Summary
Vi leverer skalerbare protokoller, der dækker konstruktionsdesign, forbigående transfektion og ekspression og oprensning af humane huntingtinproteinvarianter i fuld længde i HEK293-celler.
Abstract
Huntingtin (FL HTT) i fuld længde er et stort (aa 1-3.144), allestedsnærværende udtrykt, polyglutamin (polyQ)-holdigt protein med en masse på ca. 350 kDa. Mens den cellulære funktion af FL HTT ikke er helt forstået, er en mutant udvidelse af polyQ-kanalen over ~ 36 gentagelser forbundet med Huntingtons Sygdom (HS), hvor polyQ-længden korrelerer omtrent med debutalderen. For bedre at forstå strukturens virkning på funktionen af mutant HTT (mHTT) kræves store mængder af proteinet. Submilligram produktion af FL HTT i pattedyrceller blev opnået ved anvendelse af doxycyclin-inducerbar stabil cellelinjeekspression. Imidlertid har proteinproduktion fra stabile cellelinjer begrænsninger, der kan overvindes med forbigående transfektionsmetoder.
Dette papir præsenterer en robust metode til produktion af lav milligram mængde af FL HTT og dets varianter fra kodonoptimerede plasmider ved forbigående transfektion ved anvendelse af polyethylenimin (PEI). Metoden er skalerbar (>10 mg) og giver konsekvent 1-2 mg/l cellekultur af højt oprenset FL HTT. I overensstemmelse med tidligere rapporter viste det sig, at FL HTT's rensede opløsningstilstand var meget dynamisk; Proteinet har en tilbøjelighed til at danne dimerer og højordens oligomerer. En nøgle til at bremse oligomerdannelsen er at arbejde hurtigt for at isolere de monomere fraktioner fra de dimere og højordens oligomere fraktioner under størrelsesekskluderingskromatografi.
Størrelsesekskluderingskromatografi med multiangle lysspredning (SEC-MALS) blev brugt til at analysere det dimer og højere ordens oligomere indhold af renset HTT. Der blev ikke observeret nogen korrelation mellem FL HTT polyQ længde (Q23, Q48 og Q73) og oligomerindhold. Den exon1-slettede konstruktion (aa 91-3.144) viste sammenlignelig oligomeriseringstilbøjelighed til FL HTT (aa 1-3.144). Produktions-, oprensnings- og karakteriseringsmetoder ved SEC/MALS-brydningsindeks (RI), natriumdodecylsulfat-polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE), western blot, Native Page og Blue Native PAGE er beskrevet heri.
Introduction
Huntingtons sygdom (HS) er en sjælden neurodegenerativ sygdom, der primært er karakteriseret ved ustabil og ufrivillig motorisk bevægelse samt kognitive og psykiatriske ændringer, såsom personlighedsændringer og apati 1,2. HS er forbundet med en udvidelse af CAG-gentagelseskanalen i exon 1 af huntingtin-genet (HTT) til mere end 35 gentagelser, med et højere antal CAG-gentagelser, der korrelerer med en tidligere sygdomsdebut 3,4. Det translationelle produkt af HTT, huntingtinproteinet (HTT), er impliceret i neuronal levedygtighed og hjerneudvikling 5,6,7,8,9.
HTT er et stilladsprotein, der rapporteres at deltage i en bred vifte af cellulære processer, vesikeltransport, celledeling, ciliogenese og autofagi10,11. Den molekylære patogenese af HS er imidlertid ikke helt klar, og identifikationen af centrale proteininteraktører, der formidler den patologiske virkning af polyQ-ekspanderet mHTT, mangler. Nogle undersøgelser tyder på en gevinst af toksisk funktion fra mHTT drevet af oligomeriseringstilbøjeligheden af det udvidede HTT-protein, da HTT-aggregater er blevet identificeret i neuroner og glia hos HS-patienter og dyremodeller af sygdommen 12,13,14,15,16,17 . For at fremme undersøgelsen af funktionen og strukturen af FL HTT- og mHTT-varianter og forsyne forskere med proteinstandarder af høj kvalitet til analyseudvikling er der behov for en robust og skalerbar forsyning af homogent rekombinant protein.
På grund af sin størrelse (aa 1-3.144, nummerering baseret på polyQ-længde Q23), proteolytisk ustabilitet og tilbøjelighed til at aggregere, har FL HTT vist sig vanskeligt at udtrykke og isolere som et opløseligt protein. Tidligere er exon 1-regionen (aa 2-90) af HTT blevet udtrykt og oprenset i stor skala ved hjælp af forskellige tags, der kan øge opløseligheden af proteinet i Escherichia coli18,19,20. FL HTT blev først udtrykt og oprenset i et insektcelleekspressionssystem ved anvendelse af baculovirus 21,22, og lavopløsnings 30 Å elektronmikroskopi (EM) strukturer af kemisk tværbundet FL Q23-HTT og Q78-HTT blev rapporteret23. Undersøgelsen af HTT-strukturen blev yderligere avanceret, da produktionen af FL Q17, Q46 og Q128-HTT med native posttranslationelle modifikationer (PTM'er) blev opnået i humane celler ved hjælp af stabile cellelinjer eller adenovirusekspressionssystemer24. Disse undersøgelser tyder på, at selvom oprenset HTT hovedsageligt findes i monomer tilstand, har den også tendens til at danne højordens oligomerer og aggregater.
Analytisk ultracentrifugering af FL Q128-HTT, med en stærkt ekspanderet polyQ-region, gav flere oligomere og aggregerede fraktioner end proteinet med den ikke-ekspanderede polyQ-region24. Ved hjælp af en stabil cellelinje er en strategi med succes blevet tilpasset til at stabilisere FL HTT ved co-ekspression med interaktionspartneren HAP40. En cryo-EM-struktur af FL HTT- og HAP40-komplekset er blevet løst ved en gennemsnitlig opløsning på 4 Å ved anvendelse af det oprensede proteinkompleks (PDB: 6EZ8)25. Denne co-ekspressionsstrategi er med succes blevet tilpasset et baculovirussystem, og en række HTT-varianter af høj kvalitet med forskellige polyQ-længder er blevet udtrykt og renset fra insektceller26. Siden da blev flere cryo-EM-strukturer af HTT-komplekset med variable polyQ-længder og HAP40 og højere opløsningsstrukturer løst og deponeret i proteindatabasen27,28 (PDB: 7DXK, 7DXH, 6X9O).
Vi optimerede en transfektions- og ekspressionsmetode i HEK293-celler ved hjælp af polyethylenimin (PEI) til hurtig forbigående ekspression af FL HTT. Som et principielt bevis blev FL HTT-varianter indeholdende 23 glutaminer (FL Q23-HTT) først oprenset og karakteriseret ved hjælp af en modifikation af en oprensningsmetode beskrevettidligere 24. Denne forbigående transfektionsmetode er praktisk, yderst effektiv og skalerbar; det kan producere oprenset HTT med udbytter på 1-2 mg / l, sammenlignelig med den stabile cellelinjemetode rapporteret24. Fordi proteinet produceres i en human cellelinje, er den producerede HTT mere tilbøjelige til at have indfødte humane PTM'er, når de udsættes for massespektrometriproteomanalyse 11,29,30,31. Der blev produceret milligrammængder af varianterne FL Q48-HTT, FL Q73-HTT og exon1-deleted (ΔExon1-HTT) af FL HTT, hvilket viser, at den forbigående ekspressionsmetode er særlig nyttig til hurtigt at producere alternative varianter af HTT uden at være afhængig af den tidskrævende indsats, der kræves for at etablere stabile cellelinjer til produktion.
Følgende protokol eksemplificerer den standardmetode, der anvendes i disse forfatteres laboratorium for cellekultur, transfektion, proteinoprensning og postpurificeringsproteinkarakterisering til fremstilling af FL Q23-HTT fra en 2 L cellekultur. Protokollen kan skaleres op til større kulturer eller tilpasses til at rense andre HTT-varianter. Op til 10 L cellekulturer af FL HTT og forskellige sted- eller afkortningsmutationer af HTT- og HTT-homologer er blevet udført med succes i laboratoriet ved hjælp af den samme protokol. Renset FL HTT indeholder en høj procentdel af monomerer sammen med dimerer og højere ordens oligomerer. Den samme aggregerede profil observeres blandt de producerede varianter (Q23, Q48, Q73 og slettet Exon1). Da aggregering kan forekomme, når der ikke udvises passende omhu, blev der udført en formulerings- og fryse-optøningsstabilitetsundersøgelse for at identificere de bedste betingelser for proteinhåndtering. Metoder, såsom Blue Native PAGE og SEC / MALS-ri, er også beskrevet for at analysere HTT-oligomerindholdet som en del af kvalitetskontrolprocessen. For at gavne HS-forskningsmiljøet er plasmider og HTT-proteiner, der er beskrevet i denne undersøgelse, også deponeret i HS-fællesskabsdepotet på Coriell Institute (www.coriell.org/1/CHDI).
Protocol
1. Design og produktion af konstruktioner til FLAG-mærket HTT-pattedyrudtryk
- Hent den humane HTT-proteinsekvens i fuld længde (P42858) fra National Center for Biotechnology Information (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
BEMÆRK: Forskere skal være bekendt med HTTs domæneorganisationer og vedligeholde HTT-kerne 3D-struktur, når de designer konstruktioner til HTT-mutanter. - Anmod om en gensyntesetjeneste til at udføre kodonoptimering til human celleekspression baseret på sekvensen af P42858. Skift polyQ-tallet fra Q16 til den ønskede Q-længde (Q23 blev valgt som den første konstruktion her) og syntetiser HTT-genet i fuld længde.
