Summary
Vi tilbyr skalerbare protokoller som dekker konstruksjonsdesign, forbigående transfeksjon og uttrykk og rensing av humane huntingtin-proteinvarianter i full lengde i HEK293-celler.
Abstract
Full-lengde huntingtin (FL HTT) er et stort (aa 1-3,144), allestedsnærværende uttrykt, polyglutamin (polyQ)-holdig protein med en masse på ca. 350 kDa. Mens den cellulære funksjonen til FL HTT ikke er helt forstått, er en mutant utvidelse av polyQ-kanalen over ~ 36 repetisjoner assosiert med Huntingtons sykdom (HS), med polyQ-lengden korrelert omtrent med debutalderen. For bedre å forstå effekten av struktur på funksjonen av mutant HTT (mHTT), er det nødvendig med store mengder protein. Submilligramproduksjon av FL HTT i pattedyrceller ble oppnådd ved bruk av doksycyklininduserbart stabilt cellelinjeuttrykk. Proteinproduksjon fra stabile cellelinjer har imidlertid begrensninger som kan overvinnes med forbigående transfeksjonsmetoder.
Dette papiret presenterer en robust metode for lav-milligram mengde produksjon av FL HTT og dens varianter fra kodonoptimaliserte plasmider ved forbigående transfeksjon ved bruk av polyetylenimin (PEI). Metoden er skalerbar (>10 mg) og gir konsekvent 1-2 mg / L cellekultur av høyt renset FL HTT. I samsvar med tidligere rapporter ble den rensede løsningstilstanden til FL HTT funnet å være svært dynamisk; Proteinet har en tilbøyelighet til å danne dimerer og oligomerer av høy orden. En nøkkel til å bremse oligomerdannelsen er å arbeide raskt for å isolere de monomere fraksjonene fra de dimeriske og høyordens oligomere fraksjonene under størrelseseksklusjonskromatografi.
Størrelseseksklusjonskromatografi med multiangle lysspredning (SEC-MALS) ble brukt til å analysere det dimere og høyere ordens oligomere innholdet i renset HTT. Det ble ikke observert noen korrelasjon mellom FL HTT polyQ-lengde (Q23, Q48 og Q73) og oligomerinnhold. Den ekson1-slettede konstruksjonen (aa 91-3,144) viste sammenlignbar oligomeriseringstilbøyelighet til FL HTT (aa 1-3,144). Produksjons-, rense- og karakteriseringsmetoder ved SEC / MALS-brytningsindeks (RI), natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE), western blot, Native PAGE og Blue Native PAGE er beskrevet her.
Introduction
Huntingtons sykdom (HS) er en sjelden nevrodegenerativ sykdom primært preget av ustabil og ufrivillig motorisk bevegelse, samt kognitive og psykiatriske endringer, som personlighetsendringer og apati 1,2. HS er assosiert med en utvidelse av CAG-repetisjonskanalen lokalisert i ekson 1 av huntingtin-genet (HTT) til mer enn 35 repetisjoner, med et høyere antall CAG-repetisjoner korrelert med et tidligere sykdomsutbrudd 3,4. Det translasjonelle produktet av HTT, huntingtinproteinet (HTT), er involvert i nevronal levedyktighet og hjerneutvikling 5,6,7,8,9.
HTT er et stillasprotein rapportert å delta i et bredt spekter av cellulære prosesser, vesikkeltransport, celledeling, ciliogenese og autofagi10,11. Den molekylære patogenesen av HS er imidlertid ikke helt klar, og identifiseringen av viktige proteininteraksjoner som medierer den patologiske effekten av polyQ-ekspandert mHTT mangler. Noe forskning tyder på en gevinst av toksisk funksjon fra mHTT drevet av oligomeriseringstilbøyeligheten til det utvidede HTT-proteinet, ettersom HTT-aggregater har blitt identifisert i nevroner og glia hos HS-pasienter og dyremodeller av sykdommen 12,13,14,15,16,17 . For å drive undersøkelsen av funksjonen og strukturen til FL HTT- og mHTT-varianter og forsyne forskere med høykvalitets proteinstandarder for analyseutvikling, er det nødvendig med en robust og skalerbar tilførsel av homogent rekombinant protein.
På grunn av sin størrelse (aa 1-3,144, nummerering basert på polyQ lengde Q23), proteolytisk ustabilitet og tilbøyelighet til å aggregere, har FL HTT vist seg vanskelig å uttrykke og isolere som et løselig protein. Tidligere har ekson 1-regionen (aa 2-90) av HTT blitt uttrykt og renset i stor skala ved hjelp av forskjellige koder som kan øke oppløseligheten av proteinet i Escherichia coli18,19,20. FL HTT ble først uttrykt og renset i et insektcelleuttrykkssystem ved bruk av baculovirus21,22, og lavoppløselige 30 Å elektronmikroskopi (EM) strukturer av kjemisk tverrbundet FL Q23-HTT og Q78-HTT ble rapportert 23. Undersøkelsen av HTT-strukturen ble ytterligere avansert da produksjonen av FL Q17, Q46 og Q128-HTT med innfødte posttranslasjonelle modifikasjoner (PTM) ble oppnådd i humane celler ved bruk av stabile cellelinjer eller adenovirusuttrykkssystemer24. Disse studiene tyder på at selv om renset HTT hovedsakelig eksisterer i monomerisk tilstand, har den også en tendens til å danne høyordens oligomerer og aggregater.
Analytisk ultrasentrifugering av FL Q128-HTT, med en svært utvidet polyQ-region, ga flere oligomere og aggregerte fraksjoner enn proteinet med det ikke-ekspanderte polyQ-området24. Ved hjelp av en stabil cellelinje har en strategi blitt tilpasset for å stabilisere FL HTT ved samuttrykk med interaksjonspartneren HAP40. En kryo-EM-struktur av FL HTT- og HAP40-komplekset er løst med en gjennomsnittlig oppløsning på 4 Å ved bruk av det rensede proteinkomplekset (PDB: 6EZ8) 25. Denne co-expression-strategien er vellykket tilpasset et baculovirussystem, og en rekke HTT-varianter av høy kvalitet med forskjellige polyQ-lengder er uttrykt og renset fra insektceller26. Siden da har flere kryo-EM-strukturer av HTT-komplekset med variable polyQ-lengder og HAP40- og høyere oppløsningsstrukturer blitt løst og avsatt i Protein Data Base27,28 (PDB: 7DXK, 7DXH, 6X9O).
Vi optimaliserte en transfeksjons- og ekspresjonsmetode i HEK293-celler, ved hjelp av polyetylenimin (PEI), for rask forbigående ekspresjon av FL HTT. Som et prinsippbevis ble FL HTT-varianter som inneholdt 23 glutaminer (FL Q23-HTT) først renset og karakterisert ved hjelp av en modifikasjon av en rensemetode beskrevet tidligere24. Denne forbigående transfeksjonsmetoden er praktisk, svært effektiv og skalerbar; det kan produsere renset HTT med utbytter på 1-2 mg / L, sammenlignbar med den stabile cellelinjemetoden rapportert24. Fordi proteinet produseres i en human cellelinje, er HTT produsert mer sannsynlig å ha innfødte humane PTM-er når de blir utsatt for massespektrometri proteomikkanalyse 11,29,30,31. Milligrammengder av FL Q48-HTT, FL Q73-HTT og exon1-slettede (ΔExon1-HTT) varianter av FL HTT ble produsert, noe som viser at den forbigående uttrykksmetoden er spesielt nyttig for raskt å produsere alternative varianter av HTT uten å avhenge av den tidkrevende innsatsen som kreves for å etablere stabile cellelinjer for produksjon.
Følgende protokoll eksemplifiserer standardmetoden som brukes i disse forfatternes laboratorium for cellekultur, transfeksjon, proteinrensing og postpurifiseringsproteinkarakterisering for å produsere FL Q23-HTT fra en 2 L cellekultur. Protokollen kan skaleres opp til større kulturer eller tilpasses for å rense andre HTT-varianter. Opptil 10 L cellekulturer av FL HTT og forskjellige steds- eller trunkeringsmutasjoner av HTT- og HTT-homologer har blitt utført med hell i laboratoriet ved bruk av samme protokoll. Renset FL HTT inneholder en høy prosentandel monomerer sammen med dimere og oligomerer av høyere orden. Den samme aggregerte profilen observeres blant de produserte variantene (Q23, Q48, Q73 og slettet Exon1). Siden aggregering kan oppstå når riktig forsiktighet ikke er tatt, ble det utført en formulerings- og fryse-tine stabilitetsstudie for å identifisere de beste forholdene for proteinhåndtering. Metoder, for eksempel Blue Native PAGE og SEC / MALS-RI, er også beskrevet for å analysere HTT-oligomerinnholdet som en del av kvalitetskontrollprosessen. Til fordel for HS-forskningsmiljøet blir plasmider og HTT-proteiner beskrevet i denne studien også deponert i HS Community Repository ved Coriell Institute (www.coriell.org/1/CHDI).
Protocol
1. Design og produksjon av konstruksjoner for FLAG-merket HTT-pattedyruttrykk
- Hent full lengde human HTT-proteinsekvens (P42858) fra National Center for Biotechnology Information (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
MERK: Forskere må være kjent med HTTs domeneorganisasjoner og opprettholde HTT-kjerne 3D-struktur når de designer konstruksjoner for HTT-mutanter. - Be om en gensyntesetjeneste for å utføre kodonoptimalisering for menneskelig celleuttrykk basert på sekvensen av P42858. Endre polyQ-tallet fra Q16 til ønsket Q-lengde (Q23 ble valgt som den første konstruksjonen her) og syntetiser HTT-genet i full lengde.
