉजिटरी से भी उपलब्ध हैं; सामग्री की तालिका देखें।

3. जीआईजीए बड़े पैमाने पर अभिकर्मक के लिए एंडोटॉक्सिन-मुक्त प्लास्मिड डीएनए तैयार करता है

  1. कार्बेनिसिलिन (100 μg/ mL) के साथ एक एलबी एगर प्लेट पर pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-FLAG के बैक्टीरियल ग्लिसरॉल स्टॉक को स्ट्रीक करें। 16-24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें जब तक कि एकल उपनिवेश दिखाई न दें।
  2. एक एकल कॉलोनी चुनें, कार्बेनिसिलिन (100 μg / mL) के साथ प्लास्मिड प्रवर्धन के लिए तैयार एक समृद्ध माध्यम में 5 एमएल स्टार्टर कल्चर का टीकाकरण करें, और 8 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ें।
  3. एक एंडोटॉक्सिन मुक्त जीआईजीए प्लास्मिड शुद्धिकरण किट चुनें। पीसीडीएनए 3.1-क्यू 23-एचटीटी-टीईवी-फ्लैग प्लास्मिड को शुद्ध करने के लिए प्लास्मिड जीआईजीए किट के मैनुअल में उल्लिखित चरणों का पालन करें।
  4. एक लिमुलस अमीबोसाइट लाइसेट (एलएएल) आधारित एंडोटॉक्सिन परिमाणीकरण किट का उपयोग करके प्लास्मिड एंडोटॉक्सिन के स्तर को मापें। निर्माता के मैनुअल में निर्दिष्ट कार्यविधि का पालन करें।
    नोट: अच्छी अभिकर्मक दक्षता प्राप्त करने के लिए एक उच्च गुणवत्ता, कम एंडोटॉक्सिन स्तर प्लास्मिड शुद्धिकरण आवश्यक है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, 20-40 मिलीग्राम प्लास्मिड (सुपरकोइल्ड फॉर्म >80%) 4 मिलीग्राम / एमएल के प्लास्मिड सांद्रता पर बैक्टीरियल कल्चर के प्रति एल प्राप्त > जा सकता है। एक ठीक से शुद्ध प्लास्मिड में एंडोटॉक्सिन स्तर होना चाहिए < 30 ईयू / मिलीग्राम ओडी260/280 1.8 से 2.0 तक आमतौर पर देखा जाता है।

4. पॉलीथीनिमाइन (पीईआई) द्वारा एचईके 293 कोशिकाओं के 2 एल का बड़े पैमाने पर अभिकर्मक

  1. हिलाने के साथ 1 लीटर एंडोटॉक्सिन मुक्त पानी में 1 ग्राम पीईआई 25के जोड़ें। 100 mM HCl का उपयोग करके pH को 2.0 में समायोजित करें और तब तक हिलाएं जब तक कि सभी PEI 25K घुल न जाए। 100 mM NaOH समाधान का उपयोग करके pH को 7.0 में समायोजित करें और 0.2 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें। एलिकोट और एक वर्ष तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: पीईआई के एलिकोट को दो सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है लेकिन पिघलने के बाद कभी भी फिर से नहीं जमना चाहिए।
  2. विकास माध्यम में एचईके 293 कोशिकाओं का प्रचार करें ( सामग्री की तालिका देखें) पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेनिसिलिन के लिए 5 यू / एमएल और स्ट्रेप्टोमाइसिन के लिए 5 μg / mL पर अंतिम एकाग्रता) 37 डिग्री सेल्सियस, 90 आरपीएम, 18-24 घंटे के लिए 5% सीओ2 पर एक ह्यूमिडिफाइड शेकर इनक्यूबेटर में। अभिकर्मक से एक दिन पहले 5 एल एर्लेनमेयर फ्लास्क में विकास माध्यम का उपयोग करके ~ 1.2 × 106 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर कोशिकाओं को 2 एल तक पतला करें।
  3. 18-24 घंटे के लिए कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 90 आरपीएम, 5% सीओ 2 पर बढ़ाना जारी रखें। उपयोगकर्ता के मैनुअल के बाद सेल घनत्व और व्यवहार्यता को मापने में सक्षम ऑटो सेल काउंटर का उपयोग करके सेल मापदंडों को मापें।
    नोट: सेल घनत्व दोगुना होना चाहिए, और व्यवहार्यता >95% होनी चाहिए। अभिकर्मक से पहले सेल घनत्व लगभग 2.0 × 10 6-2.4 × 10 6 कोशिकाओं / एमएल होना चाहिए। आवश्यक होने पर अभिकर्मक से पहले कोशिकाओं को वांछित घनत्व तक पतला करें।
  4. अभिकर्मक के लिए आवश्यक प्लास्मिड और पीईआई की मात्रा की गणना करें; प्रत्येक लीटर सेल कल्चर के अभिकर्मक के लिए 1 मिलीग्राम प्लास्मिड और 3 मिलीग्राम पीईआई का उपयोग करें। 2 एल अभिकर्मक के लिए आवश्यक 2 मिलीग्राम प्लास्मिड और 6 मिलीग्राम पीईआई आवंटित करें।
  5. प्लास्मिड और पीईआई को व्यक्तिगत रूप से फॉस्फेट-बफर्ड खारा की मात्रा में पतला करें जो सेल कल्चर की कुल मात्रा के 1/20वें हिस्से के बराबर है (2 एल अभिकर्मक के लिए प्रत्येक 100 एमएल) और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। पतला प्लास्मिड और पीईआई को कोमल घुमाकर मिलाएं और मिश्रण को 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: इनक्यूबेशन के बाद मिश्रण थोड़ा बादल दिखाई देगा।
  6. मिश्रण को सेल कल्चर में जोड़ें और उन्हें मिलाने के लिए धीरे से घुमाएं।
  7. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, 90 आरपीएम पर 24 घंटे के लिए बढ़ाएं।
  8. 2 mM की अंतिम सांद्रता में 2 M सोडियम ब्यूटिरेट समाधान जोड़ें। संस्कृति में 1: 1000 (वी / वी) एंटीक्लूम्पिंग एजेंट और 1: 1000 (वी / वी) एंटीफोम जोड़ें।
  9. फ्लास्क को 32 डिग्री सेल्सियस, 90 आरपीएम, 5% सीओ2 पर एक ह्यूमिडिफाइड शेकर इनक्यूबेटर में ले जाएं, और 48 घंटे तक बढ़ते रहें।
  10. उपयोगकर्ता के मैनुअल के बाद ऑटो सेल काउंटर का उपयोग करके सेल घनत्व और व्यवहार्यता सहित सेल मापदंडों को मापें।
  11. एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 2.0 × 106 कोशिकाओं (वॉल्यूम = 2.0 × 106/सेल घनत्व) को स्थानांतरित करें। खंड 5 में पश्चिमी सोख्ता के लिए सेंट्रीफ्यूज में 1 मिनट के लिए 2,000 × ग्राम पर कोशिकाओं को पेलेट करें।
  12. 30 मिनट के लिए 2,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को काटें और शुद्धिकरण से पहले सेल गोली को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

एचटीटी अभिव्यक्ति स्तर का अनुमान लगाने के लिए एचईके 293 सेल लाइसेट का एसडीएस-पेज और पश्चिमी धब्बा

  1. एचईके 293 सेल कल्चर के बड़े पैमाने पर अभिकर्मक से पहले जमे हुए 2.0 × 106 कोशिकाओं (चरण 4.11) का एक एलिकोट लें। 50 μg/mL डिजिटोनिन, 5 mM EDTA, और 1x प्रोटीज इनहिबिटर कॉकटेल के साथ पूरक ट्राइस-बफर्ड सेलाइन (TBS) के 250 μL जोड़ें, और पिपेट का उपयोग करके कई बार एस्पिरेटेड करके सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें।
  2. कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक मिनीरोटेटर का उपयोग करके ट्यूबों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए धीरे से घुमाएं। 5 मिनट के लिए 17,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजिंग करके अघुलनशील सामग्री को छर्रों से हटा दें।
  3. सुपरनैटेंट में 4x कम करने वाले लिथियम डोडेसिलसल्फेट (LDS) लोडिंग बफर की मात्रा का 1/3गुना जोड़ें और 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
  4. सेल लाइसेट के 5-20 μL को प्रीकास्ट 3-8% ट्रिस-एसीटेट पेज जेल पर लोड करें। जेल-संगत 1x Tris-एसीटेट एसडीएस रनिंग बफर का उपयोग करके, जेल को 60 मिनट के लिए 150 V पर निरंतर वोल्टेज मोड में चलाएं।
    नोट: ट्रिस-एसीटेट एसडीएस-पेज का उपयोग एफएल एचटीटी विश्लेषण के लिए किया गया था क्योंकि यह 300 केडीए से ऊपर आणविक भार वाले प्रोटीन के लिए अन्य प्रकार के एसडीएस-पेज की तुलना में उच्च रिज़ॉल्यूशन उत्पन्न करता है। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन सीधे कोरिएल इंस्टीट्यूट (www.coriell.org/1/CHDI) में एचडी सामुदायिक रिपॉजिटरी से भी उपलब्ध हैं; सामग्री की तालिका देखें।
  5. पश्चिमी सोख्ता करने के लिए, एक ट्रांसफर बफर-समतुल्य मोटे ट्रांसफर पेपर, एक मेथनॉल-सक्रिय पॉलीविनाइलिडेन फ्लोराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली और एक एसडीएस-पेज जेल का उपयोग करके एक ट्रांसफर सैंडविच इकट्ठा करें। निर्माता के उपयोगकर्ता मैनुअल के अनुसार अर्ध-शुष्क पश्चिमी ब्लोटर का उपयोग करके पीवीडीएफ झिल्ली में प्रोटीन स्थानांतरित करें।
    नोट: आमतौर पर, 135 mA पर 20-30 मिनट 10 सेमी x 10 सेमी झिल्ली के लिए पर्याप्त है।
  6. ट्रांसफर सैंडविच को अलग करें और टीबीएसटी (20 एमएम ट्राइस पीएच 7.4, 150 एमएम एनएसीएल, और 0.1% वी / वी ट्वीन -20) में झिल्ली को अवरुद्ध करें, जो 5% डब्ल्यू / वी गैर-वसा वाले दूध के साथ पूरक है।
  7. 15 एमएल प्राथमिक एंटीबॉडी (एंटी-फ्लैग एंटीबॉडी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के लिए 1: 2,500 कमजोर पड़ने और अन्य सभी प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए 1: 2,000) के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एक रॉकर पर झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
    नोट: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी एंटी-फ्लैग एम 2, एमएबी 5492, एमएबी 5490, एमएबी 2166, एमएबी 3 ई 10, एमएबी 4 ई 10, एमएबी 2168, एमएबी 8 ए 4 ( सामग्री की तालिका देखें) हैं।
  8. 30-50 एमएल टीबीएसटी का उपयोग करके झिल्ली को 3 x 5 मिनट धोएं।
  9. फ्लोरोसेंट डाई-संयुग्मित बकरी एंटी-माउस आईजीजी द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ एक रॉकर पर झिल्ली को 1: 15,000, कमरे के तापमान पर, 15 एमएल टीबीएसटी में 5% डब्ल्यू / वी सूखे दूध से युक्त इनक्यूबेट करें।
  10. द्वितीयक एंटीबॉडी के लिए विशिष्ट तरंग दैर्ध्य का उपयोग करके फ्लोरोसेंट इमेजर पर पश्चिमी धब्बा बैंड की कल्पना करें। उपयोगकर्ता के मैनुअल के अनुसार इमेजर के साथ सॉफ्टवेयर का उपयोग करके बैंड सिग्नल की मात्रा निर्धारित करें।
    नोट: मात्रात्मक पश्चिमी सोख्ता मानक के रूप में शुद्ध एचटीटी का उपयोग करके किया जा सकता है। एचटीटी की एक रैखिक मानक सीमा उपकरण-विशिष्ट है और इस प्रयोगशाला में एंटी-फ्लैग एंटीबॉडी का उपयोग करके प्रति लेन एचटीटी के 25 एनजी से 250 एनजी तक स्थापित की गई थी। एचटीटी का पश्चिमी धब्बा गिरावट से मुक्त होना चाहिए; सेल का कुल एचटीटी अभिव्यक्ति स्तर आमतौर पर 2-4 पीजी / सेल देखा जाता है। मात्रात्मक पश्चिमी धब्बा करने के तरीके के विवरण के लिए पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल32 देखें।

