Summary
Capable de récupération fonctionnelle après une lésion de la moelle épinière, le poisson-zèbre adulte est un système modèle de premier plan pour élucider les mécanismes innés de la régénération neuronale. Ici, nous décrivons les tests d’endurance et de comportement de natation comme des lectures fonctionnelles de la régénération de la moelle épinière.
Abstract
En raison de leur capacité de régénération reconnue, les poissons-zèbres adultes sont un modèle de premier plan pour les vertébrés pour interroger les mécanismes de régénération innée de la moelle épinière. Après une transsection complète de leur moelle épinière, les poissons-zèbres étendent les ponts gliaux et axonaux à travers les tissus sectionnés, régénèrent les neurones proximaux de la lésion et retrouvent leurs capacités de nage dans les 8 semaines suivant la blessure. La récupération de la fonction de nage est donc une lecture centrale pour la réparation fonctionnelle de la moelle épinière. Ici, nous décrivons un ensemble de tests comportementaux pour quantifier la capacité motrice du poisson-zèbre à l’intérieur d’un tunnel de nage fermé. L’objectif de ces méthodes est de fournir des mesures quantifiables de l’endurance à la nage et du comportement de nage chez les poissons-zèbres adultes. Pour l’endurance de la natation, les poissons-zèbres sont soumis à une vitesse de courant d’eau en constante augmentation jusqu’à épuisement et le temps d’épuisement est signalé. Pour l’évaluation du comportement de nage, les poissons-zèbres sont soumis à de faibles vitesses de courant et les vidéos de natation sont capturées avec une vue dorsale du poisson. Le pourcentage d’activité, la fréquence des rafales et le temps passé contre le courant de l’eau fournissent des lectures quantifiables du comportement de nage. Nous avons quantifié l’endurance à la nage et le comportement de nage chez les poissons-zèbres de type sauvage avant les blessures et après la transsection de la moelle épinière. Nous avons constaté que le poisson-zèbre perdait sa fonction de nage après la transsection de la moelle épinière et retrouvait progressivement cette capacité entre 2 et 6 semaines après la blessure. Les méthodes décrites dans cette étude pourraient être appliquées aux études neurocomportementales, musculo-squelettiques, de régénération musculaire squelettique et de régénération neuronale chez le poisson-zèbre adulte.
Introduction
Les poissons-zèbres adultes sont éminemment utilisés pour étudier les mécanismes du développement neuromusculaire et musculo-squelettique et la modélisation des maladies1,2,3. Les poissons-zèbres sont capables de réparer efficacement et spontanément plusieurs tissus, y compris le cerveau, la moelle épinière et les muscles squelettiques4,5,6,7. La capacité remarquable de régénérer les tissus neuromusculaires et de modéliser les maladies attire une communauté scientifique croissante dans la recherche sur le poisson-zèbre adulte1,2,3. Cependant, bien que des tests de locomotion et de comportement de nage soient disponibles et normalisés pour les larves de poisson-zèbre, il est de plus en plus nécessaire de développer des protocoles analogues chez les poissons adultes8,9,10,11. L’objectif de cette étude est de décrire des protocoles pour quantifier l’endurance à la nage et le comportement de nage chez le poisson-zèbre adulte. Nous présentons ces protocoles dans le contexte de la recherche sur la régénération de la moelle épinière. Cependant, les protocoles comportementaux décrits ici sont également applicables aux études sur la régénération neuronale et musculaire, le développement neuromusculaire et musculo-squelettique, ainsi que la modélisation des maladies neuromusculaires et musculo-squelettiques.
Paralysie inverse du poisson-zèbre dans les 8 semaines suivant la transsection complète de la moelle épinière. Contrairement aux mammifères peu régénératifs, les poissons-zèbres présentent des réponses pro-régénératives immunitaires, neuronales et gliales nécessaires à la réparation fonctionnelle de la moelle épinière12,13,14. Une lecture ultime de la réparation fonctionnelle de la moelle épinière est la capacité du tissu lésionné à retrouver sa fonction après une blessure. Une série de méthodes normalisées pour évaluer la régénération fonctionnelle chez les rongeurs comprend des tests locomoteurs, moteurs, sensoriels et sensorimoteurs15,16,17. Les tests largement utilisés dans les lésions de la moelle épinière chez la souris comprennent l’échelle locomotrice basso mouse Scale (BMS), les tests moteurs des membres antérieurs, les tests sensoriels tactiles et les tests sensorimoteurs de marche en grille15,17. Contrairement aux systèmes de poissons-zèbres mammifères ou larvaires, les tests comportementaux chez les poissons-zèbres adultes sont moins développés, mais beaucoup plus nécessaires pour répondre aux besoins croissants des communautés de régénération tissulaire et de modélisation des maladies.
