Summary
Der erwachsene Zebrafisch ist in der Lage, sich nach einer Rückenmarksverletzung funktionell zu erholen und ist ein erstklassiges Modellsystem zur Aufklärung der angeborenen Mechanismen der neuronalen Regeneration. Hier beschreiben wir Schwimmausdauer- und Schwimmverhaltensassays als funktionelle Auslesungen der Rückenmarksregeneration.
Abstract
Aufgrund ihrer bekannten Regenerationsfähigkeit sind erwachsene Zebrafische ein erstklassiges Wirbeltiermodell, um Mechanismen der angeborenen Rückenmarksregeneration zu untersuchen. Nach vollständiger Durchtrennung ihres Rückenmarks verlängern Zebrafische Glia- und axonale Brücken über durchtrenntes Gewebe, regenerieren Neuronen proximal zur Läsion und erlangen ihre Schwimmfähigkeiten innerhalb von 8 Wochen nach der Verletzung wieder. Die Wiederherstellung der Schwimmfunktion ist somit eine zentrale Anzeige für die funktionelle Rückenmarksreparatur. Hier beschreiben wir eine Reihe von Verhaltensassays zur Quantifizierung der motorischen Kapazität von Zebrafischen in einem geschlossenen Schwimmtunnel. Ziel dieser Methoden ist es, quantifizierbare Messungen der Schwimmausdauer und des Schwimmverhaltens bei erwachsenen Zebrafischen zu liefern. Für die Schwimmausdauer sind Zebrafische bis zur Erschöpfung einer ständig steigenden Wasserströmungsgeschwindigkeit ausgesetzt, und es wird Zeit bei Erschöpfung gemeldet. Für die Beurteilung des Schwimmverhaltens werden Zebrafische niedrigen Strömungsgeschwindigkeiten ausgesetzt und Schwimmvideos werden mit einer dorsalen Ansicht des Fisches aufgenommen. Prozentuale Aktivität, Burst-Frequenz und Zeit, die gegen die Wasserströmung aufgewendet wird, liefern quantifizierbare Anzeigen des Schwimmverhaltens. Wir quantifizierten die Schwimmausdauer und das Schwimmverhalten bei Wildtyp-Zebrafischen vor Verletzungen und nach der Querschnitt des Rückenmarks. Wir fanden heraus, dass Zebrafische nach der Rückenmarkstransektion die Schwimmfunktion verlieren und diese Kapazität zwischen 2 und 6 Wochen nach der Verletzung allmählich wiedererlangen. Die in dieser Studie beschriebenen Methoden könnten auf neurobehaviorale, Muskel-Skelett-, Skelettmuskelregenerations- und neuronale Regenerationsstudien bei erwachsenen Zebrafischen angewendet werden.
Introduction
Erwachsene Zebrafische werden in hervorragender Weise verwendet, um Mechanismen der neuromuskulären und muskuloskelettalen Entwicklung und Krankheitsmodellierung zu untersuchen1,2,3. Zebrafische sind in der Lage, mehrere Gewebe effizient und spontan zu reparieren, einschließlich Gehirn, Rückenmark und Skelettmuskulatur4,5,6,7. Die bemerkenswerte Fähigkeit, neuromuskuläres Gewebe zu regenerieren und Krankheiten zu modellieren, zieht eine wachsende wissenschaftliche Gemeinschaft in die Forschung an erwachsenen Zebrafischen1,2,3. Während jedoch Assays der Fortbewegung und des Schwimmverhaltens für Larvenzebrafische verfügbar und standardisiert sind, besteht ein wachsender Bedarf, analoge Protokolle bei erwachsenen Fischen zu entwickeln8,9,10,11. Das Ziel dieser Studie ist es, Protokolle zur Quantifizierung der Schwimmausdauer und des Schwimmverhaltens bei erwachsenen Zebrafischen zu beschreiben. Wir stellen diese Protokolle im Rahmen der Rückenmarksregenerationsforschung vor. Die hier beschriebenen Verhaltensprotokolle sind jedoch gleichermaßen auf Studien zur neuronalen und Muskelregeneration, zur neuromuskulären und muskuloskelettalen Entwicklung sowie zur Modellierung neuromuskulärer und muskuloskelettaler Erkrankungen anwendbar.
Zebrafisch-Spiegelung kehrt die Lähmung innerhalb von 8 Wochen nach vollständiger Rückenmarkstransektion um. Im Gegensatz zu schlecht regenerativen Säugetieren zeigen Zebrafische pro-regenerative Immun-, neuronale und gliale Verletzungsreaktionen, die für eine funktionelle Rückenmarksreparatur erforderlich sind12,13,14. Eine ultimative Anzeige der funktionellen Rückenmarksreparatur ist die Fähigkeit des läsionierten Gewebes, seine Funktion nach einer Verletzung wiederzuerlangen. Eine Reihe standardisierter Methoden zur Beurteilung der funktionellen Regeneration bei Nagetieren umfasst lokomotorische, motorische, sensorische und sensomotorische Tests15,16,17. Zu den weit verbreiteten Tests bei Rückenmarksverletzungen bei Maus-Rückenmarksverletzungen gehören die lokomotorische Basso Mouse Scale (BMS), motorische Tests der Vordergliedmaßen, taktile sensorische Tests und Grid Walking Sensomotoriktests15,17. Im Gegensatz zu Säugetier- oder Larven-Zebrafischsystemen sind Verhaltenstests bei erwachsenen Zebrafischen weniger entwickelt, aber dringend erforderlich, um den wachsenden Bedürfnissen der Geweberegenerations- und Krankheitsmodellierungsgemeinschaften gerecht zu werden.