6. एंटी-फ्लैग कॉलम और एसईसी का उपयोग करके एचटीटी का फास्ट प्रोटीन लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (एफपीएलसी) शुद्धिकरण

  1. एंटी-फ्लैग शुद्धिकरण
    1. शुद्धिकरण के लिए आवश्यक फ्लैग राल की मात्रा का अनुमान लगाएं (आमतौर पर, 2-4 एल ट्रांसक्रिप्टेड सेल कल्चर के शुद्धिकरण के लिए एंटी-फ्लैग एम 2 आत्मीयता राल का 12 एमएल)। बफर ए (तालिका 1) का उपयोग करके 4 एमएल /मिनट की प्रवाह दर पर एफपीएलसी का उपयोग करके एक खाली कॉलम (सामग्री की तालिका देखें) पर एंटी-फ्लैग राल के 12-25 एमएल पैक करें। प्लंजर की ऊंचाई समायोजित करें, इसलिए प्लंजर के अंत और राल के बिस्तर के बीच कोई अंतर नहीं है।
    2. सेल पेलेट के प्रति 1 ग्राम लाइसिस बफर के 10 एमएल के अनुपात का उपयोग करके, ठंडे लाइसिस बफर में सेल पेलेट को पिघलाएं और निलंबित करें (तालिका 1)।
    3. सेल निलंबन को 10,000 पीएसआई पर उच्च-कतरनी होमोजेनाइज़र के माध्यम से एक बार पास करें। संगत फिक्स्ड-एंगल रोटर से लैस सेंट्रीफ्यूज में 1 घंटे के लिए 20,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा लाइसेट को स्पष्ट करें।
    4. FPLC प्रोग्राम करें (अध्ययन में उपयोग किए गए सॉफ़्टवेयर के लिए सामग्री की तालिका देखें) और निम्नलिखित अनुक्रम चलाएं।
      1. नमूना पंप के माध्यम से स्पष्ट लाइसेट लोड करें।
      2. बफर ए (तालिका 1) के 4 कॉलम वॉल्यूम (सीवी) से धोएं।
      3. बफर बी के 4 सीवी से धोएं (तालिका 1)।
      4. बफर सी के 8 सीवी से धोएं (तालिका 1)।
      5. बफर डी के 3 सीवी से धोएं (तालिका 1)।
      6. क्षालन बफर के 3 सीवी से धोएं (तालिका 1)।
    5. एसडीएस-पेज का उपयोग करके पीक अंशों के 10 μL का विश्लेषण करें। वांछित शुद्धता के साथ शिखर अंशों को इकट्ठा और संयोजित करें। एसडीएस-पेज विश्लेषण के लिए संयुक्त एलुएट्स के ~ 50 μL सहेजें।
      नोट: आम तौर पर, एक एकल शिखर दिखाई देगा, और शिखर में सभी अंशों में ~ 90% शुद्ध एचटीटी होता है।
    6. पुनर्जनन बफर (तालिका 1) के 5 सीवी का उपयोग करके एक एंटी-फ्लैग कॉलम को पुनर्जीवित करें और बफर ए के 5 सीवी का उपयोग करके कॉलम को फिर से संतुलित करें।
      नोट: एंटी-फ्लैग राल को पांच बार तक या तब तक पुन: उपयोग किया जा सकता है जब तक कि सापेक्ष उपज / लीटर पहले शुद्धिकरण के 50% तक गिर न जाए।
  2. एसईसी कॉलम का उपयोग करके आकार बहिष्करण कॉलम (एसईसी) शुद्धिकरण
    1. एक एसईसी कॉलम को पूर्वनिर्धारित करें जो एसईसी बफर के 2 × सीवी का उपयोग करके आणविक भार (एमडब्ल्यू) > 500 केडीए (उपयोग किए गए कॉलम के लिए सामग्री की तालिका देखें) के साथ प्रोटीन को अलग करने की अनुमति देता है (तालिका 1)।
    2. सीधे 50 एमएल सुपरलूप के माध्यम से एंटी-फ्लैग एलुएट (चरण 6.1.5 से) लोड करें। प्रति इंजेक्शन एसईसी बफर के 1.2 × सीवी चलाएं। एसईसी पृथक्करण को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर चलाएं।
      नोट: इस अध्ययन में चुने गए एसईसी कॉलम पर अधिकतम 5 एमएल या 15 एमएल प्रोटीन नमूना लोड किया जा सकता है। एफपीएलसी प्रोग्राम करें ताकि कई इंजेक्शन स्वचालित रूप से किए जा सकें। नमूना विधि स्क्रिप्ट को पूरक फ़ाइल 1 और पूरक फ़ाइल 2 के रूप में भी शामिल किया गया है।
    3. मोनोमर, डिमर और उच्च क्रम वाले ऑलिगोमेरिक चोटियों को अलग करने के लिए मानक एचटीटी क्षालन प्रोफ़ाइल के साथ क्षालन प्रोफ़ाइल की तुलना करें। एसईसी कॉलम के क्षालन प्रोफ़ाइल के आधार पर मोनोमेरिक एचटीटी अंशों को पूल करें। यदि वांछित हो, तो उच्च-आदेशित ऑलिगोमेरिक और डिमेरिक एचटीटी अंशों को अलग-अलग पूल करें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 100 केडीए केन्द्रापसारक संकेंद्रक का उपयोग करके पूल किए गए एचटीटी प्रोटीन को केंद्रित करें। संबंधित विलोपन गुणांक द्वारा उनके ओडी280 मूल्यों को विभाजित करके प्रोटीन सांद्रता की गणना करें (गणना के लिए क्यू 23-एचटीटी, क्यू 48-एचटीटी, क्यू 73-एचटीटी, और एक्सॉन 1-एचटीटी के सैद्धांतिक विलोपन गुणांक क्रमशः 0.776, 0.769, 0.762 और 0.798 (मिलीग्राम / एमएल) -1सेमी -1 हैं)। 1.0 मिलीग्राम / एमएल ≤ एचटीटी एकाग्रता बनाए रखें।
      नोट: ध्यान केंद्रित करने की प्रक्रिया की निगरानी करना आवश्यक है क्योंकि अतिसंकेंद्रण के परिणामस्वरूप एकत्रीकरण होगा।
    5. क्रायो-सुरक्षित माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में शुद्ध एचटीटी प्रोटीन को 100 μL < मात्रा में एलिकोट करें। फ्लैश-लिक्विड नाइट्रोजन का उपयोग करके एलिकोट को फ्रीज करें और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

7. एचटीटी पॉलीफैलिटेसिटी का विश्लेषण करने के लिए विश्लेषणात्मक एचपीएलसी एसईसी-एमएएलएस-डीआरआई

  1. एक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) प्रणाली पर 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी विश्लेषणात्मक एसईसी-एमएएलएस एक यूवी डिटेक्टर, एक मल्टीएंगल लाइट स्कैटरिंग डिटेक्टर और एक अंतर अपवर्तक सूचकांक (डीआरआई) डिटेक्टर के साथ युग्मित करें।
  2. यूएचपीएलसी कॉलम को सिस्टम से जोड़ने से पहले, पंप और डिटेक्टरों को फ़िल्टर किए गए (0.1 μm) एचपीएलसी-ग्रेड पानी के साथ शुद्ध करें।
  3. UHPLC स्तंभ को सिस्टम से कनेक्ट करें (उपयोग किए गए स्तंभ के लिए सामग्री तालिका देखें)। कॉलम को फ़िल्टर किए गए (0.1 μm) पानी और फिर SEC-MALS बफर (तालिका 1) के साथ बराबर करें जब तक कि सभी डिटेक्टर सिग्नल बेसलाइन तक नहीं पहुंच जाते।
  4. प्रति इंजेक्शन 15 मिनट के लिए 0.3 एमएल / मिनट की प्रवाह दर पर 6 मिलीग्राम / एमएल गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) के 2 μL इंजेक्ट करें और डेटा गुणवत्ता का निरीक्षण करें। बीएसए प्रोफ़ाइल के आधार पर सामान्यीकरण, चरम संरेखण और बैंड व्यापककरण सुधार करें, और निम्न एचटीटी नमूना रन के लिए एक टेम्पलेट बनाएं।
  5. फ्लोट का उपयोग करके कमरे के तापमान वाले पानी के स्नान में एफएल क्यू 23-एचटीटी नमूने की एक शीशी को जल्दी से पिघलाएं। एचटीटी को 0.1 μm स्पिन फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें। एचटीटी नमूने के 2-4 μL इंजेक्ट करें और 0.3 mL / min की प्रवाह दर पर 4 °C पर 15 मिनट के लिए चलाएं।
  6. साथ सॉफ्टवेयर का उपयोग करके क्रोमैटोग्राफिक और प्रकाश-प्रकीर्णन डेटा का विश्लेषण करें (सामग्री की तालिका देखें)। डीआरआई डिटेक्टर को एकाग्रता डिटेक्टर के रूप में उपयोग करें और एचटीटी के लिए अपवर्तक सूचकांक वृद्धि (डीएन / डीसी) के रूप में 0.185 का उपयोग करें। प्रत्येक शिखर33,34 के लिए भार-औसत आणविक द्रव्यमान निर्धारित करने के लिए एक ज़िम प्लॉट उत्पन्न करें।
    नोट: एचटीटी के अपवर्तक सूचकांक वृद्धि की गणना प्रोग्राम एसईडीएफआईटी सॉफ्टवेयर35 और एचटीटी के प्राथमिक अमीनो एसिड अनुक्रम का उपयोग करके इनपुट के रूप में 0.185 के रूप में की जाती है।
    नोट: एचटीटी मोनोमर एमडब्ल्यू को एसईसी-एमएएलएस द्वारा ~ 370 केडीए ± 30 केडीए पर निर्धारित किया जाता है। शुद्ध एचटीटी में आमतौर पर मोनोमर सामग्री 60 और 75% (इस प्रयोगशाला में) के बीच होती है। कम मोनोमर सामग्री यह संकेत दे सकती है कि एकत्रीकरण को रोकने के लिए हैंडलिंग में अधिक सावधानी बरतने की आवश्यकता है।