BEMÆRK: Den syntetiserede kodonoptimerede Q23-HTT-konstruktion i fuld længde blev leveret som en indsats i pUC18-plasmidet i denne undersøgelse. - Valgfrit: Tilføj funktioner for at lette kloning af forskellige Q-længder og rensning i konstruktionerne.
BEMÆRK: Et tobaksætsningsvirus (TEV) spaltningssted og FLAG-rensningsmærke (AAAENLYFQGDYKDDDDK) blev tilføjet til den C-terminale ende af konstruktionerne. To HindIII-steder blev designet i konstruktionerne til at omfatte polyQ-regionen (oversat proteinsekvens ændres ikke ved at introducere HindIII-steder). Dette gør det muligt for forskeren at ændre HTT's Q-længde ved restriktionsenzymfordøjelse og ligering uden at gensyntetisere det fulde HTT-gen .
2. Klon den syntetiserede HTT konstruerer til pcDNA3.1.
- Der fordøjes 5 μg pUC18-Q23-HTT og 5 μg pcDNA3.1 ved hjælp af 2 μL NheI og PmeI hver ved 37 °C i 2 timer.
- Kør en 0,5% w / v agarosegel og rens Q23-HTT-fragmentet og den fordøjede pcDNA3.1-vektor ved hjælp af et agarosegelekstraktionssæt. Kvantificer koncentrationerne af oprenset DNA med OD280 ved hjælp af et UV-spektrometer, der kan måle mikroliter prøver.
BEMÆRK: OD260/280 fra 1,8 til 2,0 observeres typisk. Den syntetiserede FL HTT leveres som en indsats med NheI og PmeI i begge ender i et pUC18-plasmid. Brug andre restriktionsenzymer, hvis HTT syntetiseres forskelligt. - Brug 10 ng fordøjet pcDNA3.1 vektor i reaktionen. Læg de oprensede DNA'er ved 1: 1 (HTT: pcDNA3.1) molært forhold i en 10 μL reaktion ved stuetemperatur i 5 minutter ved hjælp af T4 DNA-ligase.
- Omdan det ligede produkt til kompetente E. coli-celler (se materialetabellen) ved hjælp af den protokol, der er specificeret af ligaseproducenten.
- Hent 6 enkeltkolonier og lav overnatningskulturer i 4-6 ml LB suppleret med 100 μg/ml carbenicillin ved 37 °C.
- Tildel 1 ml fra hver overnatningskultur. Tilsæt glycerol til 25% v/v og gem glycerolstammen ved -80 °C. Rens den resterende overnatningskultur ved hjælp af et mini-prep-sæt i henhold til de trin, der er angivet i brugervejledningen.
- Sekvenser alle plasmider ved hjælp af sekventeringsprimere, der spænder over plasmidets transkriptionsområde. Vælg en glycerolbestand, der har den korrekte rækkefølge som master glycerolbestanden, og kassér resten.
- Valgfrit: Anmod om en gensyntesetjeneste til syntetisering af DNA med de forskellige Q-længder (Q48, Q73 og Exon1), der spænder over de to HindIII-steder i pcDNA3.1-Q23-HTT-plasmidet. Fordøje pcDNA3.1-Q23-HTT og de nyligt syntetiserede DNA'er ved hjælp af HindIII, og relér dem med T4-ligase som i trin 2.2-2.7 for at fremstille FL HTT med forskellige polyQ-længder i pcDNA3.1-plasmidet.
BEMÆRK: Plasmidkonstruktioner, der anvendes i denne undersøgelse, er også tilgængelige direkte fra HS-fællesskabsarkivet på Coriell Institute (www.coriell.org/1/CHDI); se materialeoversigten.
3. GIGA præplakerer endotoksinfrit plasmid-DNA til storskala transfektion
- Stribe de bakterielle glycerollagre af pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-FLAG på en LB agarplade med carbenicillin (100 μg/ml). Pladen inkuberes ved 37 °C i 16-24 timer, indtil der vises enkelte kolonier.
- Hent en enkelt koloni, pod en 5 ml starterkultur i et rigt medium formuleret til plasmidforstærkning med carbenicillin (100 μg / ml), og dyrk ved 37 ° C i 8 timer.
- Vælg et endotoksinfrit GIGA plasmidrensningssæt. Følg trinene beskrevet i manualen til plasmid GIGA-sættet for at rense pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-FLAG-plasmidet.
- Mål plasmidendotoksinniveauerne ved hjælp af et limulus amoebocytlysat (LAL) -baseret endotoksinkvantificeringssæt. Følg den procedure, der er angivet i producentens manual.
BEMÆRK: En plasmidrensning af høj kvalitet med lavt endotoksinniveau er afgørende for at opnå god transfektionseffektivitet. Ved anvendelse af denne protokol kan 20-40 mg plasmid (supercoiled form >80%) opnås pr. L bakteriekultur ved plasmidkoncentrationer > 4 mg / ml. Et korrekt oprenset plasmid skal have et endotoksinniveau < 30 EU/mg. OD260/280 fra 1,8 til 2,0 observeres typisk.
4. Storskala transfektion af 2 L HEK293-celler med polyethylenimin (PEI)
- Tilsæt 1 g PEI 25K til 1 liter endotoksinfrit vand under omrøring. Juster pH-værdien til 2,0 ved hjælp af 100 mM HCI, og rør rundt, indtil hele PEI 25K opløses. Juster pH-værdien til 7,0 ved hjælp af 100 mM NaOH-opløsning, og filtrer gennem et 0,2 μm filter. Aliquot og opbevares ved -20 °C i op til et år.
BEMÆRK: Aliquots af PEI kan opbevares ved 4 °C i op til to uger, men bør aldrig genfryses efter optøning. - Forplanter HEK293-celler i vækstmediet (se materialetabellen) suppleret med penicillin-streptomycin (slutkoncentration ved 5 U/ml for penicillin og 5 μg/ml for streptomycin) i en befugtet shaker-inkubator ved 37 °C, 90 omdr./min., 5% CO2 i 18-24 timer. Fortynd cellerne til 2 L ved en densitet på ~ 1,2 × 106 celler / ml ved hjælp af vækstmediet i 5 L Erlenmeyer-kolber en dag før transfektion.
- Fortsæt med at dyrke cellerne ved 37 ° C, 90 o / min, 5% CO2 i 18-24 timer. Mål celleparametrene ved hjælp af en autocelletæller, der er i stand til at måle celletæthed og levedygtighed efter brugervejledningen.
BEMÆRK: Celletætheden skal fordobles, og levedygtigheden skal være >95%. Celletætheden før transfekten skal være ca. 2,0 × 10 6-2,4 × 106 celler/ml. Fortynd cellerne til den ønskede tæthed før transfektion, når det er nødvendigt. - Beregn mængderne af plasmid og PEI, der kræves til transfekten; brug 1 mg plasmid og 3 mg PEI til transfektion af hver liter cellekultur. Tildel 2 mg plasmid og 6 mg PEI, der er nødvendige for en 2 L transfekt.
- Fortynd plasmidet og PEI individuelt til et volumen fosfatbufferet saltvand svarende til 1/20af det samlede volumen cellekultur (100 ml hver for en 2 L transfektion) og inkuberes ved stuetemperatur i 5 min. Bland det fortyndede plasmid og PEI ved blid hvirvling og inkuber blandingen ved stuetemperatur i 30 minutter.
BEMÆRK: Blandingen vil fremstå let overskyet efter inkubation. - Tilsæt blandingen til cellekulturen og hvirvl forsigtigt for at blande dem.
- Cellerne vokser ved 37 °C, 5% CO2, 90 o / min i 24 timer.
- Der tilsættes 2 M natriumbutyratopløsning til en slutkoncentration på 2 mM. Tilsæt 1:1000 (v/v) antiklumpningsmiddel og 1:1000 (v/v) antiskum til kulturen.
- Kolben flyttes til en befugtet rysteinkubator ved 32 °C, 90 omdr./min., 5 % CO2, og fortsæt med at vokse i 48 timer.
- Mål celleparametrene, herunder celletæthed og levedygtighed, ved hjælp af autocelletælleren ved hjælp af brugervejledningen.
- Overfør 2,0 × 10 6 celler (Vol = 2,0 × 106/celletæthed) i et mikrocentrifugerør. Pellet cellerne ved 2.000 × g i 1 minut i en centrifuge til western blotting i sektion 5.
- Cellerne høstes ved centrifugering ved 2.000 × g i 30 minutter, og cellepelleten opbevares ved -80 °C inden rensning.
5. SDS-PAGE og western blot af HEK293 cellelysat for at estimere HTT-ekspressionsniveau
- Der tages en aliquot på 2,0 × 106 celler, der tidligere er frosset (trin 4.11) fra den store transfektion af HEK293-cellekulturen. Tilsæt 250 μL Tris-bufferet saltvand (TBS) suppleret med 50 μg / ml digitonin, 5 mM EDTA og 1x proteasehæmmercocktail, og suspender cellepelleten igen ved at aspirere flere gange ved hjælp af en pipette.
- Drej rørene forsigtigt i 30 minutter ved 4 °C ved hjælp af en minirotator til at lyse cellerne. Pelleter det uopløselige materiale ved centrifugering ved 17.000 × g i 5 min.
- Tilsæt 1/3rd volumenet af 4x reducerende lithiumdodecylsulfat (LDS) belastningsbuffer til supernatanten og opvarm ved 70 ° C i 10 min.