Les transsections complètes de la moelle épinière entraînent une paralysie complète caudale au site de la blessure. Peu de temps après la blessure, les animaux paralysés sont moins actifs et évitent autant que possible de nager. Pour compenser la perte de capacité de nage, les animaux paralysés présentent des éclats courts et fréquents en surutilisant leurs nageoires pectorales, qui sont rostrales à la lésion. Cette stratégie de nage compensatoire entraîne un épuisement rapide et une capacité de nage inférieure. Au fur et à mesure que la moelle épinière du poisson-zèbre se régénère, les animaux retrouvent une fonction de nage oscillatoire lisse caudale à la lésion, ce qui permet une endurance accrue à la nage et des paramètres de comportement de nage améliorés. Ici, nous décrivons des méthodes pour quantifier l’endurance de nage du poisson-zèbre à des vitesses de courant d’eau croissantes et le comportement de nage à de faibles vitesses de courant.
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Protocol
Les poissons-zèbres adultes des souches Ekkwill et AB ont été maintenus à l’installation centrale Zebrafish de l’Université de Washington. Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux protocoles institutionnels de l’IACUC sur les animaux.
REMARQUE : Un exemple de configuration expérimentale est illustré à la figure 1A. Le couvercle d’étalonnage (personnalisé), le couvercle d’endurance de nage (personnalisé) et le couvercle de comportement de nage (standard, couvercle de tunnel fermé) sont illustrés à la figure 1B. Le flux de travail expérimental est présenté à la figure 2.
1. Préparation et étalonnage du tunnel de natation
- Remplissez le tunnel de baignade et le réservoir tampon environnant avec de l’eau du système de poisson zèbre (10 L d’eau filtrée; alcalinité: 50-150 mg / L CaCO3; pH: 6,8-7,5; température: 26-28,5 ° C; nitrate < 50 mg / L; nitrite < 0,1 mg / L; et salinité < 0,5-1 g / L).
- Remplissez un réservoir d’écoulement supplémentaire avec de l’eau du système de poisson-zèbre (≈7,5 L). Positionnez le tunnel de nage et le réservoir d’écoulement pour permettre à l’excès d’eau du système de poisson-zèbre de s’écouler du réservoir tampon dans le réservoir d’écoulement à travers un tube de sortie fixé sur le côté du réservoir tampon.
- Une fois le tunnel et le réservoir tampon remplis, effectuez les opérations suivantes.
- Placez la pompe de chasse à l’intérieur du réservoir tampon et connectez-la au tunnel de nage adjacent avec des tubes en PVC. Placez la pompe d’écoulement à l’intérieur du réservoir d’écoulement et connectez-la à la paroi du réservoir tampon.
- Allumez la pompe de rinçage située à l’intérieur du réservoir tampon et la pompe d’écoulement située dans le réservoir d’écoulement pour commencer la circulation de l’eau.
REMARQUE: Le système à double pompe assurera un débit d’eau continu dans le tunnel de nage (à partir de la pompe de chasse) et dans le réservoir tampon (à partir de la pompe à écoulement). - Éliminez toutes les bulles d’air piégées à l’intérieur du tunnel de nage en augmentant progressivement la vitesse du courant d’eau de 10 cm/s à 100 cm/s à des intervalles de 10 cm/s. Diminuer la vitesse à 0 cm/s par intervalles de 10 cm/s. Pour contrôler la vitesse d’écoulement, cliquez sur les flèches haut et bas dans la section Vitesse du logiciel de contrôle de la vitesse d’écoulement (voir Tableau des matériaux).
REMARQUE: Le moteur et le rotor sont connectés à l’ordinateur qui l’accompagne. Le logiciel de contrôle de la vitesse d’écoulement communique avec le moteur pour créer la vitesse d’écoulement souhaitée. L’utilisation du logiciel de contrôle de la vitesse d’écoulement est facultative. L’alternative consiste à contrôler manuellement le moteur à courant d’eau.
- Étalonnage
REMARQUE: L’étalonnage est requis avant chaque expérience.- Utilisez le couvercle d’étalonnage pour fermer le tunnel de nage.
REMARQUE: Le couvercle d’étalonnage est personnalisé avec une ouverture centrale renforcée qui s’adapte à la sonde de débitmètre utilisée pour l’étalonnage (Figure 1B). Huit écrous d’aile sont utilisés pour fixer tous les couvercles du tunnel. - Allumez le débitmètre numérique et connectez-le à la sonde du débitmètre. Placez la sonde du débitmètre à l’intérieur du tunnel de nage via le couvercle d’étalonnage. Positionnez les pales de la sonde du débitmètre perpendiculairement à la direction de l’écoulement.
- Calibrez la sortie du moteur du tunnel de nage (contrôlé par le logiciel de contrôle de la vitesse d’écoulement) à l’aide du débitmètre numérique. Pour ce faire, effectuez les opérations suivantes.
- Ouvrez le logiciel de contrôle de la vitesse d’écoulement et cliquez sur Calibration.
- Remplacez les options en haut à gauche par RPM vs Voltage. Augmentez la vitesse d’écoulement de 0 cm/s à 100 cm/s par incréments de 5 cm/s, en tapant les valeurs dans la section Vitesse du logiciel de contrôle de la vitesse d’écoulement. À chaque étape, cliquez sur le bouton « + » et enregistrez la vitesse actuelle indiquée par le débitmètre numérique.
REMARQUE : La relation linéaire résultante doit avoir une valeur R2 proche de 1. - Pour confirmer l’étalonnage, augmentez les vitesses du courant d’eau de 0 à 10, 25, 50, 75 et 100 cm/s, puis diminuez les vitesses à 75, 50, 25, 10 cm/s à l’aide des flèches haut et bas dans la section Uwater [cm/s] du logiciel de contrôle de la vitesse d’écoulement. À chaque vitesse (à partir du logiciel), mesurez et enregistrez la vitesse correspondante indiquée par le débitmètre numérique.
- Considérez le tunnel calibré et précis si les vitesses de courant d’eau mesurées sont dans un écart de ±2 cm/s. Si l’écart est supérieur à ±2 cm/s, répétez les étapes 1.4.4 à 1.4.6 pour assurer un étalonnage correct.
- Utilisez le couvercle d’étalonnage pour fermer le tunnel de nage.
2. Évaluation de l’endurance en natation
REMARQUE: Les groupes expérimentaux sont divisés en groupes de 10 animaux ou moins pour l’endurance à la nage.
- Configurez le logiciel de contrôle de la vitesse d’écoulement.
REMARQUE : L’utilisation du logiciel de contrôle de la vitesse d’écoulement dans cette section est facultative. L’alternative consiste à contrôler manuellement le moteur à courant d’eau. Pour le contrôle manuel du courant d’eau, passez à l’étape 2.3 et augmentez manuellement la vitesse du courant d’eau dans les incréments spécifiés aux étapes 2.5 et 2.6.- Ouvrez le logiciel de contrôle de la vitesse d’écoulement. Cliquez sur la case intitulée Expérimenter. Décochez Uswim et Uwater.
- Modifiez la vitesse d’écoulement dans la boîte Uwater [cm/s] en bas à gauche pour ajuster les vitesses du courant d’eau.
- Pour commencer un protocole automatisé, cliquez sur la case Démarrer la journalisation . Dans la fenêtre de dialogue qui s’ouvre, choisissez Automatisé dans la liste déroulante.
- Pour choisir un fichier de protocole précédemment enregistré, cliquez sur l’icône de fichier à côté de Fichier de protocole pour ouvrir le protocole souhaité.
- Configurez le fichier de sortie en cliquant sur l’icône du fichier à côté de Fichier journal. Dans la fenêtre de l’explorateur de fichiers qui s’ouvre, nommez le fichier de sortie et enregistrez-le à l’emplacement souhaité.
- Configurez une fenêtre de chronométrage fractionné. Assurez-vous d’avoir un accès simultané au logiciel de contrôle de la vitesse d’écoulement et aux fenêtres de minuterie sur l’écran de l’ordinateur.
- Installez un aquarium de collecte de poissons pour héberger les poissons épuisés après leur retrait du tunnel de baignade. Remplissez le réservoir de collecte avec de l’eau du système de poisson zèbre (0,75 L). Remplissez un long tube en PVC avec de l’eau du système de poisson-zèbre.
- Placer une extrémité (extrémité 1) du tube en PVC prérempli dans le réservoir de collecte et l’autre extrémité (extrémité 2) dans le réservoir tampon. Assurez-vous que l’eau peut s’écouler librement du réservoir tampon dans le réservoir de collecte.
- Serrez l’extrémité supérieure du tube en PVC (extrémité 2) avec un clip de liant pour empêcher l’écoulement de l’eau. Utilisez le clip de liant pour contrôler l’écoulement de l’eau au besoin.
- Fermez le tunnel de natation à l’aide du couvercle d’endurance de natation.
REMARQUE: Le couvercle d’endurance de natation est personnalisé avec une fenêtre de tunnel de natation pour retirer les poissons épuisés du tunnel de natation, sans interrompre le reste de l’essai (Figure 1B). - Placez un groupe de poissons à l’intérieur du tunnel de baignade. Démarrez le chronomètre fractionné tout en ajustant la vitesse du courant à 0 cm/s pendant 5 min, 9 cm/s pendant 5 min et 10 cm/s pendant 5 min en tapant ces valeurs dans la section Uwater [cm/s] du logiciel de contrôle de la vitesse d’écoulement.
REMARQUE: Cette étape acclimatera les animaux au tunnel de nage et à la direction du flux. - Après l’acclimatation des poissons, démarrez le programme automatisé de contrôle de la vitesse d’écoulement qui augmentera la vitesse du courant d’eau de 2 cm / s toutes les minutes.
REMARQUE: Les poissons nagent jusqu’à épuisement. Les poissons épuisés sont poussés vers l’arrière du tunnel de baignade. - Lorsqu’un poisson est épuisé, débranchez le tube de collecte du poisson, ouvrez la fenêtre du tunnel de nage et ramassez le poisson dans l’aquarium de collecte. Enregistrez le temps à l’épuisement à l’aide du chronomètre fractionné.
REMARQUE: Les poissons peuvent parfois dériver à l’extrémité arrière du tunnel de baignade sans être épuisés. Pour vous assurer qu’un poisson est épuisé, tapotez doucement l’extrémité arrière du tunnel ou créez une ombre sur cette zone pour stimuler le poisson à nager. Les poissons épuisés ne réagissent pas au stimulus de sursaut et gisent à plat à l’extrémité arrière du tunnel. - Répétez l’étape 2.7 jusqu’à ce que tous les poissons soient épuisés et recueillis dans l’aquarium de collecte. Cliquez sur le bouton Arrêt d’urgence du logiciel de contrôle de la vitesse d’écoulement et arrêtez la minuterie.