MERK: Den syntetiserte kodonoptimaliserte Q23-HTT-konstruksjonen i full lengde ble levert som et innlegg i pUC18-plasmidet i denne studien. - Valgfritt: Legg til funksjoner for å lette kloning av forskjellige Q-lengder og rensing i konstruksjonene.
MERK: Et tobakksetsvirus (TEV) spaltningssted og FLAG-rensemerke (AAAENLYFQGDYKDDK) ble lagt til C-terminalenden av konstruksjonene. To HindIII-steder ble designet i konstruksjonene for å omfatte polyQ-regionen (oversatt proteinsekvens endres ikke ved å introdusere HindIII-steder). Dette gjør det mulig for forskeren å endre HTTs Q-lengde ved å begrense enzymfordøyelse og ligering uten å resyntetisere hele HTT-genet .
2. Klon de syntetiserte HTT-konstruksjonene til pcDNA3.1.
- Fordøy 5 μg pUC18-Q23-HTT og 5 μg pcDNA3.1 ved bruk av 2 μL NheI og PmeI hver ved 37 °C i 2 timer.
- Kjør en 0,5% w / v agarosegel og rens Q23-HTT-fragmentet og den fordøyede pcDNA3.1-vektoren ved hjelp av et agarosegelekstraksjonssett. Kvantifiser konsentrasjonene av renset DNA ved OD280 ved hjelp av et UV-spektrometer som kan måle mikroliter prøver.
MERK: OD260/280 fra 1,8 til 2,0 observeres vanligvis. Den syntetiserte FL HTT leveres som en innsats med NheI og PmeI i begge ender i et pUC18-plasmid. Bruk andre restriksjonsenzymer hvis HTT syntetiseres annerledes. - Bruk 10 ng fordøyd pcDNA3.1 vektor i reaksjonen. Ligate de rensede DNA-ene ved 1: 1 (HTT: pcDNA3.1) molforhold i en 10 μL-reaksjon ved romtemperatur i 5 minutter ved bruk av T4 DNA-ligase.
- Transformer det ligerte produktet til kompetente E. coli-celler (se materialtabellen) ved hjelp av protokollen spesifisert av ligaseprodusenten.
- Plukk opp 6 enkeltkolonier og lag overnattingskulturer i 4-6 ml LB supplert med 100 μg / ml karbenicillin ved 37 ° C.
- Tildel 1 ml fra hver overnattingskultur. Tilsett glyserol til 25% v / v og spar glyserolbestanden ved -80 ° C. Rens den gjenværende overnattingskulturen ved hjelp av et mini-prep-sett i henhold til trinnene som er angitt i brukerhåndboken.
- Sekvenser alle plasmider ved hjelp av sekvenseringsprimere som spenner over transkripsjonsområdet til plasmidet. Velg en glyserol lager som har riktig sekvens som master glyserol lager og kaste resten.
- Valgfritt: Be om en gensyntesetjeneste for å syntetisere DNA med de forskjellige Q-lengdene (Q48, Q73 og Exon1) som spenner over de to HindIII-stedene i pcDNA3.1-Q23-HTT-plasmidet. Fordøye pcDNA3.1-Q23-HTT og de nylig syntetiserte DNA-ene ved hjelp av HindIII, og religere dem med T4 ligase som i trinn 2.2-2.7 for å lage FL HTT med forskjellige polyQ-lengder i pcDNA3.1-plasmidet.
MERK: Plasmidkonstruksjoner brukt i denne studien er også tilgjengelige direkte fra HS Community Repository ved Coriell Institute (www.coriell.org/1/CHDI); se materialtabellen.
3. GIGA prep endotoksinfritt plasmid-DNA for storskala transfeksjon
- Strek de bakterielle glyserollagrene av pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-FLAG på en LB-agarplate med karbenicillin (100 μg / ml). Inkuber platen ved 37 °C i 16-24 timer til enkeltkolonier vises.
- Plukk opp en enkelt koloni, inokuler en 5 ml startkultur i et rikt medium formulert for plasmidforsterkning med karbenicillin (100 μg / ml), og vokse ved 37 ° C i 8 timer.
- Velg et endotoksinfritt GIGA plasmidrensingssett. Følg trinnene som er beskrevet i håndboken til plasmid GIGA-settet for å rense pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-FLAG-plasmidet.
- Mål plasmid endotoksinnivåene ved hjelp av et limulus amoebocyttlysat (LAL) -basert endotoksinkvantifiseringssett. Følg prosedyren som er angitt i produsentens håndbok.
MERK: En høy kvalitet, lavt endotoksinnivå plasmidrensing er avgjørende for å oppnå god transfeksjonseffektivitet. Ved hjelp av denne protokollen kan 20-40 mg plasmid (supercoiled form >80%) oppnås per liter bakteriekultur ved plasmidkonsentrasjoner > 4 mg / ml. Et riktig renset plasmid bør ha et endotoksinnivå < 30 EU/mg. OD260/280 fra 1,8 til 2,0 observeres vanligvis.
4. Storskala transfeksjon av 2 L HEK293-celler av polyetyleneimin (PEI)
- Tilsett 1 g PEI 25K til 1 liter endotoksinfritt vann under omrøring. Juster pH-verdien til 2,0 med 100 mM HCl og rør til all PEI 25K er oppløst. Juster pH til 7,0 ved hjelp av 100 mM NaOH-løsning og filtrer gjennom et 0,2 μm filter. Aliquot og oppbevares ved -20 °C i opptil ett år.
MERK: Aliquots av PEI kan oppbevares ved 4 °C i opptil to uker, men bør aldri fryses på nytt etter tining. - Forplant HEK293-celler i vekstmediet (se materialtabellen) supplert med penicillin-streptomycin (endelig konsentrasjon ved 5 U / ml for penicillin og 5 μg / ml for streptomycin) i en fuktet shakerinkubator ved 37 ° C, 90 o / min, 5% CO2 i 18-24 timer. Fortynn cellene til 2 L ved en tetthet på ~ 1,2 × 106 celler / ml ved bruk av vekstmediet i 5 L Erlenmeyer-kolber en dag før transfeksjon.
- Fortsett å vokse cellene ved 37 ° C, 90 o / min, 5% CO2 i 18-24 timer. Mål celleparametrene ved hjelp av en automatisk celleteller som er i stand til å måle celletetthet og levedyktighet etter brukerhåndboken.
MERK: Celletettheten skal dobles, og levedyktigheten skal være >95%. Celletettheten før transfeksjonen bør være ca. 2,0 × 10 6-2,4 × 106 celler/ml. Fortynn cellene til ønsket tetthet før transfeksjon når det er nødvendig. - Beregn mengdene plasmid og PEI som kreves for transfeksjonen; bruk 1 mg plasmid og 3 mg PEI for transfeksjon av hver liter cellekultur. Allokere 2 mg plasmid og 6 mg PEI nødvendig for en 2 L transfeksjon.
- Fortynn plasmidet og PEI individuelt til et volum fosfatbufret saltvann lik 1/20th av det totale volumet av cellekultur (100 ml hver for en 2 L transfeksjon) og inkuber ved romtemperatur i 5 minutter. Bland det fortynnede plasmidet og PEI ved forsiktig virvling og inkuber blandingen ved romtemperatur i 30 minutter.
MERK: Blandingen vil virke litt overskyet etter inkubasjon. - Tilsett blandingen i cellekulturen og virvle forsiktig for å blande dem.
- Dyrk cellene ved 37 ° C, 5% CO2, 90 o / min i 24 timer.
- Tilsett 2 M natriumbutyratoppløsning til en endelig konsentrasjon på 2 mM. Tilsett 1:1000 (v/v) antiklumpemiddel og 1:1000 (v/v) antiskum til kulturen.
- Flytt kolben til en fuktet shakerinkubator ved 32 °C, 90 o / min, 5% CO2, og fortsett å vokse i 48 timer.
- Mål celleparametrene, inkludert celletetthet og levedyktighet, ved hjelp av den automatiske celletelleren etter brukerhåndboken.
- Overfør 2,0 × 10 6 celler (Vol = 2,0 × 106/celletetthet) i et mikrosentrifugerør. Pellet cellene ved 2000 × g i 1 min i en sentrifuge for vestlig blotting i seksjon 5.
- Høst cellene ved sentrifugering ved 2000 × g i 30 minutter og oppbevar cellepelleten ved -80 °C før rensing.
5. SDS-PAGE og western blot av HEK293 cellelysat for å estimere HTT-uttrykksnivå
- Ta en aliquot på 2,0 × 106 celler som tidligere er frosset (trinn 4,11) fra storskala transfeksjon av HEK293 cellekultur. Tilsett 250 μL Tris-bufret saltvann (TBS) supplert med 50 μg / ml digitonin, 5 mM EDTA og 1x proteaseinhibitorcocktail, og suspender cellepelleten på nytt ved å aspirere flere ganger ved hjelp av en pipette.
- Roter rørene forsiktig i 30 minutter ved 4 °C ved hjelp av en minirotator for å lyse cellene. Pellet det uoppløselige materialet ved sentrifuging ved 17.000 × g i 5 minutter.
- Tilsett 1/3rd volumet av 4x reduserende litiumdodecylsulfat (LDS) belastningsbuffer til supernatanten og varme ved 70 ° C i 10 minutter.