8. एचटीटी पॉलीस्प्रेसिटी का विश्लेषण करने के लिए ब्लू नेटिव पेज

  1. 20x Blue Native PAGE रनिंग बफर के 50 mL को H2 O के साथ मिलाकर 1 L एनोड बफर तैयार करें।20xBlue Native PAGE रनिंग बफर के 100 mL और 100 mL ब्लू नेटिव पेज कैथोड एडिटिव (20x) को H2 O के 1,800 mL के साथ मिलाकर2L गहरे नीले कैथोड बफर तैयार करें। उपयोग करने से पहले बफर को 4 °C तक ठंडा करें।
  2. फ्लोट का उपयोग करके कमरे के तापमान वाले पानी के स्नान में एफएल क्यू 23-एचटीटी नमूने की एक शीशी को जल्दी से पिघलाएं। उपयोग करने से पहले पिघले हुए प्रोटीन को बर्फ पर रखें।
  3. एफएल क्यू 23-एचटीटी (~ 1 मिलीग्राम / एमएल) के 5 μg, 0.5% G250 एडिटिव का 1 μL, 4x ब्लू नेटिव पेज नमूना बफर का 2.5 μL, और अंतिम मात्रा को 10 μL तक लाने के लिए पानी मिलाएं।
  4. मिश्रित एफएल क्यू 23-एचटीटी नमूने को 3-12% प्रीकास्ट बिस-ट्रिस जेल पर लोड करें। मानक के समान जेल में बिना दाग वाले प्रोटीन मानक के 7.5 μL लोड करें।
  5. टैंक के सामने गहरे नीले कैथोड बफर के साथ भरें और एनोड बफर के साथ टैंक के पीछे।
    नोट: नमूने लोड करते समय आसान विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देने के लिए नमूना लोड होने के बाद बफर भरें।
  6. एक ठंडे कमरे में 120 मिनट के लिए जेल को 150 वोल्ट पर चलाएं।
  7. बैंड देखे जाने तक जेल को डेस्टेनिंग सॉल्यूशन (तालिका 1) के साथ स्थिर करें; जेल को पानी में स्थानांतरित करें। इमेजिंग स्टेशन पर जेल की कल्पना और दस्तावेज़ीकरण करें।
    नोट: ब्लू नेटिव पेज मूल रूप से झिल्ली प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। एचटीटी की मोनोमेरिक सामग्री का अनुमान लगाने के लिए एक वैकल्पिक विधि के रूप में इस प्रयोगशाला में इसे अनुकूलित किया गया था। यह एचटीटी के हाइड्रोफोबिक क्षेत्रों को बांधता है और इसे डिटर्जेंट की कमी वाले बफर परिस्थितियों में समुच्चय बनाने से रोकता है। कूमासी ब्लू जी 250 का उपयोग किए बिना पारंपरिक मूल पृष्ठ एचटीटी को घुलनशील ऑलिगोमर्स और समुच्चय बनाने का कारण बनता है, संभवतः एचटीटी में मौजूद कई हाइड्रोफोबिक जेब के कारण।

9. एचटीटी शुद्धता का विश्लेषण करने के लिए एसडीएस पेज के बाद कूमासी या सिल्वर स्टेनिंग

  1. लोडिंग बफर की अंतिम सांद्रता बनाने और अभिकर्मक को 1x तक कम करने के लिए शुद्ध FL Q23-HTT में 4x LDS नमूना बफर और 10x कम करने वाले अभिकर्मक जोड़ें।
  2. नमूने को 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर सूखे हीटिंग ब्लॉक पर गर्म करें।
  3. 3-8% ट्रिस एसीटेट जेल पर प्रति अच्छी तरह से अधिकतम 1 μg प्रोटीन लोड करें और ट्रिस-एसीटेट एसडीएस रनिंग बफर का उपयोग करके 1 घंटे के लिए 150 V पर चलाएं।
    नोट: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन सीधे कोरिएल इंस्टीट्यूट (www.coriell.org/1/CHDI) में एचडी सामुदायिक रिपॉजिटरी से भी उपलब्ध हैं; सामग्री की तालिका देखें।
  4. कूमासी दाग
    1. जेल को 5 मिनट के लिए एच2ओ के साथ धो लें।
    2. कूमासी स्टेनिंग घोल (तालिका 1) में जेल को 30 एमएल धुंधला घोल में 15 मिनट के लिए हिलाकर दाग दें।
    3. जेल को 5 मिनट के लिए H2O के 50 mL में हिलाकर दाग हटा दें। इमेजिंग स्टेशन पर कूमासी-दाग वाले जेल की कल्पना और दस्तावेज करें।
  5. एक वाणिज्यिक चांदी दाग किट का उपयोग कर चांदी का दाग।
    1. एसडीएस-पेज के बाद, कमरे के तापमान पर 1 घंटे से रात भर के लिए फिक्सिंग सॉल्यूशन (तालिका 1) का उपयोग करके जेल को ठीक करें।
    2. किट के निर्देशों के अनुसार दाग, धोएं और विकसित करें।
    3. बैंड वांछित तीव्रता तक पहुंचने के तुरंत बाद विकासशील चरण को रोकें।
    4. एक दृश्य प्रकाश स्रोत से लैस जेल प्रलेखन प्रणाली में जेल का दस्तावेजीकरण करें।
      नोट: >95% पर शुद्ध एचटीटी को इस प्रोटोकॉल के साथ कूमासी और सिल्वर स्टेनिंग द्वारा पता लगाया जा सकता है। मात्रात्मक प्रोटीन विश्लेषण करने के तरीके के विवरण के लिए पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल32 देखें।

Representative Results

एक क्षणिक अभिव्यक्ति वेक्टर (पीसीडीएनए 3.1-क्यू 23-एचटीटी-टीईवी-फ्लैग, चित्रा 1 ए) एफएल क्यू 23-एचटीटी (क्यू 23 नंबरिंग के आधार पर एए 1-3,144) के स्तनधारी कोशिकाओं में तेजी से उत्पादन के लिए इंजीनियर किया गया है। इस निर्माण में कैसेट क्लोनिंग द्वारा विभिन्न एचटीटी उत्परिवर्तन संरचनाओं को तेजी से उत्पन्न करने के लिए डिज़ाइन की गई विशेषताएं हैं, न्यूनतम क्रोमैटोग्राफिक चरणों के साथ उच्च गुणवत्ता और समरूपता के लिए एचटीटी प्रोटीन के शुद्धिकरण की सुविधा प्रदान करती हैं, और अनटैग्ड एफएल एचटीटी का उत्पादन करने का विकल्प है। सुविधाओं की सूची में 1 शामिल हैं। एचटीटी एक्सॉन 1 में सीएजी रिपीट के आसपास हिंद III प्रतिबंध पाचन साइटों का उपयोग एंजाइम पाचन और बंधाव द्वारा विभिन्न लंबाई के पॉलीक्यू खिंचाव के साथ एफएल एचटीटी उत्परिवर्ती उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है; 2. एफएल एचटीटी के सी-टर्मिनल छोर को उच्च शुद्धता के साथ एफएल एचटीटी के एक-चरणीय आत्मीयता शुद्धिकरण और टीईवी प्रोटीज क्लीवेज का उपयोग करके टैग-मुक्त एफएल एचटीटी प्रोटीन की वैकल्पिक पीढ़ी के लिए टीईवी प्रोटीज मान्यता साइट के साथ एक फ्लैग एपिटोप के साथ टैग किया गया है; 3. एचईके 293 कोशिकाओं में उच्च-स्तरीय अभिव्यक्ति के लिए मानव सेल कोडन उपयोग के लिए कोडन-अनुकूलित एफएल एचटीटी अनुक्रम। स्तनधारी सेल लाइनों में सीएमवी प्रमोटर की उच्च ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियण गतिविधि का लाभ उठाने के लिए पीसीडीएनए 3.1 (+) वेक्टर का उपयोग निर्माण की रीढ़ के रूप में किया जाता है।

प्रारंभिक टेम्पलेट के रूप में पीसीडीएनए 3.1-क्यू 23-एचटीटी-टीईवी-फ्लैग का उपयोग करते हुए, क्यू 48 और क्यू 73 एफएल एचटीटी संरचनाओं का उत्पादन डीएनए टुकड़ों को उचित क्यू लंबाई के साथ संश्लेषित करके किया गया था, जिसमें दो हिंद III प्रतिबंध एंजाइम साइटों को फैलाया गया था और टेम्पलेट में एक ही क्षेत्र को स्वैप किया गया था। एफएल एचटीटी (एए 91-3,144) (चित्रा 1 बी) के एएक्सॉन 1 उत्परिवर्ती का उत्पादन टेम्पलेट में एक्सॉन 1 क्षेत्र में फैले हटाए गए अवशेषों के लिए निर्देशित प्राइमरों का उपयोग करके किया गया था। पीईआई का उपयोग करके पीसीडीएनए 3.1-क्यू 23-एचटीटी-टीईवी-फ्लैग के साथ स्थानांतरित एचईके 293 कोशिकाओं को 5% सीओ2 के तहत 5 एल शेकर फ्लास्क में उगाया गया था। एक विशिष्ट बड़े पैमाने पर शुद्धिकरण 2-10 एल सेल गोली का उपयोग करता है जिसमें 6.0 × 10 9-3.0 × 1010 कोशिकाएं होती हैं। शुद्धिकरण के लिए आगे बढ़ने से पहले, प्रत्येक अभिकर्मक से एचटीटी अभिव्यक्ति स्तर का अनुमान मात्रात्मक पश्चिमी सोख्ता द्वारा एक मानक के रूप में शुद्ध पुनः संयोजक फ्लैग-टैग किए गए एचटीटी और पहले एंटीबॉडी के रूप में एंटी-फ्लैग एंटीबॉडी का उपयोग करके लगाया गया था। शुद्धिकरण के लिए ≥2 पीजी एचटीटी/सेल पर अनुमानित एचटीटी अभिव्यक्ति स्तर वाले छर्रों का उपयोग किया गया था।