REMARQUE: Vérifiez tout au long de la nage si le nombre de poissons retirés de la chambre du tunnel de nage correspond aux heures enregistrées. - Répétez les étapes 2.5 à 2.8 pour chaque groupe de poissons.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici, mais pour être précis au point de temps après la blessure, il est recommandé que les films et les nages d’endurance soient effectués le même jour. Le tunnel peut continuer à circuler pendant que les expériences sont suspendues.
3. Capture de vidéos pour le test de comportement de natation
REMARQUE: Seuls jusqu’à cinq animaux peuvent être suivis à la fois. Si les groupes expérimentaux sont plus grands que cinq animaux, plusieurs vidéos peuvent être prises pour chaque groupe, où la première vidéo suit cinq animaux ou moins et la deuxième vidéo suit les cinq autres animaux ou moins. Pour les études longitudinales qui visent à suivre des animaux individuels au fil du temps, les poissons peuvent être logés individuellement et suivis à plusieurs points temporels. Tous les scripts de suivi et d’analyse sont disponibles via GitHub (voir Tableau des matériaux).
- Allumez le panneau lumineux infrarouge situé sous le tunnel de nage. Fixez la caméra sur un support au plafond au sommet du tunnel de natation. Ajustez les bagues de mise au point et d’ouverture.
REMARQUE: Les paramètres de mise au point et d’ouverture dépendent de la distance entre la caméra et le tunnel de nage, ainsi que de l’environnement lumineux. - Ouvrez le logiciel d’enregistrement de la caméra (voir tableau des matériaux). Définissez les paramètres du logiciel comme suit.
- Cliquez sur l’affichage aspect 1:4. Assurez-vous que le champ de vision couvre tout le tunnel de nage. Désactivez le contraste automatique et la balance des blancs automatiques pour normaliser l’arrière-plan et le contraste entre les groupes.
- Ouvrez la fenêtre Propriétés de l’appareil photo en cliquant sur l’icône de la clé. Réglez les paramètres comme suit: Pixel Clock: 344 MHz, Frame Rate: 70 fps, cliquez sur la case à côté de Hold pour le vérifier, Temps d’exposition: 0.290 ms. Ne fermez pas cette fenêtre.
- Recadrez la fenêtre d’enregistrement pour couvrir uniquement la chambre de nage du tunnel en inclinant / tournant la caméra si nécessaire.
- Ouvrez la fenêtre d’enregistrement en cliquant sur l’icône de la bobine de film. Définissez les paramètres d’enregistrement comme suit :
- Cochez la case correspondant au nombre maximal d’images.
- Entrez manuellement 63 000 pour le nombre d’images.
- Cochez la case Calc. Fréquence d’images. Cela permet au programme d’extraire la fréquence d’images définie à l’étape 3.2.2 (70 ips).
- Modifiez la qualité JPEG à 30.
- Enregistrez une série de tests.
- Cliquez sur Créer et nommez le nouveau fichier Test et enregistrez-le sur le bureau.
- Revenez à la fenêtre d’enregistrement et cliquez sur Enregistrer. Laissez le film de test s’exécuter pendant toute la durée du protocole (15 min).
- Une fois le test terminé, assurez-vous qu’il n’y a pas d’images perdues et que 63 000 images sont enregistrées.
- Placez un groupe de poissons dans le tunnel de nage et fermez le tunnel à l’aide d’un couvercle standard entièrement fermé (Figure 1B).
REMARQUE: Assurez-vous que tous les poissons sont dans le tunnel avant de serrer complètement le couvercle. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air sous le couvercle. Sinon, cela affectera les résultats. - Ouvrez une nouvelle fenêtre d’enregistrement et nommez le fichier. Exemple : 2_A_1_00001_WildtypeGroupA.avi
REMARQUE : Assurez-vous que les paramètres sont conformes aux paramètres des étapes 3.2 et 3.3. La qualité JPEG reviendra toujours à la valeur par défaut et doit être réinitialisée pour chaque nouveau film.
ATTENTION : Ne cliquez pas encore sur Enregistrer. - Commencez une nouvelle expérience à l’aide du logiciel de contrôle de la vitesse d’écoulement.
Remarque : Pour commencer un protocole automatisé, cliquez sur la zone Démarrer la journalisation . Dans la fenêtre de dialogue qui s’ouvre, choisissez Automatisé dans la liste déroulante. Pour choisir un fichier de protocole précédemment enregistré, cliquez sur l’icône de fichier à côté de Fichier de protocole pour ouvrir le protocole souhaité.- Pour commencer un protocole manuel, réglez la vitesse d’écoulement à 0 cm/s pendant 5 min, 10 cm/s pendant 5 min, suivie de 20 cm/s pendant 5 min à l’aide de la boîte Uwater [cm/s] du logiciel de contrôle de la vitesse d’écoulement.
- Enregistrez le nouveau fichier de sortie de données (qui sera enregistré en tant que fichier .csv) sous le même nom que le fichier vidéo et dans le même dossier.
ATTENTION : Ne cliquez pas encore sur Démarrer.
- Placez une serviette en papier ou un morceau de tissu sur le côté du tunnel de nage pour vous assurer que tous les comportements sont dus à la nage des poissons et non à une réaction de sursaut causée par un mouvement dans l’environnement.
- En succession rapide, assurez-vous que l’eau est calme et qu’aucune ondulation ne se déplace sur le cadre. Cliquez sur Enregistrer dans la fenêtre du logiciel de l’appareil photo pour lancer l’enregistrement du fichier vidéo. Cliquez sur Démarrer dans le logiciel de contrôle de la vitesse d’écoulement pour démarrer le protocole, qui se poursuivra sans interruption.
- Regardez le film pour vous assurer qu’aucune image n’est lâchée, qu’il n’y a pas de bulles dans le champ de vision et que tous les poissons sont enregistrés.
- Une fois l’enregistrement vidéo terminé, cliquez sur Arrêt d’urgence pour mettre fin au protocole de contrôle de la vitesse d’écoulement. Vérifiez le fichier de sortie de données qui est enregistré automatiquement. Cliquez sur Fermer dans la fenêtre d’enregistrement pour enregistrer le fichier vidéo.
- Retirez le couvercle. Récupérez soigneusement les poissons et retournez-les dans leur aquarium.
- Répétez les étapes 3.5 à 3.12 pour tous les groupes de poissons.
- Une fois l’enregistrement vidéo terminé pour tous les groupes, convertissez les films des vidéos 70 fps en vidéos 20 fps avec le script MovieProcessing_v5.bat . Pour ce faire, déplacez le fichier de script vers le dossier contenant les vidéos brutes. Cliquez avec le bouton droit sur le fichier et choisissez Exécuter.
Remarque : Le script s’exécute automatiquement. Une fenêtre d’invite de commande apparaîtra montrant la progression du script. L’étape ci-dessus est facultative. Il réduit le nombre d’images dans une vidéo de 15 minutes de 63 000 à 18 000 images et rend la SwimBehavior_v7. Le script R s’exécute plus rapidement. - Videz le tunnel et rangez tout le matériel.
4. Analyser les films pour l’évaluation du comportement de nage
REMARQUE: L’enregistrement et l’analyse de films peuvent être effectués sur des jours distincts.
- Ouvrez le script Tracking_v2.ijm dans Fidji et cliquez sur Exécuter pour commencer le programme. Dans la fenêtre qui apparaît, choisissez le dossier contenant les films de comportement de natation à suivre, puis cliquez sur Ouvrir. Recherchez l’image 1 du premier film, une boîte de dialogue et le gestionnaire de région d’intérêt (ROI) qui apparaîtra.
- Suivez les instructions données dans la boîte de dialogue. Créez un retour sur investissement du bas de la chambre du tunnel de nage et cliquez sur OK. Assurez-vous qu’aucun coin noir n’est visible.
REMARQUE : La fenêtre de seuil s’ouvre avec une image 1 modifiée et à seuil. - Changez la palette de couleurs de N&B à Rouge. Ajustez la valeur maximale jusqu’à ce que l’image 1 affiche le poisson en rouge et rien d’autre. Enregistrez le seuil. Cliquez sur OK dans la boîte de dialogue.
REMARQUE: Le programme s’exécutera automatiquement. Le retour sur investissement qui a été créé pour l’image 1 sera continuellement sélectionné et désélectionné pour les images suivantes. Une barre de progression surveillera le processus dans le coin inférieur droit de la fenêtre Fidji . Le suivi prend environ 40 minutes par film. Lorsque tous les films sont suivis, le programme Fidji s’arrête. Le retour sur investissement cessera d’être sélectionné. Le dossier contenant les films aura maintenant un fichier _raw.csv pour chaque film. Les Fidji peuvent être fermées à ce stade. - Alignement, assemblage et acquisition de statistiques descriptives
- Ouvrez le Behavior_v7 Swim. Script R dans R Studio.
- Cliquez sur Source dans le coin supérieur droit de la section script. Dans une nouvelle fenêtre qui s’ouvre, choisissez le dossier contenant les fichiers _raw.csv générés par Fidji. Cliquez sur Ouvrir.
REMARQUE: Le programme s’exécutera automatiquement. - Dans une boîte de dialogue qui s’affiche et vous demande de confirmer le nombre de poissons dans chaque film, cliquez sur Oui si les chiffres indiqués sont corrects, ou cliquez sur Non si les chiffres sont incorrects.
REMARQUE: Si vous avez cliqué sur Non, un message apparaîtra demandant que les films soient retracés avec un nouveau retour sur investissement et un nouveau seuil. Si vous avez cliqué sur Oui, le programme se poursuivra. - Dans la nouvelle fenêtre qui s’ouvre pour savoir si les poissons qui ne nagent pas doivent être supprimés, cliquez sur Oui ou Non.
REMARQUE: Les poissons qui ne nagent pas sont définis comme des poissons ayant moins de 50% d’activité à 10 cm / s. Il n’est pas recommandé d’enlever les poissons qui ne nagent pas. - Dans une nouvelle fenêtre contextuelle qui demande si les groupes ne sont pas aveugles et si l’utilisateur souhaite combiner des groupes, unsais ou combiner des groupes s’il existe plusieurs groupes de contrôle.