- Legg 5-20 μL cellelysat på en prefabrikkert 3-8% Tris-acetat PAGE gel. Bruk den gelkompatible 1x Tris-acetate SDS-kjørebufferen, kjør gelen i konstant spenningsmodus ved 150 V i 60 minutter.
MERK: Tris-acetat SDS-PAGE ble brukt til FL HTT-analyse fordi den genererer høyere oppløsning enn andre typer SDS-PAGE for proteiner med molekylvekt over 300 kDa. Proteiner brukt i denne studien er også tilgjengelige direkte fra HS Community Repository ved Coriell Institute (www.coriell.org/1/CHDI); se materialtabellen. - For å utføre vestlig blotting, monter en overføringssandwich ved hjelp av et overføringsbuffer-likevektet tykt overføringspapir, en metanolaktivert polyvinylidenfluorid (PVDF) membran og en SDS-PAGE-gel. Overfør proteinene til PVDF-membranen ved hjelp av en halvtørr vestlig blotter i henhold til produsentens brukerhåndbok.
MERK: Vanligvis er 20-30 min ved 135 mA tilstrekkelig for en 10 cm x 10 cm membran. - Demonter overføringssandwichen og blokker membranen i TBST (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl og 0,1 % v/v Tween-20) supplert med 5 % w/v ikke-fet melk.
- Inkuber membranen på en rocker i 1 time ved romtemperatur med 15 ml primært antistoff (1:2 500 fortynning for anti-FLAG antistoff monoklonalt antistoff og 1:2 000 for alle andre primære antistoffer).
MERK: Primære antistoffer brukt i denne studien er anti-FLAG M2, MAB5492, MAB5490, MAB2166, MAB3E10, MAB4E10, MAB2168, MAB8A4 (se materialtabellen). - Vask membranen 3 x 5 min med 30-50 ml TBST.
- Inkuber membranen på en rocker med et fluorescerende fargestoffkonjugert geit anti-mus IgG sekundært antistoff ved 1:15,000, romtemperatur, i 15 ml TBST som inneholder 5% w / v tørr melk.
- Visualiser de vestlige blotbåndene på et fluorescerende bildeapparat ved hjelp av bølgelengden som er spesifikk for det sekundære antistoffet. Kvantifiser båndsignalet ved hjelp av programvaren som følger med bildeapparatet i henhold til brukerhåndboken.
MERK: Kvantitativ western blotting kan utføres med renset HTT som standard. Et lineært standardområde for HTT er instrumentspesifikt og ble etablert i dette laboratoriet fra 25 ng til 250 ng HTT per bane ved hjelp av et anti-FLAG antistoff. Den vestlige flekken av HTT bør være fri for nedbrytning; et totalt HTT-ekspresjonsnivå på 2-4 pg / celle observeres vanligvis. Se en tidligere publisert protokoll32 for detaljer om hvordan man utfører en kvantitativ western blot.
6. Rask proteinvæskekromatografi (FPLC) rensing av HTT ved bruk av anti-FLAG kolonne og SEC
- Anti-FLAG rensing
- Beregn mengden FLAG-harpiks som trengs for rensing (vanligvis 12 ml anti-FLAG M2 affinitetsharpiks for rensing av 2-4 L transfisert cellekultur). Pakk 12-25 ml anti-FLAG-harpiks på en tom kolonne (se materialtabellen) ved bruk av FPLC med en strømningshastighet på 4 ml / min ved bruk av buffer A (tabell 1). Juster stempelets høyde, så det ikke er noe mellomrom mellom enden av stempelet og sengen av harpiks.
- Ved å bruke et forhold på 10 ml lysisbuffer per 1 g cellepellet, tine og suspendere cellepelleten i kald lysisbuffer (tabell 1).
- Pass cellesuspensjonen en gang gjennom en høyskjærhomogenisator ved 10.000 psi. Klargjør lysatet ved sentrifugering ved 20 000 × g i 1 time i en sentrifuge utstyrt med en kompatibel fastvinkelrotor.
- Programmere FPLC (se materialtabellen for programvaren som ble brukt i studien) og kjøre følgende sekvenser.
- Last det avklarte lysatet via prøvepumpen.
- Vask med 4 kolonnevolumer (CV) av buffer A (tabell 1).
- Vask med 4 CVer av buffer B (tabell 1).
- Vask med 8 CVer av buffer C (tabell 1).
- Vask med 3 CV-er med buffer D (tabell 1).
- Vask med 3 CV-er med elueringsbuffer (tab 1).
- Analyser 10 μL av toppfraksjonene ved hjelp av SDS-PAGE. Samle og kombiner toppfraksjonene med ønsket renhet. Lagre ~50 μL av de kombinerte eluatene for SDS-PAGE-analyse.
MERK: Normalt vil en enkelt topp vises, og alle fraksjoner eluert i toppen inneholder ~ 90% ren HTT. - Regenerer en anti-FLAG-kolonne ved hjelp av 5 CV-er med regenereringsbuffer (tabell 1) og balanser kolonnen på nytt ved hjelp av 5 CV-er med buffer A.
MERK: Anti-FLAG harpiks kan gjenbrukes opptil fem ganger eller til det relative utbyttet / liter faller til 50% av den første rensingen.
- Rensing av størrelsesekskluderingskolonne (SEC) ved hjelp av en SEC-kolonne
- Preequilibrate en SEC-kolonne som tillater separasjon av proteiner med molekylvekt (MW) > 500 kDa (se materialtabellen for kolonnen som brukes) ved bruk av 2 × CV av SEC Buffer (tabell 1).
- Last anti-FLAG-eluatet direkte (fra trinn 6.1.5) via en 50 ml superloop. Kjør 1,2 × CV med SEC-buffer per injeksjon. Kjør SEC-separasjonen over natten ved 4 °C.
MERK: Maksimalt 5 ml eller 15 ml proteinprøve kan lastes på SEC-kolonnene som er valgt i denne studien. Programmer FPLC slik at flere injeksjoner kan utføres automatisk. Eksempelmetodeskript er også inkludert som tilleggsfil 1 og tilleggsfil 2. - Sammenlign elueringsprofilen med standard HTT-elueringsprofil for å skille monomer, dimer og høyere bestilte oligomere topper. Slå sammen de monomere HTT-fraksjonene basert på elueringsprofilen til SEC-kolonnen. Hvis ønskelig, samle de høyere bestilte oligomere og dimeriske HTT-fraksjonene separat.
- Konsentrer det samlede HTT-proteinet ved hjelp av en 100 kDa sentrifugalkonsentrator ved 4 °C. Beregn proteinkonsentrasjonene ved å dele OD280-verdiene med de respektive utryddelseskoeffisientene (de teoretiske utryddelseskoeffisientene til henholdsvis Q23-HTT, Q48-HTT, Q73-HTT og ΔExon1-HTT er henholdsvis 0,776, 0,769, 0,762 og 0,798 (mg/ml)-1 cm-1for beregningen). Opprettholde HTT-konsentrasjonen ≤ 1,0 mg / ml.
MERK: Det er viktig å overvåke konsentrasjonsprosessen da overkonsentrasjon vil resultere i aggregering. - Aliquot det rensede HTT-proteinet i kryosikre mikrosentrifugerør i et volum < 100 μL. Flash-frys aliquotene ved hjelp av flytende nitrogen og oppbevar dem ved -80 °C.
7. Analytisk HPLC SEC-MALS-dRI for å analysere HTT-polydispersitet
- Utfør alle analytiske SEC-MALS ved 4 °C på et høytytende væskekromatografisystem (HPLC) kombinert med en UV-detektor, en multiangle lysspredningsdetektor og en differensiell brytningsindeks (dRI) detektor.
- Før du kobler UHPLC-kolonnen til systemet, må du tømme pumpen og detektorene med filtrert (0,1 μm) HPLC-vann.
- Koble UHPLC-kolonnen (se materialtabellen for kolonnen som brukes) til systemet. Juster kolonnen med filtrert (0,1 μm) vann og deretter SEC-MALS-buffer (tabell 1) til alle detektorsignalene når grunnlinjen.
- Injiser 2 μL 6 mg/ml bovint serumalbumin (BSA) med en strømningshastighet på 0,3 ml/min i 15 minutter per injeksjon og kontroller datakvaliteten. Utfør normalisering, toppjustering og korrigering av båndutvidelse basert på BSA-profilen, og opprett en mal for følgende HTT-eksempelkjøringer.
- Tine raskt et hetteglass med FL Q23-HTT-prøven i et vannbad i romtemperatur ved hjelp av en flottør. Filtrer HTT gjennom et 0,1 μm spinnfilter. Injiser 2-4 μL av HTT-prøven og kjør i 15 minutter ved 4 °C med en strømningshastighet på 0,3 ml/min.
- Analyser kromatografiske og lysspredningsdata ved hjelp av tilhørende programvare (se materialtabellen). Bruk dRI-detektoren som konsentrasjonsdetektor og bruk 0,185 som brytningsindeksøkning (dn/dc) for HTT. Generer et Zimm-plott for å bestemme vektgjennomsnittlig molekylmasse for hver topp33,34.
MERK: Brytningsindeksøkning av HTT beregnes som 0,185 ved hjelp av programmet SEDFIT software35 og primær aminosyresekvens av HTT som input.
MERK: HTT-monomer MW bestemmes av SEC-MALS ved ~370 kDa ± 30 kDa. Renset HTT har vanligvis monomerinnhold mellom 60 og 75% (i dette laboratoriet). Lavt monomerinnhold kan tyde på at det må utvises mer forsiktighet ved håndtering for å hindre aggregering.