एफएल एचटीटी के शुद्धिकरण में एक 2-चरणीय कॉलम प्रक्रिया होती है, पहले एंटी-फ्लैग आत्मीयता शुद्धिकरण के साथ और फिर एचटीटी के लिए उपयुक्त पृथक्करण सीमा के साथ जेल निस्पंदन कॉलम पर एसईसी के साथ (चित्रा 2 ए; उदाहरण के लिए सामग्री की तालिका देखें)। दोनों चरणों के बाद, एचटीटी को >95% नमूना शुद्धता पर प्राप्त किया गया था, जैसा कि एसडीएस-पेज द्वारा कूमासी ब्लू और विश्लेषणात्मक एसईसी-एमएएलएस के आधार पर >65% मोनोमर सामग्री के साथ निर्धारित किया गया था। चूंकि लंबे समय तक शुद्धि करण समय और तापमान दोनों का अंतिम एचटीटी मोनोमर सामग्री पर नकारात्मक प्रभाव पड़ता है, इसलिए एफपीएलसी का उपयोग हैंडलिंग को कम करने और सुसंगत नमूना गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए दोनों शुद्धिकरण चरणों में किया गया था। एंटी-फ्लैग शुद्धिकरण के दौरान प्रमुख संदूषक चैपरोन एचएसपी 70 था जैसा कि मास स्पेक्ट्रोमेट्री (चित्रा 2 बी, लेन 2) द्वारा निर्धारित किया गया था। यह इस खोज के अनुरूप है कि एचएसपी 70 को एफएल एचटीटी के साथ मानव सेल लाइनों24 में स्थिर रूप से व्यक्त किया गया है, यह सुझाव देते हुए कि एचएसपी 70 विवो में एफएल एचटीटी के लिए एक सामान्य स्टेबलाइजर हो सकता है।

एंटी-फ्लैग आत्मीयता शुद्धिकरण चरण (चित्रा 2 बी, लेन 1) के दौरान मैग्नीशियम क्लोराइड और एटीपी के साथ बड़े पैमाने पर धोने से एचएसपी 70 संदूषण को समाप्त किया जा सकता है। एचएसपी 70 को हटाने पर, एफएल एचटीटी उच्च-आदेशित ऑलिगोमर्स24 बनाने ≤ लिए प्रवण होता है और इसे 1 मिलीग्राम / एमएल ≤ एकाग्रता पर बनाए रखना पड़ता है। एसईसी से पहले एकाग्रता चरण अक्सर महत्वपूर्ण एकत्रीकरण का परिणाम हो सकता है। इसलिए, सबसे अच्छा अभ्यास यह है कि ध्यान केंद्रित किए बिना आकार बहिष्करण कॉलम पर एंटी-फ्लैग शुद्धिकरण से पीक अंशों को सीधे लोड किया जाए। एसईसी के बाद, मोनोमेरिक एफएल एचटीटी की अधिकतम वसूली के लिए नमूना ≤1 मिलीग्राम / एमएल पर केंद्रित था। प्रत्येक शुद्धिकरण चरण से बरामद एचटीटी की मात्रा का अनुमान या तो कूमासी ब्लू या मात्रात्मक पश्चिमी सोख्ता द्वारा परिमाणीकरण मानक के रूप में शुद्ध एफएल एचटीटी का उपयोग करके लगाया गया था (तालिका 2)। वर्णित विधि द्वारा उत्पादित शुद्ध एफएल एचटीटी प्रोटीन की विशिष्ट उपज सेल कल्चर के लगभग 1 मिलीग्राम / एल है, लेकिन बैच-टू-बैच परिवर्तनशीलता के कारण इससे नीचे गिर सकती है (तालिका 3), या यदि एंटी-फ्लैग शुद्धिकरण राल को कई बार पुन: उपयोग किया जाता है।

एफएल एचटीटी के ओवरएक्प्रेशन के परिणामस्वरूप प्रोटीन22 का विखंडन हो सकता है। यहां वर्णित विधि द्वारा उत्पादित एफएल क्यू 23-एचटीटी को एसडीएस पेज द्वारा 350 केडीए के सही मेगावाट के साथ एकल बैंड के रूप में हल किया गया है, जो या तो कूमासी जी 250 या चांदी के धुंधलापन (चित्रा 2 सी) द्वारा दाग दिया गया है। वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा, एफएल क्यू 23-एचटीटी ने एन-टर्मिनल, सी-टर्मिनल और कई मध्यवर्ती डोमेन में एपिटोप्स के खिलाफ उठाए गए एंटीबॉडी के साथ प्रतिक्रिया की, जिसमें कोई अतिरिक्त टुकड़ा-संबंधित बैंड नहीं देखा गया, यह दर्शाता है कि प्रोटीन को महत्वपूर्ण पता लगाने योग्य ट्रंकेशन के बिना अलग किया गया था (चित्रा 3 ए)। एफएल एचटीटी पॉलीक्यू लंबाई वेरिएंट क्यू 23, क्यू 48, और क्यू 73 ने पश्चिमी ब्लॉट में अपेक्षित प्रतिक्रिया व्यक्त की, जो पॉलीक्यू-निर्देशित एमएबी एमडब्ल्यू 1 के लिए उत्तरोत्तर मजबूत संकेत दिखाता है जो बढ़ती क्यू-लंबाई के साथ सहसंबंधित है: क्यू 23-एचटीटी < क्यू 48-एचटीटी < क्यू 73-एचटीटी (चित्रा 3 बी)। एंटीबॉडी एमडब्ल्यू 1 और एमएबी 549 के साथ जांच करने पर एएक्सॉन 1-एचटीटी (एए 91-3,144) के लिए कोई संकेत नहीं देखा गया, जो एन टर्मिनल एक्सॉन 1 (चित्रा 3 बी) को लक्षित करते हैं।

एसईसी-एमएएलएस को शुद्ध एचटीटी प्रोटीन के एकत्रीकरण स्थिति और आणविक द्रव्यमान का विश्लेषण करने के लिए नियोजित किया गया था। नमूने यूवी, एमएएलएस और डीआरआई डिटेक्टरों द्वारा निगरानी किए गए विश्लेषणात्मक एसईसी द्वारा विश्लेषण किए गए थे। एसईसी-एमएएलएस से प्राप्त पूर्ण दाढ़ द्रव्यमान अणुओंके आकार 33,34 पर निर्भर नहीं करता है; इसलिए, एसईसी-एमएएलएस मोनोमेरिक और ऑलिगोमेरिक अंशों के लिए एमडब्ल्यू का निष्पक्ष अनुमान प्रदान करता है जब वे अच्छी तरह से अलग हो जाते हैं। परीक्षण किए गए एचपीएलसी स्तंभों में, एसईसी कॉलम (सामग्री की तालिका देखें) ने एचटीटी मोनोमर और डिमर के बीच पर्याप्त रिज़ॉल्यूशन दिखाया ताकि दाढ़ द्रव्यमान को अलग किया जा सके (चित्रा 4)। प्रोटीन एकाग्रता डीआरआई का पता लगाने से निर्धारित की गई थी। एफएल एचटीटी के अपवर्तक सूचकांक वेतन वृद्धि (डीएन / डीसी) 0.1853 एमएल / जी हैं जैसा कि एसईडीएफआईटी सॉफ्टवेयर35 द्वारा गणना की गई है। इसी तरह के विश्लेषणात्मक एसईसी क्षालन पैटर्न को 1एक्सॉन 1 एचटीटी (91-3,144), एफएल क्यू 23, क्यू 48 और क्यू 73 एचटीटी (1-3,144) के लिए देखा गया था, जिनमें से प्रत्येक में मामूली डिमेरिक और ऑलिगोमेरिक चोटियों के साथ एक प्रमुख मोनोमर शिखर शामिल था (तालिका 4)। मोनोमेरिक रूप के लिए गणना की गई एमडब्ल्यू सैद्धांतिक मेगावाट से अधिक है। यह संभवतः उच्च-क्रम वाले ऑलिगोमेरिक चोटियों से अतिव्यापी प्रजातियों और कमजोर डीआरआई संकेतों के परिणामस्वरूप त्रुटियों के कारण होता है क्योंकि एचटीटी प्रोटीन को उच्च-क्रम वाले ऑलिगोमर्स बनाने से बचने के लिए कम सांद्रता में बनाए रखा जाता है। शुद्ध एफएल एचटीटी वेरिएंट के कई बैचों के यूवी चोटियों को एकीकृत करके, पॉलीक्यू लंबाई और कुल प्रोफ़ाइल के बीच कोई स्पष्ट संबंध नहीं देखा गया (तालिका 4)।

विश्लेषणात्मक एसईसी के अलावा, पारंपरिक मूल पेज यह निर्धारित करने के लिए किया गया था कि क्या इसका उपयोग एफएल एचटीटी ऑलिगोमेरिक स्थिति को चिह्नित करने के लिए पूरक विधि के रूप में किया जा सकता है। डिटर्जेंट के बिना देशी बफर का उपयोग करके 3-8% ट्रिस-एसीटेट जैल के माध्यम से उच्च-आदेशित ऑलिगोमर्स को हल किया गया था। एसईसी से शुद्ध एफएल एचटीटी ने ऑलिगोमेराइजेशन राज्यों (चित्रा 5 ए) के अनुरूप कई बैंड दिखाए। सबसे कम बैंड देशी मार्कर 480 केडीए और 720 केडीए के बीच स्थित था, जो कीट कोशिकाओं22 से शुद्ध एफएल एचटीटी के लिए रिपोर्ट किए गए पिछले परिणामों के समान था। हालांकि, पारंपरिक मूल पेज का उपयोग करते समय एचटीटी मोनोमर सबसे प्रचुर मात्रा में बैंड नहीं था, और परिणाम विश्लेषणात्मक एसईसी-एमएएलएस द्वारा निर्धारित कुल प्रोफ़ाइल के साथ सहसंबंधित नहीं हैं। एफएल एचटीटी36,37,38 में मौजूद कई हाइड्रोफोबिक पैच, विशेष रूप से एचएपी 40 और एफएल एचटीटी25 के बीच हाइड्रोफोबिक इंटरफ़ेस, जेल के भीतर प्रवास के दौरान उच्च-आदेशित ऑलिगोमर्स के गठन में योगदान करने की संभावना है। ऐसा इसलिए है क्योंकि हाइड्रोफोबिक क्षेत्रों को डिटर्जेंट की अनुपस्थिति या प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन को स्थिर करने में एक दूसरे के साथ बातचीत करने के लिए जाना जाता है। एचटीटी के हाइड्रोफोबिक गुणों के अनुरूप, एफएल एचटीटी एसईसी शुद्धिकरण चरण के दौरान सीएपीएस की अनुपस्थिति में उच्च-आदेशित ऑलिगोमेरिक अंशों की बढ़ती मात्रा बनाता है।