- Une fois qu’une réponse est donnée à la question précédente, assurez-vous que le programme donne un message Alignement du fichier X de Y, où X est le fichier en cours d’alignement et Y est le nombre total de fichiers à aligner. Il faut environ 30 s pour que chaque fichier soit aligné.
- Une fois les fichiers alignés, recherchez un nouveau fichier .csv généré avec le même nom (_aligned.csv). Assurez-vous que le programme combine les données, exécute des statistiques et trace des graphiques de sortie. Recherchez les fichiers d’analyse générés dans un nouveau dossier intitulé Results dans le dossier parent qui contient les fichiers _raw.csv et _aligned.csv .
- Dans le dossier Résultats , recherchez deux dossiers nommés Diagnostics et Graphs et quatre fichiers .csv nommés BulkData_Avg, BulkData_Full, SummaryData_Avg et SummaryData_Full.
REMARQUE : Le SummaryData_Full.csv contient les données individuelles pour chaque poisson de chaque groupe à chaque point temporel. Ces données sont automatiquement tracées mais peuvent être extraites et tracées ailleurs.- Assurez-vous que le dossier Graphs contient les graphiques générés par le programme et .csv fichiers contenant les points de données de chaque graphique.
- Assurez-vous que le dossier Diagnostics contient un seul fichier .csv avec les données de diagnostic des fichiers alignés.
Remarque : Les colonnes du fichier Diagnostics.csv incluent les éléments suivants : a) Le nombre d’images contenant des objets supplémentaires, qui doit être inférieur à 100. Trop d’images avec des objets supplémentaires suggèrent un problème avec le suivi. b)Le nombre d’images avec des objets manquants ou fusionnés. Il est normal que cette mesure soit élevée. Les poissons qui ne se sont pas bien régénérés seront souvent emportés à l’arrière du tunnel et seront comptés comme manquants. c) Images avec des sauts de plus de 240 pixels. Ce nombre augmente avec le nombre d’objets (poissons) dans un seul film. Une explication détaillée de la façon dont les mesures de comportement ont été calculées est fournie dans le fichier supplémentaire 1.
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Representative Results
Nous avons mis en place le tunnel de nage comme décrit à la section 1 de ce protocole (Figure 1). Nous avons évalué l’endurance à la nage (section 2 de ce protocole) ainsi que le comportement de nage (sections 3 et 4 de ce protocole) du poisson-zèbre adulte au départ et après une lésion de la moelle épinière (Figure 2).
Pour établir la fonction motrice de base, nous avons examiné l’endurance à la nage du poisson-zèbre de type sauvage sous des vitesses de courant d’eau croissantes (figure 3A). Dans ce test, le poisson-zèbre de type sauvage a nagé pendant 41 minutes avant de s’épuiser. Les poissons ont ensuite été soumis à des transsections complètes de la moelle épinière comme décrit précédemment et des tests d’endurance à la nage ont été effectués6. Après avoir anesthésié le poisson-zèbre à l’aide de MS-222, une petite incision est faite avec de fins ciseaux pour transecter la moelle épinière caudale de 4 mm à la région du tronc cérébral. Une transsection complète a été confirmée visuellement. Pour confirmer la perte de capacité de nage après une chirurgie de la moelle épinière, les animaux blessés ont été évalués 2 ou 3 jours après la blessure (dpi). À ce stade, les poissons-zèbres sont complètement paralysés caudales au site de la lésion. L’endurance en natation a été évaluée 2, 4 et 6 semaines après la blessure (wpi). À 2 wpi, les poissons lésés ont perdu 60 % de leur capacité d’endurance à la nage (figure 3A). Les poissons régénérants ont progressivement retrouvé leur endurance de nage à 4 et 6 wpi. Ces résultats indiquent que les poissons-zèbres de type sauvage sont capables de retrouver leur capacité d’endurance à nager après une lésion de la moelle épinière.
Pour examiner le comportement de nage du poisson-zèbre pendant la régénération de la moelle épinière, nous avons suivi le comportement de nage d’animaux de type sauvage à une vitesse de courant d’eau de 0 cm / s ou sous des vitesses de courant constantes et faibles de 10 et 20 cm / s (Figure 3B). Des traces moyennes de la position des poissons dans la chambre du tunnel de nage ont été utilisées pour l’évaluation visuelle du comportement de nage à de faibles vitesses de courant (figure 3B). Dans ce test, des témoins non blessés ont nagé régulièrement dans la partie avant de la chambre du tunnel de nage (plus près de la source de courant d’eau), ce qui correspond à une position Y élevée (figure 3B). En revanche, à 2 wpi, les poissons blessés n’étaient pas en mesure de maintenir une capacité de nage stable à contre-courant. Par conséquent, leurs pistes de nage sont plus irrégulières avec une diminution globale de la position Y (figure 3B). La position Y a augmenté à 4 et 6 wpi, ce qui indique que les animaux en régénération ont progressivement retrouvé leur capacité à nager à l’avant de la chambre du tunnel de natation. Pour quantifier les paramètres de comportement de nage, nous avons calculé le pourcentage d’activité, la position dans le tunnel de nage (position Y) et le temps passé à nager par rapport au courant (Figure 3C-E). Par rapport aux témoins non blessés, les animaux sectionnés à 2 wpi étaient nettement moins actifs (figure 3C), calés dans le quadrant arrière du tunnel de nage (figure 3D) et ont perdu leur capacité à nager contre de faibles vitesses de courant (figure 3E). Conformément à leur capacité innée à atteindre une récupération fonctionnelle, les animaux lésés ont progressivement normalisé les paramètres de comportement de nage à 4 et 6 wpi (Figure 3C-E). Les paramètres d’endurance et de comportement de nage combinés ont offert des lectures quantifiables de la fonction de natation et de la réparation fonctionnelle de la moelle épinière chez le poisson-zèbre.