Vollständige Rückenmarkstransektionen führen zu einer vollständigen Lähmung der Verletzungsstelle. Kurz nach der Verletzung sind gelähmte Tiere weniger aktiv und vermeiden das Schwimmen so weit wie möglich. Um die verlorene Schwimmkapazität auszugleichen, zeigen gelähmte Tiere kurze, häufige Ausbrüche, indem sie ihre Brustflossen, die rostral zur Läsion liegen, überbeanspruchen. Diese kompensatorische Schwimmstrategie führt zu schneller Erschöpfung und geringerer Schwimmkapazität. Wenn sich das Rückenmark des Zebrafischs regeneriert, erhalten die Tiere eine glatte oszillierende Schwimmfunktion zurück, die mit der Läsion konudal ist, was eine erhöhte Schwimmausdauer und verbesserte Schwimmverhaltensparameter ermöglicht. Hier beschreiben wir Methoden zur Quantifizierung der Schwimmausdauer von Zebrafischen bei steigenden Wasserströmungsgeschwindigkeiten und des Schwimmverhaltens bei niedrigen Strömungsgeschwindigkeiten.
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Protocol
Erwachsene Zebrafische der Stämme Ekkwill und AB wurden in der Zebrafish Core Facility der Washington University gehalten. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Tierprotokollen der IACUC durchgeführt.
HINWEIS: Ein Beispiel für den Versuchsaufbau ist in Abbildung 1A dargestellt. Der Kalibrierungsdeckel (kundenspezifisch), der Schwimmausdauerdeckel (kundenspezifisch) und der Schwimmverhaltensdeckel (standardmäßiger, geschlossener Tunneldeckel) sind in Abbildung 1B dargestellt. Der experimentelle Workflow ist in Abbildung 2 dargestellt.
1. Vorbereitung und Kalibrierung von Schwimmtunneln
- Füllen Sie den Schwimmtunnel und den umliegenden Puffertank mit Wasser des Zebrafischsystems (10 l gefiltertes Wasser; Alkalität: 50-150 mg / L CaCO3; pH: 6,8-7,5; Temperatur: 26-28,5 ° C; Nitrat < 50 mg / L; Nitrit < 0,1 mg / L; und Salzgehalt < 0,5-1 g / L).
- Füllen Sie einen zusätzlichen Durchflussbehälter mit Wasser des Zebrafischsystems (≈7,5 l). Positionieren Sie den Schwimmtunnel und den Durchflussbehälter, damit überschüssiges Wasser des Zebrafischsystems aus dem Puffertank durch ein an der Seite des Puffertanks befestigtes Ausflussrohr in den Durchflusstank fließen kann.
- Sobald der Tunnel und der Puffertank gefüllt sind, führen Sie die folgenden Schritte aus.
- Platzieren Sie die Spülpumpe im Puffertank und verbinden Sie sie mit PVC-Rohren mit dem angrenzenden Schwimmtunnel. Platzieren Sie die Durchflusspumpe im Durchflussbehälter und schließen Sie sie an die Wand des Puffertanks an.
- Schalten Sie die Spülpumpe im Puffertank und die Durchflusspumpe im Durchflussbehälter ein, um mit der Wasserzirkulation zu beginnen.
HINWEIS: Das Doppelpumpensystem sorgt für einen kontinuierlichen Wasserfluss in den Schwimmtunnel (von der Spülpumpe) und in den Puffertank (von der Durchflusspumpe). - Beseitigen Sie alle im Schwimmtunnel eingeschlossenen Luftblasen, indem Sie die Wasserströmungsgeschwindigkeit schrittweise von 10 cm/s auf 100 cm/s in Abständen von 10 cm/s erhöhen. Verringern Sie die Geschwindigkeit in Abständen von 10 cm/s wieder auf 0 cm/s. Um die Strömungsgeschwindigkeit zu steuern, klicken Sie auf die Aufwärts- und Abwärtspfeile im Abschnitt Geschwindigkeit der Fließgeschwindigkeitssteuerungssoftware (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Der Motor und der Rotor sind mit dem mitgelieferten Computer verbunden. Die Strömungsgeschwindigkeitsregelungssoftware kommuniziert mit dem Motor, um die gewünschte Strömungsgeschwindigkeit zu erzeugen. Die Verwendung der Fließgeschwindigkeitsregelungssoftware ist optional. Die Alternative besteht darin, den Wasserströmungsmotor manuell zu steuern.
- Kalibrierung
HINWEIS: Vor jedem Experiment ist eine Kalibrierung erforderlich.- Verwenden Sie den Kalibrierdeckel, um den Schwimmtunnel zu schließen.
HINWEIS: Der Kalibrierdeckel wird mit einer verstärkten zentralen Öffnung angepasst, die zu der für die Kalibrierung verwendeten Durchflussmessersonde passt (Abbildung 1B). Acht Flügelmuttern werden verwendet, um alle Deckel am Tunnel zu befestigen. - Schalten Sie den digitalen Durchflussmesser ein und schließen Sie ihn an die Durchflussmessersonde an. Platzieren Sie die Durchflussmessersonde über den Kalibrierdeckel im Schwimmtunnel. Positionieren Sie die Schaufeln der Durchflussmessersonde senkrecht zur Strömungsrichtung.
- Kalibrieren Sie den Ausgang des Schwimmtunnelmotors (gesteuert mit der Strömungsgeschwindigkeitssteuerungssoftware) mit dem digitalen Durchflussmesser. Führen Sie dazu die folgenden Schritte aus.
- Öffnen Sie die Strömungsgeschwindigkeitssteuerungssoftware und klicken Sie auf Kalibrierung.
- Ändern Sie die Optionen oben links in RPM vs Voltage. Erhöhen Sie die Strömungsgeschwindigkeit von 0 cm/s auf 100 cm/s in Schritten von 5 cm/s, indem Sie die Werte im Abschnitt Geschwindigkeit der Fließgeschwindigkeitssteuerungssoftware eingeben. Klicken Sie bei jedem Schritt auf die Schaltfläche "+" und zeichnen Sie die vom digitalen Durchflussmesser angezeigte Stromgeschwindigkeit auf.