ब्लू नेटिव पेज, जिसका व्यापक रूप से झिल्ली प्रोटीन और हाइड्रोफोबिक पैच39 युक्त बड़े प्रोटीन कॉम्प्लेक्स की जांच के लिए उपयोग किया जाता है, की तुलना पारंपरिक देशी पेज से की गई थी। शुद्ध एचटीटी ने ब्लू नेटिव पेज पर 643, 927 और 1070 केडीए (चित्रा 5 बी) के अनुमानित मेगावाट के साथ तीन प्रमुख बैंड दिखाए जो क्रमशः एचटीटी की मोनोमेरिक, डिमेरिक और ट्रिमरिक प्रजातियों का प्रतिनिधित्व करते हैं। मोनोमर बैंड ब्लू नेटिव पेज में सबसे प्रचुर मात्रा में बैंड बना रहा, जो समान नमूनों के विश्लेषणात्मक एसईसी प्रोफाइल के अनुरूप था। ब्लू नेटिव पेज द्वारा एचटीटी मोनोमर के मेगावाट की अतिवृद्धि एचटीटी के अद्वितीय खोखले गोलाकार संरचना या हाइड्रोफोबिक क्षेत्रों के परिणामस्वरूप हो सकती है जो संबंधित आणविक भार मार्कर 11,23,25 के सापेक्ष धीमी प्रवास का कारण बनती है। कुल मिलाकर, एफएल क्यू 23-एचटीटी, एफएल क्यू 48-एचटीटी, एफएल क्यू 73-एचटीटी, और एक्सॉन 1-एचटीटी में समान ब्लू नेटिव पेज प्रोफाइल हैं, जिनमें उनके आणविक भार अंतर के कारण प्रोटीन बैंड माइग्रेशन में केवल मामूली अंतर है।

शुद्ध प्रोटीन की गुणवत्ता की एक अतिरिक्त जांच के रूप में, सी-टर्मिनल फ्लैग टैग को टीईवी प्रोटीज के साथ उपचार द्वारा एफएल एचटीटी से हटाया जा सकता है। प्रोटियोलिटिक दरार के बाद, फ्लैग टैग हटाने की पुष्टि करने और एचटीटी गिरावट का पता लगाने के लिए चार एंटीबॉडी का उपयोग करके पश्चिमी धब्बा द्वारा नमूनों का विश्लेषण किया गया था। एंटी-फ्लैग एम 2 और एचटीटी के एन-टर्मिनस, मध्यवर्ती डोमेन और सी-टर्मिनस के एपिटोप्स के साथ तीन हंटिंगटिन-विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए विकृति ने सफल फ्लैग टैग हटाने और एचटीटी-विशिष्ट गिरावट उत्पादों (पूरक चित्रा एस 1) को नहीं दिखाया।

Figure 1
चित्रा 1: पूर्ण लंबाई एचटीटी अभिव्यक्ति के लिए निर्माण। (ए) पूर्ण लंबाई क्यू 23 एचटीटी को कोडन-अनुकूलित किया गया था और पीसीडीएनए 3.1 (+) प्लास्मिड में क्लोन किया गया था। एचटीटी के 3 'छोर को टैग-मुक्त एचटीटी प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए फ्लैग एपिटोप और टीईवी प्रोटीज क्लीवेज साइट के साथ टैग किया गया था। पॉलीग्लूटामाइन खिंचाव और प्रोलाइन-समृद्ध डोमेन को हिंद III प्रतिबंध एंडोन्यूक्लिज़ साइटों के साथ इंजीनियर किया गया था, ताकि कैसेट क्लोनिंग, यानी क्यू 48 और क्यू 73 का उपयोग करके अतिरिक्त सीएजी दोहराव डाला जा सके, ताकि विभिन्न पॉलीक्यू लंबाई के साथ एचटीटी वेरिएंट का उत्पादन किया जा सके। (बी) एएक्सॉन 1 निर्माण को टेम्पलेट के रूप में पीसीडीएनए 3.1-क्यू 23-एचटीटी का उपयोग करके पीसीआर म्यूटेनेसिस बनाया गया था। एचटीटी के अवशेष 91-3,144 अभिव्यक्ति के लिए एएक्सॉन 1 निर्माण में बने रहे। संक्षेप: एचटीटी = हंटिंगटिन; सीएमवी = साइटोमेगालोवायरस; क्यू 23 = पॉलीग्लूटामाइन खिंचाव; पीआरडी = प्रोलाइन-समृद्ध डोमेन; टीईवी = तंबाकू चप वायरस दरार साइट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: एचटीटी का बड़े पैमाने पर शुद्धिकरण। (ए) एफपीएलसी कॉलम पर एंटी-फ्लैग-शुद्ध पूर्ण लंबाई क्यू 23-एचटीटी की एसईसी प्रोफ़ाइल। क्यू 23-एचटीटी के उच्च-क्रमित ऑलिगोमर्स, डिमर और मोनोमर चोटियों को लेबल किया जाता है। मोनोमर युक्त अंशों को अंतिम एचटीटी नमूने के रूप में एकत्र किया गया था। (ख) शुद्ध क्यू23-एचटीटी के एसडीएस-पेज के साथ एटीपी/मैग्नीशियम वाशिंग स्टेप (लेन 1) या एटीपी/मैग्नीशियम धोने के बिना एचएसपी70 सह-क्षालन (लेन 2) होता है। (सी) एसडीएस-पेज पर अंतिम शुद्ध पूर्ण लंबाई वाले एचटीटी वेरिएंट को कूमासी ब्लू जी -250 या सिल्वर दाग से दाग दिया गया। संक्षिप्तीकरण: एफएल = पूर्ण लंबाई; एचटीटी = हंटिंगटिन; एसईसी = आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी; एफपीएलसी = तेज प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी; ओ = ऑलिगोमर; डी = डिमर; एम = मोनोमर; एसडीएस-पेज = सोडियम डोडेसिलसल्फेट पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन; एचएसपी 70 = हीट शॉक प्रोटीन 70। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: शुद्ध एचटीटी वेरिएंट का पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। (ए) शुद्ध एफएल क्यू 23-एचटीटी को एसडीएस-पेज पर चलाया गया और पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित कर दिया गया। प्राथमिक एंटीबॉडी और इंटरैक्शन एपिटोपलेन 1, α-फ्लैग एम 2, फ्लैग टैग हैं; लेन 2, एमएबी 5492, एचटीटी एए। 1-82; लेन 3, एमएबी 5490, एचटीटी ए ए 115-129; लेन 4, एमएबी 2166, एचटीटी एए 181-810; लेन 5, एमएबी 3 ई 10, एचटीटी ए ए 1,171-1,177; लेन 6, एमएबी 4 ई 10, एचटीटी ए ए 1,844-2,131; लेन 7, एमएबी 2168, एचटीटी ए ए 2,146-2,541; लेन 8, एमएबी 8 ए 4, एचटीटी ए 2,703-2,911। (बी) शुद्ध एफएल एचटीटी वेरिएंट के 1 μg को एसडीएस-पेज पर चलाया गया और पीवीडीएफ (बाएं) में स्थानांतरित किया गया, और एक डुप्लिकेट एसडीएस जेल चलाया गया और कूमासी ब्लू (दाएं) के साथ दाग दिया गया। प्राथमिक एंटीबॉडी और अंतःक्रियात्मक एपिटोप ्स पंक्ति 1, एमडब्ल्यू 1, विस्तारित पॉलीक्यू दोहराव हैं; पंक्ति 2, एमएबी 2166, एचटीटी एए 181-810; पंक्ति 3, एमएबी 5492, एचटीटी ए ए 1-82। संक्षेप: एफएलएल क्यू 23-एचटीटी = 23 ग्लूटामाइन अवशेषों वाले पूर्ण लंबाई वाले हंटिंगटिन प्रोटीन; एसडीएस-पेज = सोडियम डोडेसिलसल्फेट पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन; डब्ल्यूबी = पश्चिमी धब्बा; एम = मार्कर; पीवीडीएफ = पॉलीविनाइलडिडेन फ्लोराइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: पूर्ण लंबाई एचटीटी का एसईसी-एमएएलएस विश्लेषण। शुद्ध पूर्ण लंबाई Q23-HTT को UPLC कॉलम पर चित्रित किया गया था। अनुमानित मोनोमर, डिमर और ऑलिगोमर की चरम स्थिति इंगित की जाती है। आणविक भार की गणना मोनोमर, डिमर और ट्रिमर चोटियों के लिए की गई थी और तालिका 5 में सूचीबद्ध की गई थी। Q48, Q73 और AExon1 HTT के लिए समान क्षालन प्रोफाइल देखे जाते हैं, जिसमें प्रत्येक शुद्धिकरण में चर मोनोमर, डिमर और ऑलिगोमर सामग्री होती है। संक्षेप: एसईसी-एमएएलएस = बहु-कोण प्रकाश प्रकीर्णन के साथ आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी; यूवी = अल्ट्रा वायलेट; एलएस = प्रकाश प्रकीर्णन; एमडब्ल्यू = आणविक भार; Q23-HTT = हंटिंगटिन प्रोटीन जिसमें 23 ग्लूटामाइन अवशेष होते हैं; एम = मोनोमर; डी = डिमर; ओ = ऑलिगोमर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: स्पष्ट मूल पृष्ठ या ब्लू नेटिव पेज जेल का उपयोग करके शुद्ध एचटीटी का लक्षण वर्णन। एसईसी से नेटिव मार्कर और स्पष्ट मोनोमेरिक क्यू 23-एचटीटी को गैर-विकृत पेज सिस्टम (ए) और ब्लू नेटिव पेज सिस्टम (बी) में 3-8% ट्रिस-एसीटेट जैल पर हल किया गया था। संक्षिप्तरूप: एफएल = पूर्ण लंबाई; Q23-HTT = हंटिंगटिन प्रोटीन जिसमें 23 ग्लूटामाइन अवशेष होते हैं; पेज = पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन; एम = मार्कर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

क़दम नाम संयोजन
6.1.1 बफर ए 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 5% v/v ग्लिसरॉल, 5 mM EDTA, 0.01% v/v ट्वीन-20, pH 8.0.
6.1.2 लाइसिस बफर 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 5% v/v ग्लिसरॉल, 5 mM EDTA, और 1x प्रोटीज इनहिबिटर कॉकटेल
6.1.4.2 बफर ए 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 5% v/v ग्लिसरॉल, 5 mM EDTA, 0.01% v/v ट्वीन-20, pH 8.0.
6.1.4.3 बफर बी 50 mM Tris; 500 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5% वी / वी ग्लिसरॉल; 0.01% v/v ट्वीन-20, pH 8.0
6.1.4.4 बफर सी 20 mM Tris; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 एमएम एटीपी; 0.01% v/v ट्वीन-20; 5% v/v ग्लिसरॉल, pH 8.0
6.1.4.5 बफर डी 50 mM Tris; 500 mM NaCl; 5% वी / वी ग्लिसरॉल; 5 एमएम ईडीटीए; 0.5% w/v CHAPS, pH 8.0
6.1.4.6 क्षालन बफर 50 mM Tris; 500 mM NaCl; 5% वी / वी ग्लिसरॉल; 0.5% डब्ल्यू / वी सीपीएस; 0.2 मिलीग्राम / एमएल डीवाईकेडीडीडीडीके पेप्टाइड, पीएच 8.0
6.1.6 पुनर्जनन बफर 0.1 एम ग्लाइसिन एचसीएल, पीएच 3.5; 0.01% v/v ट्वीन-20
6.2.1 एसईसी बफर 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 5% v/v ग्लिसरॉल, 0.5% w/v CHAPS, 1 mM TCEP
7.3 SEC-MALS बफर 50 mM HEPES, pH 7.2, 500 mM NaCl, 5% v/v ग्लिसरॉल, 0.5% w/v CHAPS
8.7 डिस्स्टेनिंग समाधान 40% वी / वी मेथनॉल और 7% वी / वी एसिटिक एसिड
9.4.2 कूमासी धुंधला समाधान 0.01% w /v Coomasie G250, 50% v/v/मेथनॉल, 10% v/v एसिटिक एसिड
9.5.1 समाधान ठीक करना 50% v/v मेथनॉल, 10% v/v एसिटिक एसिड, फॉर्मलाडेहाइड का 50 μL/100 mL विलयन