8. Blue Native PAGE for å analysere HTT-polydispersitet
- Forbered 1 L anodebuffer ved å blande 50 ml 20x Blue Native PAGE som kjører buffer (se materialtabellen) med 950 ml H 2 O. Forbered 2 L mørkeblå katodebuffer ved å blande 100 ml 20x Blue Native PAGE som kjører buffer og 100 ml Blue Native PAGE katodeadditiv (20x) med 1 800 ml H2O. Avkjøl bufferne til 4 °C før bruk.
- Tine raskt et hetteglass med FL Q23-HTT-prøve i et vannbad i romtemperatur ved hjelp av en flottør. Hold det tinte proteinet på is før bruk.
- Bland 5 μg FL Q23-HTT (~ 1 mg / ml), 1 μL 0,5% G250 additiv, 2,5 μL 4x Blue Native PAGE prøvebuffer og vann for å bringe det endelige volumet til 10 μL.
- Legg i den blandede FL Q23-HTT-prøven på en 3-12% prefabrikkert Bis-Tris gel. Legg inn 7,5 μL av den ufargede proteinstandarden i samme gel som standarden.
- Fyll fronten av tanken med mørk blå katodebuffer og baksiden av tanken med anodebuffer.
MERK: Fyll bufferne etter at prøven er lastet inn for å tillate enkel visualisering når du laster inn prøvene. - Kjør gelen på 150 V i 120 minutter i et kaldt rom.
- Destain gelen med Destaining Solution (tabell 1) til bånd er observert; Overfør gelen til vann. Visualiser og dokumenter gelen på en bildestasjon.
MERK: Blue Native PAGE ble opprinnelig designet for å analysere membranproteiner. Det ble tilpasset i dette laboratoriet som en alternativ metode for å estimere HTTs monomere innhold. Det binder seg til de hydrofobe områdene i HTT og forhindrer det i å danne aggregater under bufferforhold som mangler vaskemiddel. Tradisjonell innfødt SIDE uten å bruke Coomassie blå G250 fører til at HTT danner løselige oligomerer og aggregater, sannsynligvis på grunn av de mange hydrofobe lommene som finnes i HTT.
9. SDS-SIDE etterfulgt av Coomassie eller sølvfarging for å analysere HTT-renhet
- Tilsett 4x LDS prøvebuffer og 10x reduksjonsreagens til renset FL Q23-HTT for å gjøre den endelige konsentrasjonen av lastbuffer og reduksjonsreagens til 1x.
- Varm prøven på en tørr varmeblokk ved 70 °C i 10 minutter.
- Legg maksimalt 1 μg protein per brønn på en 3-8% Tris-acetatgel og kjør ved 150 V i 1 time ved hjelp av Tris-acetat SDS løpende buffer.
MERK: Proteiner brukt i denne studien er også tilgjengelige direkte fra HS Community Repository ved Coriell Institute (www.coriell.org/1/CHDI); se materialtabellen. - Coomassie flekk
- Vask gelen med H2O i 5 minutter.
- Fest gelen i Coomassie-fargeløsningen (tabell 1) ved å vugge gelen i 30 ml fargeløsning i 15 minutter.
- Avbeis ved å vugge gelen i 50 ml H2O i 5 min. Gjenta to ganger. Visualiser og dokumenter Coomassie-farget gel på en bildestasjon.
- Sølvbeis ved hjelp av et kommersielt sølvflekksett.
- Etter SDS-PAGE, fest gelen ved hjelp av festeløsning (tabell 1) i 1 time til over natten ved romtemperatur.
- Utfør flekken, vask og utvikle i henhold til settets instruksjoner.
- Stopp utviklingstrinnet umiddelbart når båndene når ønsket intensitet.
- Dokumenter gelen i et geldokumentasjonssystem utstyrt med en synlig lyskilde.
MERK: HTT renset ved >95% kan oppdages av Coomassie og sølvfarging med denne protokollen. Se en tidligere publisert protokoll32 for detaljer om hvordan man utfører kvantitativ proteinanalyse.
Representative Results
En forbigående ekspresjonsvektor (pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-FLAG, figur 1A) er konstruert for rask produksjon i pattedyrceller av FL Q23-HTT (aa 1-3,144, basert på Q23-nummerering). Denne konstruksjonen har funksjonene designet for raskt å generere forskjellige HTT-mutasjonskonstruksjoner ved kassettkloning, lette rensing av HTT-protein til høy kvalitet og homogenitet med minimale kromatografiske trinn, og har muligheten til å produsere umerket FL HTT. Listen over funksjonene inkluderer 1. HindIII restriksjonsfordøyelsessteder, rundt CAG-repetisjonen i HTT ekson 1, kan brukes til å generere FL HTT-mutanter med en polyQ-strekning av forskjellige lengder ved begrensning av enzymfordøyelse og ligering; 2. C-terminalenden av FL HTT er merket med en FLAG-epitop med et TEV-proteasegjenkjenningssted for ett-trinns affinitetsrensing av FL HTT med høy renhet og valgfri generering av tagfritt FL HTT-protein ved bruk av TEV-proteasespaltning; 3. Kodonoptimalisert FL HTT-sekvens for bruk av humant cellekodon for uttrykk på høyt nivå i HEK293-celler. PCDNA 3.1 (+) vektoren brukes som ryggraden i konstruksjonen for å dra nytte av den høye transkripsjonelle aktiveringsaktiviteten til CMV-promotoren i pattedyrcellelinjer.
Ved å bruke pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-FLAG som startmal, ble Q48- og Q73 FL HTT-konstruksjonene produsert ved å syntetisere DNA-fragmenter med riktig Q-lengde som spenner over to HindIII-restriksjonsenzymsteder og bytte samme region i malen. ΔExon1-mutanten til FL HTT (aa 91-3,144) (figur 1B) ble produsert ved hjelp av primere rettet mot slettede rester som spenner over ekson 1-regionen i malen. HEK293-celler transfisert med pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-FLAG ved bruk av PEI ble dyrket i 5 L shakerflasker under 5% CO2. En typisk storskala rensing bruker en 2-10 L cellepellet som inneholder 6,0 × 10 9-3,0 ×10 10 celler. Før man gikk videre til rensing, ble HTT-ekspresjonsnivået fra hver transfeksjon estimert ved kvantitativ vestlig blotting ved bruk av renset rekombinant FLAG-merket HTT som standard og anti-FLAG antistoff som det første antistoffet. Pellets med estimert HTT-ekspresjonsnivå ved ≥2 pg HTT/celle ble brukt til rensing.
Rensing av FL HTT består av en 2-trinns kolonneprosess, først med anti-FLAG affinitetsrensing og deretter med SEC på en gelfiltreringskolonne med et egnet separasjonsområde for HTT (figur 2A; se materialtabell for eksempler). Etter begge trinnene ble HTT oppnådd ved >95% prøverenhet, som bestemt av SDS-PAGE med Coomassie blå og >65% monomerinnhold basert på analytisk SEC-MALS. Fordi både forlenget rensetid og temperatur har en negativ innvirkning på det endelige HTT-monomerinnholdet, ble FPLC brukt i begge rensetrinnene for å minimere håndtering og oppnå konsistent prøvekvalitet. Den største forurensningen under anti-FLAG-rensingen var chaperone Hsp70 som bestemt av massespektrometri (figur 2B, bane 2). Dette er i samsvar med funnet at Hsp70 er samrenset med FL HTT stabilt uttrykt i humane cellelinjer24, noe som tyder på at Hsp70 kan være en vanlig stabilisator for FL HTT in vivo.
Hsp70-forurensning kan elimineres ved omfattende vask med magnesiumklorid og ATP under anti-FLAG affinitetsrensingstrinnet (figur 2B, bane 1). Ved fjerning av Hsp70 er FL HTT tilbøyelig til å danne høyere bestilte oligomerer24 og må opprettholdes ved en konsentrasjon ≤ 1 mg / ml. Konsentrasjonstrinnet før SEC kan ofte resultere i betydelig aggregering. Derfor er den beste fremgangsmåten å laste inn toppfraksjoner direkte fra anti-FLAG-rensing på størrelsesekskluderingskolonnen uten å konsentrere seg. Etter SEC ble prøven konsentrert til ≤1 mg/ml for maksimal gjenvinning av monomer FL HTT. Mengden HTT gjenvunnet fra hvert rensetrinn ble estimert av enten Coomassie blue eller quantitative western blotting ved bruk av renset FL HTT som kvantifiseringsstandard (tabell 2). Det typiske utbyttet av rensede FL HTT-proteiner produsert ved den beskrevne metoden er ca. 1 mg / L cellekultur, men kan falle godt under det (tabell 3) på grunn av batch-til-batch-variabilitet, eller hvis anti-FLAG-renseharpiksen gjenbrukes flere ganger.
Overekspresjon av FL HTT kan resultere i fragmentering av proteinet22. FL Q23-HTT produsert ved metoden beskrevet her løst som et enkelt bånd med riktig MW på 350 kDa av SDS PAGE, farget enten av Coomassie G250 eller ved sølvfarging (figur 2C). Ved western blotting reagerte FL Q23-HTT med antistoffer hevet mot epitoper ved N-terminalen, C-terminalen og flere mellomdomener, uten ytterligere fragmentrelaterte bånd observert, noe som indikerer at proteinet ble isolert uten signifikante påvisbare trunkeringer (figur 3A). FL HTT polyQ-lengdevariantene Q23, Q48 og Q73 reagerte som forventet i western blot, og viste et gradvis sterkere signal for polyQ-rettet mAb MW1 korrelert med økende Q-lengde: Q23-HTT < Q48-HTT < Q73-HTT (figur 3B). Det ble ikke observert noe signal for ΔExon1-HTT (aa 91-3,144) ved undersøkelse med antistoffene MW1 og MAB549, som retter seg mot N-terminalekson 1 (figur 3B).