HINWEIS: Die resultierende lineare Beziehung sollte einen R2-Wert nahe 1 haben. - Um die Kalibrierung zu bestätigen, erhöhen Sie die Wasserströmungsgeschwindigkeiten von 0 auf 10, 25, 50, 75 und 100 cm / s und verringern Sie dann die Geschwindigkeiten auf 75, 50, 25, 10 cm / s mit den Aufwärts- und Abwärtspfeilen im Abschnitt Uwater [cm / s] der Strömungsgeschwindigkeitssteuerungssoftware. Messen und zeichnen Sie bei jeder Geschwindigkeit (aus der Software) die entsprechende Geschwindigkeit auf, die vom digitalen Durchflussmesser angezeigt wird.
- Betrachten Sie den Tunnel kalibriert und genau, wenn die gemessenen Wasserströmungsgeschwindigkeiten innerhalb einer Abweichung von ±2 cm / s liegen. Wenn die Abweichung mehr als ±2 cm/s beträgt, wiederholen Sie die Schritte 1.4.4 bis 1.4.6, um eine ordnungsgemäße Kalibrierung sicherzustellen.
- Verwenden Sie den Kalibrierdeckel, um den Schwimmtunnel zu schließen.
2. Beurteilung der Schwimmausdauer
HINWEIS: Experimentelle Gruppen werden in Gruppen von 10 oder weniger Tieren für die Schwimmausdauer unterteilt.
- Richten Sie die Fließgeschwindigkeitsregelungssoftware ein.
HINWEIS: Die Verwendung der Fließgeschwindigkeitsregelungssoftware in diesem Abschnitt ist optional. Die Alternative besteht darin, den Wasserströmungsmotor manuell zu steuern. Fahren Sie für die manuelle Wasserstromregelung mit Schritt 2.3 fort und erhöhen Sie die Wasserströmungsgeschwindigkeit manuell in den angegebenen Schritten in den Schritten 2.5 und 2.6.- Öffnen Sie die Software zur Steuerung der Strömungsgeschwindigkeit. Klicken Sie auf das Kästchen mit der Bezeichnung Experiment. Deaktivieren Sie Uswim und Uwater.
- Ändern Sie die Strömungsgeschwindigkeit im Feld Uwater [cm/s] unten links, um die Wasserströmungsgeschwindigkeiten anzupassen.
- Um ein automatisiertes Protokoll zu starten, klicken Sie auf das Feld Protokollierung starten . Wählen Sie im sich öffnenden Dialogfenster in der Dropdown-Liste die Option Automatisiert aus.
- Um eine zuvor gespeicherte Protokolldatei auszuwählen, klicken Sie auf das Dateisymbol neben Protokolldatei , um das gewünschte Protokoll zu öffnen.
- Richten Sie die Ausgabedatei ein, indem Sie auf das Dateisymbol neben Protokolldatei klicken. Benennen Sie im sich öffnenden Datei-Explorer-Fenster die Ausgabedatei und speichern Sie sie am gewünschten Speicherort.
- Richten Sie ein Split-Lap-Timer-Fenster ein. Stellen Sie sicher, dass Sie gleichzeitig auf die Flussgeschwindigkeitssteuerungssoftware und die Timerfenster auf dem Computerbildschirm zugreifen können.
- Richten Sie ein Fischsammelbecken ein, um erschöpfte Fische nach ihrer Entfernung aus dem Schwimmtunnel unterzubringen. Füllen Sie den Sammelbehälter mit Wasser des Zebrafischsystems (0,75 L). Füllen Sie ein langes PVC-Rohr mit Wasser des Zebrafischsystems.
- Legen Sie ein Ende (Ende 1) des vorgefüllten PVC-Rohrs in den Auffangbehälter und das andere Ende (Ende 2) in den Puffertank. Stellen Sie sicher, dass Wasser frei aus dem Pufferspeicher in den Sammelbehälter fließen kann.
- Klemmen Sie das obere Ende des PVC-Rohrs (Ende 2) mit einem Bindemittelclip ein, um den Wasserfluss zu verhindern. Verwenden Sie den Bindemittelclip, um den Wasserabfluss nach Bedarf zu steuern.
- Schließen Sie den Schwimmtunnel mit dem Schwimmausdauerdeckel.
HINWEIS: Der Schwimmausdauerdeckel ist mit einem Schwimmtunnelfenster ausgestattet, um erschöpfte Fische aus dem Schwimmtunnel zu entfernen, ohne den Rest des Assays zu unterbrechen (Abbildung 1B). - Platzieren Sie eine Gruppe von Fischen im Schwimmtunnel. Starten Sie den Split-Lap-Timer, während Sie die Stromgeschwindigkeit auf 0 cm/s für 5 min, 9 cm/s für 5 min und 10 cm/s für 5 min einstellen, indem Sie diese Werte in den Abschnitt Uwater [cm/s] der Flow Velocity Control Software eingeben.
HINWEIS: Dieser Schritt gewöhnt die Tiere an den Schwimmtunnel und die Strömungsrichtung. - Starten Sie nach der Akklimatisierung der Fische das automatisierte Fließgeschwindigkeitssteuerungsprogramm, das die Wasserströmungsgeschwindigkeit um 2 cm / s pro Minute erhöht.
HINWEIS: Fische schwimmen bis zur Erschöpfung. Erschöpfte Fische werden in Richtung des hinteren Endes des Schwimmtunnels geschoben. - Wenn ein Fisch erschöpft ist, lösen Sie das Fischsammelrohr, öffnen Sie das Fenster des Schwimmtunnels und sammeln Sie den Fisch im Sammelbecken. Zeichnen Sie die Zeit bei Erschöpfung mit dem Split-Lap-Timer auf.
HINWEIS: Fische können gelegentlich bis zum hinteren Ende des Schwimmtunnels treiben, ohne erschöpft zu sein. Um sicherzustellen, dass ein Fisch erschöpft ist, tippen Sie vorsichtig auf das hintere Ende des Tunnels oder erzeugen Sie einen Schatten über diesem Bereich, um den Fisch zum Schwimmen anzuregen. Erschöpfte Fische reagieren nicht auf den Schreckreiz und liegen flach am hinteren Ende des Tunnels. - Wiederholen Sie Schritt 2.7, bis alle Fische erschöpft und im Sammelbecken gesammelt sind. Klicken Sie auf die Not-Aus-Taste in der Durchflussgeschwindigkeitssteuerungssoftware und stoppen Sie den Timer.
HINWEIS: Überprüfen Sie während des gesamten Schwimmens, ob die Anzahl der Fische, die aus der Schwimmtunnelkammer entfernt wurden, mit den aufgezeichneten Zeiten übereinstimmt. - Wiederholen Sie die Schritte 2.5 bis 2.8 für jede Fischgruppe.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden, aber um auf den Zeitpunkt nach der Verletzung genau zu sein, wird empfohlen, dass Filme und Ausdauerschwimmen am selben Tag durchgeführt werden. Der Tunnel kann weiter zirkulieren, während Experimente pausiert werden.
3. Aufnehmen von Videos für den Schwimmverhaltenstest
HINWEIS: Es können nur bis zu fünf Tiere gleichzeitig verfolgt werden. Wenn Versuchsgruppen größer als fünf Tiere sind, können für jede Gruppe mehrere Videos aufgenommen werden, wobei das erste Video fünf oder weniger Tiere und das zweite Video die anderen fünf oder weniger Tiere verfolgt. Für Längsschnittstudien, die darauf abzielen, einzelne Tiere im Laufe der Zeit zu verfolgen, können Fische einzeln untergebracht und über mehrere Zeitpunkte hinweg verfolgt werden. Alle Skripte zum Tracking und Analysieren sind über GitHub verfügbar (siehe Materialverzeichnis).
- Schalten Sie das Infrarot-Lichtpanel ein, das sich unter dem Schwimmtunnel befindet. Befestigen Sie die Kamera an einer Deckenhalterung oben auf dem Schwimmtunnel. Passen Sie Fokus- und Blendenringe an.
HINWEIS: Die Fokus- und Blendeneinstellungen hängen vom Abstand zwischen der Kamera und dem Schwimmtunnel sowie von der Lichtumgebung ab. - Öffnen Sie die Kameraaufzeichnungssoftware (siehe Materialtabelle). Legen Sie die Softwareeinstellungen wie folgt fest.
- Klicken Sie auf die 1:4-Aspektanzeige. Stellen Sie sicher, dass das Sichtfeld den gesamten Schwimmtunnel abdeckt. Deaktivieren Sie den automatischen Kontrast und den automatischen Weißabgleich, um den Hintergrund und den Kontrast gruppenübergreifend zu normalisieren.
- Öffnen Sie das Fenster Kameraeigenschaften , indem Sie auf das Schraubenschlüsselsymbol klicken. Stellen Sie die Parameter wie folgt ein: Pixeltakt: 344 MHz, Bildrate: 70 fps, klicken Sie auf das Kästchen neben Hold , um es zu überprüfen, Belichtungszeit: 0.290 ms. Schließen Sie dieses Fenster nicht.
- Schneiden Sie das Aufnahmefenster so zu, dass es nur die Schwimmkammer des Tunnels abdeckt, indem Sie die Kamera nach Bedarf neigen / drehen.
- Öffnen Sie das Aufnahmefenster , indem Sie auf das Filmrollensymbol klicken. Legen Sie die Aufnahmeeinstellungen wie folgt fest:
- Aktivieren Sie das Kontrollkästchen für die maximale Anzahl von Frames.
- Geben Sie manuell 63.000 für die Anzahl der Frames ein.
- Aktivieren Sie das Kontrollkästchen für Calc. Frame Rate. Dadurch kann das Programm die in Schritt 3.2.2 definierte Bildrate (70 fps) abrufen.
- Ändern Sie die JPEG-Qualität auf 30.
- Zeichnen Sie einen Testlauf auf.
- Klicken Sie auf Erstellen und benennen Sie die neue Datei Test und speichern Sie sie auf dem Desktop.
- Kehren Sie zum Aufnahmefenster zurück und klicken Sie auf Aufnahme. Lassen Sie den Testfilm für die gesamte Dauer des Protokolls (15 min) laufen.
- Wenn der Test abgeschlossen ist, stellen Sie sicher, dass keine ausgelassenen Frames vorhanden sind und dass 63.000 Frames aufgezeichnet werden.
- Platzieren Sie eine Gruppe von Fischen im Schwimmtunnel und schließen Sie den Tunnel mit einem standardmäßigen, vollständig geschlossenen Deckel (Abbildung 1B).
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich alle Fische im Tunnel befinden, bevor Sie den Deckel vollständig festziehen. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen unter dem Deckel befinden. Dies wirkt sich andernfalls auf die Ergebnisse aus. - Öffnen Sie ein neues Aufzeichnungsfenster und benennen Sie die Datei. Beispiel: 2_A_1_00001_WildtypeGroupA.avi
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Einstellungen den Parametern in den Schritten 3.2 und 3.3 entsprechen. Die JPEG-Qualität wird immer auf die Standardwerte zurückgesetzt und muss für jeden neuen Film zurückgesetzt werden.
ACHTUNG: Klicken Sie noch nicht auf Aufnehmen. - Beginnen Sie ein neues Experiment mit der Flow Velocity Control Software.
HINWEIS: Um ein automatisiertes Protokoll zu starten, klicken Sie auf das Feld Protokollierung starten . Wählen Sie im sich öffnenden Dialogfenster in der Dropdown-Liste die Option Automatisiert aus. Um eine zuvor gespeicherte Protokolldatei auszuwählen, klicken Sie auf das Dateisymbol neben Protokolldatei , um das gewünschte Protokoll zu öffnen.- Um ein manuelles Protokoll zu starten, stellen Sie die Durchflussgeschwindigkeit auf 0 cm/s für 5 min, 10 cm/s für 5 min ein, gefolgt von 20 cm/s für 5 min mit der Uwater [cm/s] Box in der Durchflussgeschwindigkeitskontrollsoftware.
- Speichern Sie die neue Datenausgabedatei (wird als .csv Datei gespeichert) unter demselben Namen wie die Filmdatei und im selben Ordner.
ACHTUNG: Klicken Sie noch nicht auf Start.
- Legen Sie ein Papiertuch oder ein Stück Stoff an die Seite des Schwimmtunnels, um sicherzustellen, dass alle Verhaltensweisen auf das Schwimmen von Fischen zurückzuführen sind und nicht auf eine Schreckreaktion, die durch Bewegung in der Umgebung verursacht wird.
- Stellen Sie in schneller Folge sicher, dass das Wasser ruhig ist und sich keine Wellen über den Rahmen bewegen. Klicken Sie im Fenster der Kamerasoftware auf Aufnahme, um die Aufnahme der Filmdatei zu starten. Klicken Sie in der Flussgeschwindigkeitssteuerungssoftware auf Start , um das Protokoll zu starten, das ohne Unterbrechung fortgesetzt wird.
- Sehen Sie sich den Film an, um sicherzustellen, dass keine Bilder fallengelassen werden, dass sich keine Blasen im Sichtfeld befinden und dass alle Fische aufgezeichnet werden.
- Sobald die Filmaufnahme abgeschlossen ist, klicken Sie auf Not-Aus, um das Protokoll zur Steuerung der Flussgeschwindigkeit zu beenden. Suchen Sie nach der Datenausgabedatei, die automatisch gespeichert wird. Klicken Sie im Aufnahmefenster auf Schließen, um die Filmdatei zu speichern.
- Entfernen Sie den Deckel. Holen Sie die Fische vorsichtig und bringen Sie sie in ihr Aquarium zurück.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.5 bis 3.12 für alle Fischgruppen.
- Sobald die Filmaufnahme für alle Gruppen abgeschlossen ist, konvertieren Sie Filme von 70-fps-Videos in 20-fps-Videos mit dem MovieProcessing_v5.bat-Skript. Verschieben Sie dazu die Skriptdatei in den Ordner, der die Rohvideos enthält. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Datei und wählen Sie Ausführen.
HINWEIS: Das Skript wird automatisch ausgeführt. Es erscheint ein Eingabeaufforderungsfenster, das den Fortschritt des Skripts anzeigt. Der obige Schritt ist optional. Es reduziert die Anzahl der Frames in einem 15-minütigen Video von 63.000 auf 18.000 Frames und macht die SwimBehavior_v7. R-Skript wird schneller ausgeführt. - Leeren Sie den Tunnel und verstauen Sie die gesamte Ausrüstung.
4. Analyse von Filmen für die Bewertung des Schwimmverhaltens
HINWEIS: Filmaufnahmen und -analysen können an verschiedenen Tagen durchgeführt werden.
- Öffnen Sie das Skript Tracking_v2.ijm in Fidschi und klicken Sie auf Ausführen , um das Programm zu starten. Wählen Sie im daraufhin angezeigten Fenster den Ordner aus, der die zu verfolgenden Schwimmverhaltensfilme enthält, und klicken Sie auf Öffnen. Suchen Sie nach Bild 1 des ersten Films, einem Dialogfeld und dem ROI-Manager (Region of Interest), der angezeigt wird.
- Folgen Sie den Anweisungen im Dialogfeld. Erstellen Sie einen ROI des Bodens der Schwimmtunnelkammer und klicken Sie auf OK. Stellen Sie sicher, dass keine schwarzen Ecken zu sehen sind.
HINWEIS: Das Schwellenwertfenster wird zusammen mit einem bearbeiteten, schwellenwertförmigen Frame 1 geöffnet. - Ändern Sie das Farbschema von S/W in Rot. Passen Sie den Max-Wert an, bis Bild 1 den Fisch in Rot und nichts anderes zeigt. Notieren Sie den Schwellenwert. Klicken Sie im Dialogfeld auf OK.
HINWEIS: Das Programm wird automatisch ausgeführt. Der ROI, der für Frame 1 erstellt wurde, wird kontinuierlich ausgewählt und für nachfolgende Frames nicht ausgewählt. Ein Fortschrittsbalken überwacht den Prozess in der unteren rechten Ecke des Fidschi-Fensters . Das Tracking dauert etwa 40 Minuten pro Film. Wenn alle Filme verfolgt werden, stoppt das Fidschi-Programm . Der ROI wird nicht mehr ausgewählt. Der Ordner, der die Filme enthält, enthält nun eine _raw.csv Datei für jeden Film. Fidschi kann an dieser Stelle geschlossen werden. - Ausrichten, Zusammenstellen und Erfassen deskriptiver Statistiken
- Öffnen Sie das Swim Behavior_v7. R-Skript in R Studio.
- Klicken Sie auf Quelle in der oberen rechten Ecke des Skriptabschnitts. Wählen Sie in einem neuen Fenster, das sich öffnet, den Ordner aus, der die von Fidschi generierten _raw.csv Dateien enthält. Klicken Sie auf Öffnen.
HINWEIS: Das Programm wird automatisch ausgeführt. - Klicken Sie in einem Dialogfeld, in dem Sie aufgefordert werden, die Anzahl der Fische in jedem Film zu bestätigen, auf Ja , wenn die angegebenen Zahlen korrekt sind, oder klicken Sie auf Nein , wenn die Zahlen falsch sind.
HINWEIS: Wenn auf Nein geklickt wurde, wird eine Meldung angezeigt, in der Sie aufgefordert werden, die Filme mit einem neuen ROI und Schwellenwert erneut zu verfolgen. Wenn Ja angeklickt wurde, wird das Programm fortgesetzt. - Klicken Sie im neuen Fenster, in dem Sie gefragt werden, ob der nicht schwimmende Fisch entfernt werden soll, auf Ja oder Nein.
HINWEIS: Nicht schwimmender Fisch ist definiert als Fisch mit weniger als 50% Aktivität bei 10 cm / s. Es wird nicht empfohlen, nicht schwimmende Fische zu entfernen. - In einem neuen Popup-Fenster, in dem gefragt wird, ob die Gruppen entblindet sind und ob der Benutzer Gruppen kombinieren möchte, entblinden oder kombinieren möchte, wenn es mehr als eine Kontrollgruppe gibt.
- Nachdem eine Antwort für die vorherige Frage gegeben wurde, stellen Sie sicher, dass das Programm die Meldung Aligning file X of Y ausgibt, wobei X die aktuelle Datei ist, die ausgerichtet wird, und Y die Gesamtzahl der auszurichtenden Dateien ist. Es dauert etwa 30 s, bis jede Datei ausgerichtet ist.
- Sobald die Dateien ausgerichtet sind, suchen Sie nach einer neuen .csv Datei, die mit demselben Namen (_aligned.csv) generiert wurde. Stellen Sie sicher, dass das Programm die Daten kombiniert, Statistiken ausführt und Ausgabediagramme darstellt. Suchen Sie nach den Analysedateien, die in einem neuen Ordner mit der Bezeichnung Ergebnisse innerhalb des übergeordneten Ordners generiert wurden, der die _raw.csv- und _aligned.csv Dateien enthält.
- Suchen Sie im Ordner Ergebnisse nach zwei Ordnern mit den Namen Diagnose und Diagramme sowie nach vier .csv Dateien mit den Namen BulkData_Avg, BulkData_Full, SummaryData_Avg und SummaryData_Full.
HINWEIS: Die SummaryData_Full.csv enthält die individuellen Daten für jeden Fisch in jeder Gruppe zu jedem Zeitpunkt. Diese Daten werden automatisch geplottet, können aber an anderer Stelle extrahiert und geplottet werden.- Stellen Sie sicher, dass der Ordner "Graphen" die vom Programm generierten Diagramme und .csv Dateien enthält, die die Datenpunkte für jedes Diagramm enthalten.
- Stellen Sie sicher, dass der Ordner Diagnose eine einzelne .csv Datei mit Diagnosedaten für ausgerichtete Dateien enthält.
HINWEIS: Zu den Spalten in der Datei Diagnose.csv gehören die folgenden: a) Die Anzahl der Frames, die zusätzliche Objekte enthalten, die weniger als 100 betragen sollte. Zu viele Frames mit zusätzlichen Objekten deuten auf ein Problem mit dem Tracking hin. b)Die Anzahl der Frames mit fehlenden oder zusammengeführten Objekten. Es ist normal, dass diese Metrik hoch ist. Fische, die sich nicht gut regeneriert haben, werden häufig in den hinteren Teil des Tunnels gespült und als vermisst gezählt. c) Frames mit mehr als 240-Pixel-Sprüngen. Diese Zahl steigt mit der Anzahl der Objekte (Fische) in einem einzigen Film. Eine detaillierte Erläuterung, wie die Verhaltensmetriken berechnet wurden, finden Sie in der ergänzenden Datei 1.
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Representative Results
Wir haben den Schwimmtunnel wie in Abschnitt 1 dieses Protokolls beschrieben eingerichtet (Abbildung 1). Wir bewerteten die Schwimmausdauer (Abschnitt 2 dieses Protokolls) sowie das Schwimmverhalten (Abschnitte 3 und 4 dieses Protokolls) von erwachsenen Zebrafischen zu Studienbeginn und nach einer Rückenmarksverletzung (Abbildung 2).
Um die motorische Basisfunktion zu bestimmen, untersuchten wir die Schwimmausdauer von Wildtyp-Zebrafischen unter zunehmenden Wasserströmungsgeschwindigkeiten (Abbildung 3A). In diesem Assay schwammen Wildtyp-Zebrafische 41 Minuten lang, bevor sie erschöpft waren. Die Fische wurden dann wie zuvor beschrieben vollständigen Rückenmarkstransektionen unterzogen und Schwimmausdauertests durchgeführt6. Nach der Betäubung von Zebrafischen mit MS-222 wird ein kleiner Schnitt mit einer feinen Schere gemacht, um das Rückenmark 4 mm kaudal in die Hirnstammregion zu transektieren. Eine vollständige Transsektion wurde visuell bestätigt. Um den Verlust der Schwimmfähigkeit nach einer Rückenmarksoperation zu bestätigen, wurden verletzte Tiere 2 oder 3 Tage nach der Verletzung (dpi) untersucht. Zu diesem Zeitpunkt sind Zebrafische vollständig gelähmt mit der Läsionsstelle. Die Schwimmausdauer wurde nach 2, 4 und 6 Wochen nach der Verletzung (wpi) beurteilt. Bei 2 wpi verloren läsionierte Fische 60% ihrer Schwimmausdauerkapazität (Abbildung 3A). Regenerierende Fische gewannen allmählich die Schwimmausdauer bei 4 und 6 wpi zurück. Diese Ergebnisse zeigten, dass Wildtyp-Zebrafische in der Lage sind, die Ausdauerkapazität des Schwimmens nach einer Rückenmarksverletzung wiederzuerlangen.
Um das Schwimmverhalten von Zebrafischen während der Rückenmarksregeneration zu untersuchen, verfolgten wir das Schwimmverhalten von Wildtieren bei 0 cm/s Wasserströmungsgeschwindigkeit oder unter konstanten, niedrigen Strömungsgeschwindigkeiten von 10 und 20 cm/s (Abbildung 3B). Durchschnittliche Spuren der Fischposition in der Schwimmtunnelkammer wurden zur visuellen Beurteilung des Schwimmverhaltens bei niedrigen Strömungsgeschwindigkeiten verwendet (Abbildung 3B). Bei diesem Assay schwammen unverletzte Kontrollpersonen stetig im vorderen Teil der Schwimmtunnelkammer (näher an der Quelle der Wasserströmung), was einer erhöhten Y-Position entspricht (Abbildung 3B). Im Gegensatz dazu waren verletzte Fische bei 2 wpi nicht in der Lage, eine konstante Schwimmkapazität gegen den Strom aufrechtzuerhalten. Folglich sind ihre Schwimmbahnen unregelmäßiger, wobei die Y-Position insgesamt abnimmt (Abbildung 3B). Die Y-Position stieg bei 4 und 6 wpi, was darauf hindeutet, dass regenerierende Tiere allmählich ihre Fähigkeit wiedererlangten, vorne in der Schwimmtunnelkammer zu schwimmen. Um die Parameter des Schwimmverhaltens zu quantifizieren, haben wir die prozentuale Aktivität, die Position im Schwimmtunnel (Y-Position) und die Zeit, die gegen den Strom geschwommen ist, berechnet (Abbildung 3C-E). Im Vergleich zu unverletzten Kontrollen waren läsionierte Tiere bei 2 wpi deutlich weniger aktiv (Abbildung 3C), im hinteren Quadranten des Schwimmtunnels zum Stillstand gekommen (Abbildung 3D) und verloren ihre Fähigkeit, gegen niedrige Strömungsgeschwindigkeiten zu schwimmen (Abbildung 3E). In Übereinstimmung mit ihrer angeborenen Fähigkeit, eine funktionelle Erholung zu erreichen, normalisierten die läsionierten Tiere allmählich die Schwimmverhaltensparameter bei 4 und 6 wpi (Abbildung 3C-E). Die Parameter für Schwimmausdauer und Schwimmverhalten boten zusammen quantifizierbare Anzeigen der Schwimmfunktion und der funktionellen Rückenmarksreparatur bei Zebrafischen.