तालिका 1: बफर और समाधान की संरचना

सीढ़ी एचटीटी सांद्रता (मिलीग्राम / कुल आयतन (mL) एचटीटी सामग्री (मिलीग्राम) एचटीटी उपज प्रति सेल (पीजी / सेल) % उपज
सुपरनैटेंट 0.1792 220 39.4 4.4 100
विरोधी झंडा 1.524 8.6 13.1 1.47 33.4
सेकण्ड 0.91 3.9 3.54 0.4 9.1

तालिका 2: पीसीडीएनए 3.1-क्यू 23-एचटीटी-टीईवी-फ्लैग के साथ स्थानांतरित 2 एल एचईके 293 गोली से एचटीटी उपज। संक्षिप्तरूप: एफएल क्यू 23-एचटीटी = 23 ग्लूटामाइन अवशेषों वाले पूर्ण लंबाई वाले हंटिंगटिन प्रोटीन; टीईवी = तंबाकू चप वायरस दरार साइट; एसईसी = आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी।

एचटीटी नमूना एचटीटी उपज (मिलीग्राम / औसत शुद्धता (%)
BCA A280
1 FL DEx1-HTT (N = 3) 0.67-1.30 0.69-1.18 99.3
2 एफएल क्यू 23-एचटीटी (एन = 3) 0.25-0.92 0.28-0.98 96.9
3 एफएल क्यू 48-एचटीटी (एन = 3) 0.28-1.15 0.38-1.16 97.4
4 एफएल क्यू 73-एचटीटी (एन = 3) 0.58-1.05 0.57-0.97 98.8

तालिका 3: चार एफएल एचटीटी संस्करण शुद्धिकरण और उनकी अंतिम शुद्धता की प्रोटीन उपज का सारांश। संक्षिप्त नाम: एफएलएल एचटीटी = पूर्ण लंबाई हंटिंगटिन प्रोटीन।

एचटीटी नमूना एक D M
FL Q23-HTT 4.2-6.9% 18.7-29.3% 66.5-76.0%
FL Q48-HTT 4.0-9.4% 10.6-17.8% 73.6-85.4%
FL Q73-HTT 2.0-14.0% 16.9-24.6% 65.1-81.1%

तालिका 4: शुद्धिकरण से एफएल एचटीटी वेरिएंट के प्रतिनिधि कुल, डिमर और मोनोमर सामग्री का सारांश। संक्षिप्तरूप: एफएल एचटीटी = पूर्ण लंबाई हंटिंगटिन प्रोटीन; ए = कुल; डी = डिमर; एम = मोनोमर; एसईसी = आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी।

पूरक चित्रा एस 1: टीईवी प्रोटीज पाचन के बाद पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। शुद्ध एफएल क्यू 23-एचटीटी और एफएल क्यू 48-एचटीटी को एसडीएस-पेज पर चलाया गया, पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित किया गया, और टीईवी डाइजेस्ट के बाद पश्चिमी सोख्ता द्वारा विश्लेषण किया गया। इस्तेमाल किए गए प्राथमिक एंटीबॉडी एंटी-फ्लैग एम 2 (फ्लैग टैग), एमएबी 5492 (एचटीटी एए 1-82), एमएबी 3 ई 10 (एचटीटी एए 997-1,276), और एमएबी 2168 (एचटीटी एए 2,146-2,541) थे। लेन 1, प्रोटीन मानक; लेन 2, क्यू 23-एचटीटी-टीईवी-फ्लैग; लेन 3, क्यू 48-एचटीटी-टीईवी-फ्लैग; लेन 4, क्यू 23-एचटीटी-टीईवी-फ्लैग को 1: 5 पर टीईवी प्रोटीज के साथ इलाज किया गया, रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर; लेन 5, क्यू 48-एचटीटी-टीईवी-फ्लैग को 1: 5 पर टीईवी प्रोटीज के साथ इलाज किया जाता है, रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर। संक्षिप्तरूप: एफएल एचटीटी = पूर्ण लंबाई हंटिंगटिन प्रोटीन; एसडीएस-पेज = सोडियम डोडेसिलसल्फेट पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन; टीईवी = तंबाकू चप वायरस; पीवीडीएफ = पॉलीविनाइलडिडेन फ्लोराइड। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 2: फ्रीज-पिघलना चक्र के अधीन एफएल एचटीटी वेरिएंट का एसईसी-एमएएलएस विश्लेषण। शुद्ध Q23-HTT (A) और Q48-HTT (B) को -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज किया गया और कमरे के तापमान पर 6 बार तक पिघलाया गया। पहले फ्रीज-पिघलने और छठे फ्रीज-पिघलने चक्र के बाद क्यू 23-एचटीटी और क्यू 48-एचटीटी का विश्लेषण एसईसी-एमएएलएस द्वारा किया गया था। बार-बार फ्रीज-पिघलने चक्रों के बाद प्रकाश प्रकीर्णन द्वारा मोनोमर अंश में मामूली कमी और डिमर और उच्च-क्रम ऑलिगोमर अंशों में वृद्धि देखी गई। अनुमानित मोनोमर, डिमर और उच्च क्रम ऑलिगोमर की चरम स्थिति इंगित की जाती है। संक्षिप्तरूप: एफएल एचटीटी = पूर्ण लंबाई हंटिंगटिन प्रोटीन; ओ = ऑलिगोमर; डी = डिमर; एम = मोनोमर; एसईसी-एमएएलएस = बहु-कोण प्रकाश प्रकीर्णन के साथ आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 3: फ्रीज-पिघलना चक्र के अधीन एफएल एचटीटी वेरिएंट का एसडीएस पेज। शुद्ध क्यू 23-एचटीटी (लेन 2-7) और क्यू 48-एचटीटी (लेन 9-14) को -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज किया गया और कमरे के तापमान पर 6 बार तक पिघलाया गया। Q23-HTT और Q48-HTT के एलिकोट प्रत्येक फ्रीज-पिघलने चक्र के बाद संग्रहीत किए गए थे और फिर SDS PAGE द्वारा विश्लेषण किया गया था। कुल या अवक्रमण उत्पादों में कोई वृद्धि नहीं देखी गई; बैंड डेंसिटोमेट्री द्वारा नमूनों को स्थिर और >95% शुद्ध माना जाता था। संक्षिप्तरूप: एफएल एचटीटी = पूर्ण लंबाई हंटिंगटिन प्रोटीन; एसडीएस-पेज = सोडियम डोडेसिलसल्फेट पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: FPLC 15 mL एंटी-FLAG HTT स्क्रिप्ट. संक्षिप्तरूप = एफपीएलसी = तेज प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी; एचटीटी = हंटिंगटिन प्रोटीन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: एफपीएलसी SEC_MALS एचटीटी स्क्रिप्ट। संक्षेप: एसईसी-एमएएलएस = बहु-कोण प्रकाश प्रकीर्णन के साथ आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी; एफपीएलसी = तेज प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी; एचटीटी = हंटिंगटिन प्रोटीन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

हम यहां इम्यूनोसे और एमएस परख विकास, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए नियंत्रण और संरचना-कार्य अध्ययन के लिए मानकों के रूप में उपयोग के लिए उपयुक्त शुद्धता और समरूपता के साथ कई एफएल एचटीटी प्रोटीन संरचनाओं को उत्पन्न करने के लिए एक क्षणिक अभिकर्मक, अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण विधि का वर्णन करते हैं। यह क्षणिक अभिव्यक्ति विधि स्केलेबल और बहुमुखी है और उपयोगकर्ता को पहले वर्णित स्थिर सेल लाइनों या वायरस-आधारित विधियों का उपयोग करने की तुलना में एफएल एचटीटी वेरिएंट की कम-मिलीग्राम मात्रा को अधिक कुशलता से उत्पन्न करने में सक्षम बनाती है। नियमित रूप से, 2-5 मिलीग्राम अत्यधिक शुद्ध एफएल एचटीटी को प्लास्मिड के निर्माण के बाद क्षणिक अभिव्यक्ति विधि का उपयोग करके एक सप्ताह से भी कम समय में 2 एल स्केल प्रोटीन उत्पादन से उत्पन्न किया जा सकता है, जिसमें प्रति लीटर सेल कल्चर में 1-2.5 मिलीग्राम एफएल एचटीटी की विशिष्ट उपज होती है।

यहां वर्णित क्षणिक अभिव्यक्ति विधि स्थिर सेल लाइन अभिव्यक्ति में कई बाधाओं को दूर करती है, जैसे कि सेल लाइनों को स्थापित करने के लिए आवश्यक लंबे समय और भंडारण और स्थिर सेल लाइनों को बनाए रखने में कठिनाइयां। पीईआई बाजार में अन्य अभिकर्मक अभिकर्मकों की तुलना में अपेक्षाकृत सस्ता है, जो बड़े पैमाने पर अभिकर्मक को आर्थिक रूप से व्यवहार्य बनाता है। प्रोटोकॉल में सीमाएं भी हैं: अभिकर्मक दक्षता काफी हद तक प्लास्मिड की गुणवत्ता, इष्टतम सेल विकास और पीईआई को कितनी अच्छी तरह संग्रहीत और तैयार किया जाता है, इस पर निर्भर करती है। ऑपरेटरों को प्रोटीन पैदावार में भारी गिरावट से बचने के लिए उन महत्वपूर्ण चरणों में विशेष देखभाल करने और गुणवत्ता नियंत्रण करने की आवश्यकता होती है। प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले एंटी-फ्लैग राल भी अपेक्षाकृत महंगे हैं और कई शुद्धिकरण और पुनर्जनन के बाद एफएल एचटीटी के कम कैप्चर को दर्शाता है। कुछ शोधकर्ताओं को आत्मीयता राल के अधिक मजबूत उत्थान की अनुमति देने के लिए एक अलग टैग पर स्विच करना अधिक व्यावहारिक लग सकता है।