SEC-MALS ble brukt til å analysere aggregeringstilstanden og molekylmassen til det rensede HTT-proteinet. Prøver ble analysert av analytisk SEC overvåket av UV-, MALS- og dRI-detektorer. Den absolutte molare massen oppnådd fra SEC-MALS er ikke avhengig av formen på molekyler33,34; Derfor gir SEC-MALS en objektiv estimering av MW for monomere og oligomere fraksjoner når de er godt separert. Blant HPLC-kolonnene som ble testet, viste SEC-kolonnen (se materialtabellen) tilstrekkelig oppløsning mellom HTT-monomeren og dimeren slik at molare masser kunne skilles (figur 4). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved påvisning av dRI. Brytningsindeksøkninger (dn/dc) for FL HTT er 0,1853 ml/g som beregnet av SEDFIT-programvaren35. Lignende analytiske SEC-elueringsmønstre ble observert for ΔExon1 HTT (91-3,144), FL Q23, Q48 og Q73 HTT (1-3,144), hver bestående av en stor monomertopp med mindre dimeriske og oligomere topper (tabell 4). Den beregnede MW for den monomere formen er større enn den teoretiske MW. Dette skyldes sannsynligvis overlappende arter fra høyere ordnede oligomere topper og feil som følge av svake dRI-signaler, da HTT-proteiner opprettholdes i lav konsentrasjon for å unngå å danne høyere bestilte oligomerer. Ved å integrere UV-toppene i flere partier med rensede FL HTT-varianter, ble det ikke observert noen klar korrelasjon mellom polyQ-lengde og aggregatprofil (tabell 4).
I tillegg til analytisk SEC ble tradisjonell native PAGE utført for å avgjøre om den kan brukes som en komplementær metode for å karakterisere FL HTT oligomer tilstand. Høyere bestilte oligomerer ble løst gjennom 3-8% Tris-acetatgeler ved bruk av innfødt buffer uten vaskemiddel. Renset FL HTT fra SEC viste flere bånd tilsvarende oligomeriseringstilstandene (figur 5A). Det laveste båndet var lokalisert mellom innfødt markør 480 kDa og 720 kDa, i likhet med tidligere resultater rapportert for FL HTT renset fra insektceller22. HTT-monomeren var imidlertid ikke det mest tallrike båndet ved bruk av tradisjonell innfødt PAGE, og resultatene korrelerer ikke med den samlede profilen bestemt av analytisk SEC-MALS. Flere hydrofobe flekker tilstede i FL HTT36,37,38, spesielt det hydrofobe grensesnittet mellom HAP40 og FL HTT25, vil sannsynligvis bidra til dannelsen av høyere bestilte oligomerer under migrasjon i gelen. Dette skyldes at hydrofobe regioner er kjent for å interagere med hverandre i fravær av vaskemiddel eller stabiliserende protein-protein-interaksjoner. I samsvar med de hydrofobe egenskapene til HTT, DANNER FL HTT økende mengder høyere bestilte oligomere fraksjoner i fravær av CHAPS under SEC-rensetrinnet.
Blue Native PAGE, som er mye brukt til å undersøke membranproteiner og store proteinkomplekser som inneholder hydrofobe flekker39, ble sammenlignet med tradisjonell innfødt PAGE. Renset HTT viste tre store bånd på Blue Native PAGE med estimert MW på henholdsvis 643, 927 og 1070 kDa (figur 5B) som sannsynligvis representerer de monomere, dimeriske og trimeriske artene av HTT. Monomerbandet forble det mest tallrike bandet i Blue Native PAGE, og korresponderte godt med den analytiske SEC-profilen til de samme prøvene. Overestimeringen av MW av HTT-monomeren av Blue Native PAGE kan skyldes den unike hule sfæriske strukturen eller hydrofobe regioner av HTT som forårsaker langsommere migrasjon i forhold til tilsvarende molekylvektmarkører 11,23,25. Samlet sett har FL Q23-HTT, FL Q48-HTT, FL Q73-HTT og ΔExon1-HTT lignende Blue Native PAGE-profiler med bare små forskjeller i proteinbåndmigrasjonen på grunn av deres molekylvektforskjeller.
Som en ekstra kontroll av kvaliteten på de rensede proteinene, kan C-terminal FLAG-taggen fjernes fra FL HTT ved behandling med TEV-protease. Etter proteolytisk spaltning ble prøver analysert av western blot ved hjelp av fire antistoffer for å bekrefte fjerning av FLAG-tag og oppdage HTT-nedbrytning. Immunreaktivitet mot anti-FLAG M2 og tre huntingtin-spesifikke antistoffer med epitoper mot N-terminalen, mellomdomener og C-endestasjon for HTT viste vellykket fjerning av FLAG-tag og ingen HTT-spesifikke nedbrytningsprodukter (supplerende figur S1).
Figur 1: Konstruer for HTT-uttrykk i full lengde. (A) Full lengde Q23 HTT ble kodonoptimalisert og klonet til pcDNA3.1 (+) plasmid. 3'-enden av HTT ble merket med Flag-epitop og TEV-proteasespaltningssted for å produsere tagfritt HTT-protein. Polyglutaminstrekningen og det prolinrike domenet ble konstruert med flankerte HindIII-restriksjonsendonukleasesteder for å sette inn ytterligere CAG-repetisjoner ved hjelp av kassettkloning, dvs. Q48 og Q73, for å produsere HTT-varianter med forskjellige polyQ-lengder . (B) ΔExon1 konstruere ble laget PCR mutagenese ved hjelp av pcDNA3.1-Q23-HTT som mal. Rester 91-3,144 av HTT forble i ΔExon1-konstruksjonen for uttrykk. Forkortelser: HTT = huntingtin; CMV = cytomegalovirus; Q23 = polyglutamin strekk; PRD = prolinrikt domene; TEV = tobakk etse virus spaltningssted. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Storskala rensing av HTT. (A) SEC-profil av anti-flaggrenset Q23-HTT i full lengde på en FPLC-kolonne. Høyt bestilte oligomerer, dimer og monomer topper av Q23-HTT er merket. Fraksjoner som inneholdt monomer ble samlet inn som den endelige HTT-prøven. (B) SDS-PAGE av renset Q23-HTT med ATP / magnesium vasketrinn (bane 1) eller uten ATP / magnesium vask resulterer i Hsp70 co-eluering (lane 2). (C) Endelig renset HTT-varianter i full lengde på SDS-PAGE farget med Coomassie blå G-250 eller sølvflekk. Forkortelser: FL = full lengde; HTT = huntingtin; SEC = størrelse eksklusjon kromatografi; FPLC = rask proteinvæskekromatografi; O = oligomer; D = dimer; M = monomer; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfat polyakrylamidgelelektroforese; Hsp70 = varmesjokkprotein 70. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Western blot-analyse av rensede HTT-varianter. (A) Renset FL Q23-HTT ble kjørt på SDS-PAGE og overført til PVDF-membran. De primære antistoffene og samvirkende epitoper er Lane 1, α-FLAG M2, FLAG tag; Kjørefelt 2, MAB5492, HTT aa. 1-82; Kjørefelt 3, MAB5490, HTT aa 115-129; Lane 4, MAB2166, HTT aa 181-810; Lane 5, MAB3E10, HTT aa 1,171-1,177; Lane 6, MAB4E10, HTT aa 1,844-2,131; Lane 7, MAB2168, HTT aa 2,146-2,541; Lane 8, MAB8A4, HTT aa 2,703-2,911. (B) 1 μg rensede FL HTT-varianter ble kjørt på SDS-PAGE og overført til PVDF (venstre), og en duplikat SDS-gel ble kjørt og farget med Coomassie Blue (høyre). De primære antistoffene og interagerende epitoper er rad 1, MW1, utvidede PolyQ-repetisjoner; Rad 2, MAB2166, HTT aa 181-810; Rad 3, MAB5492, HTT aa 1-82. Forkortelser: FLL Q23-HTT = huntingtinprotein i full lengde som inneholder 23 glutaminrester; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfat polyakrylamidgelelektroforese; WB = vestlig blot; M = markør; PVDF = polyvinylidenfluorid. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: SEC-MALS analyse av full lengde HTT. Renset full lengde Q23-HTT ble eluert på en UPLC-kolonne. Topposisjoner for predikert monomer, dimer og oligomer er indikert. Molekylvekter ble beregnet for monomer-, dimer- og trimertopper og listet opp i tabell 5. Lignende elueringsprofiler observeres for Q48, Q73 og ΔExon1 HTT, med variabelt monomer-, dimer- og oligomerinnhold i hver rensing. Forkortelser: SEC-MALS = Størrelsesekskluderingskromatografi med flervinklet lysspredning; UV = Ultrafiolett; LS = Lysspredning; MW = molekylvekt; Q23-HTT = huntingtinprotein som inneholder 23 glutaminrester; M = monomer; D = dimer; O = oligomer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Karakterisering av renset HTT ved bruk av clear Native PAGE eller Blue Native PAGE gel. Native og tilsynelatende monomer Q23-HTT fra SEC ble løst på 3-8% Tris-acetate gels i et ikke-denaturerende PAGE-system (A) og et Blue Native PAGE-system (B). Forkortelser: FL = full lengde; Q23-HTT = huntingtinprotein som inneholder 23 glutaminrester; PAGE = polyakrylamidgelelektroforese; M = markør. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Skritt | Navn | Komposisjon | ||
| 6.1.1 | Buffer A | 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 5 % v/v glyserol, 5 mM EDTA, 0,01 % v/v Tween-20, pH 8,0. | ||
| 6.1.2 | Lysis Buffer | 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 5 % v/v glyserol, 5 mM EDTA og 1x proteasehemmer cocktail | ||
| 6.1.4.2 | Buffer A | 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 5 % v/v glyserol, 5 mM EDTA, 0,01 % v/v Tween-20, pH 8,0. | ||
| 6.1.4.3 | Buffer B | 50 mM Tris; 500 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5% v / v glyserol; 0,01 % v/v Tween-20, pH 8,0 | ||
| 6.1.4.4 | Buffer C | 20 mM Tris; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM ATP; 0,01 % v/v Tween-20; 5 % v/v glyserol, pH 8,0 | ||
| 6.1.4.5 | Buffer D | 50 mM Tris; 500 mM NaCl; 5% v / v glyserol; 5 mM EDTA; 0,5 % w/v CHAPS, pH 8,0 | ||
| 6.1.4.6 | Elueringsbuffer | 50 mM Tris; 500 mM NaCl; 5% v / v glyserol; 0,5 % m/v CHAPS; 0,2 mg/ml DYKDDDDK peptid, pH 8,0 | ||
| 6.1.6 | Regenerering Buffer | 0,1 M glycin HCl, pH 3,5; 0,01 % v/v Tween-20 | ||
| 6.2.1 | SEC-buffer | 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 5 % v/v glyserol, 0,5 % w/v CHAPS, 1 mM TCEP | ||
| 7.3 | SEC-MALS-buffer | 50 mM HEPES, pH 7,2, 500 mM NaCl, 5 % v/v glyserol, 0,5 % w/v CHAPS | ||
| 8.7 | Destaining Løsning | 40 % v/v metanol og 7 % v/v eddiksyre | ||
| 9.4.2 | Coomassie Fargelegging Løsning | 0,01 % w/v Coomassie G250, 50 % v/v/metanol, 10 % v/v eddiksyre | ||
| 9.5.1 | Fikse løsning | 50 % v/v metanol, 10 % v/v eddiksyre, 50 mikroliter formaldehyd/100 ml oppløsning | ||
Tabell 1: Sammensetning av buffere og løsninger
| Trinn | HTT-konsentrasjon (mg/ml) | Totalt volum (ml) | HTT-innhold (mg) | HTT-utbytte per celle (pg/celle) | % utbytte |
| Supernatant | 0.1792 | 220 | 39.4 | 4.4 | 100 |
| Anti-flagg | 1.524 | 8.6 | 13.1 | 1.47 | 33.4 |
| SEK | 0.91 | 3.9 | 3.54 | 0.4 | 9.1 |
Tabell 2: HTT-utbytte fra en 2-liters HEK293-pellet transfisert med pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-Flag. Forkortelser: FL Q23-HTT = huntingtinprotein i full lengde som inneholder 23 glutaminrester; TEV = tobakk etse virus spaltningssted; SEC = størrelse eksklusjon kromatografi.
| HTT-prøve | HTT-utbytte (mg/l) | Gj.sn. renhet (%) | ||
| BCA | En280 | |||
| 1 | FL DEx1-HTT (N=3) | 0.67-1.30 | 0.69-1.18 | 99.3 |
| 2 | FL Q23-HTT (N=3) | 0.25-0.92 | 0.28-0.98 | 96.9 |
| 3 | FL Q48-HTT (N=3) | 0.28-1.15 | 0.38-1.16 | 97.4 |
| 4 | FL Q73-HTT (N=3) | 0.58-1.05 | 0.57-0.97 | 98.8 |
Tabell 3: Sammendrag av proteinutbyttet av fire FL HTT-variantrensinger og deres endelige renhet. Forkortelse: FLL HTT = huntingtinprotein i full lengde.
| HTT-prøve | En | D | M |
| FL Q23-HTT | 4.2-6.9% | 18.7-29.3% | 66.5-76.0% |
| FL Q48-HTT | 4.0-9.4% | 10.6-17.8% | 73.6-85.4% |
| FL Q73-HTT | 2.0-14.0% | 16.9-24.6% | 65.1-81.1% |
Tabell 4: Sammendrag av det representative aggregat-, dimer- og monomerinnholdet i FL HTT-varianter fra rensingen. Forkortelser: FL HTT = huntingtinprotein i full lengde; A = samlet; D = dimer; M = monomer; SEC = størrelse eksklusjon kromatografi.
Supplerende figur S1: Western blot-analyse etter TEV-proteasefordøyelse. Renset FL Q23-HTT og FL Q48-HTT ble kjørt på SDS-PAGE, overført til PVDF membraner, og analysert ved western blotting etter TEV digest. Primære antistoffer som ble brukt var anti-Flag M2 (Flag tag), MAB5492 (HTT aa 1-82), MAB3E10 (HTT aa 997-1,276) og MAB2168 (HTT aa 2,146-2,541). Lane 1, Protein Standard; Kjørefelt 2, Q23-HTT-TEV-flagg; Lane 3, Q48-HTT-TEV-flagg; Lane 4, Q23-HTT-TEV-Flag behandlet med TEV protease ved 1:5, over natten ved 4 °C; Lane 5, Q48-HTT-TEV-Flag behandlet med TEV protease ved 1:5, over natten ved 4 °C. Forkortelser: FL HTT = huntingtinprotein i full lengde; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfat polyakrylamidgelelektroforese; TEV = tobakk etch virus; PVDF = polyvinylidenfluorid. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S2: SEC-MALS-analyse av FL HTT-varianter utsatt for fryse-tine-sykluser. Renset Q23-HTT (A) og Q48-HTT (B) ble frosset ved -80 °C og tint ved romtemperatur i opptil 6 ganger. Q23-HTT og Q48-HTT etter den første fryse-tiningen og den sjette fryse-tine-syklusen ble deretter analysert av SEC-MALS. En liten reduksjon i monomerfraksjonen og økning i dimer- og høyordens oligomerfraksjoner ble observert ved lysspredning etter gjentatte fryse-tine-sykluser. Toppposisjoner av predikert monomer, dimer og høyordens oligomer er indikert. Forkortelser: FL HTT = huntingtinprotein i full lengde; O = oligomer; D = dimer; M = monomer; SEC-MALS = Størrelsesekskluderingskromatografi med flervinklet lysspredning. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S3: SDS-SIDE av FL HTT-varianter utsatt for fryse-tine-sykluser. Renset Q23-HTT (baner 2-7) og Q48-HTT (baner 9-14) ble frosset ved -80 °C og tint ved romtemperatur i opptil 6 ganger. Aliquots av Q23-HTT og Q48-HTT ble lagret etter hver fryse-tine syklus og deretter analysert av SDS PAGE. Det ble ikke observert noen økning i aggregat- eller nedbrytningsprodukter. prøvene ble ansett som stabile og >95% rene ved bånddensitometri. Forkortelser: FL HTT = huntingtinprotein i full lengde; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfat polyakrylamidgelelektroforese. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 1: FPLC 15 ml anti-FLAG HTT-skript. Forkortelser = FPLC = rask proteinvæskekromatografi; HTT = huntingtin protein. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: FPLC SEC_MALS HTT-skript. Forkortelser: SEC-MALS = Størrelsesekskluderingskromatografi med flervinklet lysspredning; FPLC = rask proteinvæskekromatografi; HTT = huntingtin protein. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Vi beskriver her en forbigående transfeksjons-, ekspresjons- og rensemetode for å generere flere FL HTT-proteinkonstruksjoner med egnet renhet og homogenitet for bruk som standarder for immunoassay- og MS-analyseutvikling, kontroller for western blot-analyse og for strukturfunksjonsstudier. Denne forbigående uttrykksmetoden er skalerbar og allsidig og gjør det mulig for brukeren å generere lave milligrammengder av FL HTT-varianter mer effektivt enn å bruke stabile cellelinjer eller virusbaserte metoder beskrevet tidligere21,22,23,24. Rutinemessig kan 2-5 mg høyt renset FL HTT genereres fra en 2 L skala proteinproduksjonskjøring på mindre enn en uke ved bruk av forbigående ekspresjonsmetode når plasmidet er konstruert, med et typisk utbytte på 1-2,5 mg FL HTT per liter cellekultur.
Den forbigående ekspresjonsmetoden som er beskrevet her, overvinner mange hindringer i stabilt cellelinjeuttrykk, for eksempel den lange tiden som trengs for å etablere cellelinjer og vanskeligheter med lagring og vedlikehold av stabile cellelinjer. PEI er også relativt billig sammenlignet med andre transfeksjonsreagenser i markedet, noe som gjør storskala transfeksjon økonomisk levedyktig. Det er også begrensninger i protokollen: transfeksjonseffektivitet avhenger i stor grad av kvaliteten på plasmidene, optimal cellevekst og hvor godt PEI lagres og fremstilles. Operatører må være spesielt forsiktige og utføre kvalitetskontroller i de kritiske trinnene for å unngå et drastisk fall i proteinutbyttet. Anti-FLAG harpiks brukt i protokollen er også relativt dyrt og viser redusert fangst av FL HTT etter flere rensinger og regenereringer. Noen forskere kan finne det mer praktisk å bytte til en annen tag for å tillate mer robust regenerering av affinitetsharpiksen.
Ulike cellelinjer og uttrykksbetingelser ble testet for å optimalisere FL HTT-uttrykksnivåer. HEK293-celler ble valgt for ekspresjon av FL HTT på grunn av det høye uttrykket av protein og enkel håndtering i et suspensjonskulturformat, noe som gjør metoden egnet for storskala uttrykk i enten shakere eller bioreaktorer. Et høyere FL HTT-proteinuttrykksnivå kan oppnås ved lavere dyrkingstemperaturer som 32 ° C i stedet for å bruke den vanlige temperaturen på 37 ° C. Det er mulig at den lavere temperaturen kan bremse proteinsyntesen og fremme riktig folding av FL HTT40. Dette fenomenet er imidlertid ikke spesifikt for FL HTT eller de testede cellelinjene. Den reduserte posttransfeksjonstemperaturen har blitt mye brukt i farmasøytisk proteinuttrykk i CHO-celler. Selv om mekanismen ikke er fullt ut forstått, antas det at lave temperaturer arresterer cellesyklusen i G1-fasen og avleder cellulær energi til proteinproduksjon41.
Full-lengde HTT renset fra pattedyrceller co-elutes med chaperone Hsp7024, og Mg-ATP vasketrinn kan fjerne Hsp70-proteinet. Interessant nok observeres ikke co-eluted Hsp70 i FL HTT renset fra et insektcelleuttrykkssystem21,22,23. Dette kan gjenspeile en forskjell i PTM av FL HTT eller varmesjokkproteinresponser på overekspresjon av FL HTT i pattedyr- og insektceller. Når det rekombinante proteinet har blitt strippet for Hsp70, kreves ikke-ioniske vaskemidler som CHAPS eller DDM for å stabilisere den monomere formen av FL HTT.
Oligomeriseringstilstandene til FL HTT-varianter ble analysert ved hjelp av Blue Native PAGE og SEC-MALS. En liten brøkdel av dimerisk og høyere ordens oligomer HTT var tilstede når den ble analysert av enten Blue Native PAGE eller SEC-MALS. Merk at høyere bestilte oligomerer dannet av FL HTT ikke ser ut til å korrelere med polyQ-lengde, og selv Exon1-delesjonsmutanten viser et lignende oligomer-dimer-monomerforhold. De faktiske variasjonene i oligomerinnhold mellom disse konstruksjonene skyldes sannsynligvis mindre forskjeller i produksjon og håndtering av hvert parti. I motsetning til aggregater og fibriller dannet av HTT Exon140,41, forble de høyere bestilte oligomerene til FL HTT løselige og kunne analyseres av SEC og Native PAGE.
Renset monomer FL HTT er bare relativt stabil. Langvarig lagring ved 4 °C, korte inkubasjoner ved romtemperatur eller konsentrasjoner > 1 mg/ml vil alle konvertere monomere FL HTT til dimeriske og høyere bestilte oligomere former, selv om det ikke er observert synlig nedbør under disse forholdene. Renset monomer FL HTT opprettholdt ved ≤1 mg/ml forble relativt stabil ved -80 °C i lagringsbuffer (50 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, 5 % v/v glyserol, 0,5 % w/v CHAPS og 5 mM DTT) som tidligere beskrevet24. Opptil 6 fryse-tine sykluser av FL HTT fremstilt og lagret på denne måten forårsaket ikke synlig utfelling av proteinet, selv om et lite skifte til en høyere oligomer tilstand ble observert av SEC-MALS (supplerende figur S2). Prøver ble også analysert av SDS PAGE etter gjentatte fryse-tine sykluser. Ingen synlige bunnfall ble observert; ingen aggregater eller ytterligere nedbrytningsprodukter ble sett av SDS-PAGE (supplerende figur S3). Den langsiktige stabiliteten til renset FL HTT er fortsatt under utredning. I mangel av avgjørende langtidsdata anbefaler vi at du oppbevarer renset FL HTT ved -80 °C i maksimalt 6 måneder.
Rekombinante FL HTT-proteinvarianter av høy kvalitet og metodene for å produsere dem er etterspurt av HS-forskningsmiljøet. Disse proteinene er i bruk som immunoassay og MS analytiske standarder, i strukturelle studier, og for utvikling av nye FL HTT-spesifikke analyser. De store transientuttrykksmetodene som er beskrevet her, har konsekvent produsert milligrammengder av FL HTT-varianter med >95% renhet, noe som gir viktige verktøy for HTT-studier. Produksjon av titalls milligram høyt rensede FL HTT polyQ-varianter og andre mutanter til støtte for HS-forskning har blitt rutine.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter med innholdet i denne artikkelen.
Acknowledgments
Vi takker Institutt for farmasøytiske vitenskaper, The State University of New York i Buffalo, for å utføre MS-analyse av HTT. Dette arbeidet var et samarbeid med CHDI Foundation. Vi takker spesielt Elizabeth M. Doherty; Ignacio Munoz-Sanjuan; Douglas Macdonald, CHDI-stiftelsen; og Rory Curtis, Curia, for deres uvurderlige innspill under utarbeidelsen av dette manuskriptet. Vi er også takknemlige for Michele Luche, Mithra Mahmoudi og Stephanie Fox for deres støtte til denne forskningsinnsatsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 kDa concentrator-Amicon | Millipore | UFC910096 | Protocol Section Number-6.2.4 |
| 20x blue native PAGE running buffer | Invitrogen | BN2001 | Protocol Section Number-8.1 |
| 20x TBS | Thermo Fisher | PI28358 | Protocol Section Number-5.1 |
| 4x blue native PAGE sample buffer | Invitrogen | BN2003 | Protocol Section Number-8.3 |
| 4x LDS loading buffer | Invitrogen | NP0007 | Protocol Section Number-5.3 |
| 5 L Erlenmeyer flasks | Corning | 431685 | Protocol Section Number-4.2 |
| Agarose gel extraction kit | Qiagen | 28704 | Protocol Section Number-2.2 |
| Anti-clumping agent | Thermo Fisher | 0010057AE | Protocol Section Number-4.8 |
| anti-FLAG M2 affinity gel | Sigma | A2220 | Protocol Section Number-6.1.1 |
| anti-FLAG M2 | Sigma | F3165 | Protocol Section Number-5.7 |
| Anti foam-Excell anti foam | Sigma | 59920C-1B | Protocol Section Number-4.8 |
| ATP | Sigma | A6419 | Protocol Section Number-6.1.4.4 |
| BEH 450 SEC | Waters | 186006851 | 2.5 µm x 4.6 mm x 150 mm Protocol Section Number-7.3 |
| blue native PAGE 5% G-250 sample additive | Invitrogen | BN2004 | Protocol Section Number-8.3 |
| carbenicillin | Thermo Fisher | 10177012 | Protocol Section Number-2.5 |
| centrifuge - Sorvall Lynx 6000 | Thermo Fisher | 75006590 | Protocol Section Number-6.1.3 |
| Cell Counter - ViCELL | BECKMAN COULTER | Protocol Section Number-4.3 | |
| CHAPS | Anatrace | C316S | Protocol Section Number-6.1.4.6 |
| Competent E. coli cells-TOP10 | Invitrogen | C404010 | Protocol Section Number-2.4 |
| digitonin | Sigma | D141 | Protocol Section Number-5.1 |
| differential refractive index detector | Wyatt | Protocol Section Number-7.1 | |
| DYKDDDDK peptide | Genscript | Peptide synthesis service Protocol Section Number-6.1.4.6 |
|
| EDTA | Sigma | EDS | Protocol Section Number-5.1 |
| EndoFree Plasmid Giga Kit | Qiagen | 12391 | Protocol Section Number-3.3 |
| Endotoxin free water | Cytiva | SH30529.03 | Protocol Section Number-4.1 |
| endotoxin quantification kit-CRL Endosafe Nexgen-PTS detection system | Charles River | PTS150K | Protocol Section Number-3.4 |
| fixed angle rotor A23-6x100 rotor | Thermo Fisher | 75003006 | Protocol Section Number-6.1.3 |
| FPLC software- Unicorn 6.2 | Cytiva | Protocol Section Number-6.1.4 | |
| Gene synthesis | Genscript | Gene synthesis service Protocol Section Number-1.2 |
|
| Glycerol | Fisher Scientific Glycerol (Certified ACS) | G33-4 | Protocol Section Number-5.6 |
| Growth Medium-Expi293 expression medium | Thermo Fisher | A1435102 | Protocol Section Number-4.2 |
| HEK293 cells | Thermo Fisher | R79007 | Protocol Section Number-4 |
| high shear homogenizer-Microfluidizer | MicroFluidics | LM10 | Protocol Section Number-6.1.3 |
| HPLC - 1260 infinity II Bio-Insert HPLC | Agilent | Protocol Section Number-7.1 | |
| Image Studio | LiCor | Image analysis software Protocol Section Number-5.1 |
|
| MAB2166 | Sigma | MAB2166 | Protocol Section Number-5.7 |
| MAB2168 | EMD | MAB2168 | Protocol Section Number-5.7 |
| MAB3E10 | Santa Cruz | SC-47757 | Protocol Section Number-5.7 |
| MAB4E10 | Santa Cruz | SC-7757 | Protocol Section Number-5.7 |
| MAB5490 | Sigma | MAB5490 | Protocol Section Number-5.7 |
| MAB5492 | Sigma | MAB5492 | Protocol Section Number-5.7 |
| MAB8A4 | Santa Cruz | SC-47759 | Protocol Section Number-5.7 |
| multi-angle light scattering detector | Wyatt | Protocol Section Number-7.1 | |
| NativeMark Unstained Protein Standard | Invitrogen | LC0725 | Protocol Section Number-8.4 |
| NaCl | Sigma | S9888 | Protocol Section Number-5.6 |
| NheI | New England Biolab | R0131S | Hi-Fi version available Protocol Section Number-2.2 |
| NuPAGE 3–8% Tris acetate gels | Invitrogen | EA0375PK2 | Protocol Section Number-5.4 |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running buffer | Invitrogen | LA0041 | Protocol Section Number-5.4 |
| PEI 25K | Polysciences | 23966-1 | Protocol Section Number-4.1 |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15070063 | Protocol Section Number-4.2 |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Cytiva | SH30256.02 | Protocol Section Number-4.5 |
| plasmid miniprep kit | Qiagen | 27104 | Protocol Section Number-2.6 |
| PmeI | New England Biolab | R0560S | Protocol Section Number-2.2 |
| precast Bis-tris gel- 3-12% NativePAGE Novex Bis-Tris Gel | Invitrogen | BN1003BOX | Protocol Section Number-8.4 |
| protease inhibitor cocktail | GoldBio | GB-331-1 | Protocol Section Number-5.1 |
| SEC-MALS analysis software - Astra 7 | Wyatt Technology | Protocol Section Number-7.6 | |
| secondary antibody -IRdye 800 CW goat anti-mouse IgG | LiCor | 926-32210 | Protocol Section Number-5.9 |
| Superose 6 pg XK 16/70 | Cytiva | 90100042 | Protocol Section Number-6.2 |
| Tris base | Fisher | BP152 | Protocol Section Number-5.6 |
| Tween-20 | Thermo Fisher | AAJ20605AP | Protocol Section Number-6.1.1 |
| UV spectrometer - Nanodrop 8000 | Thermo Fisher | ND-8000-GL | Protocol Section Number-2.2 |
| XK26/100 | Cytiva | 28988951 | Protocol Section Number-6.1.1 |
References
- Walker, F. O.
- McColgan, P., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: a clinical review. European Journal of Neurology. 25 (1), 24-34 (2018).
- Duyao, M., et al. Trinucleotide repeat length instability and age of onset in Huntington's disease. Nature Genetics. 4 (4), 387-392 (1993).
- MacDonald, M. E., et al. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
- Nasir, J., et al. Targeted disruption of the Huntington's disease gene results in embryonic lethality and behavioral and morphological changes in heterozygotes. Cell. 81 (5), 811-823 (1995).
- Dragatsis, I., Levine, M. S., Zeitlin, S. Inactivation of Hdh in the brain and testis results in progressive neurodegeneration and sterility in mice. Nature Genetics. 26 (3), 300-306 (2000).
- Anne, S. L., Saudou, F., Humbert, S. Phosphorylation of huntingtin by cyclin-dependent kinase 5 is induced by DNA damage and regulates wild-type and mutant huntingtin toxicity in neurons. Journal of Neuroscience. 27 (27), 7318-7328 (2007).
- Dietrich, P., Johnson, I. M., Alli, S., Dragatsis, I. Elimination of huntingtin in the adult mouse leads to progressive behavioral deficits, bilateral thalamic calcification, and altered brain iron homeostasis. PLoS Genetics. 13 (7), 1006846 (2017).
- Dragatsis, I., et al. Effect of early embryonic deletion of huntingtin from pyramidal neurons on the development and long-term survival of neurons in cerebral cortex and striatum. Neurobiology of Disease. 111, 102-117 (2018).
- Benn, C. L., et al. Huntingtin modulates transcription, occupies gene promoters in vivo, and binds directly to DNA in a polyglutamine-dependent manner. Journal of Neuroscience. 28 (42), 10720-10733 (2008).
- Saudou, F., Humbert, S.
- Davies, S. W., et al. Formation of neuronal intranuclear inclusions underlies the neurological dysfunction in mice transgenic for the HD mutation. Cell. 90 (3), 537-548 (1997).
- DiFiglia, M., et al. Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science. 277 (5334), 1990-1993 (1997).
- Gutekunst, C. A., et al. Nuclear and neuropil aggregates in Huntington's disease: Relationship to neuropathology. Journal of Neuroscience. 19 (7), 2522-2534 (1999).
- Hodgson, J. G., et al. A YAC mouse model for Huntington's disease with full-length mutant huntingtin, cytoplasmic toxicity, and selective striatal neurodegeneration. Neuron. 23 (1), 181-192 (1999).
- Hoffner, G., Djian, P. Polyglutamine aggregation in Huntington disease: does structure determine toxicity. Molecular Neurobiology. 52 (3), 1297-1314 (2015).
- Waldvogel, H. J., Kim, E. H., Tippett, L. J., Vonsattel, J. P. G., Faull, R. L. M.
- Kim, M. Beta conformation of polyglutamine track revealed by a crystal structure of huntingtin N-terminal region with insertion of three histidine residues. Prion. 7 (3), 221-228 (2013).
- Hoop, C. L., et al. Huntingtin exon 1 fibrils feature an interdigitated β-hairpin-based polyglutamine core. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1546-1551 (2016).
- Vieweg, S., Ansaloni, A., Wang, Z. M., Warner, J. B., Lashuel, H. A. An intein-based strategy for the production of tag-free huntingtin exon 1 proteins enables new insights into the polyglutamine dependence of Httex1 aggregation and fibril formation. Journal of Biological Chemistry. 291 (23), 12074-12086 (2016).
- Seong, I. S., et al. Huntingtin facilitates polycomb repressive complex 2. Human Molecular Genetics. 19 (4), 573-583 (2009).
- Li, W., Serpell, L. C., Carter, W. J., Rubinsztein, D. C., Huntington, J. A. Expression and characterization of full-length human huntingtin, an elongated HEAT repeat protein. Journal of Biological Chemistry. 281 (23), 15916-15922 (2006).
- Vijayvargia, R., et al. Huntingtin's spherical solenoid structure enables polyglutamine tract-dependent modulation of its structure and function. eLife. 5, 11184 (2016).
- Huang, B., et al. Scalable production in human cells and biochemical characterization of full-length normal and mutant huntingtin. PLoS ONE. 10 (3), 0121055 (2015).
- Guo, Q., et al. The cryo-electron microscopy structure of huntingtin. Nature. 555 (7694), 117-120 (2018).
- Harding, R. J., et al. Design and characterization of mutant and wildtype huntingtin proteins produced from a toolkit of scalable eukaryotic expression systems. Journal of Biological Chemistry. 294 (17), 6986-7001 (2019).
- Harding, R. J., et al. HAP40 orchestrates huntingtin structure for 1 differential interaction with polyglutamine 2 expanded exon 1. bioRxiv. , (2021).
- Huang, B., et al. Pathological polyQ expansion does not alter the conformation of the Huntingtin-HAP40 complex. Structure. 29 (8), 804-809 (2021).
- Colin, E., et al. Huntingtin phosphorylation acts as a molecular switch for anterograde/retrograde transport in neurons. EMBO Journal. 27 (15), 2124-2134 (2008).
- Thompson, L. M., et al. IKK phosphorylates Huntingtin and targets it for degradation by the proteasome and lysosome. Journal of Cell Biology. 187 (7), 1083-1099 (2009).
- Ratovitski, T., et al. Post-translational modifications (PTMs), identified on endogenous Huntingtin, cluster within proteolytic domains between HEAT repeats. Journal of Proteome Research. 16 (8), 2692-2708 (2017).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of western blot data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
- Tarazona, M. P., Saiz, E. Combination of SEC/MALS experimental procedures and theoretical analysis for studying the solution properties of macromolecules. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 56 (1-3), 95-116 (2003).
- Folta-Stogniew, E. Oligomeric states of proteins determined by size-exclusion chromatography coupled with light scattering, absorbance, and refractive index detectors. Methods in Molecular Biology. 328, Clifton, N.J. 97-112 (2006).
- McMeekin, T. L., Wilensky, M., Groves, M. L. Refractive indices of proteins in relation to amino acid composition and specific volume. Biochemical and Biophysical Research Communications. 7 (2), 151-156 (1962).
- Atwal, R. S., et al. Huntingtin has a membrane association signal that can modulate huntingtin aggregation, nuclear entry and toxicity. Human Molecular Genetics. 16 (21), 2600-2615 (2007).
- Kegel-Gleason, K. B. Huntingtin interactions with membrane phospholipids: Strategic targets for therapeutic intervention. Journal of Huntington's Disease. 2 (3), 239-250 (2013).
- Michalek, M., Salnikov, E. S., Werten, S., Bechinger, B. Membrane interactions of the amphipathic amino terminus of huntingtin. Biochemistry. 52 (5), 847-858 (2013).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schägger, H.
- Nissley, D. A., O'Brien, E. P. Altered co-translational processing plays a role in huntington's pathogenesis-A hypothesis. Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 54 (2016).
- Kumar, N., Gammell, P., Clynes, M. Proliferation control strategies to improve productivity and survival during CHO based production culture: A summary of recent methods employed and the effects of proliferation control in product secreting CHO cell lines. Cytotechnology. 53 (1-3), 33-46 (2007).
