Summary
Volwassen zebravis is in staat tot functioneel herstel na een dwarslaesie en is een vooraanstaand modelsysteem om aangeboren mechanismen van neurale regeneratie op te helderen. Hier beschrijven we zwemuithoudingsvermogen en zwemgedragstests als functionele uitlezingen van regeneratie van het ruggenmerg.
Abstract
Vanwege hun beroemde regeneratieve vermogen zijn volwassen zebravissen een vooraanstaand gewerveld model om mechanismen van aangeboren regeneratie van het ruggenmerg te ondervragen. Na volledige transsectie van hun ruggenmerg breiden zebravissen gliale en axonale bruggen uit over afgehakt weefsel, regenereren neuronen proximaal aan de laesie en herwinnen hun zwemcapaciteiten binnen 8 weken na verwonding. Herstel van de zwemfunctie is dus een centrale uitlezing voor functioneel ruggenmergherstel. Hier beschrijven we een reeks gedragstests om de motorcapaciteit van zebravissen in een afgesloten zwemtunnel te kwantificeren. Het doel van deze methoden is om kwantificeerbare metingen te leveren van zwemuithoudingsvermogen en zwemgedrag bij volwassen zebravissen. Voor zwemuithoudingsvermogen worden zebravissen onderworpen aan een constant toenemende waterstroomsnelheid tot uitputting en tijd bij uitputting wordt gemeld. Voor de beoordeling van het zwemgedrag worden zebravissen onderworpen aan lage stroomsnelheden en worden zwemvideo's vastgelegd met een dorsaal zicht op de vis. Procentuele activiteit, barstfrequentie en tijd doorgebracht tegen de waterstroom bieden kwantificeerbare uitlezingen van zwemgedrag. We kwantificeerden zwemuithoudingsvermogen en zwemgedrag bij wild-type zebravissen vóór letsel en na ruggenmergtranssectie. We ontdekten dat zebravissen de zwemfunctie verliezen na dwarslaesie en geleidelijk die capaciteit terugkrijgen tussen 2 en 6 weken na het letsel. De methoden die in deze studie worden beschreven, kunnen worden toegepast op neurobehaviorale, musculoskeletale, skeletspierregeneratie en neurale regeneratiestudies bij volwassen zebravissen.
Introduction
Volwassen zebravissen worden bij uitstek gebruikt om mechanismen van neuromusculaire en musculoskeletale ontwikkeling en ziektemodellering te onderzoeken1,2,3. Zebravissen zijn in staat tot efficiënt, spontaan herstel van meerdere weefsels, waaronder de hersenen, het ruggenmerg en de skeletspieren4,5,6,7. Het opmerkelijke vermogen om neuromusculaire weefsels en modelziekten te regenereren, trekt een groeiende wetenschappelijke gemeenschap aan voor onderzoek naar volwassen zebravissen1,2,3. Hoewel testen van voortbeweging en zwemgedrag beschikbaar en gestandaardiseerd zijn voor larvale zebravissen, is er een groeiende behoefte om analoge protocollen te ontwikkelen bij volwassen vissen8,9,10,11. Het doel van deze studie is om protocollen te beschrijven om zwemuithoudingsvermogen en zwemgedrag bij volwassen zebravissen te kwantificeren. We presenteren deze protocollen in het kader van ruggenmergregeneratieonderzoek. De gedragsprotocollen die hier worden beschreven, zijn echter evenzeer van toepassing op studies naar neurale en spierregeneratie, neuromusculaire en musculoskeletale ontwikkeling, evenals neuromusculaire en musculoskeletale ziektemodellering.
Zebravis omgekeerde verlamming binnen 8 weken na volledige ruggenmergtranssectie. In tegenstelling tot slecht regeneratieve zoogdieren vertonen zebravissen pro-regeneratieve immuun-, neuronale en gliale letselresponsen die nodig zijn voor functioneel ruggenmergherstel12,13,14. Een ultieme uitlezing van functioneel ruggenmergherstel is het vermogen van het laesieweefsel om zijn functie na een verwonding terug te krijgen. Een reeks gestandaardiseerde methoden om functionele regeneratie bij knaagdieren te beoordelen, omvat locomotorische, motorische, sensorische en sensomotorische tests15,16,17. Veel gebruikte tests bij dwarslaesie bij muizen omvatten de locomotorische Basso Mouse Scale (BMS), motorische tests voor de voorpoot, tactiele sensorische tests en sensomotorische tests voor het lopen van rasters15,17. In tegenstelling tot zoogdier- of larvale zebravissystemen zijn gedragstests bij volwassen zebravissen minder ontwikkeld, maar toch hard nodig om tegemoet te komen aan de groeiende behoeften van de weefselregeneratie en ziektemodelleringsgemeenschappen.
Volledige dwarslaesietranssecties resulteren in volledige verlamming caudaal naar de plaats van het letsel. Kort na het letsel zijn verlamde dieren minder actief en vermijden ze zoveel mogelijk zwemmen. Om de verloren zwemcapaciteit te compenseren, vertonen verlamde dieren korte, frequente uitbarstingen door hun borstvinnen te veel te gebruiken, die rostrale aan de laesie liggen. Deze compenserende zwemstrategie resulteert in snelle uitputting en een lagere zwemcapaciteit. Naarmate het ruggenmerg van de zebravis regenereert, krijgen dieren een soepele oscillerende zwemfunctie terug die dicht bij de laesie ligt, waardoor een verhoogd zwemuithoudingsvermogen en verbeterde zwemgedragsparameters mogelijk zijn. Hier beschrijven we methoden om het uithoudingsvermogen van zebravissen te kwantificeren bij toenemende waterstroomsnelheden en zwemgedrag bij lage stroomsnelheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Volwassen zebravissen van de Ekkwill- en AB-stammen werden onderhouden in de Washington University Zebrafish Core Facility. Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele dierprotocollen van de IACUC.