Abbildung 1: Einrichtung des Schwimmtunnels und kundenspezifische Deckel. (A) Repräsentative Bilder des eingerichteten Schwimmtunnels einschließlich vergrößerter Ober- und Seitenansichten der Schwimmtunnelkammer. (B) Bilder der Schwimmtunneldeckel, die für die verschiedenen in diesem Protokoll beschriebenen Anwendungen verwendet werden. Ein standardmäßiger, vollständig geschlossener Schwimmtunneldeckel wird für Schwimmverhaltenstests verwendet (Abschnitt 3 dieses Protokolls). Für die Kalibrierung wird ein modifizierter Schwimmtunneldeckel verwendet, der einen digitalen Handdurchflussmesser aufnehmen kann (Abschnitt 1 dieses Protokolls). Ein modifizierter Schwimmausdauerdeckel, der einen abnehmbaren Deckel am hinteren Ende der Schwimmtunnelkammer enthält, ermöglicht die Entfernung erschöpfter Fische während der Schwimmausdauerprüfung (Abschnitt 2 dieses Protokolls). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Experimentelle Pipeline zur Untersuchung der Schwimmausdauer und des Schwimmverhaltens bei erwachsenen Zebrafischen. Zur Schwimmausdauer schwammen Fische gegen eine zunehmende Wasserströmung bis zur Erschöpfung. Für das Schwimmverhalten werden Schwimmparameter in Abwesenheit von und bei niedrigen Strömungsgeschwindigkeiten bewertet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Funktionelle Erholung bei Wildtyp-Zebrafischen nach Rückenmarksverletzung. (A) Motorische Funktion, bestimmt durch Schwimmausdauertests für Wildtyp-Zebrafische zu Studienbeginn und 2, 4 und 6 wpi. Punkte kennzeichnen einzelne Tiere aus zwei unabhängigen Experimenten. (B) Schwimmverhaltenstests verfolgten Wildtyp-Zebrafische unter niedrigen Wasserströmungsgeschwindigkeiten. Die durchschnittliche Y-Position wird zu jedem Zeitpunkt während des Trackings angezeigt (0 cm/s für 5 min, 10 cm/s für 5 min und 20 cm/s für 5 min). (C-E) Prozentuale Aktivität (C), durchschnittliche Y-Position im Tunnel (D) und Zeitschwamm gegen die Strömung (E) wurden mit 20 cm/s quantifiziert. Für alle Quantifizierungen werden zwei unabhängige Experimente gezeigt. n = 30 im Zustand vor der Verletzung; n = 23 bei 2 wpi, n = 20 bei 4 wpi, n = 18 bei 6 wpi. Einweg-ANOVA wurde für statistische Analysen verwendet. Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dar. *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001; P < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzungsdatei 1: Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Erwachsene Zebrafische sind ein beliebtes Wirbeltiersystem zur Modellierung menschlicher Krankheiten und zur Untersuchung von Mechanismen der Geweberegeneration. CRISPR/Cas9 Genome Editing hat umgekehrte genetische Studien zur Modellierung von Krankheiten bei Zebrafischen revolutioniert; Die großflächige Genetik bei erwachsenen Zebrafischen wurde jedoch durch biologische und technische Herausforderungen behindert, einschließlich der Nichtverfügbarkeit von erwachsenem Zebrafischgewebe für die Phänotypisierung mit hohem Durchsatz. Angesichts der komplexen Anatomie von erwachsenen Zebrafischen ist eine längere histologische Verarbeitung erforderlich, um die Gewebearchitektur zu erhalten und zu analysieren. Die in dieser Studie beschriebenen Assays für Schwimmausdauer und Schwimmverhalten können verwendet werden, um vor der Histologie bei einem mittleren Durchsatz auf neuronale, muskuläre oder skelettale Phänotypen vorzuscreenen. Da Studien zur Geweberegeneration darauf abzielen, die funktionelle Gewebereparatur zu verbessern, werden die in dieser Studie beschriebenen Protokolle für Studien der neuralen, muskulären und skelettalen Regenerationsforschung weitgehend anwendbar, wenn nicht sogar unerlässlich sein.
Funktionelle Fortbewegungsassays waren ein wesentlicher Bestandteil unseres Verständnisses der neuronalen Entwicklung und Regeneration. Standard-Lokomotorassays sind bei Wirbeltierarten, einschließlich Ratten, Mäusen und Larvenzebrafischen, weit verbreitet. Maus- und Rattenmodellsysteme verfügen über Verhaltens- und funktionelle Fortbewegungsassays wie BMS16 bzw. BBB17,18. In ähnlicher Weise wurde eine Vielzahl von Protokollen beschrieben, um die Fortbewegung, die Schreckreaktion und das Verhalten bei Larvenzebrafischen zu messen. Diese Protokolle sind effizient, um Verhaltensunterschiede zwischen experimentellen Gruppen in hellen und dunklen Umgebungen, Raubtierausweichen und Aktivität aufzudecken19,20,21. Hier beschreiben wir quantifizierbare, reproduzierbare Methoden zur Messung der funktionellen Erholung nach einer Rückenmarksverletzung bei erwachsenen Zebrafischen.
Beachten Sie, dass diese Studie mehrere Einschränkungen aufweist. Erstens sind Verhaltensstudien stark von genetischen und Umweltfaktoren abhängig. Um die genetische Variabilität zu kontrollieren, verwendeten wir Geschwister, um Alter, Geschlecht und den genetischen Hintergrund in experimentellen Gruppen zu kontrollieren22,23. Um Umweltfaktoren zu kontrollieren, haben wir sichergestellt, dass Experimente zur gleichen Tageszeit unter kontrollierten Temperatur- und Lichtbedingungen durchgeführt werden20. Zweitens, während der Schwimmverhaltensassay weniger empfindlich auf voreingenommene Analysen reagiert, bestimmt der Forscher, der den Schwimmausdauertest durchführt, wann ein Fisch die Erschöpfung erreicht, und fährt fort, erschöpfte Fische aus der Schwimmtunnelkammer zu entfernen, ohne den Rest der Fischkohorte zu unterbrechen. So wurden unsere Schwimmausdauerexperimente von einem einzigen Forscher durchgeführt, der für experimentelle Bedingungen blind ist. Es ist besonders wichtig, die Variabilität von Forscher zu Forscher für Längsschnittstudien von experimentellen Gruppen im Laufe der Zeit zu vermeiden. Schließlich können Kollisionen zwischen Fischen die Tracking-Analyse bei Schwimmverhaltenstests erschweren. Wir empfehlen daher, Schwimmverhaltenstests für Gruppen von fünf oder weniger Fischen durchzuführen, um die Wahrscheinlichkeit von Kollisionen zwischen Fischen zu minimieren.
In Anbetracht kritischer Schritte stellen wir fest, dass verletzte Fische besonders in den ersten Tagen nach Verletzungen zerbrechlich sein können. Wir empfehlen daher, Fisch mit äußerster Sorgfalt zu behandeln. Bei Schwimm-Ausdauer-Assays reduziert das schnellstmögliche Sammeln von Fischen mit dem PVC-Rohr, entweder Kopf oder Schwanz, die Wahrscheinlichkeit von sekundären Verletzungen während des Sammelprozesses. Bei Schwimmverhaltensanalysen kann die Spülpumpe gelegentlich Wellen erzeugen, die Filme verzerren und Analysefehler verursachen. In diesem Fall kann die Spülpumpe kurz ausgeschaltet werden. Wir empfehlen jedoch nicht, die Spülpumpe für längere Zeit auszuschalten, um sicherzustellen, dass das Wasser ständig zwischen der Schwimmtunnelkammer und dem Puffertank zirkuliert. Die Überwachung der Filmaufnahme ermöglicht die sofortige Beendigung und den Neustart des Films, wenn ein Bild fallen gelassen wurde oder ein Fisch vom Aufnahmebereich abweicht. Wenn der R-Code während der Durchführung der Tracking-Analyse während der Dateiverarbeitung einen Fehler ausgibt, liegt das wahrscheinlichste Problem in der Benennung der Dateien. Das Programm ist so konzipiert, dass es unter einer sehr spezifischen Benennungsstrategie funktioniert: Timepoint_Group_Subgroup_Stock number_Anything anderen (z. B. 0_A_1_00001_WildtypeGroupA.avi). Mit dieser Benennung können mehrere Zeitpunkte, Gruppen und Untergruppen aufgetragen und aufeinander abgestimmt werden. Während Prüfpunkte in das Analyseskript integriert wurden, um eine ordnungsgemäße Nachverfolgung sicherzustellen, ist es wichtig, die Analyseausgabe sorgfältig zu überprüfen. Das Programm fragt automatisch, ob die Fischnummer korrekt ist, und fordert Filme zur erneuten Analyse auf, wenn die Fischnummer falsch ist. Im Diagramm "Durchschnittliche Y-Position" können geradlinige Artefakte angezeigt werden, die darauf hinweisen, dass ein zusätzliches Objekt als Fisch erkannt wurde. In diesem Fall ist es am besten, den Film sorgfältig anzusehen, um zusätzliche Artefakte auszuschließen, die tendenziell mit einer höheren Fließgeschwindigkeit auftreten.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir danken der Washington University Zebrafish Shared Resource für die Tierpflege. Diese Forschung wurde vom NIH unterstützt (R01 NS113915 bis M.H.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoSwim software | Loligo Systems | MI10000 | Optional - for Automatic control of current velocity |
| Customized lid | Loligo Systems | MI10001 | This customized lid is used for swim endurance |
| DAQ-BT | Loligo Systems | SW10600 | Optional - for Automatic control of current velocity |
| Eheim pump | Loligo Systems | PU10160 | 20 L/min. This pump is placed in theflow-through tank. |
| Fiji | Fiji | Freely available through Image J (Fiji) | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Flowtherm | Loligo Systems | AC10000 | Handheld digital flow meter - for calibration |
| High Speed Camera | Loligo Systems | VE10380 | USB 3.0 color video camera (4MP) |
| IR light panel | Loligo Systems | VE10775 | 450 x 210 mm, placed under the swim tunnel chamber |
| Monofocal lens | Loligo Systems | VE10388 | 25mm manual lens |
| PVC Tubing | VWR | 60985-534 | 5/16 x 7/16" Wall thickness: 1/16" |
| R Studio | R Studio | Freely available. Version 3.6 with extra packages. | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Swim tunnel respirometer | Loligo Systems | SW10060 | 5L (120V/60Hz). The system includes the swim chamber, motor, manual control of water current velocity, 1 pump placed inside the chamber, standard swim tunnel lid for swim behavior, and modified swim tunnel lid for calibration |
| uEye Cockpit | IDS | Freely available software to control camera parameters | Alternative cameras and accompanying softwares could be used |
| Vane wheel flow probe | Loligo Systems | AC10002 | Digital flow probe - for calibration |
References
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