Figure 1 : Tunnel de nage mis en place et couvercles personnalisés. (A) Images représentatives de la mise en place du tunnel de baignade, y compris des vues panoramiques supérieures et latérales de la chambre du tunnel de natation. B) Images des couvercles des tunnels de nage utilisés pour les diverses applications décrites dans le présent protocole. Un couvercle de tunnel de nage standard entièrement fermé est utilisé pour les essais de comportement de nage (section 3 du présent protocole). Un couvercle de tunnel de nage modifié qui accueille un débitmètre numérique portatif est utilisé pour l’étalonnage (section 1 du présent protocole). Un couvercle d’endurance de nage modifié, contenant un couvercle amovible à l’extrémité postérieure de la chambre du tunnel de nage, permet d’éliminer les poissons épuisés pendant les essais d’endurance à la nage (section 2 du présent protocole). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Pipeline expérimental pour tester l’endurance à la nage et le comportement de nage chez les poissons-zèbres adultes. Pour l’endurance de la natation, les poissons nageaient contre un courant d’eau croissant jusqu’à épuisement. Pour le comportement de nage, les paramètres de nage sont évalués en l’absence et à de faibles vitesses de courant. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Récupération fonctionnelle chez le poisson-zèbre de type sauvage après une lésion de la moelle épinière. (A) Fonction motrice déterminée par des essais d’endurance à la nage pour le poisson-zèbre de type sauvage au départ et 2, 4 et 6 wpi. Les points désignent des animaux individuels issus de deux expériences indépendantes. (B) Les tests de comportement de nage ont suivi les poissons-zèbres de type sauvage sous de faibles vitesses de courant d’eau. La position Y moyenne est indiquée à chaque point temporel tout au long du suivi (0 cm/s pendant 5 min, 10 cm/s pendant 5 min et 20 cm/s pendant 5 min). (C-E) Le pourcentage d’activité (C), la position moyenne Y dans le tunnel (D) et le temps passé à nager par rapport au flux (E) ont été quantifiés à 20 cm/s. Pour toutes les quantifications, deux expériences indépendantes sont présentées. n = 30 dans l’état d’avant la blessure; n = 23 à 2 wpi, n = 20 à 4 wpi, n = 18 à 6 wpi. L’ANOVA unidirectionnelle a été utilisée pour les analyses statistiques. Les barres d’erreur représentent l’erreur type de la moyenne (MEB). *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001; P < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Dossier supplémentaire 1 : Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Le poisson-zèbre adulte est un système de vertébrés populaire pour modéliser les maladies humaines et étudier les mécanismes de régénération des tissus. L’édition du génome CRISPR/Cas9 a révolutionné les études génétiques inversées pour la modélisation des maladies chez le poisson-zèbre; cependant, la génétique à grande échelle chez le poisson-zèbre adulte a été entravée par des défis biologiques et techniques, y compris l’indisponibilité des tissus de poisson-zèbre adultes au phénotypage à haut débit. Compte tenu de l’anatomie complexe du poisson-zèbre adulte, un traitement histologique prolongé est nécessaire pour obtenir et analyser l’architecture tissulaire. Les tests d’endurance et de comportement de nage décrits dans cette étude peuvent être utilisés pour pré-dépister les phénotypes neuronaux, musculaires ou squelettiques à un débit moyen avant l’histologie. De plus, comme les études sur la régénération tissulaire visent à améliorer la réparation fonctionnelle des tissus, les protocoles décrits dans cette étude seront largement applicables, sinon essentiels, pour les études de recherche sur la régénération neuronale, musculaire et squelettique.
Les tests de locomotion fonctionnelle ont fait partie intégrante de notre compréhension du développement neuronal et de la régénération. Les essais locomoteurs standard sont largement disponibles chez les espèces de vertébrés, y compris les rats, les souris et les larves de poissons-zèbres. Les systèmes modèles de souris et de rats ont des tests de locomotion comportementaux et fonctionnels tels que le BMS16 et le BBB17,18, respectivement. De même, une foule de protocoles ont été décrits pour mesurer la locomotion, la réponse aux sursauts et le comportement chez les larves de poissons-zèbres. Ces protocoles sont efficaces pour révéler les différences de comportement entre les groupes expérimentaux dans les environnements clairs et sombres, l’évasion des prédateurs et l’activité19,20,21. Nous décrivons ici des méthodes quantifiables et reproductibles pour mesurer la récupération fonctionnelle après une lésion de la moelle épinière chez le poisson-zèbre adulte.
Notez que cette étude présente plusieurs limites. Premièrement, les études comportementales dépendent fortement de facteurs génétiques et environnementaux. Pour contrôler la variabilité génétique, nous avons utilisé des frères et sœurs pour contrôler l’âge, le sexe et le contexte génétique dans les groupes expérimentaux22,23. Pour contrôler les facteurs environnementaux, nous nous sommes assurés que les expériences sont effectuées à la même heure de la journée, dans des conditions de température et d’éclairage contrôlées20. Deuxièmement, bien que le test du comportement de nage soit moins sensible à l’analyse biaisée, le chercheur qui effectue le test d’endurance de nage détermine quand un poisson atteint l’épuisement et procède à l’élimination des poissons épuisés de la chambre du tunnel de nage sans interrompre le reste de la cohorte de poissons. Ainsi, nos expériences d’endurance en natation ont été réalisées par un seul chercheur aveuglé par les conditions expérimentales. Il est particulièrement important d’éviter la variabilité de chercheur à chercheur pour les études longitudinales de groupes expérimentaux au fil du temps. Enfin, les collisions entre poissons peuvent compliquer l’analyse de suivi dans les tests de comportement de nage. Nous recommandons donc d’effectuer des tests de comportement de nage pour des groupes de cinq poissons ou moins afin de minimiser les risques de collisions entre poissons.
En tenant compte des étapes critiques, nous notons que les poissons blessés peuvent être fragiles, en particulier dans les premiers jours suivant une blessure. Nous recommandons donc de manipuler le poisson avec un soin extrême. Pour les tests d’endurance à la nage, la collecte des poissons avec le tube en PVC le plus rapidement possible, la tête ou la queue en premier, réduit le risque de blessures secondaires pendant le processus de collecte. Pour les tests de comportement de nage, la pompe de chasse d’eau peut parfois créer des vagues, déformer les films et provoquer des erreurs d’analyse. Dans ce cas, la pompe de rinçage peut être brièvement éteinte. Cependant, nous ne recommandons pas d’éteindre la pompe de chasse d’eau pendant de longues périodes pour s’assurer que l’eau circule constamment entre la chambre du tunnel de nage et le réservoir tampon. La surveillance de l’enregistrement vidéo permet de mettre fin et de redémarrer immédiatement le film si une image a été lâchée ou si un poisson s’écarte de la zone d’enregistrement. Dans d’autres considérations, lors de l’exécution de l’analyse de suivi, si le code R donne une erreur pendant le traitement du fichier, le problème le plus probable est dans la dénomination des fichiers. Le programme est conçu pour fonctionner selon une stratégie de nommage très spécifique : Timepoint_Group_Subgroup_Stock number_Anything d’autre (par exemple, 0_A_1_00001_WildtypeGroupA.avi). Cette dénomination permet de tracer et d’aligner plusieurs points temporels, groupes et sous-groupes. Enfin, bien que des points de contrôle aient été intégrés au script d’analyse pour assurer un suivi approprié, il est important de vérifier soigneusement les résultats de l’analyse. Le programme demandera automatiquement si le numéro de poisson est correct et demandera des films pour une nouvelle analyse si le numéro de poisson est incorrect. Des artefacts en ligne droite peuvent apparaître dans le diagramme de position Y moyenne, indiquant qu’un objet supplémentaire a été reconnu comme un poisson. Dans ce cas, le meilleur plan d’action est de regarder attentivement le film pour exclure les artefacts supplémentaires qui ont tendance à apparaître à une vitesse d’écoulement plus élevée.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Nous remercions la ressource partagée Zebrafish de l’Université de Washington pour les soins aux animaux. Cette recherche a été soutenue par le NIH (R01 NS113915 à M.H.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoSwim software | Loligo Systems | MI10000 | Optional - for Automatic control of current velocity |
| Customized lid | Loligo Systems | MI10001 | This customized lid is used for swim endurance |
| DAQ-BT | Loligo Systems | SW10600 | Optional - for Automatic control of current velocity |
| Eheim pump | Loligo Systems | PU10160 | 20 L/min. This pump is placed in theflow-through tank. |
| Fiji | Fiji | Freely available through Image J (Fiji) | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Flowtherm | Loligo Systems | AC10000 | Handheld digital flow meter - for calibration |
| High Speed Camera | Loligo Systems | VE10380 | USB 3.0 color video camera (4MP) |
| IR light panel | Loligo Systems | VE10775 | 450 x 210 mm, placed under the swim tunnel chamber |
| Monofocal lens | Loligo Systems | VE10388 | 25mm manual lens |
| PVC Tubing | VWR | 60985-534 | 5/16 x 7/16" Wall thickness: 1/16" |
| R Studio | R Studio | Freely available. Version 3.6 with extra packages. | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Swim tunnel respirometer | Loligo Systems | SW10060 | 5L (120V/60Hz). The system includes the swim chamber, motor, manual control of water current velocity, 1 pump placed inside the chamber, standard swim tunnel lid for swim behavior, and modified swim tunnel lid for calibration |
| uEye Cockpit | IDS | Freely available software to control camera parameters | Alternative cameras and accompanying softwares could be used |
| Vane wheel flow probe | Loligo Systems | AC10002 | Digital flow probe - for calibration |
References
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