- Læg 5-20 μL cellelysat på en præfabrikeret 3-8% Tris-acetat PAGE gel. Brug den gelkompatible 1x Tris-acetat SDS-kørebuffer til at køre gelen i en konstant spændingstilstand ved 150 V i 60 minutter.
BEMÆRK: Tris-acetat SDS-PAGE blev brugt til FL HTT-analyse, fordi den genererer højere opløsning end andre typer SDS-PAGE for proteiner med molekylvægt over 300 kDa. Proteiner, der anvendes i denne undersøgelse, er også tilgængelige direkte fra HS-fællesskabslageret på Coriell Institute (www.coriell.org/1/CHDI); se materialeoversigten. - For at udføre western blotting skal du samle en overførselssandwich ved hjælp af et overførselsbuffer-ækvilibreret tykt overførselspapir, en methanolaktiveret polyvinylidenfluorid (PVDF) membran og en SDS-PAGE-gel. Overfør proteinerne til PVDF-membranen ved hjælp af en halvtør vestlig blotter i henhold til producentens brugervejledning.
BEMÆRK: Typisk er 20-30 min ved 135 mA tilstrækkeligt til en membran på 10 cm x 10 cm. - Overføringssandwichen skilles ad, og membranen blokeres i TBST (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl og 0,1 % v/v Tween-20) suppleret med 5 % fedtfri mælk.
- Inkubere membranen på en vippe i 1 time ved stuetemperatur med 15 ml primært antistof (1:2.500 fortynding for anti-FLAG antistof monoklonalt antistof og 1:2.000 for alle andre primære antistoffer).
BEMÆRK: Primære antistoffer, der anvendes i denne undersøgelse, er anti-FLAG M2, MAB5492, MAB5490, MAB2166, MAB3E10, MAB4E10, MAB2168, MAB8A4 (se materialetabellen). - Vask membranen 3 x 5 min med 30-50 ml TBST.
- Inkuber membranen på en vippe med et fluorescerende farvekonjugeret gedeantimus IgG sekundært antistof ved 1:15.000, stuetemperatur, i 15 ml TBST indeholdende 5% w/v tørmælk.
- Visualiser de vestlige blotbånd på et fluorescerende kamera ved hjælp af bølgelængden, der er specifik for det sekundære antistof. Kvantificer båndsignalet ved hjælp af softwaren, der ledsager billedkameraet i henhold til brugervejledningen.
BEMÆRK: Kvantitativ western blotting kan udføres ved hjælp af renset HTT som standard. Et lineært standardområde for HTT er instrumentspecifikt og blev etableret i dette laboratorium fra 25 ng til 250 ng HTT pr. bane ved hjælp af et anti-FLAG-antistof. HTT's western blot bør være fri for forringelse; et samlet HTT-ekspressionsniveau på 2-4 pg/celle observeres typisk. Se en tidligere offentliggjort protokol32 for detaljer om, hvordan man udfører en kvantitativ western blot.
6. Hurtig proteinvæskekromatografi (FPLC) oprensning af HTT ved hjælp af anti-FLAG-kolonne og SEC
- Anti-FLAG rensning
- Anslå mængden af FLAG-harpiks, der er nødvendig til oprensning (typisk 12 ml anti-FLAG M2-affinitetsharpiks til oprensning af 2-4 liter transficeret cellekultur). Pak 12-25 ml anti-FLAG-harpiks på en tom kolonne (se materialetabellen) ved hjælp af FPLC med en strømningshastighed på 4 ml/min ved hjælp af buffer A (tabel 1). Juster stemplets højde, så der ikke er noget mellemrum mellem enden af stemplet og harpiksbunden.
- Ved hjælp af et forhold på 10 ml lysisbuffer pr. 1 g cellepellet optøes og suspenderes cellepelleten i kold lysisbuffer (tabel 1).
- Før cellesuspensionen en gang gennem en homogenisator med høj forskydning ved 10.000 psi. Lysatet klargøres ved centrifugering ved 20.000 × g i 1 time i en centrifuge udstyret med en kompatibel fastvinklet rotor.
- Programmere FPLC'en (se materialetabellen for den software, der blev brugt i undersøgelsen), og kør følgende sekvenser.
- Læg det klargjorte lysat i via prøvepumpen.
- Vask med 4 kolonnevolumener (CV'er) buffer A (tabel 1).
- Vask med 4 CV'er af buffer B (tabel 1).
- Vask med 8 CV'er buffer C (tabel 1).
- Vask med 3 CV'er buffer D (tabel 1).
- Vask med 3 CV'er af elutionsbuffer (tabel 1).
- Analyser 10 μL af topfraktionerne ved hjælp af SDS-PAGE. Saml og kombiner topfraktionerne med den ønskede renhed. Gem ~50 μL af de kombinerede eluater til SDS-PAGE-analyse.
BEMÆRK: Normalt vises en enkelt top, og alle fraktioner, der elueres i toppen, indeholder ~ 90% ren HTT. - Regenerer en anti-FLAG-kolonne ved hjælp af 5 CV'er regenereringsbuffer (tabel 1), og re-ligevægter kolonnen ved hjælp af 5 CV'er af buffer A.
BEMÆRK: Anti-FLAG harpiks kan genbruges op til fem gange, eller indtil det relative udbytte / liter falder til 50% af den første oprensning.
- Rensning af kolonne til ekskludering af størrelse (SEC) ved hjælp af en SEC-kolonne
- Forædler en SEC-kolonne, der tillader adskillelse af proteiner med molekylvægt (MW) > 500 kDa (se materialetabellen for den anvendte kolonne) ved hjælp af 2 × CV af SEC-buffer (tabel 1).
- Indlæs anti-FLAG-eluatet direkte (fra trin 6.1.5) via en 50 ml superloop. Kør 1,2 × CV for SEC-buffer pr. injektion. Kør SEC-adskillelsen natten over ved 4 °C.
BEMÆRK: Der kan maksimalt indlæses 5 ml eller 15 ml proteinprøve på de SEC-kolonner, der er valgt i denne undersøgelse. Programmer FPLC'en, så flere injektioner kan udføres automatisk. Eksempelmetodescripts er også inkluderet som supplerende fil 1 og supplerende fil 2. - Sammenlign elueringsprofilen med standard HTT-elueringsprofilen for at skelne mellem monomer-, dimer- og højere ordens oligomere toppe. Saml de monomere HTT-fraktioner baseret på elueringsprofilen for SEC-kolonnen. Hvis det ønskes, skal du samle de højere ordnede oligomere og dimeriske HTT-fraktioner separat.
- Det samlede HTT-protein koncentreres ved hjælp af en 100 kDa centrifugalkoncentrator ved 4 °C. Beregn proteinkoncentrationerne ved at dividere deres OD280-værdier med de respektive udryddelseskoefficienter (de teoretiske udryddelseskoefficienter for Q23-HTT, Q48-HTT, Q73-HTT og ΔExon1-HTT er henholdsvis 0,776, 0,769, 0,762 og 0,798 (mg/ml)-1 cm-1til beregningen). Hold HTT-koncentrationen ≤ 1,0 mg / ml.
BEMÆRK: Det er vigtigt at overvåge koncentrationsprocessen, da overkoncentration vil resultere i aggregering. - Aliquot det oprensede HTT-protein i kryosikre mikrocentrifugerør i et volumen < 100 μL. Flash-frys aliquoterne ved hjælp af flydende nitrogen og opbevar dem ved -80 °C.
7. Analytisk HPLC SEC-MALS-dRI til analyse af HTT-polydispersitet
- Udfør alle analytiske SEC-MALS ved 4 °C på et højtydende væskekromatografisystem (HPLC) kombineret med en UV-detektor, en multivinkellysspredningsdetektor og en dRI-detektor (Differential Refractive Index).
- Før du tilslutter UHPLC-søjlen til systemet, skal du rense pumpen og detektorerne med filtreret (0,1 μm) HPLC-vand.
- Tilslut UHPLC-kolonnen (se materialetabellen for den anvendte kolonne) til systemet. Kolonnen ligevægtes med filtreret (0,1 μm) vand og derefter SEC-MALS-buffer (tabel 1), indtil alle detektorsignalerne når baseline.
- Der injiceres 2 μL 6 mg/ml bovin serumalbumin (BSA) ved en strømningshastighed på 0,3 ml/min i 15 minutter pr. injektion, og datakvaliteten kontrolleres. Udfør normalisering, spidsjustering og båndudvidelseskorrektion baseret på BSA-profilen, og opret en skabelon til følgende HTT-eksempelkørsler.
- Optø hurtigt et hætteglas med FL Q23-HTT-prøven i et vandbad ved stuetemperatur ved hjælp af en flyder. Filtrer HTT gennem et 0,1 μm spinfilter. 2-4 μL af HTT-prøven injiceres og køres i 15 minutter ved 4 °C ved en strømningshastighed på 0,3 ml/min.
- Analyser de kromatografiske og lysspredningsdata ved hjælp af ledsagende software (se materialetabellen). Brug dRI-detektoren som koncentrationsdetektor, og brug 0,185 som brydningsindeksforøgelse (dn/dc) for HTT. Generer et Zimm-plot for at bestemme den vægtgennemsnitlige molekylmasse for hver top33,34.
BEMÆRK: Brydningsindeksforøgelse af HTT beregnes som 0,185 ved hjælp af programmet SEDFIT software35 og primær aminosyresekvens af HTT som input.
BEMÆRK: HTT monomer MW bestemmes af SEC-MALS ved ~ 370 kDa ± 30 kDa. Renset HTT har typisk monomerindhold mellem 60 og 75% (i dette laboratorium). Lavt monomerindhold kan indikere, at der skal udvises større omhu ved håndtering for at forhindre aggregering.
8. Blue Native PAGE til analyse af HTT-polydispersitet
- Forbered 1 liter anodebuffer ved at blande 50 ml 20x Blue Native PAGE løbende buffer (se materialetabellen) med 950 ml H 2 O. Forbered2L mørkeblå katodebuffer ved at blande 100 ml 20x Blue Native PAGE kørende buffer og 100 ml Blue Native PAGE katodeadditiv (20x) med 1.800 ml H2O. Afkøl bufferne til 4 °C før brug.
- Optø hurtigt et hætteglas med FL Q23-HTT-prøve i et vandbad ved stuetemperatur ved hjælp af en flyder. Optøet protein på is før brug.
- Bland 5 μg FL Q23-HTT (~ 1 mg / ml), 1 μL 0,5% G250-additiv, 2,5 μL 4x Blue Native PAGE-prøvebuffer og vand for at bringe det endelige volumen til 10 μL.
- Læg den blandede FL Q23-HTT-prøve på en 3-12% præfabrikeret Bis-Tris gel. 7,5 μL af den ufarvede proteinstandard indlæses i samme gel som standarden.
- Fyld tankens forside med mørkeblå katodebuffer og bagsiden af tanken med anodebuffer.
BEMÆRK: Fyld bufferne, når prøven er indlæst, for at muliggøre nem visualisering, når prøverne indlæses. - Kør gelen ved 150 V i 120 min i et koldt rum.
- Gelen afrystes med affarvningsopløsning (tabel 1), indtil der observeres bånd; Overfør gelen til vand. Visualiser og dokumentér gelen på en billedbehandlingsstation.
BEMÆRK: Blue Native PAGE blev oprindeligt designet til at analysere membranproteiner. Det blev tilpasset i dette laboratorium som en alternativ metode til at estimere HTT's monomere indhold. Det binder sig til de hydrofobe områder af HTT og forhindrer det i at danne aggregater under bufferbetingelser, der mangler vaskemiddel. Traditionel native PAGE uden brug af Coomassie blå G250 får HTT til at danne opløselige oligomerer og aggregater, sandsynligvis på grund af de mange hydrofobe lommer, der findes i HTT.
9. SDS PAGE efterfulgt af Coomassie eller sølvfarvning for at analysere HTT-renhed
- Der tilsættes 4x LDS-prøvebuffer og 10x reducerende reagens til oprenset FL Q23-HTT for at gøre den endelige koncentration af belastningsbuffer og reduktionsreagens til 1x.
- Prøven opvarmes på en tør varmeblok ved 70 °C i 10 min.
- Læg maksimalt 1 μg protein pr. brønd på en 3-8% Tris-acetatgel og kør ved 150 V i 1 time ved hjælp af Tris-acetat SDS-løbebuffer.
BEMÆRK: Proteiner, der anvendes i denne undersøgelse, er også tilgængelige direkte fra HS-fællesskabslageret på Coriell Institute (www.coriell.org/1/CHDI); se materialeoversigten. - Coomassie plet
- Vask gelen med H2O i 5 min.
- Plet gelen i Coomassie-farvningsopløsningen (tabel 1) ved at vippe gelen i 30 ml farvningsopløsning i 15 min.
- Afsylt ved at rokke gelen i 50 ml H2O i 5 min. Gentag to gange. Visualiser og dokumenter den Coomassie-farvede gel på en billeddannelsesstation.
- Sølvplet ved hjælp af et kommercielt sølvpletsæt.
- Efter SDS-PAGE fastgøres gelen ved hjælp af Fixing Solution (tabel 1) i 1 time til natten over ved stuetemperatur.
- Udfør pletten, vask og udvikl i henhold til sættets instruktioner.
- Stop straks udviklingstrinnet, når båndene når den ønskede intensitet.
- Dokumentér gelen i et geldokumentationssystem udstyret med en synlig lyskilde.
BEMÆRK: HTT oprenset ved >95% kan detekteres af Coomassie og sølvfarvning med denne protokol. Se en tidligere offentliggjort protokol32 for detaljer om, hvordan man udfører kvantitativ proteinanalyse.
Representative Results
En forbigående ekspressionsvektor (pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-FLAG, figur 1A) er konstrueret til hurtig produktion i pattedyrceller af FL Q23-HTT (aa 1-3.144, baseret på Q23-nummerering). Denne konstruktion har funktionerne designet til hurtigt at generere forskellige HTT-mutationskonstruktioner ved kassettekloning, lette oprensning af HTT-protein til høj kvalitet og homogenitet med minimale kromatografiske trin og har mulighed for at producere umærket FL HTT. Listen over funktionerne indeholder 1. HindIII-restriktionsfordøjelsessteder, der omgiver CAG-gentagelsen i HTT exon 1, kan bruges til at generere FL HTT-mutanter med en polyQ-strækning af forskellige længder ved restriktionsenzymfordøjelse og ligering; 2. den C-terminale ende af FL HTT er mærket med en FLAG-epitop med et TEV-proteasegenkendelsessted til et-trins affinitetsrensning af FL HTT med høj renhed og valgfri generering af tagfrit FL HTT-protein ved hjælp af TEV-proteasespaltning; 3. Codonoptimeret FL HTT-sekvens til human cellekodonbrug til ekspression på højt niveau i HEK293-celler. PCDNA 3.1 (+) vektoren bruges som rygraden i konstruktionen til at drage fordel af CMV-promotorens høje transkriptionelle aktiveringsaktivitet i pattedyrcellelinjer.
Ved hjælp af pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-FLAG som startskabelon blev Q48- og Q73 FL HTT-konstruktionerne produceret ved at syntetisere DNA-fragmenter med korrekt Q-længde, der spænder over to HindIII-restriktionsenzymsteder og bytter den samme region i skabelonen. ΔExon1-mutanten af FL HTT (aa 91-3.144) (figur 1B) blev fremstillet ved hjælp af primere rettet mod slettede rester, der spænder over exon 1-regionen i skabelonen. HEK293-celler transficeret med pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-FLAG ved hjælp af PEI blev dyrket i 5 L shakerkolber under 5% CO2. En typisk storskala oprensning bruger en 2-10 L cellepellet indeholdende 6,0 × 10 9-3,0 × 1010 celler. Før man gik videre til oprensning, blev HTT-ekspressionsniveauet fra hver transfektion estimeret ved kvantitativ western blotting ved hjælp af renset rekombinant FLAG-mærket HTT som standard og anti-FLAG-antistof som det første antistof. Pellets med et estimeret HTT-ekspressionsniveau på ≥2 pg HTT / celle blev brugt til oprensning.
Oprensning af FL HTT består af en 2-trins søjleproces, først med anti-FLAG-affinitetsrensning og derefter med SEC på en gelfiltreringskolonne med et passende separationsområde for HTT (figur 2A; se materialetabel for eksempler). Efter begge trin blev HTT opnået ved >95% prøverenhed, som bestemt af SDS-PAGE med Coomassie blå og >65% monomerindhold baseret på analytisk SEC-MALS. Da både forlænget rensningstid og temperatur har en negativ indvirkning på det endelige HTT-monomerindhold, blev FPLC anvendt i begge rensningstrin for at minimere håndteringen og opnå ensartet prøvekvalitet. Den største forurening under anti-FLAG-rensningen var chaperone Hsp70 som bestemt ved massespektrometri (figur 2B, bane 2). Dette er i overensstemmelse med konstateringen af, at Hsp70 er co-oprenset med FL HTT stabilt udtrykt i humane cellelinjer24, hvilket tyder på, at Hsp70 kan være en fælles stabilisator for FL HTT in vivo.
Hsp70-forurening kan elimineres ved omfattende vask med magnesiumchlorid og ATP under anti-FLAG-affinitetsrensningstrinnet (figur 2B, bane 1). Efter fjernelse af Hsp70 er FL HTT tilbøjelig til at danne højere ordens oligomerer24 og skal opretholdes i en koncentration ≤ 1 mg / ml. Koncentrationstrinnet før SEC kan ofte resultere i betydelig aggregering. Derfor er den bedste praksis at indlæse spidsbelastningsfraktioner direkte fra anti-FLAG-rensning på størrelsesekskluderingskolonnen uden at koncentrere sig. Efter SEC blev prøven koncentreret til ≤1 mg/ml for maksimal genvinding af monomere FL HTT. Mængden af HTT, der blev genvundet fra hvert rensningstrin, blev estimeret ved enten Coomassie blue eller kvantitativ western blotting ved hjælp af oprenset FL HTT som kvantificeringsstandard (tabel 2). Det typiske udbytte af oprensede FL HTT-proteiner produceret ved den beskrevne metode er ca. 1 mg / L cellekultur, men kan falde langt under det (tabel 3) på grund af batch-til-batch-variabilitet, eller hvis anti-FLAG-rensningsharppiksen genbruges flere gange.
Overekspression af FL HTT kan resultere i fragmentering af proteinet22. FL Q23-HTT produceret ved den her beskrevne metode løst som et enkelt bånd med den korrekte MW på 350 kDa af SDS PAGE, farvet enten af Coomassie G250 eller af sølvfarvning (figur 2C). Ved western blotting reagerede FL Q23-HTT med antistoffer hævet mod epitoper ved N-terminalen, C-terminalen og flere mellemliggende domæner, uden at der blev observeret yderligere fragmentrelaterede bånd, hvilket indikerer, at proteinet blev isoleret uden signifikante påviselige afkortninger (figur 3A). FL HTT polyQ-længdevarianterne Q23, Q48 og Q73 reagerede som forventet i western blot, hvilket viste et gradvist stærkere signal for polyQ-rettet mAb MW1, der korrelerede med stigende Q-længde: Q23-HTT < Q48-HTT < Q73-HTT (figur 3B). Der blev ikke observeret noget signal for ΔExon1-HTT (aa 91-3.144), når det blev undersøgt med antistofferne MW1 og MAB549, som er rettet mod N-terminalen exon 1 (figur 3B).
SEC-MALS blev anvendt til at analysere aggregeringstilstanden og molekylmassen af det oprensede HTT-protein. Prøver blev analyseret af analytiske SEC overvåget af UV-, MALS- og dRI-detektorer. Den absolutte molære masse opnået fra SEC-MALS afhænger ikke af formen af molekyler33,34; SEC-MALS giver derfor et upartisk skøn over MW for monomere og oligomere fraktioner, når de er godt adskilt. Blandt de testede HPLC-søjler viste SEC-kolonnen (se materialetabellen) tilstrækkelig opløsning mellem HTT-monomeren og dimeren, således at der kunne skelnes mellem molære masser (figur 4). Proteinkoncentrationen blev bestemt ved dRI-detektion. Brydningsindeksstigninger (dn/dc) for FL HTT er 0,1853 ml/g som beregnet af SEDFIT-softwaren35. Lignende analytiske SEC-elueringsmønstre blev observeret for ΔExon1 HTT (91-3.144), FL Q23, Q48 og Q73 HTT (1-3.144), der hver bestod af en større monomertop med mindre dimeriske og oligomere toppe (tabel 4). Den beregnede MW for den monomere form er større end den teoretiske MW. Dette skyldes sandsynligvis overlappende arter fra højere ordnede oligomere toppe og fejl som følge af svage dRI-signaler, da HTT-proteiner opretholdes i lav koncentration for at undgå at danne højere ordnede oligomerer. Ved at integrere UV-toppe fra flere batcher af oprensede FL HTT-varianter blev der ikke observeret nogen klar sammenhæng mellem polyQ-længde og samlet profil (tabel 4).
Ud over analytisk SEC blev traditionel native PAGE udført for at afgøre, om den kan bruges som en komplementær metode til at karakterisere FL HTT oligomere tilstand. Højere ordnede oligomerer blev opløst gennem 3-8% Tris-acetatgeler ved anvendelse af native buffer uden vaskemiddel. Renset FL HTT fra SEC viste flere bånd svarende til oligomeriseringstilstandene (figur 5A). Det laveste bånd var placeret mellem native markør 480 kDa og 720 kDa, svarende til tidligere rapporterede resultater for FL HTT renset fra insektceller22. HTT-monomeren var imidlertid ikke det mest rigelige bånd, når man brugte traditionel native PAGE, og resultaterne korrelerer ikke med den samlede profil bestemt af analytisk SEC-MALS. Flere hydrofobe pletter til stede i FL HTT36,37,38, især den hydrofobe grænseflade mellem HAP40 og FL HTT25, vil sandsynligvis bidrage til dannelsen af højere ordnede oligomerer under migration i gelen. Dette skyldes, at hydrofobe regioner er kendt for at interagere med hinanden i mangel af vaskemiddel eller stabiliserende protein-proteininteraktioner. I overensstemmelse med HTT's hydrofobe egenskaber danner FL HTT stigende mængder af højere ordnede oligomere fraktioner i fravær af CHAPS under SEC-rensningstrinnet.
Blue Native PAGE, som i vid udstrækning bruges til at undersøge membranproteiner og store proteinkomplekser indeholdende hydrofobe pletter39, blev sammenlignet med traditionel indfødt PAGE. Renset HTT viste tre store bånd på Blue Native PAGE med estimeret MW på 643, 927 og 1070 kDa (figur 5B), der sandsynligvis repræsenterer henholdsvis de monomeriske, dimeriske og trimeriske arter af HTT. Monomerbåndet forblev det mest rigelige band i Blue Native PAGE, svarende godt til den analytiske SEC-profil for de samme prøver. Overvurderingen af MW af HTT-monomeren af Blue Native PAGE kan skyldes den unikke hule sfæriske struktur eller hydrofobe regioner af HTT, der forårsager langsommere migration i forhold til tilsvarende molekylvægtmarkører 11,23,25. Samlet set har FL Q23-HTT, FL Q48-HTT, FL Q73-HTT og ΔExon1-HTT lignende Blue Native PAGE-profiler med kun små forskelle i proteinbåndmigrationen på grund af deres molekylvægtforskelle.
Som en yderligere kontrol af kvaliteten af de oprensede proteiner kan C-terminal FLAG-mærket fjernes fra FL HTT ved behandling med TEV-protease. Efter proteolytisk spaltning blev prøver analyseret af western blot ved hjælp af fire antistoffer for at bekræfte fjernelse af FLAG-tag og detektere HTT-nedbrydning. Immunreaktivitet over for anti-FLAG M2 og tre huntingtin-specifikke antistoffer med epitoper til N-terminalen, mellemdomæner og C-terminus af HTT viste vellykket fjernelse af FLAG-tag og ingen HTT-specifikke nedbrydningsprodukter (supplerende figur S1).
Figur 1: Konstruktion til HTT-udtryk i fuld længde. (A) Q23 HTT i fuld længde blev kodonoptimeret og klonet til pcDNA3.1 (+) plasmid. 3'-enden af HTT blev mærket med Flag-epitop og TEV-protease-spaltningssted for at producere tagfrit HTT-protein. Det polyglutamin-stræknings- og prolinrige domæne blev konstrueret med flankerede HindIII-begrænsningsendonukleasesteder for at indsætte yderligere CAG-gentagelser ved hjælp af kassettekloning, dvs. Q48 og Q73, for at producere HTT-varianter med forskellige polyQ-længder. (B) ΔExon1-konstruktion blev lavet PCR-mutagenese ved hjælp af pcDNA3.1-Q23-HTT som skabelon. Rester 91-3.144 af HTT forblev i ΔExon1-konstruktionen til udtryk. Forkortelser: HTT = huntingtin; CMV = cytomegalovirus; Q23 = polyglutamin strækning; PRD = prolinrigt domæne; TEV = spaltningssted for tobaksætsningsvirus. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Storstilet rensning af HTT. (A) SEC-profil af anti-Flag-renset Q23-HTT i fuld længde på en FPLC-kolonne. Højt ordnede oligomerer, dimer og monomertoppe i Q23-HTT er mærket. Brøker indeholdende monomer blev indsamlet som den endelige HTT-prøve. (B) SDS-SIDE af renset Q23-HTT med ATP / magnesium vasketrin (bane 1) eller uden ATP / magnesiumvask resulterer i Hsp70 co-elution (bane 2). (C) Endelige rensede HTT-varianter i fuld længde på SDS-PAGE farvet med Coomassie blå G-250 eller sølvplet. Forkortelser: FL = fuld længde; HTT = huntingtin; SEC = størrelsesekskluderingskromatografi; FPLC = hurtig proteinvæskekromatografi; O = oligomer; D = dimer; M = monomer; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfatpolyacrylamid gelelektroforese; Hsp70 = varmechokprotein 70. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Western blot-analyse af oprensede HTT-varianter . (A) Renset FL Q23-HTT blev kørt på SDS-PAGE og overført til PVDF-membranen. De primære antistoffer og interagerende epitoper er Lane 1, α-FLAG M2, FLAG-tag; Bane 2, MAB5492, HTT aa. 1-82; Bane 3, MAB5490, HTT aa 115-129; Bane 4, MAB2166, HTT aa 181-810; Bane 5, MAB3E10, HTT aa 1.171-1.177; Bane 6, MAB4E10, HTT aa 1.844-2.131; Bane 7, MAB2168, HTT aa 2.146-2.541; Bane 8, MAB8A4, HTT aa 2.703-2.911. (B) 1 μg rensede FL HTT-varianter blev kørt på SDS-PAGE og overført til PVDF (venstre), og en duplikat SDS-gel blev kørt og farvet med Coomassie Blue (højre). De primære antistoffer og interagerende epitoper er række 1, MW1, ekspanderede PolyQ-gentagelser; Række 2, MAB2166, HTT aa 181-810; Række 3, MAB5492, HTT aa 1-82. Forkortelser: FLL Q23-HTT = huntingtinprotein i fuld længde indeholdende 23 glutaminrester; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfatpolyacrylamid gelelektroforese; WB = western blot; M = markør; PVDF = polyvinylidenfluorid. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: SEC-MALS analyse af HTT i fuld længde. Renset Q23-HTT i fuld længde blev elueret på en UPLC-søjle. Toppositioner for forudsagt monomer, dimer og oligomerer er angivet. Molekylvægte blev beregnet for monomer-, dimer- og trimertoppe og angivet i tabel 5. Lignende elueringsprofiler observeres for Q48, Q73 og ΔExon1 HTT med variabelt monomer-, dimer- og oligomerindhold i hver oprensning. Forkortelser: SEC-MALS = Størrelsesekskluderingskromatografi med lysspredning med flere vinkler; UV = Ultra Violet; LS = Lysspredning; MW = Molekylvægt; Q23-HTT = huntingtinprotein indeholdende 23 glutaminrester; M = monomer; D = dimer; O = oligomer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Karakterisering af renset HTT ved hjælp af klar Native PAGE eller Blue Native PAGE gel. Native Marker og tilsyneladende monomere Q23-HTT fra SEC blev løst på 3-8% Tris-acetatgeler i et ikke-denaturerende PAGE-system (A) og et Blue Native PAGE-system (B). Forkortelser: FL = fuld længde; Q23-HTT = huntingtinprotein indeholdende 23 glutaminrester; PAGE = polyacrylamid gelelektroforese; M = markør. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Skridt | Navn | Sammensætning | ||
| 6.1.1 | Buffer A | 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 5% v/v glycerol, 5 mM EDTA, 0,01% v/v Tween-20, pH 8,0. | ||
| 6.1.2 | Lysis Buffer | 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 5% v/v glycerol, 5 mM EDTA og 1x proteasehæmmer cocktail | ||
| 6.1.4.2 | Buffer A | 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 5% v/v glycerol, 5 mM EDTA, 0,01% v/v Tween-20, pH 8,0. | ||
| 6.1.4.3 | Buffer B | 50 mM Tris; 500 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5% v/v glycerol; 0,01 % v/v Tween-20, pH 8,0 | ||
| 6.1.4.4 | Buffer C | 20 mM Tris; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM ATP; 0,01% v/v Tween-20; 5% v/v glycerol, pH 8,0 | ||
| 6.1.4.5 | Buffer D | 50 mM Tris; 500 mM NaCl; 5% v/v glycerol; 5 mM EDTA; 0,5 % uden CHAPS, pH 8,0 | ||
| 6.1.4.6 | Elueringsbuffer | 50 mM Tris; 500 mM NaCl; 5% v/v glycerol; 0,5% m/v CHAPS; 0,2 mg/ml DYKDDDDK peptid, pH 8,0 | ||
| 6.1.6 | Regenerering buffer | 0,1 M glycin HCI, pH 3,5; 0,01% v/v Tween-20 | ||
| 6.2.1 | SEC Buffer | 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 5% v/v glycerol, 0,5% m/v CHAPS, 1 mM TCEP | ||
| 7.3 | SEC-MALS Buffer | 50 mM HEPES, pH 7,2, 500 mM NaCl, 5% v/v glycerol, 0,5% m/v CHAPS | ||
| 8.7 | Affarvningsløsning | 40% v/v methanol og 7% v/v eddikesyre | ||
| 9.4.2 | Coomassie farvning løsning | 0,01% w / v Coomassie G250, 50% v / v / methanol, 10% v / v eddikesyre | ||
| 9.5.1 | Løsning til fastsættelse | 50% v/v methanol , 10% v/v eddikesyre, 50 μL formaldehyd/100 ml opløsning | ||
Tabel 1: Bufferes og opløsningers sammensætning
| Trin | HTT-koncentration (mg/ml) | Samlet volumen (ml) | HTT-indhold (mg) | HTT-udbytte pr. celle (pg/celle) | % udbytte |
| Supernatant | 0.1792 | 220 | 39.4 | 4.4 | 100 |
| Anti-flag | 1.524 | 8.6 | 13.1 | 1.47 | 33.4 |
| SEK | 0.91 | 3.9 | 3.54 | 0.4 | 9.1 |
Tabel 2: HTT-udbytte fra en 2 L HEK293 pellet transficeret med pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-Flag. Forkortelser: FL Q23-HTT = huntingtinprotein i fuld længde indeholdende 23 glutaminrester; TEV = spaltningssted for tobaksætsningsvirus; SEC = størrelsesekskluderingskromatografi.
| HTT-prøve | HTT-udbytte (mg/l) | Gns. renhed (%) | ||
| B.T. | A280 | |||
| 1 | FL DEx1-HTT (N=3) | 0.67-1.30 | 0.69-1.18 | 99.3 |
| 2 | FL Q23-HTT (N=3) | 0.25-0.92 | 0.28-0.98 | 96.9 |
| 3 | FL Q48-HTT (N=3) | 0.28-1.15 | 0.38-1.16 | 97.4 |
| 4 | FL Q73-HTT (N=3) | 0.58-1.05 | 0.57-0.97 | 98.8 |
Tabel 3: Resumé af proteinudbyttet af fire FL HTT-variantoprensninger og deres endelige renhed. Forkortelse: FLL HTT = huntingtinprotein i fuld længde.
| HTT-prøve | En | D | M |
| FL Q23-HTT | 4.2-6.9% | 18.7-29.3% | 66.5-76.0% |
| FL Q48-HTT | 4.0-9.4% | 10.6-17.8% | 73.6-85.4% |
| FL Q73-HTT | 2.0-14.0% | 16.9-24.6% | 65.1-81.1% |
Tabel 4: Oversigt over det repræsentative aggregerede, dimer- og monomerindhold i FL HTT-varianter fra rensningen. Forkortelser: FL HTT = huntingtinprotein i fuld længde; A = aggregat; D = dimer; M = monomer; SEC = størrelsesekskluderingskromatografi.
Supplerende figur S1: Western blot-analyse efter TEV-proteasefordøjelse. Renset FL Q23-HTT og FL Q48-HTT blev kørt på SDS-PAGE, overført til PVDF-membraner og analyseret ved western blotting efter TEV-fordøjelse. Primære antistoffer, der blev brugt, var anti-Flag M2 (Flag-tag), MAB5492 (HTT aa 1-82), MAB3E10 (HTT aa 997-1.276) og MAB2168 (HTT aa 2.146-2.541). Bane 1, proteinstandard; Bane 2, Q23-HTT-TEV-Flag; Bane 3, Q48-HTT-TEV-Flag; Bane 4, Q23-HTT-TEV-Flag behandlet med TEV-protease ved 1:5, natten over ved 4 °C; Bane 5, Q48-HTT-TEV-Flag behandlet med TEV-protease ved 1:5, natten over ved 4 °C. Forkortelser: FL HTT = huntingtinprotein i fuld længde; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfatpolyacrylamid gelelektroforese; TEV = tobaksætsningsvirus; PVDF = polyvinylidenfluorid. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S2: SEC-MALS-analyse af FL HTT-varianter, der udsættes for fryse-optøningscyklusser. Renset Q23-HTT (A) og Q48-HTT (B) blev frosset ved -80 °C og optøet ved stuetemperatur i op til 6 gange. Q23-HTT og Q48-HTT efter den første fryse-optøning og den sjette fryse-optøningscyklus blev derefter analyseret af SEC-MALS. Et lille fald i monomerfraktion og stigning i dimer og højordens oligomerfraktioner blev observeret ved lysspredning efter gentagne fryse-optøningscyklusser. Toppositioner for forudsagt monomer, dimer og oligomer af høj orden er angivet. Forkortelser: FL HTT = huntingtinprotein i fuld længde; O = oligomer; D = dimer; M = monomer; SEC-MALS = Størrelsesekskluderingskromatografi med lysspredning med flere vinkler. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S3: SDS-SIDE af FL HTT-varianter, der udsættes for fryse-optøningscyklusser. Renset Q23-HTT (bane 2-7) og Q48-HTT (bane 9-14) blev frosset ved -80 °C og optøet ved stuetemperatur i op til 6 gange. Aliquots af Q23-HTT og Q48-HTT blev opbevaret efter hver fryse-optøningscyklus og derefter analyseret af SDS PAGE. Der blev ikke observeret nogen stigning i aggregerede produkter eller nedbrydningsprodukter; Prøverne blev betragtet som stabile og >95% rene ved banddensitometri. Forkortelser: FL HTT = huntingtinprotein i fuld længde; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfatpolyacrylamid gelelektroforese. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 1: FPLC 15 ml anti-FLAG HTT-script. Forkortelser = FPLC = hurtig proteinvæskekromatografi; HTT = huntingtinprotein. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: FPLC SEC_MALS HTT-script. Forkortelser: SEC-MALS = Størrelsesekskluderingskromatografi med lysspredning med flere vinkler; FPLC = hurtig proteinvæskekromatografi; HTT = huntingtinprotein. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Vi beskriver her en forbigående transfektions-, ekspressions- og oprensningsmetode til at generere flere FL HTT-proteinkonstruktioner med passende renhed og homogenitet til brug som standarder for immunassay og MS-assayudvikling, kontroller til western blot-analyse og til strukturfunktionsundersøgelser. Denne forbigående ekspressionsmetode er skalerbar og alsidig og gør det muligt for brugeren at generere mængder af FL HTT-varianter med lavt milligram mere effektivt end ved hjælp af stabile cellelinjer eller virusbaserede metoder beskrevet tidligere21,22,23,24. Rutinemæssigt kan 2-5 mg højt oprenset FL HTT genereres fra en 2 L skala proteinproduktion, der køres på mindre end en uge ved hjælp af den forbigående ekspressionsmetode, når plasmidet er konstrueret, med et typisk udbytte på 1-2,5 mg FL HTT pr. Liter cellekultur.
Den forbigående ekspressionsmetode, der er beskrevet her, overvinder mange forhindringer i stabil cellelinjeekspression, såsom den lange tid, der er nødvendig for at etablere cellelinjer og vanskeligheder med opbevaring og vedligeholdelse af stabile cellelinjer. PEI er også relativt billigt sammenlignet med andre transfektionsreagenser på markedet, hvilket gør transfektion i stor skala økonomisk levedygtig. Der er også begrænsninger i protokollen: transfektionseffektivitet afhænger i vid udstrækning af plasmidernes kvalitet, optimal cellevækst og hvor godt PEI opbevares og tilberedes. Operatører skal være særlig forsigtige og udføre kvalitetskontrol i disse kritiske trin for at undgå et drastisk fald i proteinudbyttet. Anti-FLAG-harpiks, der anvendes i protokollen, er også relativt dyr og viser reduceret indfangning af FL HTT efter flere oprensninger og regenereringer. Nogle forskere kan finde det mere praktisk at skifte til et andet mærke for at tillade mere robust regenerering af affinitetsharpiksen.
Forskellige cellelinjer og ekspressionsbetingelser blev testet for at optimere FL HTT-ekspressionsniveauer. HEK293-celler blev valgt til ekspression af FL HTT på grund af den høje ekspression af protein og den lette håndtering i et suspensionskulturformat, hvilket gør metoden velegnet til storskalaekspression i enten rystere eller bioreaktorer. Et højere FL HTT-proteinekspressionsniveau kan opnås ved lavere dyrkningstemperaturer såsom 32 °C i stedet for at anvende den sædvanlige temperatur på 37 °C. Det er muligt, at den lavere temperatur kan bremse proteinsyntesen og fremme korrekt foldning af FL HTT40. Dette fænomen er imidlertid ikke specifikt for FL HTT eller de testede cellelinjer. Den reducerede posttransfektionstemperatur er blevet anvendt i vid udstrækning i farmaceutisk proteinekspression i CHO-celler. Selvom mekanismen ikke er fuldt ud forstået, menes det, at lave temperaturer standser cellecyklussen i G1-fasen og omdirigerer cellulær energi til proteinproduktion41.
HTT i fuld længde renset fra pattedyrceller co-elutes med chaperone Hsp7024, og Mg-ATP vasketrin kan fjerne Hsp70-proteinet. Interessant nok observeres co-elueret Hsp70 ikke i FL HTT renset fra et insektcelleekspressionssystem21,22,23. Dette kan afspejle en forskel i PTM'erne for FL HTT eller varmechokproteinresponser på overekspression af FL HTT i pattedyr og insektceller. Når det rekombinante protein er blevet fjernet fra Hsp70, kræves ikke-ioniske vaskemidler som CHAPS eller DDM for at stabilisere den monomere form af FL HTT.
Oligomeriseringstilstandene for FL HTT-varianter blev analyseret ved hjælp af Blue Native PAGE og SEC-MALS. En lille brøkdel af dimeric og højere ordens oligomeric HTT var til stede, når den blev analyseret af enten Blue Native PAGE eller SEC-MALS. Bemærk, at højere ordnede oligomerer dannet af FL HTT ikke ser ud til at korrelere med polyQ-længden, og selv Exon1-sletningsmutanten viser et lignende oligomer-dimer-monomer-forhold. De faktiske variationer i oligomerindholdet blandt disse konstruktioner skyldes sandsynligvis mindre forskelle i produktionen og håndteringen af hvert parti. I modsætning til aggregater og fibriller dannet af HTT Exon140,41 forblev de højere ordnede oligomerer af FL HTT opløselige og kunne analyseres af SEC og Native PAGE.
Renset monomer FL HTT er kun relativt stabil. Langvarig opbevaring ved 4 °C, korte inkubationer ved stuetemperatur eller koncentrationer > 1 mg/ml vil alle omdanne monomere FL HTT til dimere og højere ordens oligomere former, selv om der ikke observeres nogen synlig nedbør under disse forhold. Renset monomer FL HTT opretholdt ved ≤1 mg/ml forblev relativt stabil ved -80 °C i lagerbuffer (50 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, 5 % v/v glycerol, 0,5 % w/v CHAPS og 5 mM DTT) som tidligere beskrevet24. Op til 6 fryse-optøningscyklusser af FL HTT fremstillet og opbevaret på denne måde forårsagede ikke synlig udfældning af proteinet, selvom et lille skift til en højere oligomer tilstand blev observeret af SEC-MALS (supplerende figur S2). Prøver blev også analyseret af SDS PAGE efter gentagne fryse-optøningscyklusser. Der blev ikke observeret synlige bundfald; der blev ikke set aggregater eller yderligere nedbrydningsprodukter af SDS-PAGE (supplerende figur S3). Den langsigtede stabilitet af oprenset FL HTT er stadig under undersøgelse. I mangel af afgørende langsigtede data anbefaler vi at opbevare renset FL HTT ved -80 °C i højst 6 måneder.
Rekombinante FL HTT-proteinvarianter af høj kvalitet og metoderne til at producere dem er i høj kurs i HS-forskningsmiljøet. Disse proteiner er i brug som immunoassay og MS analytiske standarder, i strukturelle undersøgelser og til udvikling af nye FL HTT-specifikke assays. De store forbigående ekspressionsmetoder, der er beskrevet her, har konsekvent produceret milligrammængder af FL HTT-varianter med >95% renhed, hvilket giver vigtige værktøjer til HTT-undersøgelser. Produktion af snesevis af milligram højt oprensede FL HTT polyQ-varianter og andre mutanter til støtte for HS-forskning er blevet rutine.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter med indholdet af denne artikel.
Acknowledgments
Vi takker Institut for Farmaceutiske Videnskaber, State University of New York i Buffalo, for at udføre MS-analyse af HTT. Dette arbejde var et samarbejde med CHDI Foundation. Vi takker specifikt Elizabeth M. Doherty; Ignacio Munoz-Sanjuan; Se hele annoncen 2600 Glostrup Glostrup Dækcenter I går 1.500 kr. og Rory Curtis, Curia, for deres uvurderlige input under udarbejdelsen af dette manuskript. Vi er også taknemmelige for Michele Luche, Mithra Mahmudi og Stephanie Fox for deres støtte til denne forskningsindsats.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 kDa concentrator-Amicon | Millipore | UFC910096 | Protocol Section Number-6.2.4 |
| 20x blue native PAGE running buffer | Invitrogen | BN2001 | Protocol Section Number-8.1 |
| 20x TBS | Thermo Fisher | PI28358 | Protocol Section Number-5.1 |
| 4x blue native PAGE sample buffer | Invitrogen | BN2003 | Protocol Section Number-8.3 |
| 4x LDS loading buffer | Invitrogen | NP0007 | Protocol Section Number-5.3 |
| 5 L Erlenmeyer flasks | Corning | 431685 | Protocol Section Number-4.2 |
| Agarose gel extraction kit | Qiagen | 28704 | Protocol Section Number-2.2 |
| Anti-clumping agent | Thermo Fisher | 0010057AE | Protocol Section Number-4.8 |
| anti-FLAG M2 affinity gel | Sigma | A2220 | Protocol Section Number-6.1.1 |
| anti-FLAG M2 | Sigma | F3165 | Protocol Section Number-5.7 |
| Anti foam-Excell anti foam | Sigma | 59920C-1B | Protocol Section Number-4.8 |
| ATP | Sigma | A6419 | Protocol Section Number-6.1.4.4 |
| BEH 450 SEC | Waters | 186006851 | 2.5 µm x 4.6 mm x 150 mm Protocol Section Number-7.3 |
| blue native PAGE 5% G-250 sample additive | Invitrogen | BN2004 | Protocol Section Number-8.3 |
| carbenicillin | Thermo Fisher | 10177012 | Protocol Section Number-2.5 |
| centrifuge - Sorvall Lynx 6000 | Thermo Fisher | 75006590 | Protocol Section Number-6.1.3 |
| Cell Counter - ViCELL | BECKMAN COULTER | Protocol Section Number-4.3 | |
| CHAPS | Anatrace | C316S | Protocol Section Number-6.1.4.6 |
| Competent E. coli cells-TOP10 | Invitrogen | C404010 | Protocol Section Number-2.4 |
| digitonin | Sigma | D141 | Protocol Section Number-5.1 |
| differential refractive index detector | Wyatt | Protocol Section Number-7.1 | |
| DYKDDDDK peptide | Genscript | Peptide synthesis service Protocol Section Number-6.1.4.6 |
|
| EDTA | Sigma | EDS | Protocol Section Number-5.1 |
| EndoFree Plasmid Giga Kit | Qiagen | 12391 | Protocol Section Number-3.3 |
| Endotoxin free water | Cytiva | SH30529.03 | Protocol Section Number-4.1 |
| endotoxin quantification kit-CRL Endosafe Nexgen-PTS detection system | Charles River | PTS150K | Protocol Section Number-3.4 |
| fixed angle rotor A23-6x100 rotor | Thermo Fisher | 75003006 | Protocol Section Number-6.1.3 |
| FPLC software- Unicorn 6.2 | Cytiva | Protocol Section Number-6.1.4 | |
| Gene synthesis | Genscript | Gene synthesis service Protocol Section Number-1.2 |
|
| Glycerol | Fisher Scientific Glycerol (Certified ACS) | G33-4 | Protocol Section Number-5.6 |
| Growth Medium-Expi293 expression medium | Thermo Fisher | A1435102 | Protocol Section Number-4.2 |
| HEK293 cells | Thermo Fisher | R79007 | Protocol Section Number-4 |
| high shear homogenizer-Microfluidizer | MicroFluidics | LM10 | Protocol Section Number-6.1.3 |
| HPLC - 1260 infinity II Bio-Insert HPLC | Agilent | Protocol Section Number-7.1 | |
| Image Studio | LiCor | Image analysis software Protocol Section Number-5.1 |
|
| MAB2166 | Sigma | MAB2166 | Protocol Section Number-5.7 |
| MAB2168 | EMD | MAB2168 | Protocol Section Number-5.7 |
| MAB3E10 | Santa Cruz | SC-47757 | Protocol Section Number-5.7 |
| MAB4E10 | Santa Cruz | SC-7757 | Protocol Section Number-5.7 |
| MAB5490 | Sigma | MAB5490 | Protocol Section Number-5.7 |
| MAB5492 | Sigma | MAB5492 | Protocol Section Number-5.7 |
| MAB8A4 | Santa Cruz | SC-47759 | Protocol Section Number-5.7 |
| multi-angle light scattering detector | Wyatt | Protocol Section Number-7.1 | |
| NativeMark Unstained Protein Standard | Invitrogen | LC0725 | Protocol Section Number-8.4 |
| NaCl | Sigma | S9888 | Protocol Section Number-5.6 |
| NheI | New England Biolab | R0131S | Hi-Fi version available Protocol Section Number-2.2 |
| NuPAGE 3–8% Tris acetate gels | Invitrogen | EA0375PK2 | Protocol Section Number-5.4 |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running buffer | Invitrogen | LA0041 | Protocol Section Number-5.4 |
| PEI 25K | Polysciences | 23966-1 | Protocol Section Number-4.1 |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15070063 | Protocol Section Number-4.2 |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Cytiva | SH30256.02 | Protocol Section Number-4.5 |
| plasmid miniprep kit | Qiagen | 27104 | Protocol Section Number-2.6 |
| PmeI | New England Biolab | R0560S | Protocol Section Number-2.2 |
| precast Bis-tris gel- 3-12% NativePAGE Novex Bis-Tris Gel | Invitrogen | BN1003BOX | Protocol Section Number-8.4 |
| protease inhibitor cocktail | GoldBio | GB-331-1 | Protocol Section Number-5.1 |
| SEC-MALS analysis software - Astra 7 | Wyatt Technology | Protocol Section Number-7.6 | |
| secondary antibody -IRdye 800 CW goat anti-mouse IgG | LiCor | 926-32210 | Protocol Section Number-5.9 |
| Superose 6 pg XK 16/70 | Cytiva | 90100042 | Protocol Section Number-6.2 |
| Tris base | Fisher | BP152 | Protocol Section Number-5.6 |
| Tween-20 | Thermo Fisher | AAJ20605AP | Protocol Section Number-6.1.1 |
| UV spectrometer - Nanodrop 8000 | Thermo Fisher | ND-8000-GL | Protocol Section Number-2.2 |
| XK26/100 | Cytiva | 28988951 | Protocol Section Number-6.1.1 |
References
- Walker, F. O.
- McColgan, P., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: a clinical review. European Journal of Neurology. 25 (1), 24-34 (2018).
- Duyao, M., et al. Trinucleotide repeat length instability and age of onset in Huntington's disease. Nature Genetics. 4 (4), 387-392 (1993).
- MacDonald, M. E., et al. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
- Nasir, J., et al. Targeted disruption of the Huntington's disease gene results in embryonic lethality and behavioral and morphological changes in heterozygotes. Cell. 81 (5), 811-823 (1995).
- Dragatsis, I., Levine, M. S., Zeitlin, S. Inactivation of Hdh in the brain and testis results in progressive neurodegeneration and sterility in mice. Nature Genetics. 26 (3), 300-306 (2000).
- Anne, S. L., Saudou, F., Humbert, S. Phosphorylation of huntingtin by cyclin-dependent kinase 5 is induced by DNA damage and regulates wild-type and mutant huntingtin toxicity in neurons. Journal of Neuroscience. 27 (27), 7318-7328 (2007).
- Dietrich, P., Johnson, I. M., Alli, S., Dragatsis, I. Elimination of huntingtin in the adult mouse leads to progressive behavioral deficits, bilateral thalamic calcification, and altered brain iron homeostasis. PLoS Genetics. 13 (7), 1006846 (2017).
- Dragatsis, I., et al. Effect of early embryonic deletion of huntingtin from pyramidal neurons on the development and long-term survival of neurons in cerebral cortex and striatum. Neurobiology of Disease. 111, 102-117 (2018).
- Benn, C. L., et al. Huntingtin modulates transcription, occupies gene promoters in vivo, and binds directly to DNA in a polyglutamine-dependent manner. Journal of Neuroscience. 28 (42), 10720-10733 (2008).
- Saudou, F., Humbert, S.
- Davies, S. W., et al. Formation of neuronal intranuclear inclusions underlies the neurological dysfunction in mice transgenic for the HD mutation. Cell. 90 (3), 537-548 (1997).
- DiFiglia, M., et al. Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science. 277 (5334), 1990-1993 (1997).
- Gutekunst, C. A., et al. Nuclear and neuropil aggregates in Huntington's disease: Relationship to neuropathology. Journal of Neuroscience. 19 (7), 2522-2534 (1999).
- Hodgson, J. G., et al. A YAC mouse model for Huntington's disease with full-length mutant huntingtin, cytoplasmic toxicity, and selective striatal neurodegeneration. Neuron. 23 (1), 181-192 (1999).
- Hoffner, G., Djian, P. Polyglutamine aggregation in Huntington disease: does structure determine toxicity. Molecular Neurobiology. 52 (3), 1297-1314 (2015).
- Waldvogel, H. J., Kim, E. H., Tippett, L. J., Vonsattel, J. P. G., Faull, R. L. M.
- Kim, M. Beta conformation of polyglutamine track revealed by a crystal structure of huntingtin N-terminal region with insertion of three histidine residues. Prion. 7 (3), 221-228 (2013).
- Hoop, C. L., et al. Huntingtin exon 1 fibrils feature an interdigitated β-hairpin-based polyglutamine core. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1546-1551 (2016).
- Vieweg, S., Ansaloni, A., Wang, Z. M., Warner, J. B., Lashuel, H. A. An intein-based strategy for the production of tag-free huntingtin exon 1 proteins enables new insights into the polyglutamine dependence of Httex1 aggregation and fibril formation. Journal of Biological Chemistry. 291 (23), 12074-12086 (2016).
- Seong, I. S., et al. Huntingtin facilitates polycomb repressive complex 2. Human Molecular Genetics. 19 (4), 573-583 (2009).
- Li, W., Serpell, L. C., Carter, W. J., Rubinsztein, D. C., Huntington, J. A. Expression and characterization of full-length human huntingtin, an elongated HEAT repeat protein. Journal of Biological Chemistry. 281 (23), 15916-15922 (2006).
- Vijayvargia, R., et al. Huntingtin's spherical solenoid structure enables polyglutamine tract-dependent modulation of its structure and function. eLife. 5, 11184 (2016).
- Huang, B., et al. Scalable production in human cells and biochemical characterization of full-length normal and mutant huntingtin. PLoS ONE. 10 (3), 0121055 (2015).
- Guo, Q., et al. The cryo-electron microscopy structure of huntingtin. Nature. 555 (7694), 117-120 (2018).
- Harding, R. J., et al. Design and characterization of mutant and wildtype huntingtin proteins produced from a toolkit of scalable eukaryotic expression systems. Journal of Biological Chemistry. 294 (17), 6986-7001 (2019).
- Harding, R. J., et al. HAP40 orchestrates huntingtin structure for 1 differential interaction with polyglutamine 2 expanded exon 1. bioRxiv. , (2021).
- Huang, B., et al. Pathological polyQ expansion does not alter the conformation of the Huntingtin-HAP40 complex. Structure. 29 (8), 804-809 (2021).
- Colin, E., et al. Huntingtin phosphorylation acts as a molecular switch for anterograde/retrograde transport in neurons. EMBO Journal. 27 (15), 2124-2134 (2008).
- Thompson, L. M., et al. IKK phosphorylates Huntingtin and targets it for degradation by the proteasome and lysosome. Journal of Cell Biology. 187 (7), 1083-1099 (2009).
- Ratovitski, T., et al. Post-translational modifications (PTMs), identified on endogenous Huntingtin, cluster within proteolytic domains between HEAT repeats. Journal of Proteome Research. 16 (8), 2692-2708 (2017).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of western blot data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
- Tarazona, M. P., Saiz, E. Combination of SEC/MALS experimental procedures and theoretical analysis for studying the solution properties of macromolecules. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 56 (1-3), 95-116 (2003).
- Folta-Stogniew, E. Oligomeric states of proteins determined by size-exclusion chromatography coupled with light scattering, absorbance, and refractive index detectors. Methods in Molecular Biology. 328, Clifton, N.J. 97-112 (2006).
- McMeekin, T. L., Wilensky, M., Groves, M. L. Refractive indices of proteins in relation to amino acid composition and specific volume. Biochemical and Biophysical Research Communications. 7 (2), 151-156 (1962).
- Atwal, R. S., et al. Huntingtin has a membrane association signal that can modulate huntingtin aggregation, nuclear entry and toxicity. Human Molecular Genetics. 16 (21), 2600-2615 (2007).
- Kegel-Gleason, K. B. Huntingtin interactions with membrane phospholipids: Strategic targets for therapeutic intervention. Journal of Huntington's Disease. 2 (3), 239-250 (2013).
- Michalek, M., Salnikov, E. S., Werten, S., Bechinger, B. Membrane interactions of the amphipathic amino terminus of huntingtin. Biochemistry. 52 (5), 847-858 (2013).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schägger, H.
- Nissley, D. A., O'Brien, E. P. Altered co-translational processing plays a role in huntington's pathogenesis-A hypothesis. Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 54 (2016).
- Kumar, N., Gammell, P., Clynes, M. Proliferation control strategies to improve productivity and survival during CHO based production culture: A summary of recent methods employed and the effects of proliferation control in product secreting CHO cell lines. Cytotechnology. 53 (1-3), 33-46 (2007).