OPMERKING: Een voorbeeld van de experimentele opstelling is weergegeven in figuur 1A. Het kalibratiedeksel (aangepast), het zwemhoudingsdeksel (aangepast) en het zwemgedragdeksel (standaard, gesloten tunneldeksel) zijn weergegeven in figuur 1B. De experimentele workflow is weergegeven in figuur 2.
1. Voorbereiding en kalibratie van zwemtunnels
- Vul de zwemtunnel en het omliggende buffervat met zebravissysteemwater (10 L gefilterd water; alkaliteit: 50-150 mg / L CaCO3; pH: 6,8-7,5; temperatuur: 26-28,5 ° C; nitraat < 50 mg / L; nitriet < 0,1 mg / L; en zoutgehalte < 0,5-1 g / L).
- Vul een extra doorstroomtank met zebravissysteemwater (≈7,5 L). Plaats de zwemtunnel en de doorstroomtank om overtollig zebravissysteemwater uit het buffervat in de doorstroomtank te laten stromen via een uitstroombuis die aan de zijkant van het buffervat is bevestigd.
- Zodra de tunnel en het buffervat zijn gevuld, voert u het volgende uit.
- Plaats de spoelpomp in het buffervat en sluit deze met PVC-buizen aan op de aangrenzende zwemtunnel. Plaats de doorstroompomp in het doorstroomvat en sluit deze aan op de wand van het buffervat.
- Schakel de spoelpomp in het buffervat en de doorstroompomp in de doorstroomtank in om de watercirculatie te starten.
OPMERKING: Het dubbele pompsysteem zorgt voor een continue waterstroom in de zwemtunnel (van de spoelpomp) en in het buffervat (van de doorstroompomp). - Verwijder alle luchtbellen die in de zwemtunnel zijn opgesloten door de waterstroomsnelheid geleidelijk te verhogen van 10 cm / s naar 100 cm / s in intervallen van 10 cm / s. Verlaag de snelheid terug naar 0 cm/s met intervallen van 10 cm/s. Als u de stroomsnelheid wilt regelen, klikt u op de pijl-omhoog en pijl-omlaag in het gedeelte Snelheid van de stroomsnelheidsregelingssoftware (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: De motor en rotor zijn aangesloten op de bijbehorende computer. De flow velocity control software communiceert met de motor om de gewenste flowsnelheid te creëren. Het gebruik van de flow velocity control software is optioneel. Het alternatief is om de waterstroommotor handmatig aan te sturen.
- Calibratie
OPMERKING: Kalibratie is vereist voor elk experiment.- Gebruik het kalibratiedeksel om de zwemtunnel te sluiten.
OPMERKING: Het kalibratiedeksel is aangepast met een versterkte centrale opening die past op de stroommetersonde die wordt gebruikt voor kalibratie (figuur 1B). Acht vleugelmoeren worden gebruikt om alle deksels aan de tunnel vast te maken. - Schakel de digitale flowmeter in en sluit deze aan op de flowmetersonde. Plaats de stroommetersonde via het kalibratiedeksel in de zwemtunnel. Plaats de bladen van de stroommetersonde loodrecht op de richting van de stroom.
- Kalibreer de uitgang van de zwemtunnelmotor (geregeld met de flow velocity control software) met behulp van de digitale flowmeter. Voer hiervoor de volgende stappen uit.
- Open de stroomsnelheidsregelingssoftware en klik op Kalibratie.
- Wijzig de opties linksboven in RPM vs Voltage. Verhoog de stroomsnelheid van 0 cm/s naar 100 cm/s in stappen van 5 cm/s door de waarden in het gedeelte Snelheid van de stroomsnelheidsregelingssoftware te typen. Klik bij elke stap op de knop "+" en noteer de stroomsnelheid die wordt aangegeven door de digitale stroommeter.
OPMERKING: De resulterende lineaire relatie moet een R2-waarde hebben die dicht bij 1 ligt. - Om de kalibratie te bevestigen, verhoogt u de waterstroomsnelheden van 0 naar 10, 25, 50, 75 en 100 cm/s en verlaagt u vervolgens de snelheden tot 75, 50, 25, 10 cm/s met behulp van de pijlen omhoog en omlaag in het gedeelte Uwater [cm/s] van de stroomsnelheidsregelingssoftware. Meet en registreer bij elke snelheid (van de software) de overeenkomstige snelheid die wordt aangegeven door de digitale flowmeter.
- Beschouw de tunnel als gekalibreerd en nauwkeurig als de gemeten waterstroomsnelheden binnen een afwijking van ±2 cm / s liggen. Als de afwijking groter is dan ±2 cm/s, herhaalt u de stappen 1.4.4 tot en met 1.4.6 om een goede kalibratie te garanderen.
- Gebruik het kalibratiedeksel om de zwemtunnel te sluiten.
2. Beoordeling van het zwemuithoudingsvermogen
OPMERKING: Experimentele groepen zijn verdeeld in groepen van 10 of minder dieren voor zwemuithoudingsvermogen.
- Stel de flow velocity control software in.
OPMERKING: Het gebruik van de stroomsnelheidsregelingssoftware in dit gedeelte is optioneel. Het alternatief is om de waterstroommotor handmatig aan te sturen. Ga voor handmatige waterstroomregeling verder met stap 2.3 en verhoog handmatig de waterstroomsnelheid in de opgegeven stappen in stap 2.5 en 2.6.- Open de stroomsnelheidsregelingssoftware. Klik op het vak Experiment. Verwijder het vinkje bij Uswim en Uwater.
- Wijzig de stroomsnelheid in het vak Uwater [cm/s] linksonder voor het aanpassen van de waterstroomsnelheden.
- Als u een geautomatiseerd protocol wilt starten, klikt u op het vak Logboekregistratie starten . Kies in het dialoogvenster dat wordt geopend de optie Geautomatiseerd in de vervolgkeuzelijst.
- Om een eerder opgeslagen protocolbestand te kiezen, klikt u op het bestandspictogram naast Protocolbestand om het gewenste protocol te openen.
- Stel het uitvoerbestand in door op het bestandspictogram naast Logbestand te klikken. Geef in het verkennervenster dat wordt geopend het uitvoerbestand een naam en sla het op de gewenste locatie op.
- Stel een split lap timer venster in. Zorg ervoor dat u gelijktijdig toegang hebt tot de stroomsnelheidsregelingssoftware en timervensters op het computerscherm.
- Zet een aquarium voor het verzamelen van vissen op om uitgeputte vissen te huisvesten nadat ze uit de zwemtunnel zijn verwijderd. Vul de opvangtank met zebravissysteemwater (0,75 L). Vul een lange PVC buis met zebravis systeem water.
- Plaats het ene uiteinde (uiteinde 1) van de voorgevulde PVC-buis in de opvangtank en het andere uiteinde (uiteinde 2) in het buffervat. Zorg ervoor dat water vrij kan stromen van het buffervat in het opvangvat.
- Klem het bovenste uiteinde van de PVC-buis (uiteinde 2) vast met een bindmiddelclip om waterstroom te voorkomen. Gebruik de bindmiddelclip om de uitstroom van water naar behoefte te regelen.
- Sluit de zwemtunnel met behulp van het zwemuithoudingsdeksel.
OPMERKING: Het zwemuithoudingsdeksel is aangepast met een zwemtunnelvenster om uitgeputte vissen uit de zwemtunnel te verwijderen, zonder de rest van de test te onderbreken (figuur 1B). - Plaats een groep vissen in de zwemtunnel. Start de split lap timer terwijl u de stroomsnelheid aanpast aan 0 cm/s gedurende 5 min, 9 cm/s gedurende 5 min en 10 cm/s gedurende 5 min door deze waarden te typen in het gedeelte Uwater [cm/s] van de flow velocity control software.
OPMERKING: Deze stap zal dieren laten wennen aan de zwemtunnel en stroomrichting. - Na het acclimatiseren van vissen, start u het geautomatiseerde stroomsnelheidscontroleprogramma dat de waterstroomsnelheid elke minuut met 2 cm / s verhoogt.
OPMERKING: Vissen zwemmen tot uitputting. Uitgeputte vissen worden naar de achterkant van de zwemtunnel geduwd. - Wanneer een vis uitgeput is, maakt u de visopvangbuis los, opent u het raam van de zwemtunnel en verzamelt u de vis in de verzameltank. Noteer de tijd bij uitputting met behulp van de split lap timer.
OPMERKING: Vissen kunnen af en toe naar de achterkant van de zwemtunnel drijven zonder uitgeput te raken. Om ervoor te zorgen dat een vis uitgeput is, tikt u voorzichtig op de achterkant van de tunnel of creëert u een schaduw over dat gebied om de vis te stimuleren om te zwemmen. Uitgeputte vissen reageren niet op de schrikprikkel en liggen plat aan de achterkant van de tunnel. - Herhaal stap 2.7 totdat alle vissen zijn uitgeput en verzameld in het verzamelvak. Klik op de knop Noodstop op de stroomsnelheidsbesturingssoftware en stop de timer.
OPMERKING: Controleer tijdens het zwemmen of het aantal vissen dat uit de zwemtunnelkamer is verwijderd, overeenkomt met de geregistreerde tijden. - Herhaal stap 2.5 tot en met 2.8 voor elke groep vissen.
OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd, maar om nauwkeurig te zijn tot het tijdstip na het letsel, wordt aanbevolen dat films en duurzwemmen op dezelfde dag worden uitgevoerd. De tunnel kan blijven circuleren terwijl experimenten worden gepauzeerd.
3. Video's vastleggen voor zwemgedragstest
OPMERKING: Er kunnen maximaal vijf dieren tegelijk worden gevolgd. Als experimentele groepen groter zijn dan vijf dieren, kunnen meerdere video's worden gemaakt voor elke groep, waarbij de eerste video vijf of minder dieren volgt en de tweede video de andere vijf of minder dieren volgt. Voor longitudinale studies die gericht zijn op het volgen van individuele dieren in de loop van de tijd, kunnen vissen individueel worden gehuisvest en gevolgd op meerdere tijdstippen. Alle scripts voor tracking en analyse zijn beschikbaar via GitHub (zie Tabel met materialen).
- Schakel het infraroodlichtpaneel onder de zwemtunnel in. Bevestig de camera aan een plafondbevestiging bovenop de zwemtunnel. Pas de scherpstel- en diafragmaringen aan.
OPMERKING: De instellingen voor scherpstelling en diafragma zijn afhankelijk van de afstand tussen de camera en de zwemtunnel, evenals de lichtomgeving. - Open de opnamesoftware van de camera (zie Tabel met materialen). Stel de software-instellingen als volgt in.
- Klik op de 1:4-aspectweergave. Zorg ervoor dat het gezichtsveld de hele zwemtunnel bedekt. Schakel automatisch contrast en automatische witbalans uit om de achtergrond en het contrast tussen groepen te normaliseren.
- Open het venster Camera-eigenschappen door op het moersleutelpictogram te klikken. Stel de parameters als volgt in: Pixel Clock: 344 MHz, Frame Rate: 70 fps, klik op het vakje naast Vasthouden om het aan te vinken, Belichtingstijd: 0,290 ms. Sluit dit venster niet.
- Snijd het opnamevenster bij om alleen de zwemkamer van de tunnel te bedekken door de camera indien nodig te kantelen/draaien.
- Open het opnamevenster door op het filmrolpictogram te klikken. Stel de opname-instellingen als volgt in:
- Vink het vakje aan voor het maximale aantal frames.
- Voer handmatig 63.000 in voor het aantal frames.
- Vink het vakje aan voor Calc. Framesnelheid. Hierdoor kan het programma de framesnelheid trekken die is gedefinieerd in stap 3.2.2 (70 fps).
- Wijzig de JPEG-kwaliteit in 30.
- Neem een testrun op.
- Klik op Maken en geef het nieuwe bestand de naam Test en sla het op het bureaublad op.
- Ga terug naar het opnamevenster en klik op Opnemen. Laat de testfilm gedurende de gehele duur van het protocol (15 min) draaien.
- Zodra de test is voltooid, moet u ervoor zorgen dat er geen gevallen frames zijn en dat 63.000 frames worden opgenomen.
- Plaats een groep vissen in de zwemtunnel en sluit de tunnel met een standaard volledig gesloten deksel (figuur 1B).
OPMERKING: Zorg ervoor dat alle vissen zich in de tunnel bevinden voordat u het deksel volledig vastdraait. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen onder het deksel zitten. Dit heeft anders invloed op de resultaten. - Open een nieuw opnamevenster en geef het bestand een naam. Voorbeeld: 2_A_1_00001_WildtypeGroupA.avi
OPMERKING: Zorg ervoor dat de instellingen in overeenstemming zijn met de parameters in stap 3.2 en 3.3. De JPEG-kwaliteit gaat altijd terug naar de standaardwaarden en moet voor elke nieuwe film opnieuw worden ingesteld.
LET OP: Klik nog niet op record. - Begin een nieuw experiment met behulp van de flow velocity control software.
OPMERKING: Als u een geautomatiseerd protocol wilt starten, klikt u op het vak Logboekregistratie starten . Kies in het dialoogvenster dat wordt geopend de optie Geautomatiseerd in de vervolgkeuzelijst. Om een eerder opgeslagen protocolbestand te kiezen, klikt u op het bestandspictogram naast Protocolbestand om het gewenste protocol te openen.- Om een handmatig protocol te starten, stelt u de stroomsnelheid in op 0 cm /s gedurende 5 minuten, 10 cm / s gedurende 5 minuten, gevolgd door 20 cm / s gedurende 5 minuten met behulp van de Uwater [cm / s] -doos in de stroomsnelheidsregelingssoftware.
- Sla het nieuwe gegevensbestand (wordt opgeslagen als een .csv bestand) op onder dezelfde naam als het filmbestand en in dezelfde map.
LET OP: Klik nog niet op start.
- Plaats een papieren handdoek of stuk stof aan de zijkant van de zwemtunnel om ervoor te zorgen dat al het gedrag te wijten is aan het zwemmen van vissen en niet aan een schrikreactie veroorzaakt door beweging in de omgeving.
- Zorg er snel achter elkaar voor dat het water kalm is en dat er geen rimpelingen over het frame bewegen. Klik op Opnemen in het venster van de camerasoftware om te beginnen met het opnemen van het filmbestand. Klik op Start in de stroomsnelheidsregelingssoftware om het protocol te starten, dat ononderbroken wordt voortgezet.
- Bekijk de film om er zeker van te zijn dat er geen frames vallen, dat er geen bubbels in het gezichtsveld zijn en dat alle vissen worden opgenomen.
- Zodra de filmopname is voltooid, klikt u op Noodstop om het stroomsnelheidsregelprotocol te beëindigen. Controleer op het gegevensbestand dat automatisch wordt opgeslagen. Klik op Sluiten in het opnamevenster om het filmbestand op te slaan.
- Verwijder het deksel. Haal de vissen voorzichtig op en breng ze terug naar hun aquarium.
- Herhaal stap 3.5 tot en met 3.12 voor alle groepen vissen.
- Zodra de filmopname voor alle groepen is voltooid, converteert u films van 70 fps-video's naar video's met 20 fps met het MovieProcessing_v5.bat script. Verplaats hiervoor het scriptbestand naar de map met de RAW-video's. Klik met de rechtermuisknop op het bestand en kies Uitvoeren.
OPMERKING: Het script wordt automatisch uitgevoerd. Er verschijnt een opdrachtpromptvenster met de voortgang van het script. De bovenstaande stap is optioneel. Het vermindert het aantal frames in een video van 15 minuten van 63.000 naar 18.000 frames en maakt de SwimBehavior_v7. R-script wordt sneller uitgevoerd. - Maak de tunnel leeg en leg alle apparatuur op.
4. Films analyseren voor beoordeling van zwemgedrag
OPMERKING: Filmopname en analyse kunnen op afzonderlijke dagen worden voltooid.
- Open het script Tracking_v2.ijm in Fiji en klik op Uitvoeren om het programma te starten. Kies in het venster dat verschijnt de map met de zwemgedragsfilms die u wilt bijhouden en klik op Openen. Zoek naar frame 1 van de eerste film, een dialoogvenster en de ROI-manager (Region of Interest) die wordt weergegeven.
- Volg de aanwijzingen in het dialoogvenster. Maak een ROI van de bodem van de zwemtunnelkamer en klik op OK. Zorg ervoor dat er geen zwarte hoeken te zien zijn.
OPMERKING: Het drempelvenster wordt geopend samen met een bewerkt, gedrempeld frame 1. - Wijzig het kleurenschema van zwart-wit in rood. Pas de maxwaarde aan totdat frame 1 de vis in het rood weergeeft en niets anders. Noteer de drempel. Klik op OK in het dialoogvenster.
OPMERKING: Het programma wordt automatisch uitgevoerd. De ROI die voor Frame 1 is gemaakt, wordt continu geselecteerd en niet geselecteerd voor volgende frames. Een voortgangsbalk bewaakt het proces in de rechterbenedenhoek van het Fiji-venster . Tracking duurt ongeveer 40 minuten per film. Wanneer alle films zijn bijgehouden, stopt het Fiji-programma . De ROI wordt niet meer geselecteerd. De map met de films heeft nu een _raw.csv bestand voor elke film. Fiji kan op dit moment worden gesloten. - Uitlijnen, assembleren en verkrijgen van beschrijvende statistieken
- Open de Swim Behavior_v7. R script in R Studio.
- Klik op Bron in de rechterbovenhoek van het scriptgedeelte. Kies in een nieuw venster dat wordt geopend de map met de _raw.csv bestanden die door Fiji zijn gegenereerd. Klik op Openen.
OPMERKING: Het programma wordt automatisch uitgevoerd. - Klik in een dialoogvenster waarin u wordt gevraagd het aantal vissen in elke film te bevestigen op Ja als de opgegeven getallen correct zijn of klik op Nee als de getallen onjuist zijn.
OPMERKING: Als er op Nee is geklikt, verschijnt er een bericht waarin wordt gevraagd om de films opnieuw bij te houden met een nieuwe ROI en drempel. Als op Ja is geklikt, gaat het programma verder. - Klik in het nieuwe venster dat wordt geopend met de vraag of de niet-zwemmende vis moet worden verwijderd op Ja of Nee.
OPMERKING: Niet-zwemmende vis wordt gedefinieerd als vis met minder dan 50% activiteit bij 10 cm / s. Het wordt niet aanbevolen om niet-zwemmende vissen te verwijderen. - In een nieuw pop-upvenster waarin wordt gevraagd of de groepen niet-geblindeerd zijn en of de gebruiker groepen wil combineren, deblind of combineren als er meer dan één controlegroep is.
- Nadat een antwoord is gegeven op de vorige vraag, moet u ervoor zorgen dat het programma een bericht geeft Bestand X van Y uitlijnen, waarbij X het huidige bestand is dat wordt uitgelijnd en Y het totale aantal bestanden is dat moet worden uitgelijnd. Het duurt ongeveer 30 s voordat elk bestand is uitgelijnd.
- Zodra de bestanden zijn uitgelijnd, controleert u op een nieuw .csv bestand dat is gegenereerd met dezelfde naam (_aligned.csv). Zorg ervoor dat het programma de gegevens combineert, statistieken uitvoert en uitvoergrafieken plot. Controleer op de analysebestanden die zijn gegenereerd in een nieuwe map met het label Resultaten in de bovenliggende map die de _raw.csv - en _aligned.csv-bestanden bevat.
- Controleer in de map Resultaten op twee mappen met de naam Diagnostische gegevens en grafieken en vier .csv bestanden met de naam BulkData_Avg, BulkData_Full, SummaryData_Avg en SummaryData_Full.
OPMERKING: De SummaryData_Full.csv bevat de individuele gegevens voor elke vis in elke groep op elk tijdstip. Deze gegevens worden automatisch uitgezet, maar kunnen elders worden geëxtraheerd en uitgezet.- Zorg ervoor dat de map Grafieken de grafieken bevat die door het programma zijn gegenereerd en .csv bestanden met de gegevenspunten voor elke grafiek.
- Zorg ervoor dat de map Diagnostische gegevens één .csv bestand bevat met diagnostische gegevens voor uitgelijnde bestanden.
OPMERKING: Kolommen in het bestand Diagnostische gegevens.csv bevatten het volgende: a) Het aantal frames met extra objecten, dat minder dan 100 moet zijn. Te veel frames met extra objecten suggereren een probleem met de tracking. b)Het aantal frames met ontbrekende of samengevoegde objecten. Het is normaal dat deze statistiek hoog is. Vissen die niet goed geregenereerd zijn, worden vaak naar de achterkant van de tunnel geveegd en worden als vermist beschouwd. c) Frames met sprongen van meer dan 240 pixels. Dit aantal neemt toe met het aantal objecten (vissen) in een enkele film. Een gedetailleerde uitleg van hoe de gedragsstatistieken zijn berekend, wordt gegeven in Aanvullend bestand 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We hebben de zwemtunnel ingericht zoals beschreven in paragraaf 1 van dit protocol (figuur 1). We beoordeelden het zwemuithoudingsvermogen (sectie 2 van dit protocol) en het zwemgedrag (secties 3 en 4 van dit protocol) van volwassen zebravissen bij baseline en na ruggenmergletsel (figuur 2).
Voor het vaststellen van de motorische functie van de basislijn onderzochten we het zwemuithoudingsvermogen van wilde zebravissen onder toenemende waterstroomsnelheden (figuur 3A). In deze test zwommen wilde zebravissen 41 minuten voordat ze uitgeput raakten. Vissen werden vervolgens onderworpen aan volledige ruggenmergtranssecties zoals eerder beschreven en zwemuithoudingstests werden uitgevoerd6. Na het verdoven van zebravissen met MS-222, wordt een kleine incisie gemaakt met een fijne schaar om het ruggenmerg 4 mm caudaal naar het hersenstamgebied te transecteren. Een volledige transsectie werd visueel bevestigd. Om het verlies van zwemcapaciteit na een ruggenmergoperatie te bevestigen, werden gewonde dieren 2 of 3 dagen na het letsel (dpi) beoordeeld. Op dit moment zijn zebravissen volledig verlamd caudaal naar de laesieplaats. Het zwemuithoudingsvermogen werd beoordeeld op 2, 4 en 6 weken na het blessure (wpi). Bij 2 wpi verloren laesievissen 60% van hun zwemuithoudingsvermogen (figuur 3A). Regenererende vissen herwonnen geleidelijk het zwemuithoudingsvermogen bij 4 en 6 wpi. Deze resultaten gaven aan dat wilde zebravissen in staat zijn om het zwemuithoudingsvermogen te herwinnen na een dwarslaesie.
Om het zwemgedrag van zebravissen tijdens de regeneratie van het ruggenmerg te onderzoeken, volgden we het zwemgedrag van wildtype dieren bij 0 cm / s waterstroomsnelheid of onder constante, lage stroomsnelheden van 10 en 20 cm / s (figuur 3B). Gemiddelde sporen van vispositie in de zwemtunnelkamer werden gebruikt voor visuele beoordeling van zwemgedrag bij lage stroomsnelheden (figuur 3B). In deze test zwommen ongedeerde controles gestaag in het voorste deel van de zwemtunnelkamer (dichter bij de bron van de waterstroom), wat overeenkomt met een verhoogde Y-positie (figuur 3B). Daarentegen waren gewonde vissen bij 2 wpi niet in staat om een stabiele zwemcapaciteit tegen de stroom in te behouden. Bijgevolg zijn hun zwemwegen onregelmatiger met een algehele afname van de Y-positie (figuur 3B). De Y-positie nam toe bij 4 en 6 wpi, wat aangeeft dat regenererende dieren geleidelijk hun vermogen om te zwemmen in de voorkant van de zwemtunnelkamer herwonnen. Om de parameters van het zwemgedrag te kwantificeren, berekenden we het percentage activiteit, de positie in de zwemtunnel (Y-positie) en zwom de tijd tegen de stroom in (figuur 3C-E). Ten opzichte van niet-gewonde controles waren de laesiedieren bij 2 wpi duidelijk minder actief (figuur 3C), kwamen vast te zitten in het achterste kwadrant van de zwemtunnel (figuur 3D) en verloren hun vermogen om tegen lage stroomsnelheden in te zwemmen (figuur 3E). In overeenstemming met hun aangeboren vermogen om functioneel herstel te bereiken, normaliseerden laesiedieren geleidelijk de zwemgedragsparameters bij 4 en 6 wpi (figuur 3C-E). De parameters voor zwemuithoudingsvermogen en zwemgedrag boden samen kwantificeerbare uitlezingen van de zwemfunctie en functionele reparatie van het ruggenmerg bij zebravissen.
Figuur 1: Zwemtunnel opgezet en deksels op maat. (A) Representatieve beelden van de opgezette zwemtunnel, inclusief ingezoomde boven- en zijaanzichten van de zwemtunnelkamer. (B) Afbeeldingen van de deksels van de zwemtunnel die worden gebruikt voor de verschillende toepassingen die in dit protocol worden beschreven. Een standaard, volledig gesloten zwemtunneldeksel wordt gebruikt voor zwemgedragstests (sectie 3 van dit protocol). Voor kalibratie wordt een aangepast zwemtunneldeksel gebruikt dat plaats biedt aan een handheld digitale flowmeter (sectie 1 van dit protocol). Een aangepast zwemuithoudingsdeksel, met een verwijderbaar deksel aan het achterste uiteinde van de zwemtunnelkamer, maakt het mogelijk om uitgeputte vissen te verwijderen tijdens zwemuithoudingstests (sectie 2 van dit protocol). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Experimentele pijplijn om te testen op zwemuithoudingsvermogen en zwemgedrag bij volwassen zebravissen. Voor zwemuithoudingsvermogen zwommen vissen tegen een toenemende waterstroom in tot uitputting. Voor zwemgedrag worden zwemparameters beoordeeld in afwezigheid van en bij lage stroomsnelheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Functioneel herstel bij wildtype zebravissen na dwarslaesie. (A) Motorische functie bepaald door zwemuithoudingstests voor wildtype zebravissen bij baseline en 2, 4 en 6 wpi. Stippen duiden individuele dieren aan uit twee onafhankelijke experimenten. (B) Zwemgedragstests volgden wilde zebravissen onder lage waterstroomsnelheden. De gemiddelde Y-positie wordt weergegeven op elk tijdstip tijdens het volgen (0 cm / s gedurende 5 minuten, 10 cm / s gedurende 5 minuten en 20 cm / s gedurende 5 minuten). (C-E) Procentuele activiteit (C), gemiddelde Y-positie in de tunnel (D) en tijdzwom tegen de stroom in (E) werden gekwantificeerd op 20 cm / s. Voor alle kwantificeringen worden twee onafhankelijke experimenten getoond. n = 30 in de toestand vóór het letsel; n = 23 bij 2 wpi, n = 20 bij 4 wpi, n = 18 bij 6 wpi. Eenrichtingsverkeer ANOVA werd gebruikt voor statistische analyses. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde (SEM). *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001; P < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand 1: Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Volwassen zebravissen zijn een populair gewerveld systeem voor het modelleren van menselijke ziekten en het bestuderen van mechanismen van weefselregeneratie. CRISPR/Cas9-genoombewerking heeft een revolutie teweeggebracht in omgekeerde genetische studies voor het modelleren van ziekten bij zebravissen; grootschalige genetica in volwassen zebravissen is echter gehinderd door biologische en technische uitdagingen, waaronder de onbeschikbaarheid van volwassen zebravisweefsels tot fenotypering met hoge doorvoer. Gezien de complexe anatomie van volwassen zebravissen, is langdurige histologische verwerking vereist om weefselarchitectuur te verkrijgen en te analyseren. De zwemuithoudingsvermogen en zwemgedragstests die in deze studie worden beschreven, kunnen worden gebruikt om vooraf te screenen op neurale, spier- of skeletfenotypen bij een gemiddelde doorvoer vóór histologie. Bovendien, aangezien studies van weefselregeneratie gericht zijn op het verbeteren van functioneel weefselherstel, zullen de protocollen die in deze studie worden beschreven breed toepasbaar, zo niet essentieel, zijn voor studies van neuraal, spier- en skeletregeneratieonderzoek.
Functionele locomotietests zijn een integraal onderdeel geweest van ons begrip van neurale ontwikkeling en regeneratie. Standaard locomotorische testen zijn op grote schaal beschikbaar bij gewervelde soorten, waaronder ratten, muizen en larvale zebravissen. Muis- en rattenmodelsystemen hebben gedrags- en functionele voortbewegingstests zoals respectievelijk de BMS16 en BBB17,18. Evenzo zijn er een groot aantal protocollen beschreven om voortbeweging, schrikreactie en gedrag bij larvale zebravissen te meten. Deze protocollen zijn efficiënt om gedragsverschillen tussen experimentele groepen in lichte en donkere omgevingen, roofdierontwijking en activiteit19,20,21 te onthullen. Hier beschrijven we kwantificeerbare, reproduceerbare methoden om functioneel herstel na dwarslaesie bij volwassen zebravissen te meten.
Merk op dat deze studie verschillende beperkingen met zich meebrengt. Ten eerste zijn gedragsstudies sterk afhankelijk van genetische en omgevingsfactoren. Om te controleren op genetische variabiliteit, gebruikten we broers en zussen om te controleren op leeftijd, geslacht en de genetische achtergrond in experimentele groepen22,23. Om omgevingsfactoren te controleren, hebben we ervoor gezorgd dat experimenten op hetzelfde moment van de dag worden uitgevoerd, onder gecontroleerde temperatuur en lichtomstandigheden20. Ten tweede, terwijl de zwemgedragstest minder gevoelig is voor bevooroordeelde analyse, bepaalt de onderzoeker die de zwemuithoudingstest uitvoert wanneer een vis uitputting bereikt en gaat hij verder met het verwijderen van uitgeputte vissen uit de zwemtunnelkamer zonder de rest van het viscohort te onderbreken. Zo werden onze zwemuithoudingsexperimenten uitgevoerd door een enkele onderzoeker die blind is voor experimentele omstandigheden. Het is vooral belangrijk om variabiliteit tussen onderzoekers te vermijden voor longitudinale studies van experimentele groepen in de loop van de tijd. Ten slotte kunnen botsingen tussen vissen de trackinganalyse in zwemgedragstests bemoeilijken. We raden daarom aan om zwemgedragstests uit te voeren voor groepen van vijf of minder vissen om de kans op botsingen tussen vissen te minimaliseren.
Met het oog op kritieke stappen merken we op dat gewonde vissen kwetsbaar kunnen zijn, vooral in de vroege dagen na het letsel. We raden daarom aan om met vis met uiterste zorg om te gaan. Voor zwemuithoudingstests vermindert het zo snel mogelijk verzamelen van vis met de PVC-buis, eerst kop of staart, de kans op secundaire verwondingen tijdens het verzamelproces. Voor zwemgedragstests kan de spoelpomp af en toe golven creëren, waardoor de films worden vervormd en analysefouten worden veroorzaakt. In dit geval kan de spoelpomp kort worden uitgeschakeld. We raden echter niet aan om de spoelpomp voor langere tijd uit te schakelen om ervoor te zorgen dat er constant water circuleert tussen de zwemtunnelkamer en het buffervat. Het bewaken van de filmopname maakt onmiddellijke beëindiging en herstart van de film mogelijk als een frame is gevallen of een vis afdwaalt van het opnamegebied. In aanvullende overwegingen, tijdens het uitvoeren van de trackinganalyse, als de R-code een fout geeft tijdens de verwerking van bestanden, is het meest waarschijnlijke probleem de naamgeving van de bestanden. Het programma is gemaakt om te functioneren onder een zeer specifieke naamgevingsstrategie: Timepoint_Group_Subgroup_Stock number_Anything anders (bijvoorbeeld 0_A_1_00001_WildtypeGroupA.avi). Met deze naamgeving kunnen meerdere tijdspunten, groepen en subgroepen worden uitgezet en uitgelijnd. Ten slotte, hoewel checkpoints zijn ingebouwd in het analysescript om een goede tracking te garanderen, is het belangrijk om de analyse-uitvoer zorgvuldig te controleren. Het programma zal automatisch vragen of het visnummer correct is en films vragen voor heranalyse als het visnummer onjuist is. Rechtlijnige artefacten kunnen worden weergegeven in de grafiek Gemiddelde Y-positie, wat aangeeft dat een extra object als een vis is herkend. In dit geval is de beste manier van handelen om de film zorgvuldig te bekijken om extra artefacten uit te sluiten die de neiging hebben om bij een hogere stroomsnelheid te verschijnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
We bedanken de Washington University Zebrafish Shared Resource voor de verzorging van dieren. Dit onderzoek werd ondersteund door de NIH (R01 NS113915 tot M.H.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoSwim software | Loligo Systems | MI10000 | Optional - for Automatic control of current velocity |
| Customized lid | Loligo Systems | MI10001 | This customized lid is used for swim endurance |
| DAQ-BT | Loligo Systems | SW10600 | Optional - for Automatic control of current velocity |
| Eheim pump | Loligo Systems | PU10160 | 20 L/min. This pump is placed in theflow-through tank. |
| Fiji | Fiji | Freely available through Image J (Fiji) | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Flowtherm | Loligo Systems | AC10000 | Handheld digital flow meter - for calibration |
| High Speed Camera | Loligo Systems | VE10380 | USB 3.0 color video camera (4MP) |
| IR light panel | Loligo Systems | VE10775 | 450 x 210 mm, placed under the swim tunnel chamber |
| Monofocal lens | Loligo Systems | VE10388 | 25mm manual lens |
| PVC Tubing | VWR | 60985-534 | 5/16 x 7/16" Wall thickness: 1/16" |
| R Studio | R Studio | Freely available. Version 3.6 with extra packages. | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Swim tunnel respirometer | Loligo Systems | SW10060 | 5L (120V/60Hz). The system includes the swim chamber, motor, manual control of water current velocity, 1 pump placed inside the chamber, standard swim tunnel lid for swim behavior, and modified swim tunnel lid for calibration |
| uEye Cockpit | IDS | Freely available software to control camera parameters | Alternative cameras and accompanying softwares could be used |
| Vane wheel flow probe | Loligo Systems | AC10002 | Digital flow probe - for calibration |
References
- Becker, C. G., Becker, T. Neuronal regeneration from ependymo-radial glial cells: cook, little pot, cook. Developmental Cell. 32 (4), 516-527 (2015).
- Mokalled, M. H., Poss, K. D.
- Orger, M. B., de Polavieja, G. G. Zebrafish behavior: opportunities and challenges. Annual Review of Neuroscience. 40, 125-147 (2017).
- Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Mokalled, M. H., et al. Injury-induced ctgfa directs glial bridging and spinal cord regeneration in zebrafish. Science. 354 (6312), 630-634 (2016).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Developmental Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).
- Wolman, M. A., et al. A genome-wide screen identifies PAPP-AA-mediated IGFR signaling as a novel regulator of habituation learning. Neuron. 85 (6), 1200-1211 (2015).
- Granato, M., et al. Genes controlling and mediating locomotion behavior of the zebrafish embryo and larva. Development. 123, 399-413 (1996).
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (23), 10545-10549 (1995).
- Moens, C. B., Yan, Y. L., Appel, B., Force, A. G., Kimmel, C. B. Valentino: a zebrafish gene required for normal hindbrain segmentation. Development. 122 (12), 3981-3990 (1996).
- Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
- Reimer, M. M., et al. Motor neuron regeneration in adult zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (34), 8510-8516 (2008).
- Klatt Shaw, D., et al. Localized EMT reprograms glial progenitors to promote spinal cord repair. Developmental Cell. 56 (5), 613-626 (2021).
- Ahmed, R. U., Alam, M., Zheng, Y. P. Experimental spinal cord injury and behavioral tests in laboratory rats. Heliyon. 5 (3), 01324 (2019).
- Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Fatemi, G., Faden, A. I. A combined scoring method to assess behavioral recovery after mouse spinal cord injury. Neuroscience Research. 67 (2), 117-125 (2010).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Scheff, S. W., Saucier, D. A., Cain, M. E. A statistical method for analyzing rating scale data: the BBB locomotor score. Journal of Neurotrauma. 19 (10), 1251-1260 (2002).
- Li, Q., et al. Differential behavioral responses of zebrafish larvae to yohimbine treatment. Psychopharmacology (Berl). 232 (1), 197-208 (2015).
- Wakamatsu, Y., Ogino, K., Hirata, H. Swimming capability of zebrafish is governed by water temperature, caudal fin length and genetic background. Scientific Reports. 9 (1), 16307 (2019).
- Ahmed, O., Seguin, D., Gerlai, R. An automated predator avoidance task in zebrafish. Behavioral Brain Research. 216 (1), 166-171 (2011).
- Conradsen, C., McGuigan, K. Sexually dimorphic morphology and swimming performance relationships in wild-type zebrafish Danio rerio. Journal of Fish Biology. 87 (5), 1219-1233 (2015).
- Leris, I., Sfakianakis, D. G., Kentouri, M. Are zebrafish Danio rerio males better swimmers than females. Journal of Fish Biology. 83 (5), 1381-1386 (2013).
