Vurdering af svømmeudholdenhed og svømmeadfærd hos voksne zebrafisk

Summary

I stand til funktionel genopretning efter rygmarvsskade er voksne zebrafisk et førende modelsystem til at belyse medfødte mekanismer for neural regenerering. Her beskriver vi svømmeudholdenhed og svømmeadfærdsanalyser som funktionelle aflæsninger af rygmarvsregenerering.

Abstract

På grund af deres berømte regenerative kapacitet er voksne zebrafisk en førende hvirveldyrmodel til at forhøre mekanismer for medfødt rygmarvsregenerering. Efter fuldstændig transektion af deres rygmarv strækker zebrafisk glial- og aksonale broer over afskåret væv, regenererer neuroner proksimale til læsionen og genvinder deres svømmekapacitet inden for 8 uger efter skaden. Restitution af svømmefunktionen er således en central aflæsning for funktionel rygmarvsreparation. Her beskriver vi et sæt adfærdsmæssige analyser for at kvantificere zebrafiskens motoriske kapacitet inde i en lukket svømmetunnel. Målet med disse metoder er at tilvejebringe kvantificerbare målinger af svømmeudholdenhed og svømmeadfærd hos voksne zebrafisk. For svømmeudholdenhed udsættes zebrafisk for en konstant stigende vandstrømshastighed indtil udmattelse, og tid ved udmattelse rapporteres. Til vurdering af svømmeadfærd udsættes zebrafisk for lave strømhastigheder, og svømmevideoer optages med en dorsal visning af fisken. Procent aktivitet, burstfrekvens og tid brugt mod vandstrømmen giver kvantificerbare aflæsninger af svømmeadfærd. Vi kvantificerede svømmeudholdenhed og svømmeadfærd hos zebrafisk af vild type før skade og efter rygmarvstranssektion. Vi fandt ud af, at zebrafisk mister svømmefunktionen efter rygmarvstranssektion og gradvist genvinder denne kapacitet mellem 2 og 6 uger efter skaden. De metoder, der er beskrevet i denne undersøgelse, kan anvendes til neuroadfærdsmæssige, muskuloskeletale, skeletmuskelregenerering og neurale regenereringsstudier hos voksne zebrafisk.

Introduction

Voksne zebrafisk bruges eminent til at undersøge mekanismer for neuromuskulær og muskuloskeletal udvikling og sygdomsmodellering1,2,3. Zebrafisk er i stand til effektiv, spontan reparation af flere væv, herunder hjernen, rygmarven og skeletmuskulaturen4,5,6,7. Den bemærkelsesværdige evne til at regenerere neuromuskulært væv og modelsygdomme tiltrækker et voksende videnskabeligt samfund til voksen zebrafiskforskning1,2,3. Men mens assays af bevægelse og svømmeadfærd er tilgængelige og standardiserede for larver zebrafisk, er der et voksende behov for at udvikle analoge protokoller i voksne fisk8,9,10,11. Målet med denne undersøgelse er at beskrive protokoller til at kvantificere svømmeudholdenhed og svømmeadfærd hos voksne zebrafisk. Vi præsenterer disse protokoller i forbindelse med rygmarvsregenereringsforskning. Imidlertid er de adfærdsprotokoller, der er beskrevet her, lige så anvendelige til undersøgelser af neural og muskelregenerering, neuromuskulær og muskuloskeletal udvikling samt neuromuskulær og muskuloskeletal sygdomsmodellering.

Zebrafisk omvendt lammelse inden for 8 uger efter fuldstændig rygmarvstranssektion. I modsætning til dårligt regenerative pattedyr viser zebrafisk pro-regenerative immun-, neuronale og glialskaderesponser, der er nødvendige for funktionel rygmarvsreparation12,13,14. En ultimativ aflæsning af funktionel rygmarvsreparation er det læsionerede vævs evne til at genvinde sin funktion efter skade. En række standardiserede metoder til vurdering af funktionel regenerering hos gnavere omfatter lokomotoriske, motoriske, sensoriske og sensorimotoriske tests15,16,17. Udbredte tests i musens rygmarvsskade omfatter den lokomotoriske Basso Mouse Scale (BMS), forbensmotoriske tests, taktile sensoriske tests og gittergang sensorimotoriske ^tests15,17. I modsætning til pattedyrs- eller larvezebrafiskesystemer er adfærdstest i voksne zebrafisk mindre udviklede, men alligevel meget nødvendige for at imødekomme de voksende behov i vævsregenererings- og sygdomsmodelleringssamfundene.

Komplette rygmarvstransektioner resulterer i fuldstændig lammelse kaudal til skadestedet. Kort efter skaden er lammede dyr mindre aktive og undgår at svømme så meget som muligt. For at kompensere for tabt svømmekapacitet viser lammede dyr korte, hyppige udbrud ved at overbruge deres brystfinner, som ligger rostrale til læsionen. Denne kompenserende svømmestrategi resulterer i hurtig udmattelse og lavere svømmekapacitet. Efterhånden som zebrafiskens rygmarv regenererer, genvinder dyrene en glat oscillerende svømmefunktion kaudal til læsionen, hvilket giver mulighed for øget svømmeudholdenhed og forbedrede svømmeadfærdsparametre. Her beskriver vi metoder til at kvantificere zebrafiskens svømmeudholdenhed ved stigende vandstrømshastigheder og svømmeadfærd ved lave strømhastigheder.

Protocol

Voksne zebrafisk af Ekkwill- og AB-stammerne blev opretholdt på Washington University Zebrafish Core Facility. Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med IACUC's institutionelle dyreprotokoller.

BEMÆRK: Et eksempel på forsøgsopstillingen er vist i figur 1A. Kalibreringslåget (tilpasset), svømmeudholdenhedslåget (tilpasset) og svømmeadfærdslåget (standard, lukket tunnellåg) er vist i figur 1B. Den eksperimentelle arbejdsgang er vist i figur 2.

1. Forberedelse og kalibrering af svømmetunnel

1. Fyld svømmetunnelen og den omgivende buffertank med vand fra zebrafisksystemet (10 L filtreret vand; alkalinitet: 50-150 mg/l _CaCO3; pH: 6,8-7,5; temperatur: 26-28,5 °C; nitrat < 50 mg/l; nitrit < 0,1 mg/l; og saltholdigheden < 0,5-1 g/l).
2. Fyld en ekstra gennemstrømningstank med zebrafisksystemvand (≈7,5 L). Placer svømmetunnelen og gennemstrømningstanken for at give mulighed for overskydende zebrafisksystemvand at strømme fra buffertanken ind i gennemstrømningstanken gennem et udstrømningsrør, der er fastgjort på siden af buffertanken.
3. Når tunnelen og buffertanken er fyldt, skal du udføre følgende.
   1. Placer skyllepumpen inde i buffertanken, og tilslut den til den tilstødende svømmetunnel med PVC-rør. Placer gennemstrømningspumpen inde i gennemstrømningstanken, og tilslut den til buffertankens væg.
   2. Tænd for skyllepumpen inde i buffertanken og gennemstrømningspumpen placeret i gennemstrømningstanken for at starte vandcirkulationen.
      BEMÆRK: Det dobbelte pumpesystem sikrer kontinuerlig vandgennemstrømning ind i svømmetunnelen (fra skyllepumpen) og ind i buffertanken (fra gennemstrømningspumpen).
   3. Ryd eventuelle luftbobler, der er fanget inde i svømmetunnelen, ved gradvist at øge vandstrømshastigheden fra 10 cm/s til 100 cm/s med intervaller på 10 cm/s. Sænk hastigheden tilbage til 0 cm/s i intervaller på 10 cm/s. Hvis du vil styre flowhastigheden, skal du klikke på pil op og pil ned i afsnittet Hastighed i flowhastighedsstyringssoftwaren (se Tabel over materialer).
      BEMÆRK: Motoren og rotoren er tilsluttet den medfølgende computer. Flowhastighedsstyringssoftwaren kommunikerer med motoren for at skabe den ønskede strømningshastighed. Brugen af flowhastighedsstyringssoftwaren er valgfri. Alternativet er at styre vandstrømsmotoren manuelt.
4. Kalibrering
   BEMÆRK: Kalibrering er påkrævet før hvert eksperiment.
   1. Brug kalibreringslåget til at lukke svømmetunnelen.
      BEMÆRK: Kalibreringslåget er tilpasset med en forstærket central åbning, der passer til flowmålersonden, der bruges til kalibrering (figur 1B). Otte vingemøtrikker bruges til at fastgøre alle lågene til tunnelen.
   2. Tænd for den digitale flowmåler, og tilslut den til flowmålersonden. Placer flowmålersonden inde i svømmetunnelen via kalibreringslåget. Placer strømningsmålersondens knive vinkelret på strømningsretningen.
   3. Kalibrer svømmetunnelmotorens output (styret med flowhastighedsstyringssoftwaren) ved hjælp af den digitale flowmåler. For at gøre dette skal du udføre følgende trin.
   4. Åbn flowhastighedsstyringssoftwaren, og klik på Kalibrering.
   5. Skift indstillingerne øverst til venstre til RPM vs Spænding. Forøg strømningshastigheden fra 0 cm/s til 100 cm/s i trin på 5 cm/s ved at skrive værdierne i afsnittet Hastighed i flowhastighedsstyringssoftwaren. Ved hvert trin skal du klikke på knappen "+" og registrere den aktuelle hastighed, der er angivet af den digitale flowmåler.
      BEMÆRK: Det resulterende lineære forhold skal have en ^R2-værdi tæt på 1.
   6. For at bekræfte kalibreringen skal du øge vandstrømshastighederne fra 0 til 10, 25, 50, 75 og 100 cm/s og derefter sænke hastighederne til 75, 50, 25, 10 cm/s ved hjælp af pil op og pil ned i Uwater [cm/s]- sektionen i flowhastighedsstyringssoftwaren. Ved hver hastighed (fra softwaren) måles og registreres den tilsvarende hastighed, der er angivet af den digitale flowmåler.
   7. Betragt tunnelen som kalibreret og nøjagtig, hvis de målte vandstrømshastigheder ligger inden for en afvigelse på ±2 cm/s. Hvis afvigelsen er over ±2 cm/s, gentages trin 1.4.4 til 1.4.6 for at sikre korrekt kalibrering.

2. Vurdering af svømmeudholdenhed

BEMÆRK: Eksperimentelle grupper er opdelt i grupper på 10 eller færre dyr til svømmeudholdenhed.

1. Konfigurer flowhastighedsstyringssoftwaren.
   BEMÆRK: Brugen af flowhastighedsstyringssoftwaren i dette afsnit er valgfri. Alternativet er at styre vandstrømsmotoren manuelt. For manuel vandstrømsstyring skal du fortsætte til trin 2.3 og manuelt øge vandstrømshastigheden i de specificerede trin i trin 2.5 og 2.6.
   1. Åbn flowhastighedsstyringssoftwaren. Klik på feltet Eksperiment. Fjern markeringen af Uswim og Uwater.
   2. Skift strømningshastigheden i Uwater [cm/s]- boksen nederst til venstre for at justere vandstrømshastighederne.
   3. For at starte en automatiseret protokol skal du klikke på feltet Start logføring . I det dialogvindue, der åbnes, skal du vælge Automatiseret på rullelisten.
   4. For at vælge en tidligere gemt protokolfil skal du klikke på filikonet ved siden af Protokolfil for at åbne den ønskede protokol.
   5. Konfigurer outputfilen ved at klikke på filikonet ved siden af Logfil. I filudforskervinduet, der åbnes, skal du navngive outputfilen og gemme den på det ønskede sted.
2. Konfigurer et split lap timer vindue. Sørg for at have samtidig adgang til flowhastighedsstyringssoftwaren og timervinduerne på computerskærmen.
3. Opret et akvarium til opsamling af fisk, der kan huse udmattede fisk, efter at de er fjernet fra svømmetunnelen. Fyld opsamlingstanken med zebrafiskesystemvand (0,75 L). Fyld et langt PVC-rør med zebrafisksystemvand.
   1. Anbring den ene ende (ende 1) af det fyldte PVC-rør i opsamlingstanken og den anden ende (ende 2) i buffertanken. Sørg for, at vand frit kan strømme fra buffertanken ind i opsamlingstanken.
   2. Fastgør den øverste ende af PVC-røret (ende 2) med en bindemiddelclips for at forhindre vandgennemstrømning. Brug bindemiddelklemmen til at styre udstrømningen af vand efter behov.
4. Luk svømmetunnelen ved hjælp af svømmeudholdenhedslåget.
   BEMÆRK: Svømmeudholdenhedslåget er tilpasset med et svømmetunnelvindue for at fjerne udmattede fisk fra svømmetunnelen uden at afbryde resten af analysen (figur 1B).
5. Placer en gruppe fisk inde i svømmetunnelen. Start split-omgangstimeren, mens du justerer strømhastigheden til 0 cm/s i 5 minutter, 9 cm/s i 5 minutter og 10 cm/s i 5 minutter ved at skrive disse værdier i Uwater [cm/s]- sektionen i flowhastighedsstyringssoftwaren.
   BEMÆRK: Dette trin vil akklimatisere dyr til svømmetunnelen og strømningsretningen.
6. Efter akklimatisering af fisk skal du starte det automatiserede flowhastighedskontrolprogram, der vil øge vandstrømshastigheden med 2 cm / s hvert minut.
   BEMÆRK: Fisk vil svømme indtil udmattelse. Udmattede fisk skubbes mod bagenden af svømmetunnelen.
7. Når en fisk er opbrugt, skal du løsne fiskeopsamlingsrøret, åbne svømmetunnelvinduet og samle fisken i opsamlingstanken. Optag tiden ved udmattelse ved hjælp af split lap timer.
   BEMÆRK: Fisk kan lejlighedsvis drive til bagenden af svømmetunnelen uden at være udmattede. For at sikre, at en fisk er udmattet, skal du forsigtigt trykke på tunnelens bagende eller skabe en skygge over dette område for at stimulere fisken til at svømme. Udmattede fisk reagerer ikke på den forskrækkede stimulus og ligger fladt i bagenden af tunnelen.
8. Gentag trin 2.7, indtil alle fiskene er opbrugt og samlet i opsamlingstanken. Klik på knappen Nødstop på flowhastighedsstyringssoftwaren, og stop timeren.
   BEMÆRK: Dobbelttjek under hele svømmeturen, om antallet af fisk, der fjernes fra svømmetunnelkammeret, svarer til de registrerede tider.
9. Gentag trin 2,5 til 2,8 for hver gruppe fisk.
   BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her, men for at være nøjagtig til tidspunktet efter skaden anbefales det, at film og udholdenhedssvømning udføres samme dag. Tunnelen kan fortsætte med at cirkulere, mens eksperimenter er sat på pause.

3. Optagelse af videoer til svømmeadfærdsanalyse

BEMÆRK: Kun op til fem dyr kan spores ad gangen. Hvis forsøgsgrupperne er større end fem dyr, kan der optages flere videoer for hver gruppe, hvor den første video sporer fem eller færre dyr, og den anden video sporer de andre fem eller færre dyr. For langsgående undersøgelser, der sigter mod at spore individuelle dyr over tid, kan fisk opholdes individuelt og spores på tværs af flere tidspunkter. Alle scripts til sporing og analyse er tilgængelige via GitHub (se Tabel over materialer).

1. Tænd for panelet Infrarødt lys under svømmetunnelen. Fastgør kameraet på et loftsbeslag oven på svømmetunnelen. Juster fokus- og blænderinge.
   BEMÆRK: Fokus- og blændeindstillinger afhænger af afstanden mellem kameraet og svømmetunnelen samt lysmiljøet.
2. Åbn kameraets optagelsessoftware (se Materialetabel). Indstil softwareindstillingerne som følger.
   1. Klik på 1:4-aspektvisningen. Sørg for, at synsfeltet dækker hele svømmetunnelen. Deaktiver automatisk kontrast og automatisk hvidbalance for at normalisere baggrunden og kontrasten på tværs af grupper.
   2. Åbn vinduet Kameraegenskaber ved at klikke på skruenøgleikonet. Indstil parametrene som følger: Pixelur: 344 MHz, Billedhastighed: 70 fps, klik på afkrydsningsfeltet ud for Hold for at kontrollere det, Eksponeringstid: 0,290 ms. Luk ikke dette vindue.
   3. Beskær optagelsesvinduet , så det kun dækker tunnelens svømmekammer, ved at vippe/dreje kameraet efter behov.
3. Åbn optagelsesvinduet ved at klikke på ikonet for filmrullen. Indstil optagelsesindstillingerne som følger:
   1. Marker afkrydsningsfeltet for det maksimale antal rammer.
   2. Indtast manuelt 63.000 for antallet af billeder.
   3. Marker afkrydsningsfeltet for Beregn. Dette gør det muligt for programmet at trække den billedhastighed, der er defineret i trin 3.2.2 (70 fps).
   4. Skift JPEG-kvalitet til 30.
4. Optag en testkørsel.
   1. Klik på Opret og navngiv den nye fil Test og gem den på skrivebordet.
   2. Gå tilbage til optagelsesvinduet, og klik på Optag. Lad testfilmen køre i hele protokollens varighed (15 min).
   3. Når testen er afsluttet, skal du sørge for, at der ikke er nogen tabte rammer, og at der optages 63.000 billeder.
5. Anbring en gruppe fisk i svømmetunnelen, og luk tunnelen ved hjælp af et fuldt lukket standardlåg (figur 1B).
   BEMÆRK: Sørg for, at alle fiskene er i tunnelen, inden låget strammes helt. Sørg for, at der ikke er luftbobler under låget. Dette vil ellers påvirke resultaterne.
6. Åbn et nyt optagelsesvindue, og navngiv filen. Eksempel: 2_A_1_00001_WildtypeGroupA.avi
   BEMÆRK: Sørg for, at indstillingerne er i overensstemmelse med parametrene i trin 3.2 og 3.3. JPEG-kvaliteten går altid tilbage til standard og skal nulstilles for hver ny film.
   FORSIGTIG: Klik ikke på optag endnu.
7. Start et nyt eksperiment ved hjælp af flowhastighedsstyringssoftwaren.
   BEMÆRK: For at starte en automatiseret protokol skal du klikke på feltet Start logføring . I det dialogvindue, der åbnes, skal du vælge Automatiseret på rullelisten. For at vælge en tidligere gemt protokolfil skal du klikke på filikonet ved siden af Protokolfil for at åbne den ønskede protokol.
   1. For at starte en manuel protokol skal du indstille strømningshastigheden til 0 cm/s i 5 minutter, 10 cm/s i 5 minutter efterfulgt af 20 cm/s i 5 minutter ved hjælp af boksen Uwater [cm/s] i flowhastighedsstyringssoftwaren.
   2. Gem den nye dataoutputfil (gemmes som en .csv-fil) under samme navn som filmfilen og i samme mappe.
      FORSIGTIG: Klik ikke på start endnu.
8. Placer et papirhåndklæde eller et stykke stof på siden af svømmetunnelen for at sikre, at al adfærd skyldes fiskesvømning og ikke skyldes en forskrækkelsesreaktion forårsaget af bevægelse i miljøet.
9. I hurtig rækkefølge skal du sørge for, at vandet er roligt, og at der ikke bevæger sig krusninger over rammen. Klik på Optag i kameraets softwarevindue for at starte optagelsen af filmfilen. Klik på Start i flowhastighedsstyringssoftwaren for at starte protokollen, som fortsætter uafbrudt.
10. Se filmen for at sikre, at ingen rammer tabes, at der ikke er bobler i synsfeltet, og at alle fisk optages.
11. Når filmoptagelsen er afsluttet, skal du klikke på Nødstop for at afslutte flowhastighedskontrolprotokollen. Kontroller, om dataoutputfilen gemmes automatisk. Klik på Luk i optagelsesvinduet for at gemme filmfilen.
12. Fjern låget. Hent forsigtigt fiskene og returner dem til deres tank.
13. Gentag trin 3.5 til 3.12 for alle grupper af fisk.
14. Når filmoptagelsen er færdig for alle grupperne, skal du konvertere film fra 70 fps-videoer til 20 fps-videoer med MovieProcessing_v5.bat-scriptet . For at gøre dette skal du flytte scriptfilen til den mappe, der indeholder raw-videoerne. Højreklik på filen, og vælg Kør.
    BEMÆRK: Scriptet kører automatisk. Et kommandopromptvindue vises, der viser scriptets fremskridt. Ovenstående trin er valgfrit. Det reducerer antallet af billeder i en 15 minutters video fra 63.000 til 18.000 billeder og gør SwimBehavior_v7. R-script kører hurtigere.
15. Tøm tunnelen og læg alt udstyret væk.

4. Analyse af film til vurdering af svømmeadfærd

BEMÆRK: Filmoptagelse og analyse kan afsluttes på separate dage.

1. Åbn scriptet Tracking_v2.ijm i Fiji , og klik på Kør for at starte programmet. I det vindue, der dukker op, skal du vælge den mappe, der indeholder de svømmeadfærdsfilm, der skal spores, og klikke på Åbn. Se efter ramme 1 i den første film, en dialogboks og den region of interest (ROI) manager, der kommer op.
2. Følg anvisningerne i dialogboksen. Opret et investeringsafkast for bunden af svømmetunnelkammeret, og klik på OK. Sørg for, at der ikke ses sorte hjørner.
   BEMÆRK: Tærskelvinduet åbnes sammen med en redigeret, tærskelramme 1.
3. Skift farveskemaet fra B&W til Rødt. Juster den maksimale værdi , indtil ramme 1 viser fisken i rødt og intet andet. Optag tærsklen. Klik på OK i dialogboksen.
   BEMÆRK: Programmet kører automatisk. Det investeringsafkast, der blev lavet til frame 1, vil løbende blive valgt og ikke valgt til efterfølgende rammer. En statuslinje overvåger processen i nederste højre hjørne af Fiji-vinduet . Sporing tager cirka 40 minutter pr. Film. Når alle filmene spores, stopper Fiji-programmet . ROI vil stoppe med at blive valgt. Mappen, der indeholder filmene, har nu en _raw.csv fil for hver film. Fiji kan lukkes på dette tidspunkt.
4. Justering, samling og erhvervelse af beskrivende statistikker
   1. Åbn Behavior_v7. R-script i R Studio.
   2. Klik på Kilde i øverste højre hjørne af scriptafsnittet. I et nyt vindue, der åbnes, skal du vælge den mappe, der indeholder de _raw.csv filer, der er genereret af Fiji. Klik på Åbn.
      BEMÆRK: Programmet kører automatisk.
   3. I en dialogboks, der vises, hvor du bliver bedt om at bekræfte antallet af fisk i hver film, skal du klikke på Ja , hvis de angivne tal er korrekte, eller klikke på Nej , hvis tallene er forkerte.
      BEMÆRK: Hvis der blev klikket på Nej, vises en meddelelse, der beder om, at filmene spores igen med et nyt investeringsafkast og en ny tærskel. Hvis der blev klikket på Ja, fortsætter programmet.
   4. I det nye vindue, der åbnes, og spørg, om den ikke-svømmende fisk skal fjernes, skal du klikke på Ja eller Nej.
      BEMÆRK: Ikke-svømmende fisk defineres som fisk med mindre end 50% aktivitet ved 10 cm/s. Det anbefales ikke, at ikke-svømmende fisk fjernes.
   5. I et nyt pop op-vindue, der spørger, om grupperne er afblindede, og om brugeren ønsker at kombinere grupper, afblinde eller kombinere grupper, hvis der er mere end én kontrolgruppe.
   6. Når der er givet et svar på det foregående spørgsmål, skal du sikre dig, at programmet giver en meddelelse Justering af fil X af Y, hvor X er den aktuelle fil, der justeres, og Y er det samlede antal filer, der skal justeres. Det tager cirka 30 s for hver fil at blive justeret.
5. Når filerne er justeret, skal du kontrollere, om der er en ny .csv fil, der er genereret med samme navn (_aligned.csv). Sørg for, at programmet kombinerer dataene, kører statistik og plotter outputgrafer. Kontrollér, om der er genereret analysefiler i en ny mappe med navnet Resultater i den overordnede mappe, der indeholder _raw.csv og _aligned.csv filer.
6. I mappen Resultater skal du kontrollere, om der er to mapper med navnet Diagnostik og grafer og fire .csv filer med navnet BulkData_Avg, BulkData_Full, SummaryData_Avg og SummaryData_Full.
   BEMÆRK: SummaryData_Full.csv indeholder de individuelle data for hver fisk i hver gruppe på hvert tidspunkt. Disse data plotes automatisk, men kan udtrækkes og plotes andre steder.
   1. Sørg for, at mappen Grafer indeholder de grafer, der genereres af programmet, og .csv filer, der indeholder datapunkterne for hver graf.
   2. Sørg for, at mappen Diagnostik indeholder en enkelt .csv fil med diagnosticeringsdata for justerede filer.
      BEMÆRK: Kolonner i filen Diagnostik.csv indeholder følgende: a) Antallet af rammer, der indeholder ekstra objekter, som skal være mindre end 100. For mange rammer med ekstra objekter tyder på et problem med sporingen. b) Antallet af rammer med manglende eller flettede objekter. Det er normalt, at denne måling er høj. Fisk, der ikke har regenereret godt, vil ofte blive fejet til bagsiden af tunnelen og vil blive regnet som manglende. c) Rammer med mere end 240 pixel spring. Dette tal stiger med antallet af objekter (fisk) i en enkelt film. En detaljeret forklaring på, hvordan adfærdsmålingerne blev beregnet, findes i Supplerende fil 1.

Representative Results

Vi opstillede svømmetunnelen som beskrevet i afsnit 1 i denne protokol (figur 1). Vi vurderede svømmeudholdenhed (afsnit 2 i denne protokol) samt svømmeadfærd (afsnit 3 og 4 i denne protokol) hos voksne zebrafisk ved baseline og efter rygmarvsskade (figur 2).

Med henblik på at fastslå baselinemotorisk funktion undersøgte vi svømmeudholdenheden for zebrafisk af vildtypen under stigende vandstrømshastigheder (figur 3A). I dette assay svømmede vildtype zebrafisk i 41 minutter, før de blev udmattede. Fisk blev derefter udsat for komplette rygmarvstransektioner som tidligere beskrevet, og der blev udført svømmeudholdenhedsanalyser6. Efter bedøvelse af zebrafisk ved hjælp af MS-222 laves et lille snit med fin saks for at transektere rygmarven 4 mm kaudal til hjernestammeområdet. En komplet transektion blev bekræftet visuelt. For at bekræfte tabet af svømmekapacitet efter rygmarvsoperation blev skadede dyr vurderet 2 eller 3 dage efter skade (dpi). På dette tidspunkt er zebrafisk fuldstændig lammet kaudal til læsionsstedet. Svømmeudholdenhed blev vurderet til 2, 4 og 6 uger efter skaden (wpi). Ved 2 wpi mistede læsionerede fisk 60% af deres svømmeudholdenhedskapacitet (figur 3A). Regenererende fisk genvandt gradvist svømme udholdenhed ved 4 og 6 wpi. Disse resultater viste, at vildtype zebrafisk er i stand til at genvinde svømme udholdenhedskapacitet efter rygmarvsskade.

For at undersøge zebrafiskens svømmeadfærd under rygmarvsregenerering sporede vi svømmeadfærden hos vildtypedyr ved 0 cm/s vandstrømshastighed eller under konstante, lave strømhastigheder på 10 og 20 cm/s (figur 3B). Gennemsnitlige spor af fiskeposition i svømmetunnelkammeret blev brugt til visuel vurdering af svømmeadfærd ved lave strømhastigheder (figur 3B). I dette assay svømmede uskadte kontroller støt i den forreste del af svømmetunnelkammeret (tættere på vandstrømmen), hvilket svarer til en forhøjet Y-position (figur 3B). I modsætning hertil var skadede fisk ved 2 wpi ikke i stand til at opretholde en stabil svømmekapacitet mod strømmen. Derfor er deres svømmebaner mere uregelmæssige med et samlet fald i Y-position (figur 3B). Y-positionen steg ved 4 og 6 wpi, hvilket indikerer, at regenererende dyr gradvist genvandt deres evne til at svømme foran svømmetunnelkammeret. For at kvantificere svømmeadfærdsparametre beregnede vi procentaktiviteten, positionen i svømmetunnelen (Y-position) og den svømmede tid mod strømmen (figur 3C-E). I forhold til uskadte kontroller var læsionerede dyr ved 2 wpi markant mindre aktive (figur 3C), gik i stå i svømmetunnelens bageste kvadrant (figur 3D) og mistede deres evne til at svømme mod lave strømhastigheder (figur 3E). I overensstemmelse med deres medfødte evne til at opnå funktionel genopretning normaliserede læsionerede dyr gradvist svømmeadfærdsparametre ved 4 og 6 wpi (figur 3C-E). Parametrene svømmeudholdenhed og svømmeadfærd tilbød tilsammen kvantificerbare udlæsninger af svømmefunktion og funktionel rygmarvsreparation hos zebrafisk.

Figur 1: Svømmetunnel opsat og tilpassede låg. A) Repræsentative billeder af den svømmetunnel, der er oprettet, herunder zoomet top- og sidevisning af svømmetunnelkammeret. (B) Billeder af de svømmetunnellåg, der anvendes til de forskellige anvendelser, der er beskrevet i denne protokol. Et standard, fuldt lukket svømmetunnellåg bruges til svømmeadfærdsanalyser (afsnit 3 i denne protokol). Et modificeret svømmetunnellåg, der rummer en håndholdt digital flowmåler, bruges til kalibrering (afsnit 1 i denne protokol). Et modificeret svømmeudholdenhedslåg, der indeholder et aftageligt låg i den bageste ende af svømmetunnelkammeret, gør det muligt at fjerne udmattede fisk under svømmeudholdenhedstest (afsnit 2 i denne protokol). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Eksperimentel pipeline til assay for svømmeudholdenhed og svømmeadfærd hos voksne zebrafisk. Til svømme udholdenhed svømmede fisk mod en stigende vandstrøm indtil udmattelse. For svømmeadfærd vurderes svømmeparametre i fravær af og ved lave strømhastigheder. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Funktionel restitution hos vildtype zebrafisk efter rygmarvsskade. A) Motorisk funktion bestemt ved svømmeudholdenhedsanalyser for vildtype zebrafisk ved baseline og 2, 4 og 6 wpi. Prikker betegner individuelle dyr fra to uafhængige forsøg. (B) Svømmeadfærdsanalyser spores vildtype zebrafisk under lave vandstrømshastigheder. Den gennemsnitlige Y-position vises på hvert tidspunkt under hele sporingen (0 cm/s i 5 minutter, 10 cm/s i 5 minutter og 20 cm/s i 5 minutter). (C-E) Procentaktivitet (C), gennemsnitlig Y-position i tunnelen (D) og tid svømmet mod strømmen (E) blev kvantificeret til 20 cm/s. For alle kvantificeringer vises to uafhængige eksperimenter. n = 30 i tilstanden før skaden n = 23 ved 2 wpi, n = 20 ved 4 wpi, n = 18 ved 6 wpi. Envejs ANOVA blev brugt til statistiske analyser. Fejllinjer repræsenterer standardfejlen i middelværdien (SEM). *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001; P < 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil 1: Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Voksne zebrafisk er et populært hvirveldyrsystem til modellering af menneskelige sygdomme og undersøgelse af mekanismer for vævsregenerering. CRISPR/Cas9 genomredigering har revolutioneret omvendte genetiske studier til modellering af sygdomme hos zebrafisk; Genetik i stor skala hos voksne zebrafisk er imidlertid blevet hæmmet af biologiske og tekniske udfordringer, herunder manglende tilgængelighed af voksne zebrafiskvæv til fænotyping med høj kapacitet. I betragtning af den komplekse anatomi af voksne zebrafisk er langvarig histologisk behandling nødvendig for at opnå og analysere vævsarkitektur. De svømmeudholdenheds- og svømmeadfærdsassays, der er beskrevet i denne undersøgelse, kan bruges til at forscreene for neurale, muskulære eller skeletfænotyper ved en medium gennemstrømning før histologi. Da undersøgelser af vævsregenerering sigter mod at forbedre funktionel vævsreparation, vil de protokoller, der er beskrevet i denne undersøgelse, desuden være bredt anvendelige, hvis ikke afgørende, til undersøgelser af neurale, muskulære og skeletregenereringsforskning.

Funktionelle bevægelsesanalyser har været en integreret del af vores forståelse af neural udvikling og regenerering. Standard lokomotoriske assays er bredt tilgængelige i hvirveldyrarter, herunder rotter, mus og larver zebrafisk. Muse- og rottemodelsystemer har adfærdsmæssige og funktionelle bevægelsesassays som henholdsvis ^BMS16 og ^BBB17,18. Tilsvarende er der beskrevet et væld af protokoller til måling af bevægelse, forskrækkelsesrespons og adfærd hos larvezebrafisk. Disse protokoller er effektive til at afsløre adfærdsmæssige forskelle mellem eksperimentelle grupper i lyse og mørke miljøer, rovdyrunddragelse og aktivitet19,20,21. Her beskriver vi kvantificerbare, reproducerbare metoder til måling af funktionel restitution efter rygmarvsskade hos voksne zebrafisk.

Bemærk, at denne undersøgelse præsenterer flere begrænsninger. For det første er adfærdsundersøgelser meget afhængige af genetiske og miljømæssige faktorer. For at kontrollere for genetisk variabilitet brugte vi søskende til at kontrollere for alder, køn og den genetiske baggrund på tværs af eksperimentelle ^grupper22,23. For at kontrollere for miljøfaktorer sørgede vi for, at eksperimenter udføres på samme tidspunkt af dagen under kontrollerede temperatur- og ^lysforhold20. For det andet, mens svømmeadfærdsanalysen er mindre følsom over for forudindtaget analyse, bestemmer forskeren, der kører svømmeudholdenhedsanalysen, hvornår en fisk når udmattelse og fortsætter med at fjerne udmattede fisk fra svømmetunnelkammeret uden at afbryde resten af fiskekohorten. Således blev vores svømmeudholdenhedseksperimenter udført af en enkelt forsker, der er blindet for eksperimentelle forhold. Det er især vigtigt at undgå forsker-til-forsker-variabilitet for langsgående undersøgelser af eksperimentelle grupper over tid. Endelig kan kollisioner mellem fisk komplicere sporingsanalysen i svømmeadfærdsassays. Vi anbefaler derfor at udføre svømmeadfærdsanalyser for grupper på fem eller færre fisk for at minimere chancerne for kollisioner mellem fisk.

I betragtning af kritiske trin bemærker vi, at skadede fisk kan være skrøbelige, især i de tidlige dage efter skade. Vi anbefaler derfor at håndtere fisk med ekstrem omhu. Til svømme udholdenhedsanalyser reducerer indsamling af fisk med PVC-røret så hurtigt som muligt, enten hoved eller hale først, risikoen for sekundære skader under indsamlingsprocessen. Til svømmeadfærdsanalyser kan skyllepumpen lejlighedsvis skabe bølger, forvrænge filmene og forårsage analysefejl. I dette tilfælde kan skyllepumpen kortvarigt slukkes. Vi anbefaler dog ikke at slukke for skyllepumpen i længere tid for at sikre, at der konstant cirkulerer vand mellem svømmetunnelkammeret og buffertanken. Overvågning af filmoptagelse giver mulighed for øjeblikkelig afslutning og genstart af filmen, hvis en ramme er blevet tabt, eller en fisk forvilder sig væk fra optagelsesområdet. I yderligere overvejelser, mens du udfører sporingsanalysen, hvis R-koden giver en fejl under filbehandling, er det mest sandsynlige problem i navngivningen af filerne. Programmet er lavet til at fungere under en meget specifik navngivningsstrategi: Timepoint_Group_Subgroup_Stock number_Anything andet (for eksempel 0_A_1_00001_WildtypeGroupA.avi). Denne navngivning gør det muligt at tegne og justere flere tidspunkter, grupper og undergrupper sammen. Endelig, mens kontrolpunkter er indbygget i analysescriptet for at sikre korrekt sporing, er det vigtigt at kontrollere analyseoutputtet omhyggeligt. Programmet spørger automatisk, om fiskenummeret er korrekt, og beder om film til genanalyse, hvis fiskenummeret er forkert. Lineære artefakter kan forekomme i plottet Gennemsnitlig Y-position, hvilket indikerer, at et ekstra objekt er blevet genkendt som en fisk. I dette tilfælde er det bedste handlingsforløb at se filmen omhyggeligt for at udelukke ekstra artefakter, der har tendens til at vises med en højere strømningshastighed.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AutoSwim software	Loligo Systems	MI10000	Optional - for Automatic control of current velocity
Customized lid	Loligo Systems	MI10001	This customized lid is used for swim endurance
DAQ-BT	Loligo Systems	SW10600	Optional - for Automatic control of current velocity
Eheim pump	Loligo Systems	PU10160	20 L/min. This pump is placed in theflow-through tank.
Fiji	Fiji	Freely available through Image J (Fiji)	Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior
Flowtherm	Loligo Systems	AC10000	Handheld digital flow meter - for calibration
High Speed Camera	Loligo Systems	VE10380	USB 3.0 color video camera (4MP)
IR light panel	Loligo Systems	VE10775	450 x 210 mm, placed under the swim tunnel  chamber
Monofocal lens	Loligo Systems	VE10388	25mm manual lens
PVC Tubing	VWR	60985-534	5/16 x 7/16"  Wall thickness: 1/16"
R Studio	R Studio	Freely available. Version 3.6 with extra packages.	Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior
Swim tunnel respirometer	Loligo Systems	SW10060	5L (120V/60Hz). The system includes the swim chamber, motor, manual control of water current velocity, 1 pump placed inside the chamber, standard swim tunnel lid for swim behavior, and modified swim tunnel lid for calibration
uEye Cockpit	IDS	Freely available software to control camera parameters	Alternative cameras and accompanying softwares could be used
Vane wheel flow probe	Loligo Systems	AC10002	Digital flow probe - for calibration