एफएल एचटीटी अभिव्यक्ति स्तरों को अनुकूलित करने के लिए विभिन्न सेल लाइनों और अभिव्यक्ति स्थितियों का परीक्षण किया गया था। एचईके 293 कोशिकाओं को एफएल एचटीटी की अभिव्यक्ति के लिए चुना गया था क्योंकि प्रोटीन की उच्च अभिव्यक्ति और निलंबन संस्कृति प्रारूप में हैंडलिंग में आसानी थी, जिससे विधि शेकर्स या बायोरिएक्टर में बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति के लिए उपयुक्त हो गई। एक उच्च एफएल एचटीटी प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर 37 डिग्री सेल्सियस के प्रथागत तापमान का उपयोग करने के बजाय 32 डिग्री सेल्सियस जैसे कम संवर्धन तापमान पर प्राप्त किया जा सकता है। यह संभव है कि कम तापमान प्रोटीन संश्लेषण को धीमा कर सकता है और एफएल एचटीटी40 की सही तह को बढ़ावा दे सकता है। हालांकि, यह घटना एफएल एचटीटी या परीक्षण की गई सेल लाइनों के लिए विशिष्ट नहीं है। सीएचओ कोशिकाओं में दवा प्रोटीन अभिव्यक्ति में कम पोस्टट्रांसफेक्शन तापमान का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। यद्यपि तंत्र पूरी तरह से समझा नहीं गया है, यह माना जाता है कि कम तापमान जी 1 चरण में सेल चक्र को गिरफ्तार करता है और सेलुलर ऊर्जा को प्रोटीन उत्पादन41 में मोड़ता है।

स्तनधारी कोशिकाओं से शुद्ध पूर्ण लंबाई वाले एचटीटी को चैपरोन एचएसपी 7024 के साथ सह-एल्यूट्स किया जाता है, और एमजी-एटीपी धोने के चरण एचएसपी 70 प्रोटीन को हटा सकते हैं। दिलचस्प बात यह है कि कीट सेल अभिव्यक्ति प्रणाली 21,22,23 से शुद्ध एफएल एचटीटी में सह-एल्यूटेड एचएसपी 70 नहीं देखा जाता है। यह स्तनधारी और कीट कोशिकाओं में एफएल एचटीटी के अतिवृद्धि के लिए एफएल एचटीटी या हीट शॉक प्रोटीन प्रतिक्रियाओं के पीटीएम में अंतर को प्रतिबिंबित कर सकता है। एक बार पुनः संयोजक प्रोटीन को एचएसपी 70 से हटा दिया गया है, एफएल एचटीटी के मोनोमेरिक रूप को स्थिर करने के लिए सीएपीएस या डीडीएम जैसे गैर-आयनिक डिटर्जेंट की आवश्यकता होती है।

एफएल एचटीटी वेरिएंट के ऑलिगोमेराइजेशन राज्यों का विश्लेषण ब्लू नेटिव पेज और एसईसी-एमएएलएस का उपयोग करके किया गया था। ब्लू नेटिव पेज या एसईसी-एमएएलएस द्वारा विश्लेषण किए जाने पर डिमेरिक और उच्च-क्रम ऑलिगोमेरिक एचटीटी का एक छोटा सा अंश मौजूद था। ध्यान दें, एफएल एचटीटी द्वारा गठित उच्च-आदेशित ऑलिगोमर्स पॉलीक्यू लंबाई के साथ सहसंबंधित प्रतीत नहीं होते हैं, और यहां तक कि एक्सॉन 1 विलोपन उत्परिवर्ती एक समान ऑलिगोमर-डिमर-मोनोमर अनुपात प्रदर्शित करता है। इन संरचनाओं के बीच ऑलिगोमर सामग्री में वास्तविक भिन्नता प्रत्येक बैच के उत्पादन और हैंडलिंग में मामूली अंतर के कारण होने की संभावना है। एचटीटी एक्सॉन 140,41 द्वारा गठित समुच्चय और फाइब्रिल के विपरीत, एफएल एचटीटी के उच्च-आदेशित ऑलिगोमर्स घुलनशील बने रहे और एसईसी और नेटिव पेज द्वारा उनका विश्लेषण किया जा सकता है।

शुद्ध मोनोमेरिक एफएल एचटीटी केवल अपेक्षाकृत स्थिर है। 4 डिग्री सेल्सियस पर लंबे समय तक भंडारण, कमरे के तापमान पर छोटी ऊष्मायन, या 1 मिलीग्राम / एमएल > सांद्रता सभी मोनोमेरिक एफएल एचटीटी को डिमेरिक और उच्च-क्रमित ऑलिगोमेरिक रूपों में परिवर्तित कर देंगे, भले ही उन परिस्थितियों में कोई दिखाई देने वाली वर्षा न हो। ≤1 मिलीग्राम / एमएल पर बनाए रखा गया शुद्ध मोनोमेरिक एफएल एचटीटी भंडारण बफर (50 एमएम ट्राइस, पीएच 8.0, 500 एमएम एनएसीएल, 5% वी / वी ग्लिसरॉल, 0.5% डब्ल्यू / वी सीएपीएस, और 5 एमएम डीटीटी) में -80 डिग्री सेल्सियस पर अपेक्षाकृत स्थिर रहा, जैसा कि पहले वर्णित24 था। इस तरह से तैयार और संग्रहीत एफएल एचटीटी के 6 फ्रीज-पिघलने चक्रों ने प्रोटीन की दृश्य वर्षा का कारण नहीं बनाया, हालांकि एसईसी-एमएएलएस (पूरक चित्रा एस 2) द्वारा उच्च ओलिगोमेरिक अवस्था में मामूली बदलाव देखा गया था। बार-बार फ्रीज-पिघलाव चक्र के बाद एसडीएस पेज द्वारा नमूनों का भी विश्लेषण किया गया था। कोई दृश्यमान अवक्षेप नहीं देखा गया; एसडीएस-पेज (पूरक चित्रा एस 3) द्वारा कोई समुच्चय या अतिरिक्त गिरावट उत्पाद नहीं देखा गया था। शुद्ध एफएल एचटीटी की दीर्घकालिक स्थिरता अभी भी जांच के अधीन है। निर्णायक दीर्घकालिक डेटा की अनुपस्थिति में, हम शुद्ध एफएल एचटीटी को 6 महीने से अधिक समय तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करने की सलाह देते हैं।

उच्च गुणवत्ता वाले, पुनः संयोजक एफएल एचटीटी प्रोटीन वेरिएंट और उन्हें उत्पादन करने के तरीके एचडी अनुसंधान समुदाय द्वारा उच्च मांग में हैं। ये प्रोटीन संरचनात्मक अध्ययनों में इम्यूनोएसे और एमएस विश्लेषणात्मक मानकों के रूप में उपयोग में हैं, और नए एफएल एचटीटी-विशिष्ट परख के विकास के लिए। यहां वर्णित बड़े पैमाने पर क्षणिक अभिव्यक्ति विधियों ने लगातार >95% शुद्धता के साथ एफएल एचटीटी वेरिएंट की मिलीग्राम मात्रा का उत्पादन किया है, जो एचटीटी अध्ययनों के लिए आवश्यक उपकरण प्रदान करता है। एचडी अनुसंधान के समर्थन में अत्यधिक शुद्ध एफएल एचटीटी पॉलीक्यू वेरिएंट और अन्य उत्परिवर्ती के दसियों मिलीग्राम का उत्पादन नियमित हो गया है।

Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि इस लेख की सामग्री के साथ उनके हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम एचटीटी के एमएस विश्लेषण करने के लिए बफ़ेलो में स्टेट यूनिवर्सिटी ऑफ न्यूयॉर्क के फार्मास्यूटिकल साइंसेज विभाग को धन्यवाद देते हैं। यह काम सीएचडीआई फाउंडेशन के साथ एक सहयोगी प्रयास था। हम विशेष रूप से एलिजाबेथ एम डोहर्टी को धन्यवाद देते हैं; इग्नासियो मुनोज-संजुआन; डगलस मैकडोनाल्ड, सीएचडीआई फाउंडेशन; और रोरी कर्टिस, कुरिया, इस पांडुलिपि की तैयारी के दौरान उनके अमूल्य इनपुट के लिए। हम इस शोध प्रयास के समर्थन के लिए मिशेल लुचे, मिथरा महमूदी और स्टेफ़नी फॉक्स के भी आभारी हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 kDa concentrator-Amicon Millipore UFC910096 Protocol Section Number-6.2.4
20x blue native PAGE running buffer Invitrogen BN2001 Protocol Section Number-8.1
20x TBS Thermo Fisher PI28358 Protocol Section Number-5.1
4x blue native PAGE sample buffer Invitrogen BN2003 Protocol Section Number-8.3
4x LDS loading buffer Invitrogen NP0007 Protocol Section Number-5.3
5 L Erlenmeyer flasks Corning 431685 Protocol Section Number-4.2
Agarose gel extraction kit Qiagen 28704 Protocol Section Number-2.2
Anti-clumping agent Thermo Fisher 0010057AE Protocol Section Number-4.8
anti-FLAG M2 affinity gel Sigma A2220 Protocol Section Number-6.1.1
anti-FLAG M2 Sigma F3165 Protocol Section Number-5.7
Anti foam-Excell anti foam Sigma 59920C-1B Protocol Section Number-4.8
ATP Sigma A6419 Protocol Section Number-6.1.4.4
BEH 450 SEC Waters 186006851 2.5 µm x 4.6 mm x 150 mm
Protocol Section Number-7.3
blue native PAGE 5% G-250 sample additive Invitrogen BN2004 Protocol Section Number-8.3
carbenicillin Thermo Fisher 10177012 Protocol Section Number-2.5
centrifuge - Sorvall Lynx 6000 Thermo Fisher 75006590 Protocol Section Number-6.1.3
Cell Counter - ViCELL BECKMAN COULTER Protocol Section Number-4.3
CHAPS Anatrace C316S Protocol Section Number-6.1.4.6
Competent E. coli cells-TOP10 Invitrogen C404010 Protocol Section Number-2.4
digitonin Sigma D141 Protocol Section Number-5.1
differential refractive index detector Wyatt Protocol Section Number-7.1
DYKDDDDK peptide Genscript Peptide synthesis service
Protocol Section Number-6.1.4.6
EDTA Sigma EDS Protocol Section Number-5.1
EndoFree Plasmid Giga Kit Qiagen 12391 Protocol Section Number-3.3
Endotoxin free water Cytiva SH30529.03 Protocol Section Number-4.1
endotoxin quantification kit-CRL Endosafe Nexgen-PTS detection system Charles River PTS150K Protocol Section Number-3.4
fixed angle rotor A23-6x100 rotor Thermo Fisher 75003006 Protocol Section Number-6.1.3
FPLC software- Unicorn 6.2 Cytiva Protocol Section Number-6.1.4
Gene synthesis Genscript Gene synthesis service
Protocol Section Number-1.2
Glycerol Fisher Scientific Glycerol (Certified ACS) G33-4 Protocol Section Number-5.6
Growth Medium-Expi293 expression medium Thermo Fisher A1435102 Protocol Section Number-4.2
HEK293 cells Thermo Fisher R79007 Protocol Section Number-4
high shear homogenizer-Microfluidizer MicroFluidics LM10 Protocol Section Number-6.1.3
HPLC - 1260 infinity II Bio-Insert HPLC Agilent Protocol Section Number-7.1
Image Studio LiCor Image analysis software
Protocol Section Number-5.1
MAB2166 Sigma MAB2166 Protocol Section Number-5.7
MAB2168 EMD MAB2168 Protocol Section Number-5.7
MAB3E10 Santa Cruz SC-47757 Protocol Section Number-5.7
MAB4E10 Santa Cruz SC-7757 Protocol Section Number-5.7
MAB5490 Sigma MAB5490 Protocol Section Number-5.7
MAB5492 Sigma MAB5492 Protocol Section Number-5.7
MAB8A4 Santa Cruz SC-47759 Protocol Section Number-5.7
multi-angle light scattering detector Wyatt Protocol Section Number-7.1
NativeMark Unstained Protein Standard Invitrogen LC0725 Protocol Section Number-8.4
NaCl Sigma S9888 Protocol Section Number-5.6
NheI New England Biolab R0131S Hi-Fi version available
Protocol Section Number-2.2
NuPAGE 3–8% Tris acetate gels Invitrogen EA0375PK2 Protocol Section Number-5.4
NuPAGE Tris-Acetate SDS Running buffer Invitrogen LA0041 Protocol Section Number-5.4
PEI 25K Polysciences 23966-1 Protocol Section Number-4.1
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15070063 Protocol Section Number-4.2
Phosphate Buffered Saline (PBS) Cytiva SH30256.02 Protocol Section Number-4.5
plasmid miniprep kit Qiagen 27104 Protocol Section Number-2.6
PmeI New England Biolab R0560S Protocol Section Number-2.2
precast Bis-tris gel- 3-12% NativePAGE Novex Bis-Tris Gel Invitrogen BN1003BOX Protocol Section Number-8.4
protease inhibitor cocktail GoldBio GB-331-1 Protocol Section Number-5.1
SEC-MALS analysis software - Astra 7 Wyatt Technology Protocol Section Number-7.6
secondary antibody -IRdye 800 CW goat anti-mouse IgG LiCor 926-32210 Protocol Section Number-5.9
Superose 6 pg XK 16/70 Cytiva 90100042 Protocol Section Number-6.2
Tris base Fisher BP152 Protocol Section Number-5.6
Tween-20 Thermo Fisher AAJ20605AP Protocol Section Number-6.1.1
UV spectrometer - Nanodrop 8000 Thermo Fisher ND-8000-GL Protocol Section Number-2.2
XK26/100 Cytiva 28988951 Protocol Section Number-6.1.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Walker, F. O. Huntington's disease. Lancet. 369 (9557), 218-228 (2007).
  2. McColgan, P., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: a clinical review. European Journal of Neurology. 25 (1), 24-34 (2018).
  3. Duyao, M., et al. Trinucleotide repeat length instability and age of onset in Huntington's disease. Nature Genetics. 4 (4), 387-392 (1993).
  4. MacDonald, M. E., et al. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
  5. Nasir, J., et al. Targeted disruption of the Huntington's disease gene results in embryonic lethality and behavioral and morphological changes in heterozygotes. Cell. 81 (5), 811-823 (1995).
  6. Dragatsis, I., Levine, M. S., Zeitlin, S. Inactivation of Hdh in the brain and testis results in progressive neurodegeneration and sterility in mice. Nature Genetics. 26 (3), 300-306 (2000).
  7. Anne, S. L., Saudou, F., Humbert, S. Phosphorylation of huntingtin by cyclin-dependent kinase 5 is induced by DNA damage and regulates wild-type and mutant huntingtin toxicity in neurons. Journal of Neuroscience. 27 (27), 7318-7328 (2007).
  8. Dietrich, P., Johnson, I. M., Alli, S., Dragatsis, I. Elimination of huntingtin in the adult mouse leads to progressive behavioral deficits, bilateral thalamic calcification, and altered brain iron homeostasis. PLoS Genetics. 13 (7), 1006846 (2017).
  9. Dragatsis, I., et al. Effect of early embryonic deletion of huntingtin from pyramidal neurons on the development and long-term survival of neurons in cerebral cortex and striatum. Neurobiology of Disease. 111, 102-117 (2018).
  10. Benn, C. L., et al. Huntingtin modulates transcription, occupies gene promoters in vivo, and binds directly to DNA in a polyglutamine-dependent manner. Journal of Neuroscience. 28 (42), 10720-10733 (2008).
  11. Saudou, F., Humbert, S. The biology of huntingtin. Neuron. 89 (5), 910-926 (2016).
  12. Davies, S. W., et al. Formation of neuronal intranuclear inclusions underlies the neurological dysfunction in mice transgenic for the HD mutation. Cell. 90 (3), 537-548 (1997).
  13. DiFiglia, M., et al. Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science. 277 (5334), 1990-1993 (1997).
  14. Gutekunst, C. A., et al. Nuclear and neuropil aggregates in Huntington's disease: Relationship to neuropathology. Journal of Neuroscience. 19 (7), 2522-2534 (1999).
  15. Hodgson, J. G., et al. A YAC mouse model for Huntington's disease with full-length mutant huntingtin, cytoplasmic toxicity, and selective striatal neurodegeneration. Neuron. 23 (1), 181-192 (1999).
  16. Hoffner, G., Djian, P. Polyglutamine aggregation in Huntington disease: does structure determine toxicity. Molecular Neurobiology. 52 (3), 1297-1314 (2015).
  17. Waldvogel, H. J., Kim, E. H., Tippett, L. J., Vonsattel, J. P. G., Faull, R. L. M. The neuropathology of Huntington's disease. Current Topics in Behavioral Neurosciences. 22, 33-80 (2014).
  18. Kim, M. Beta conformation of polyglutamine track revealed by a crystal structure of huntingtin N-terminal region with insertion of three histidine residues. Prion. 7 (3), 221-228 (2013).
  19. Hoop, C. L., et al. Huntingtin exon 1 fibrils feature an interdigitated β-hairpin-based polyglutamine core. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1546-1551 (2016).
  20. Vieweg, S., Ansaloni, A., Wang, Z. M., Warner, J. B., Lashuel, H. A. An intein-based strategy for the production of tag-free huntingtin exon 1 proteins enables new insights into the polyglutamine dependence of Httex1 aggregation and fibril formation. Journal of Biological Chemistry. 291 (23), 12074-12086 (2016).
  21. Seong, I. S., et al. Huntingtin facilitates polycomb repressive complex 2. Human Molecular Genetics. 19 (4), 573-583 (2009).
  22. Li, W., Serpell, L. C., Carter, W. J., Rubinsztein, D. C., Huntington, J. A. Expression and characterization of full-length human huntingtin, an elongated HEAT repeat protein. Journal of Biological Chemistry. 281 (23), 15916-15922 (2006).
  23. Vijayvargia, R., et al. Huntingtin's spherical solenoid structure enables polyglutamine tract-dependent modulation of its structure and function. eLife. 5, 11184 (2016).
  24. Huang, B., et al. Scalable production in human cells and biochemical characterization of full-length normal and mutant huntingtin. PLoS ONE. 10 (3), 0121055 (2015).
  25. Guo, Q., et al. The cryo-electron microscopy structure of huntingtin. Nature. 555 (7694), 117-120 (2018).
  26. Harding, R. J., et al. Design and characterization of mutant and wildtype huntingtin proteins produced from a toolkit of scalable eukaryotic expression systems. Journal of Biological Chemistry. 294 (17), 6986-7001 (2019).
  27. Harding, R. J., et al. HAP40 orchestrates huntingtin structure for 1 differential interaction with polyglutamine 2 expanded exon 1. bioRxiv. , (2021).
  28. Huang, B., et al. Pathological polyQ expansion does not alter the conformation of the Huntingtin-HAP40 complex. Structure. 29 (8), 804-809 (2021).
  29. Colin, E., et al. Huntingtin phosphorylation acts as a molecular switch for anterograde/retrograde transport in neurons. EMBO Journal. 27 (15), 2124-2134 (2008).
  30. Thompson, L. M., et al. IKK phosphorylates Huntingtin and targets it for degradation by the proteasome and lysosome. Journal of Cell Biology. 187 (7), 1083-1099 (2009).
  31. Ratovitski, T., et al. Post-translational modifications (PTMs), identified on endogenous Huntingtin, cluster within proteolytic domains between HEAT repeats. Journal of Proteome Research. 16 (8), 2692-2708 (2017).
  32. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of western blot data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
  33. Tarazona, M. P., Saiz, E. Combination of SEC/MALS experimental procedures and theoretical analysis for studying the solution properties of macromolecules. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 56 (1-3), 95-116 (2003).
  34. Folta-Stogniew, E. Oligomeric states of proteins determined by size-exclusion chromatography coupled with light scattering, absorbance, and refractive index detectors. Methods in Molecular Biology. 328, Clifton, N.J. 97-112 (2006).
  35. McMeekin, T. L., Wilensky, M., Groves, M. L. Refractive indices of proteins in relation to amino acid composition and specific volume. Biochemical and Biophysical Research Communications. 7 (2), 151-156 (1962).
  36. Atwal, R. S., et al. Huntingtin has a membrane association signal that can modulate huntingtin aggregation, nuclear entry and toxicity. Human Molecular Genetics. 16 (21), 2600-2615 (2007).
  37. Kegel-Gleason, K. B. Huntingtin interactions with membrane phospholipids: Strategic targets for therapeutic intervention. Journal of Huntington's Disease. 2 (3), 239-250 (2013).
  38. Michalek, M., Salnikov, E. S., Werten, S., Bechinger, B. Membrane interactions of the amphipathic amino terminus of huntingtin. Biochemistry. 52 (5), 847-858 (2013).
  39. Wittig, I., Braun, H. P., Schägger, H. Blue native PAGE. Nature Protocols. 1 (1), 418-428 (2006).
  40. Nissley, D. A., O'Brien, E. P. Altered co-translational processing plays a role in huntington's pathogenesis-A hypothesis. Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 54 (2016).
  41. Kumar, N., Gammell, P., Clynes, M. Proliferation control strategies to improve productivity and survival during CHO based production culture: A summary of recent methods employed and the effects of proliferation control in product secreting CHO cell lines. Cytotechnology. 53 (1-3), 33-46 (2007).

Tags

जैव रसायन अंक 178
एक क्षणिक अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करके स्तनधारी कोशिकाओं में पूर्ण लंबाई वाले मानव हंटिंगटिन वेरिएंट का कुशल और स्केलेबल उत्पादन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pace, J. B., Huang, N. N.,… More

Pace, J. B., Huang, N. N., Séguin, J. P., Esquina, C., Olin, E., Zhu, G., Carr, G. Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System. J. Vis. Exp. (178), e63190, doi:10.3791/63190 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter