Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

הערכה של סיבולת שחייה והתנהגות שחייה בדגי זברה בוגרים

Published: November 12, 2021 doi: 10.3791/63240
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Developmental Biology, Washington University School of Medicine, 2Center of Regenerative Medicine, Washington University School of Medicine

Summary

דגי זברה בוגרים, המסוגלים להחלמה תפקודית לאחר פגיעה בחוט השדרה, הם מערכת מודלים מובילה להבהרת מנגנונים מולדים של התחדשות עצבית. כאן, אנו מתארים סיבולת שחייה והתנהגות שחייה בדיקות כמו קריאות פונקציונליות של התחדשות חוט השדרה.

Abstract

בשל יכולת ההתחדשות המפורסמת שלהם, דגי זברה בוגרים הם מודל מוביל של בעלי חוליות לחקור מנגנונים של התחדשות מולדת של חוט השדרה. לאחר העברה מלאה של חוט השדרה שלהם, דגי זברה מרחיבים גשרי גליה ואקסונל על פני רקמות קטועות, מחדשים נוירונים קרובים לנגע, ומחזירים את יכולות השחייה שלהם תוך 8 שבועות מפציעה. התאוששות של תפקוד השחייה היא אפוא קריאה מרכזית לתיקון חוט השדרה תפקודי. כאן, אנו מתארים סדרה של בדיקות התנהגותיות כדי לכמת את יכולת המנוע של דגי הזברה בתוך מנהרת שחייה סגורה. מטרתן של שיטות אלה היא לספק מדידות הניתנות לכימות של סיבולת שחייה והתנהגות שחייה בדגי זברה בוגרים. עבור סיבולת שחייה, דגי זברה נתונים למהירות זרם מים גדלה כל הזמן עד תשישות, וזמן תשישות מדווח. להערכת התנהגות השחייה, דגי זברה נתונים למהירויות זרם נמוכות וסרטוני שחייה נלכדים עם מבט גב של הדגים. פעילות אחוזים, תדירות התפרצות וזמן שהושקע כנגד זרם המים מספקים קריאות הניתנות לכימות של התנהגות השחייה. כימתנו סיבולת שחייה והתנהגות שחייה בדגי זברה מסוג בר לפני פציעה ואחרי מעבר חוט השדרה. גילינו שדגי זברה מאבדים את תפקוד השחייה לאחר מעבר חוט השדרה ומחזירים בהדרגה את היכולת הזו בין שבועיים לשישה שבועות לאחר הפציעה. השיטות המתוארות במחקר זה ניתן ליישם neurobehavioral, שרירים ושלד, התחדשות שרירי השלד, ומחקרי התחדשות עצבית בדגי זברה בוגרים.

Introduction

דגי זברה בוגרים משמשים באופן בולט כדי לחקור מנגנונים של התפתחות שרירית שרירית ושרירים ושלד ומודלים של מחלות 1,2,3. דגי זברה מסוגלים לבצע תיקון יעיל וספונטני של רקמות מרובות, כולל המוח, חוט השדרה ושרירי השלד4,5,6,7. היכולת המדהימה לחדש רקמות נוירו-שריריות ומחלות מודל מושכת קהילה מדעית הולכת וגדלה למחקר דגי זברה למבוגרים1,2,3. עם זאת, בעוד בדיקות של תנועה והתנהגות לשחות זמינים סטנדרטיים עבור דגי זברה זחליים, יש צורך גובר לפתח פרוטוקולים אנלוגיים דגים בוגרים8,9,10,11. מטרת המחקר היא לתאר פרוטוקולים לכמת סיבולת שחייה והתנהגות שחייה בדגי זברה בוגרים. אנו מציגים פרוטוקולים אלה בהקשר של מחקר התחדשות חוט השדרה. עם זאת, הפרוטוקולים ההתנהגותיים המתוארים כאן ישימים באותה מידה למחקרים של התחדשות עצבית ושרירים, התפתחות עצבית שרירית ושרירים ושלד, כמו גם מודלים של מחלות שריריות ושרירים ושלד.

שיתוק הפוך של דגי זברה תוך 8 שבועות מהעברת חוט השדרה המלאה. שלא כמו יונקים מתחדשים בצורה גרועה, דגי זברה מציגים תגובות לפגיעה חיסונית, עצבית וגלייתית פרו-רגנרטיביות הנדרשות לתיקון תפקודי של חוט השדרה 12,13,14. קריאה אולטימטיבית של תיקון חוט השדרה תפקודי היא היכולת של הרקמה הנגעה לחזור לתפקודה לאחר פציעה. חבילה של שיטות סטנדרטיות להערכת התחדשות תפקודית במכרסמים כוללת בדיקות לוקומוטור, מנוע, חושים וסנסימוטורים15,16,17. בדיקות נפוצות בפגיעה בחוט השדרה של העכבר כוללות את סולם העכברים של לוקומוטור באסו (BMS), בדיקות מוטוריות מקדימות, בדיקות חושיות מישוש ובדיקות סנסורימוטורי הליכה ברשת15,17. בניגוד למערכות של דגי זברה יונקים או זחלים, בדיקות התנהגותיות בדגי זברה בוגרים פחות מפותחות, אך נחוצות מאוד כדי להתאים לצרכים הגדלים של קהילות התחדשות הרקמות ומודול מחלות.

עבירות שלמות בחוט השדרה גורמות לשיתוק מוחלט באתר הפציעה. זמן קצר לאחר הפציעה, בעלי חיים משותקים פחות פעילים ונמנעים משחייה ככל האפשר. כדי לפצות על אובדן כושר השחייה, בעלי חיים משותקים מציגים התפרצויות קצרות ותכופות על ידי שימוש יתר בסנפירי החזה שלהם, השוכנים רוסטרלי לנגע. אסטרטגיית שחייה מפצה זו גורמת לתשישות מהירה ולקיבולת שחייה נמוכה יותר. ככל שחוט השדרה של דגי הזברה מתחדש, בעלי החיים חוזרים לתפקוד שחייה תנודתי חלק עד הנגע, מה שמאפשר סיבולת שחייה מוגברת ופרמטרים משופרים של התנהגות השחייה. כאן, אנו מתארים שיטות לכמת סיבולת שחייה של דגי זברה בהגדלת מהירויות זרם המים והתנהגות השחייה במהירויות זרם נמוכות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

דגי זברה בוגרים של זני אקוויל ו- AB נשמרו במתקן הליבה של דגי הזברה באוניברסיטת וושינגטון. כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לפרוטוקולים המוסדיים של IACUC בבעלי חיים.

הערה: דוגמה להתקנה הניסיונית מוצגת באיור 1A. מכסה הכיול (מותאם אישית), מכסה סיבולת השחייה (מותאם אישית) ומכסה התנהגות השחייה (מכסה מנהרה סטנדרטי וסגור) מוצגים באיור 1B. זרימת העבודה הניסיונית מוצגת באיור 2.

1. הכנה וכיול מנהרת שחייה

  1. מלא את מנהרת השחייה ואת מיכל החיץ שמסביב במי מערכת דגי זברה (10 L מסוננים מים; אלקליניות: 50-150 מ"ג / L CaCO3; pH: 6.8-7.5; טמפרטורה: 26-28.5 °C (26 °F; חנקות < 50 מ"ג / ליטר; ניטריט < 0.1 מ"ג / ליטר; ומליחות < 0.5-1 גרם / ליטר).
  2. מלאו מיכל זרימה נוסף במי מערכת דגי זברה (≈7.5 ליטר). מקם את מנהרת השחייה ואת מיכל הזרימה כדי לאפשר עודף מי מערכת דגי זברה לזרום ממיכל החיץ למיכל הזרימה דרך צינור זרימה מאובטח בצד של מיכל החיץ.
  3. לאחר מילוי המנהרה ומיכל החיץ, בצע את הפעולות הבאות.
    1. מקם את משאבת הסומק בתוך מיכל החיץ וחבר אותה למנהרת השחייה הסמוכה עם צינורות PVC. הנח את משאבת הזרימה בתוך מיכל הזרימה וחבר אותה לקיר מיכל החיץ.
    2. הפעל את משאבת הסומק הממוקמת בתוך מיכל החיץ ואת משאבת הזרימה הממוקמת במיכל הזרימה כדי להתחיל את זרימת המים.
      הערה: מערכת המשאבה הכפולה תבטיח זרימת מים רציפה למנהרת השחייה (ממשאבת השטיפה) ולמיכל החיץ (ממשאבת הזרימה).
    3. נקה את כל בועות האוויר שנלכדו בתוך מנהרת השחייה על ידי הגדלה הדרגתית של מהירות זרם המים מ-10 ס"מ/ש' ל-100 ס"מ לשנייה במרווחים של 10 ס"מ לשנייה. להקטין את המהירות בחזרה ל 0 ס"מ / s במרווחים של 10 ס"מ / ש'. לשליטה במהירות הזרימה, לחצו על החצים למעלה ולמטה במקטע מהירות של תוכנת בקרת מהירות הזרימה (ראו טבלת חומרים).
      הערה: המנוע והרוטור מחוברים למחשב המצורף. תוכנת בקרת מהירות הזרימה מתקשרת עם המנוע כדי ליצור את מהירות הזרימה הרצויה. השימוש בתוכנת בקרת מהירות הזרימה הוא אופציונלי. החלופה היא לשלוט באופן ידני במנוע זרם המים.
  4. כיול
    הערה: יש צורך בכיול לפני כל ניסוי.
    1. השתמש במכסה הכיול כדי לסגור את מנהרת השחייה.
      הערה: מכסה הכיול מותאם אישית עם פתח מרכזי מחוזק שמתאים לבדיקת מד הזרימה המשמשת לכיול (איור 1B). שמונה כנפיים משמשים לאבטחת כל המכסים למנהרה.
    2. הפעל את מד הזרימה הדיגיטלי וחבר אותו לבדיקת מד הזרימה. מקם את גשושית מד הזרימה בתוך מנהרת השחייה דרך מכסה הכיול. מקם את הלהבים של גשושית מד הזרימה בניצב לכיוון הזרימה.
    3. כייל את הפלט של מנוע מנהרת השחייה (הנשלט באמצעות תוכנת בקרת מהירות הזרימה) באמצעות מד הזרימה הדיגיטלי. לשם כך, בצע את השלבים הבאים.
    4. פתח את תוכנת בקרת מהירות הזרימה ולחץ על כיול.
    5. שנה את האפשרויות בפינה הימנית העליונה לסל"ד לעומת מתח. הגדל את מהירות הזרימה מ- 0 ס"מ/ ש' ל- 100 ס"מ/ ש' במרווחים של 5 ס"מ/ s, על-ידי הקלדת הערכים במקטע המהירות של תוכנת בקרת מהירות הזרימה. בכל שלב, לחץ על לחצן "+" והקלט את המהירות הנוכחית המצוינת על-ידי מד הזרימה הדיגיטלי.
      הערה: קשר הגומלין הליניארי שנוצר צריך לכלול ערך R2 קרוב ל- 1.
    6. כדי לאשר כיול, הגדל את מהירויות זרם המים מ- 0 ל- 10, 25, 50, 75 ו- 100 ס"מ / s ולאחר מכן הקטן את המהירויות ל- 75, 50, 25, 10 ס"מ / s באמצעות החצים למעלה ולמטה בחלק Uwater [cm/s] של תוכנת בקרת מהירות הזרימה. בכל מהירות (מהתוכנה), מודדים ומתעדים את המהירות המתאימה המצוינת על ידי מד הזרימה הדיגיטלי.
    7. קחו בחשבון את המנהרה מכוילת ומדויקת אם מהירויות זרם המים הנמדדות נמצאות בתוך סטייה של ±2 ס"מ לשנייה. אם הסטייה חורגת ±2 ס"מ לשנייה, חזור על שלבים 1.4.4 עד 1.4.6 כדי להבטיח כיול תקין.

2. הערכה של סיבולת שחייה

הערה: קבוצות ניסיוניות מחולקות לקבוצות של 10 בעלי חיים או פחות לסיבולת שחייה.

  1. הגדר את תוכנת בקרת מהירות הזרימה.
    הערה: השימוש בתוכנת בקרת מהירות הזרימה בסעיף זה הוא אופציונלי. החלופה היא לשלוט באופן ידני במנוע זרם המים. לשליטה ידנית בזרם המים, המשך לשלב 2.3 והגדל ידנית את מהירות זרם המים במרווחים שצוינו בשלבים 2.5 ו- 2.6.
    1. פתח את תוכנת בקרת מהירות הזרימה. לחץ על התיבה הנקראת ניסוי. בטל את הסימון של אוסווים ואווטר.
    2. שנה את מהירות הזרימה בתיבה Uwater [cm/s] בפינה השמאלית התחתונה להתאמת מהירויות זרם המים.
    3. כדי להתחיל פרוטוקול אוטומטי, לחץ על התיבה התחל רישום . בחלון הדו-שיח שנפתח, בחר אוטומטי מהרשימה הנפתחת.
    4. כדי לבחור קובץ פרוטוקול שנשמר בעבר, לחץ על סמל הקובץ לצד קובץ פרוטוקול כדי לפתוח את הפרוטוקול הרצוי.
    5. הגדר את קובץ הפלט על-ידי לחיצה על סמל הקובץ לצד קובץ יומן הרישום. בחלון סייר הקבצים שנפתח, תן שם לקובץ הפלט ושמור אותו במיקום הרצוי.
  2. הגדרת חלון טיימר הקפה מפוצל. הקפד לקבל גישה בו-זמנית לתוכנת בקרת מהירות הזרימה ולחלונות הטיימר על מסך המחשב.
  3. להקים מיכל איסוף דגים כדי לאכלס דגים מותשים לאחר הסרתם ממנהרת השחייה. מלאו את מיכל האיסוף במי מערכת דגי זברה (0.75 ליטר). מלאו צינור PVC ארוך במי מערכת דגי זברה.
    1. מקם קצה אחד (סוף 1) של צינור ה- PVC הממולא מראש במיכל האיסוף ואת הקצה השני (סוף 2) במיכל החיץ. ודא שמים יכולים לזרום בחופשיות ממיכל החיץ למיכל האיסוף.
    2. מהדקים את הקצה העליון של שפופרת PVC (סוף 2) עם קליפ קלסר למניעת זרימת מים. השתמש במהדק הקלסר כדי לשלוט ביציאת המים לפי הצורך.
  4. סגור את מנהרת השחייה באמצעות מכסה סיבולת השחייה.
    הערה: מכסה סיבולת השחייה מותאם אישית עם חלון מנהרת שחייה כדי להסיר דגים מותשים ממנהרת השחייה, מבלי להפריע לשאר הבדיקה (איור 1B).
  5. מניחים קבוצה אחת של דגים בתוך מנהרת השחייה. הפעל את טיימר ההקפה המפוצל תוך התאמת מהירות הזרם ל- 0 ס"מ/ש' למשך 5 דקות, 9 ס"מ/ש' למשך 5 דקות ו- 10 ס"מ/ש' למשך 5 דקות על-ידי הקלדת ערכים אלה במקטע Uwater [cm/s] של תוכנת בקרת מהירות הזרימה.
    הערה: שלב זה יתאקלם בעלי חיים למנהרת השחייה וכיוון הזרימה.
  6. לאחר התאקלמות הדגים, התחל את תוכנית בקרת מהירות הזרימה האוטומטית שתגדיל את מהירות זרם המים ב -2 ס"מ / ש 'בכל דקה.
    הערה: דגים ישחו עד תשישות. דגים מותשים נדחפים לכיוון הקצה האחורי של מנהרת השחייה.
  7. כאשר דג מותש, בטלו את צינור איסוף הדגים, פתחו את חלון מנהרת השחייה ואספו את הדגים במיכל האיסוף. הקלט את השעה בתשישות באמצעות טיימר ההקפה המפוצל.
    הערה: דגים יכולים מדי פעם להיסחף לקצה האחורי של מנהרת השחייה מבלי להיות מותשים. כדי להבטיח שהדגים מותשים, הקישו בעדינות על הקצה האחורי של המנהרה או צרו צל מעל אזור זה כדי לעורר את הדגים לשחות. דגים מותשים אינם מגיבים לגירוי המבהיל ושוכבים שטוחים בקצה האחורי של המנהרה.
  8. חזור על שלב 2.7 עד שכל הדגים מותשים ונאספים במיכל האיסוף. לחץ על לחצן עצירת חירום בתוכנת בקרת מהירות הזרימה והפסק את הטיימר.
    הערה: בדקו פעמיים לאורך השחייה אם מספר הדגים שהוצאו מתא מנהרת השחייה תואם את הזמנים שתועדו.
  9. חזור על שלבים 2.5 עד 2.8 עבור כל קבוצת דגים.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן, אך ליתר דיוק עד לנקודת הזמן לאחר הפציעה, מומלץ לבצע סרטים ושחיות סיבולת באותו יום. המנהרה יכולה להמשיך להסתובב בזמן שהניסויים מושהים.

3. לכידת קטעי וידאו לבדיקת התנהגות שחייה

הערה: ניתן לעקוב אחר עד חמישה בעלי חיים בלבד בכל פעם. אם קבוצות ניסוי גדולות מחמש חיות, ניתן לצלם סרטונים מרובים עבור כל קבוצה, כאשר הסרטון הראשון עוקב אחר חמש חיות או פחות והסרטון השני עוקב אחר חמש החיות האחרות או פחות. עבור מחקרים אורכיים שמטרתם לעקוב אחר בעלי חיים בודדים לאורך זמן, דגים יכולים להיות מאוחסנים בנפרד ומעקב על פני נקודות זמן מרובות. כל הסקריפטים למעקב וניתוח זמינים באמצעות GitHub (ראה טבלת חומרים).

  1. הפעל את לוח האור אינפרא אדום הממוקם מתחת למנהרת השחייה. אבטחו את המצלמה על מתקן התקרה מעל מנהרת השחייה. התאם את המיקוד ואת טבעות הצמצם.
    הערה: הגדרות המיקוד והצמצם תלויות במרחק בין המצלמה למנהרת השחייה, כמו גם בסביבת האור.
  2. פתח את תוכנת הקלטת המצלמה (ראה טבלת חומרים). הגדר את הגדרות התוכנה באופן הבא.
    1. לחץ על תצוגת ההיבטים של 1:4. ודא ששדה הראייה מכסה את כל מנהרת השחייה. בטל את הניגודיות האוטומטית ואת האיזון הלבן האוטומטי כדי לנרמל את הרקע והניגודיות בין קבוצות.
    2. פתח את החלון מאפייני מצלמה על-ידי לחיצה על סמל מפתח הברגים. הגדר את הפרמטרים כדלקמן: שעון פיקסל: 344 MHz, קצב פריימים: 70 fps, לחץ על התיבה לצד החזק כדי לבדוק את זה, זמן חשיפה: 0.290 אלפיות השנייה. אל תסגור חלון זה.
    3. חתוך את חלון ההקלטה כדי לכסות רק את תא השחייה של המנהרה על-ידי הטיה/סיבוב המצלמה לפי הצורך.
  3. פתח את חלון ההקלטה על-ידי לחיצה על סמל סליל הסרט. הגדר את הגדרות ההקלטה באופן הבא:
    1. סמן את התיבה עבור המספר המרבי של מסגרות.
    2. הזן ידנית 63,000 עבור מספר המסגרות.
    3. סמן את התיבה עבור חישוב קצב פריימים. פעולה זו מאפשרת לתוכנית למשוך את קצב הפריימים המוגדר בשלב 3.2.2 (70 fps).
    4. שנה את איכות JPEG ל - 30.
  4. הקלט ריצת מבחן.
    1. לחץ על צור ושם לקובץ החדש בדוק ושמור אותו בשולחן העבודה.
    2. חזור לחלון ההקלטה ולחץ על הקלט. תן לסרט הבדיקה לפעול לכל משך הפרוטוקול (15 דקות).
    3. לאחר סיום הבדיקה, ודא כי אין מסגרות שהושמטו וכי 63,000 מסגרות נרשמות.
  5. הניחו קבוצת דגים במנהרת השחייה וסגרו את המנהרה באמצעות מכסה סגור לחלוטין (איור 1B).
    הערה: ודאו שכל הדגים נמצאים במנהרה לפני הידוק מלא של המכסה. ודא שאין בועות אוויר מתחת למכסה. הדבר ישפיע אחרת על התוצאות.
  6. פתח חלון הקלטה חדש ותן שם לקובץ. דוגמה: 2_A_1_00001_WildtypeGroupA.avi
    הערה: ודא שההגדרות הן בהתאם לפרמטרים בשלבים 3.2 ו- 3.3. איכות JPEG תמיד תחזור לברירת המחדל ויש לאפס אותה עבור כל סרט חדש.
    שים לב: אל תלחץ עדיין על רשומה.
  7. התחל ניסוי חדש באמצעות תוכנת בקרת מהירות הזרימה.
    הערה: כדי להתחיל פרוטוקול אוטומטי, לחץ על התיבה התחל רישום . בחלון הדו-שיח שנפתח, בחר אוטומטי מהרשימה הנפתחת. כדי לבחור קובץ פרוטוקול שנשמר בעבר, לחץ על סמל הקובץ לצד קובץ פרוטוקול כדי לפתוח את הפרוטוקול הרצוי.
    1. כדי להתחיל פרוטוקול ידני, הגדר את מהירות הזרימה ל-0 ס"מ/ש' למשך 5 דקות, 10 ס"מ לשנייה למשך 5 דקות, ולאחר מכן 20 ס"מ/ש' למשך 5 דקות באמצעות התיבה Uwater [cm/s] בתוכנת בקרת מהירות הזרימה.
    2. שמור את קובץ פלט הנתונים החדש (יישמר כקובץ .csv) תחת שם זהה לזה של קובץ הסרט ובאותה תיקיה.
      שים לב: אל תלחץ עדיין על התחל.
  8. מניחים מגבת נייר או פיסת בד בצד מנהרת השחייה כדי להבטיח שכל ההתנהגויות נובעות משחייה בדגים ולא בגלל תגובה מבהילה הנגרמת על ידי תנועה בסביבה.
  9. ברצף מהיר, ודאו שהמים רגועים ושאין אדוות נעות על פני המסגרת. לחץ על הקלט בחלון תוכנת המצלמה כדי להתחיל להקליט את קובץ הסרט. לחץ על התחל בתוכנת בקרת מהירות הזרימה כדי להתחיל את הפרוטוקול, אשר ימשיך ללא הפרעה.
  10. צפה בסרט כדי לוודא כי אין מסגרות נפלו, כי אין בועות בשדה הראייה, וכי כל הדגים מתועדים.
  11. לאחר השלמת הקלטת הסרט, לחץ על עצירת חירום כדי לסיים את פרוטוקול בקרת מהירות הזרימה. חפש את קובץ פלט הנתונים שנשמר באופן אוטומטי. לחץ על סגור בחלון ההקלטה כדי לשמור את קובץ הסרט.
  12. הסר את המכסה. בזהירות לאחזר את הדגים ולהחזיר אותם למיכל שלהם.
  13. חזור על שלבים 3.5 עד 3.12 עבור כל קבוצות הדגים.
  14. לאחר סיום הקלטת הסרט עבור כל הקבוצות, המר סרטים מסרטוני 70 fps ל- 20 סרטוני fps עם סקריפט MovieProcessing_v5.bat . לשם כך, העבר את קובץ ה- Script לתיקיה המכילה את סרטוני הווידאו הגולמיים. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הקובץ ובחר הפעל.
    הערה: קובץ ה- Script פועל באופן אוטומטי. יופיע חלון שורת פקודה המציג את התקדמות קובץ ה- Script. השלב שלעיל הוא אופציונלי. הוא מפחית את מספר הפריימים בסרטון של 15 דקות מ-63,000 ל-18,000 פריימים והופך את SwimBehavior_v7. סקריפט R פועל מהר יותר.
  15. לרוקן את המנהרה ולשים בצד את כל הציוד.

4. ניתוח סרטים להערכת התנהגות שחייה

הערה: ניתן להשלים הקלטה וניתוח של סרטים בימים נפרדים.

  1. פתח את קובץ ה- Script של Tracking_v2.ijm בפיג'י ולחץ על הפעל כדי להתחיל את התוכנית. בחלון שמופיע, בחר את התיקיה המכילה את סרטי התנהגות השחייה למעקב ולחץ על פתח. חפש את מסגרת 1 של הסרט הראשון, תיבת דו-שיח ואת מנהל אזור העניין (ROI) שיעלה.
  2. בצע את ההוראות שניתנו בתיבת הדו-שיח. צור החזר השקעה של החלק התחתון של תא מנהרת השחייה ולחץ על אישור. ודא שלא יראו פינות שחורות.
    הערה: חלון הסף ייפתח יחד עם מסגרת 1 ערוכה ומסומנת בסף.
  3. שנה את ערכת הצבעים מ - B&W לאדום. התאם את הערך המרבי עד שמסגרת 1 תציג את הדג באדום ולא שום דבר אחר. רשום את הסף. לחץ על אישור בתיבת הדו-שיח.
    הערה: התוכנית תופעל באופן אוטומטי. ההחזר על ההשקעה שנוצר עבור מסגרת 1 ייבחר ברציפות ולא ייבחר עבור המסגרות הבאות. מד התקדמות יפקח על התהליך בפינה השמאלית התחתונה של חלון פיג'י . המעקב אורך כ-40 דקות לכל סרט. כאשר כל הסרטים הם במעקב, תוכנית פיג'י תפסיק. ההחזר על ההשקעה יפסיק להיבחר. התיקיה המכילה את הסרטים תכלול כעת קובץ _raw.csv עבור כל סרט. פיג'י יכולה להיות סגורה בשלב זה.
  4. יישור, הרכבה ורכישה של סטטיסטיקות תיאוריות
    1. פתח את Behavior_v7 השחייה. תסריט R באולפן R.
    2. לחץ על מקור בפינה השמאלית העליונה של מקטע הסקריפט. בחלון חדש שנפתח, בחר את התיקיה המכילה את קבצי _raw.csv שנוצרו על-ידי פיג'י. לחץ על פתח.
      הערה: התוכנית תפעל באופן אוטומטי.
    3. בתיבת דו-שיח שקופצת ומבקשת לאשר את מספר הדגים בכל סרט, לחץ על כן אם המספרים שניתנו נכונים, או לחץ על לא אם המספרים שגויים.
      הערה : אם לא נלחץ, תופיע הודעה המבקשת לעקוב מחדש אחר הסרטים באמצעות החזר על ההשקעה והסף החדשים. אם לחץ על כן , התוכנית תמשיך.
    4. בחלון החדש שנפתח ושואל אם יש להסיר את הדגים שאינם שוחים, לחץ על כן או על לא.
      הערה: דגים שאינם שוחים מוגדרים כדגים עם פחות מ-50% פעילות ב-10 ס"מ לשנייה. לא מומלץ להסיר דגים שאינם שוחים.
    5. בחלון מוקפץ חדש ששואל אם הקבוצות אינן מאושרות והאם המשתמש מעוניין לשלב קבוצות כלשהן, לבטל את הבעיה או לשלב קבוצות אם יש יותר מקבוצת ביקורת אחת.
    6. לאחר מתן תגובה לשאלה הקודמת, ודא כי התוכנית נותנת הודעה יישור קובץ X של Y, כאשר X הוא הקובץ הנוכחי מיושר ו- Y הוא המספר הכולל של קבצים ליישר. נדרשים כ- 30 s כדי שכל קובץ יהיה מיושר.
  5. לאחר יישור הקבצים, חפש קובץ .csv חדש שנוצר בעל שם זהה (_aligned.csv). ודא שהתוכנית משלבת את הנתונים, מפעילה סטטיסטיקה ומתווה תרשימי פלט. בדוק אם קיימים קבצי הניתוח שנוצרו בתיקיה חדשה הנקראת תוצאות בתוך תיקיית האב המכילה את קבצי _raw.csv _aligned.csv.
  6. בתוך התיקיה תוצאות, חפש שתי תיקיות בשם Diagnostics and Graphs וארבעה קבצים .csv בשם BulkData_Avg, BulkData_Full, SummaryData_Avg SummaryData_Full.
    הערה: SummaryData_Full.csv מכיל את הנתונים הבודדים עבור כל דג בכל קבוצה בכל נקודת זמן. נתונים אלה מתווים באופן אוטומטי אך ניתן לחלץ אותם ולהתוות אותם במקום אחר.
    1. ודא שהתיקיה Graphs מכילה את הגרפים שנוצרו על-ידי התוכנית ואת .csv הקבצים המכילים את נקודות הנתונים עבור כל תרשים.
    2. ודא שהתיקיה Diagnostics מכילה קובץ .csv יחיד עם נתוני אבחון עבור קבצים מיושרים.
      הערה: עמודות בקובץ האבחון.csv כוללות את הפריטים הבאים: א) מספר המסגרות המכילות אובייקטים נוספים, שאמורות להיות פחות מ- 100. מסגרות רבות מדי עם אובייקטים נוספים מצביעות על בעיה במעקב. ב)מספר המסגרות עם אובייקטים חסרים או ממוזגים. זה נורמלי שהמדד הזה יהיה גבוה. דגים שלא התחדשו היטב ייסחפו לעתים קרובות לחלק האחורי של המנהרה וייספרו כנעדרים. ג) מסגרות עם יותר מ-240 פיקסלים של קפיצות. מספר זה גדל עם מספר האובייקטים (דגים) בסרט אחד. הסבר מפורט על אופן חישוב מדדי ההתנהגות מסופק בקובץ משלים 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הקמנו את מנהרת השחייה כמתואר בסעיף 1 לפרוטוקול זה (איור 1). הערכנו את סיבולת השחייה (סעיף 2 בפרוטוקול זה) כמו גם את התנהגות השחייה (סעיפים 3 ו-4 לפרוטוקול זה) של דגי זברה בוגרים בבסיס ואחרי פגיעה בחוט השדרה (איור 2).

לביסוס פונקציה מוטורית בסיסית, בדקנו את סיבולת השחייה של דגי זברה מסוג בר תחת מהירויות הולכות וגדלות של זרם מים (איור 3A). בבדיקה זו, דגי זברה מסוג בר שחו במשך 41 דקות לפני שהשתכרו. לאחר מכן, דגים היו נתונים לתעלות שלמות בחוט השדרה כפי שתואר בעבר ובוצעו בדיקות סיבולת שחייה6. לאחר מרדים דגי זברה באמצעות MS-222, חתך קטן נעשה עם מספריים עדינים כדי להעביר את חוט השדרה 4 מ"מ caudal לאזור גזע המוח. העברה מלאה אושרה חזותית. כדי לאשר את אובדן כושר השחייה לאחר ניתוח בחוט השדרה, בעלי חיים פצועים הוערכו ביומיים או שלושה לאחר הפציעה (dpi). בשלב זה, דגי זברה משותקים לחלוטין caudal לאתר הנגע. סיבולת השחייה הוערכה ב 2, 4, ו 6 שבועות לאחר פציעה (wpi). ב-2 wpi, דגים נגועים איבדו 60% מכושר סיבולת השחייה שלהם (איור 3A). דגים מתחדשים החזירו בהדרגה את סיבולת השחייה ב-4 ו-6 wpi. תוצאות אלה הצביעו על כך שדגי זברה מסוג בר מסוגלים להחזיר את יכולת סיבולת השחייה לאחר פגיעה בחוט השדרה.

כדי לבחון את התנהגות השחייה של דגי הזברה במהלך התחדשות חוט השדרה, עקבנו אחר התנהגות השחייה של בעלי חיים מסוג בר במהירות של 0 ס"מ/ש' או תחת מהירויות קבועות ונמוכות של זרם של 10 ו-20 ס"מ לשנייה (איור 3B). המסלולים הממוצעים של מיקום הדגים בתא מנהרת השחייה שימשו להערכה חזותית של התנהגות השחייה במהירויות זרם נמוכות (איור 3B). בבדיקה זו, פקדים שלא נפגעו שחו בהתמדה בחלק הקדמי של תא מנהרת השחייה (קרוב יותר למקור זרם המים), התואם לעמדת Y מוגבהת (איור 3B). לעומת זאת, ב 2 wpi, דגים פצועים לא הצליחו לשמור על יכולת שחייה יציבה נגד הזרם. כתוצאה מכך, מסלולי השחייה שלהם חריגים יותר עם ירידה כוללת במיקום ה-Y (איור 3B). תנוחת Y גדלה ב 4 ו 6 wpi, המציין כי בעלי חיים מתחדשים בהדרגה חזרו ליכולתם לשחות בחלק הקדמי של תא מנהרת השחייה. כדי לכמת את הפרמטרים של התנהגות השחייה, חישבנו את אחוז הפעילות, המיקום במנהרת השחייה (מיקום Y) והזמן שחה נגד הזרם (איור 3C-E). יחסית לבקרות שלא נפגעו, בעלי חיים שנגעו ב-2 wpi היו פחות פעילים באופן משמעותי (איור 3C), נתקעו ברביע האחורי של מנהרת השחייה (איור 3D), ואיבדו את יכולתם לשחות נגד מהירויות זרם נמוכות (איור 3E). בהתאם ליכולתם המולדת להשיג התאוששות תפקודית, בעלי חיים עם נגעים נרמלו בהדרגה את הפרמטרים של התנהגות השחייה ב-4 ו-6 wpi (איור 3C-E). הפרמטרים של סיבולת השחייה והתנהגות השחייה יחד הציעו קריאות ניתנות לכימות של תפקוד שחייה ותיקון תפקודי של חוט השדרה בדגי זברה.

Figure 1
איור 1: מנהרת שחייה מוגדרת ומכסים מותאמים אישית. (א) תמונות מייצגות של מנהרת השחייה שהוקמה כולל נופים זומים של החלק העליון והצדדי של תא מנהרת השחייה. (ב) תמונות של מכסי מנהרת השחייה המשמשים ליישומים השונים המתוארים בפרוטוקול זה. מכסה מנהרת שחייה סטנדרטי וסגור לחלוטין משמש לבדיקות התנהגות שחייה (סעיף 3 בפרוטוקול זה). מכסה מנהרת שחייה שונה המתאים למד זרימה דיגיטלי כף יד משמש לכיול (סעיף 1 בפרוטוקול זה). מכסה סיבולת שחייה שונה, המכיל מכסה נשלף בקצה האחורי של תא מנהרת השחייה, מאפשר הסרה של דגים מותשים במהלך בדיקות סיבולת שחייה (סעיף 2 של פרוטוקול זה). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: צינור ניסיוני לבדיקת סיבולת שחייה והתנהגות שחייה בדגי זברה בוגרים. לסיבולת שחייה, דגים שחו כנגד זרם מים הולך וגדל עד לתשישות. עבור התנהגות השחייה, פרמטרי השחייה מוערכים בהיעדר ובמהירויות זרם נמוכות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: התאוששות תפקודית בדגי זברה מסוג בר לאחר פגיעה בחוט השדרה. (A) פונקציה מוטורית נקבעת על-ידי בדיקות סיבולת שחייה עבור דגי זברה מסוג בר בקו הבסיס ו- 2, 4 ו- 6 wpi. נקודות מציינות בעלי חיים בודדים משני ניסויים עצמאיים. (B) בדיקות התנהגות שחייה במעקב אחר דגי זברה מסוג בר תחת מהירויות זרם מים נמוכות. מיקום ה-Y הממוצע מוצג בכל נקודת זמן לאורך המעקב (0 ס"מ/ש' במשך 5 דקות, 10 ס"מ לשנייה למשך 5 דקות ו-20 ס"מ לשנייה למשך 5 דקות). (C-E) אחוז הפעילות (C), מיקום Y ממוצע במנהרה (D) וזמן שחה נגד הזרימה (E) היו מכמתים ב 20 ס"מ לשנייה. עבור כל הכימות, מוצגים שני ניסויים עצמאיים. n = 30 במצב שלפני הפציעה; n = 23 ב 2 wpi, n = 20 ב 4 wpi, n = 18 ב 6 wpi. ANOVA חד כיווני שימש לניתוחים סטטיסטיים. קווי שגיאה מייצגים את השגיאה הסטנדרטית של הממוצע (SEM). *P < 0.05; **P < 0.01; P < 0.001; P < 0.0001. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

דגי זברה בוגרים הם מערכת חוליות פופולרית למידול מחלות אנושיות ולחקר מנגנונים של התחדשות רקמות. עריכת הגנום CRISPR/Cas9 חוללה מהפכה במחקרים גנטיים הפוכים למידול מחלות בדגי זברה; עם זאת, גנטיקה בקנה מידה גדול בדגי זברה בוגרים הופרעה על ידי אתגרים ביולוגיים וטכניים, כולל אי זמינות של רקמות דגי זברה בוגרים לפנוטיפינג בעל תפוקה גבוהה. בהתחשב באנטומיה המורכבת של דגי זברה בוגרים, עיבוד היסטולוגי ממושך נדרש כדי להשיג ולנתח ארכיטקטורת רקמות. בדיקות סיבולת השחייה והתנהגות השחייה המתוארות במחקר זה יכולות לשמש למסך מראש עבור פנוטיפים עצביים, שריריים או שלדיים בתפוקה בינונית לפני היסטולוגיה. יתר על כן, כמו מחקרים של התחדשות רקמות שואפים לשפר את תיקון רקמות פונקציונליות, הפרוטוקולים המתוארים במחקר זה יהיה ישים באופן נרחב, אם לא חיוני, למחקרים של מחקרים עצביים, שריריים, ומחקר התחדשות שלד.

בדיקות תנועה פונקציונליות היו חלק בלתי נפרד מההבנה שלנו של התפתחות עצבית והתחדשות. בדיקות לוקומוטור סטנדרטיות זמינות באופן נרחב במינים בעלי חוליות, כולל חולדות, עכברים ודגי זברה זחליים. מערכות מודל עכברים וחולדות כוללות בדיקות תנועה התנהגותיות ופונקציונליות כגון BMS16 ו- BBB17,18, בהתאמה. באופן דומה, שורה של פרוטוקולים תוארו כדי למדוד תנועה, תגובה מבהילה, והתנהגות בדגי זברה זחליים. פרוטוקולים אלה יעילים כדי לחשוף הבדלים התנהגותיים בין קבוצות ניסוי בסביבות בהירות וחשוכות, התחמקות טורף, ופעילות19,20,21. כאן, אנו מתארים שיטות הניתנות לכימות, הניתנות לשחזור למדידת התאוששות תפקודית לאחר פגיעה בחוט השדרה בדגי זברה בוגרים.

שים לב כי מחקר זה מציג מספר מגבלות. ראשית, מחקרים התנהגותיים תלויים מאוד בגורמים גנטיים וסביבתיים. כדי לשלוט על השונות הגנטית, השתמשנו באחים כדי לשלוט על הגיל, המין והרקע הגנטי על פני קבוצות ניסוי22,23. כדי לשלוט בגורמים סביבתיים, דאגנו שהניסויים יבוצעו באותו זמן של היום, בתנאי טמפרטורה ותאורה מבוקרים20. שנית, בעוד שבדיקת התנהגות השחייה פחות רגישה לניתוח מוטה, החוקר שמנהל את בדיקת סיבולת השחייה קובע מתי דג מגיע לתשישות וממשיך להסיר דגים מותשים מתא מנהרת השחייה מבלי להפריע לשאר קבוצת הדגים. לכן, ניסויי סיבולת השחייה שלנו בוצעו על ידי חוקר יחיד אשר עיוור לתנאי ניסוי. חשוב במיוחד להימנע משוונות בין חוקרים לחוקרים למחקרים אורכיים של קבוצות ניסוי לאורך זמן. לבסוף, התנגשויות בין דגים עלולות לסבך את ניתוח המעקב בבדיקות התנהגות השחייה. לכן אנו ממליצים לבצע בדיקות התנהגות שחייה לקבוצות של חמישה דגים או פחות כדי למזער את הסיכויים להתנגשויות בין דגים.

בהתחשב בצעדים קריטיים, נציין כי דגים פצועים יכולים להיות שבירים במיוחד בימים הראשונים לאחר הפציעה. לכן אנו ממליצים לטפל בדגים בזהירות רבה. עבור בדיקות סיבולת שחייה, איסוף דגים עם צינור PVC מהר ככל האפשר, או ראש או זנב הראשון, מקטין את הסיכוי לפציעות משניות במהלך תהליך האיסוף. עבור בדיקות התנהגות שחייה, משאבת הסומק יכולה מדי פעם ליצור גלים, לעוות את הסרטים ולגרום לשגיאות ניתוח. במקרה זה, ניתן לכבות את משאבת הסומק לזמן קצר. עם זאת, איננו ממליצים לכבות את משאבת השטיפה לזמנים ממושכים כדי להבטיח שהמים זורמים כל הזמן בין תא מנהרת השחייה למיכל החיץ. ניטור הקלטת סרט מאפשר סיום מיידי והפעלה מחדש של הסרט אם מסגרת הושמטה או דג תועה מאזור ההקלטה. בשיקולים נוספים, בעת ביצוע ניתוח המעקב, אם קוד R נותן שגיאה במהלך עיבוד קבצים, הבעיה הסבירה ביותר היא במתן שמות לקבצים. התוכנית נעשית לתפקד תחת אסטרטגיית מתן שמות ספציפית מאוד: Timepoint_Group_Subgroup_Stock number_Anything אחר (למשל, 0_A_1_00001_WildtypeGroupA.avi). מתן שמות זה מאפשר להתוות וליישר נקודות זמן, קבוצות וקבוצות משנה מרובות יחד. לבסוף, בעוד מחסומים נבנו לתוך סקריפט הניתוח כדי להבטיח מעקב נאות, חשוב לבדוק בקפידה את פלט הניתוח. התוכנית תשאל באופן אוטומטי אם מספר הדגים נכון, ותבקש מהסרטים לנתח מחדש אם מספר הדג שגוי. חפצים בקו ישר עשויים להופיע בתרשים המיקום הממוצע של Y, המציין שאובייקט נוסף זוהה כדג. במקרה זה, דרך הפעולה הטובה ביותר היא לצפות בזהירות בסרט כדי לא לכלול חפצים נוספים שנוטים להופיע במהירות זרימה גבוהה יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

אנו מודים למשאב המשותף של דגי הזברה של אוניברסיטת וושינגטון לטיפול בבעלי חיים. מחקר זה נתמך על ידי NIH (R01 NS113915 ל- M.H.M).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AutoSwim software Loligo Systems MI10000 Optional - for Automatic control of current velocity
Customized lid Loligo Systems MI10001 This customized lid is used for swim endurance
DAQ-BT Loligo Systems SW10600 Optional - for Automatic control of current velocity
Eheim pump Loligo Systems PU10160 20 L/min. This pump is placed in theflow-through tank.
Fiji Fiji Freely available through Image J (Fiji) Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior
Flowtherm Loligo Systems AC10000 Handheld digital flow meter - for calibration
High Speed Camera Loligo Systems VE10380 USB 3.0 color video camera (4MP)
IR light panel Loligo Systems VE10775 450 x 210 mm, placed under the swim tunnel  chamber
Monofocal lens Loligo Systems VE10388 25mm manual lens
PVC Tubing VWR 60985-534 5/16 x 7/16"  Wall thickness: 1/16"
R Studio R Studio Freely available. Version 3.6 with extra packages. Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior
Swim tunnel respirometer Loligo Systems SW10060 5L (120V/60Hz). The system includes the swim chamber, motor, manual control of water current velocity, 1 pump placed inside the chamber, standard swim tunnel lid for swim behavior, and modified swim tunnel lid for calibration
uEye Cockpit IDS Freely available software to control camera parameters Alternative cameras and accompanying softwares could be used
Vane wheel flow probe Loligo Systems AC10002 Digital flow probe - for calibration

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Becker, C. G., Becker, T. Neuronal regeneration from ependymo-radial glial cells: cook, little pot, cook. Developmental Cell. 32 (4), 516-527 (2015).
  2. Mokalled, M. H., Poss, K. D. A regeneration toolkit. Developmental Cell. 47 (3), 267-280 (2018).
  3. Orger, M. B., de Polavieja, G. G. Zebrafish behavior: opportunities and challenges. Annual Review of Neuroscience. 40, 125-147 (2017).
  4. Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
  5. Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
  6. Mokalled, M. H., et al. Injury-induced ctgfa directs glial bridging and spinal cord regeneration in zebrafish. Science. 354 (6312), 630-634 (2016).
  7. Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Developmental Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).
  8. Wolman, M. A., et al. A genome-wide screen identifies PAPP-AA-mediated IGFR signaling as a novel regulator of habituation learning. Neuron. 85 (6), 1200-1211 (2015).
  9. Granato, M., et al. Genes controlling and mediating locomotion behavior of the zebrafish embryo and larva. Development. 123, 399-413 (1996).
  10. Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (23), 10545-10549 (1995).
  11. Moens, C. B., Yan, Y. L., Appel, B., Force, A. G., Kimmel, C. B. Valentino: a zebrafish gene required for normal hindbrain segmentation. Development. 122 (12), 3981-3990 (1996).
  12. Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
  13. Reimer, M. M., et al. Motor neuron regeneration in adult zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (34), 8510-8516 (2008).
  14. Klatt Shaw, D., et al. Localized EMT reprograms glial progenitors to promote spinal cord repair. Developmental Cell. 56 (5), 613-626 (2021).
  15. Ahmed, R. U., Alam, M., Zheng, Y. P. Experimental spinal cord injury and behavioral tests in laboratory rats. Heliyon. 5 (3), 01324 (2019).
  16. Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Fatemi, G., Faden, A. I. A combined scoring method to assess behavioral recovery after mouse spinal cord injury. Neuroscience Research. 67 (2), 117-125 (2010).
  17. Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
  18. Scheff, S. W., Saucier, D. A., Cain, M. E. A statistical method for analyzing rating scale data: the BBB locomotor score. Journal of Neurotrauma. 19 (10), 1251-1260 (2002).
  19. Li, Q., et al. Differential behavioral responses of zebrafish larvae to yohimbine treatment. Psychopharmacology (Berl). 232 (1), 197-208 (2015).
  20. Wakamatsu, Y., Ogino, K., Hirata, H. Swimming capability of zebrafish is governed by water temperature, caudal fin length and genetic background. Scientific Reports. 9 (1), 16307 (2019).
  21. Ahmed, O., Seguin, D., Gerlai, R. An automated predator avoidance task in zebrafish. Behavioral Brain Research. 216 (1), 166-171 (2011).
  22. Conradsen, C., McGuigan, K. Sexually dimorphic morphology and swimming performance relationships in wild-type zebrafish Danio rerio. Journal of Fish Biology. 87 (5), 1219-1233 (2015).
  23. Leris, I., Sfakianakis, D. G., Kentouri, M. Are zebrafish Danio rerio males better swimmers than females. Journal of Fish Biology. 83 (5), 1381-1386 (2013).

Tags

מדעי המוח גיליון 177
הערכה של סיבולת שחייה והתנהגות שחייה בדגי זברה בוגרים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Burris, B., Jensen, N., Mokalled, M. … More

Burris, B., Jensen, N., Mokalled, M. H. Assessment of Swim Endurance and Swim Behavior in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (177), e63240, doi:10.3791/63240 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter