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Neuroscience

वयस्क Zebrafish में तैरना धीरज और तैरना व्यवहार का आकलन

Published: November 12, 2021 doi: 10.3791/63240
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Developmental Biology, Washington University School of Medicine, 2Center of Regenerative Medicine, Washington University School of Medicine

Summary

रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद कार्यात्मक वसूली में सक्षम, वयस्क ज़ेबराफ़िश तंत्रिका उत्थान के जन्मजात तंत्र को स्पष्ट करने के लिए एक प्रमुख मॉडल प्रणाली है। यहां, हम रीढ़ की हड्डी के उत्थान के कार्यात्मक रीडआउट के रूप में तैरने धीरज और तैरने के व्यवहार का वर्णन करते हैं।

Abstract

उनकी प्रसिद्ध पुनर्योजी क्षमता के कारण, वयस्क ज़ेबराफ़िश जन्मजात रीढ़ की हड्डी के उत्थान के तंत्र से पूछताछ करने के लिए एक प्रमुख कशेरुक मॉडल हैं। अपनी रीढ़ की हड्डी के पूर्ण अभिकर्मक के बाद, ज़ेब्राफ़िश कटे हुए ऊतकों में ग्लियाल और अक्षीय पुलों का विस्तार करती है, घाव के समीपस्थ न्यूरॉन्स को पुनर्जीवित करती है, और चोट के 8 सप्ताह के भीतर अपनी तैरने की क्षमता को फिर से प्राप्त करती है। तैरने समारोह की वसूली इस प्रकार कार्यात्मक रीढ़ की हड्डी की मरम्मत के लिए एक केंद्रीय रीडआउट है। यहां, हम एक संलग्न तैरने वाली सुरंग के अंदर ज़ेब्राफ़िश मोटर क्षमता को मापने के लिए व्यवहारिक assays के एक सेट का वर्णन करते हैं। इन तरीकों का लक्ष्य वयस्क ज़ेब्राफ़िश में तैरने के धीरज और तैरने के व्यवहार के मात्रात्मक माप प्रदान करना है। तैरने के धीरज के लिए, ज़ेब्राफ़िश को थकावट तक लगातार बढ़ते पानी के वर्तमान वेग के अधीन किया जाता है, और थकावट पर समय की सूचना दी जाती है। तैरने के व्यवहार के आकलन के लिए, ज़ेबराफ़िश को कम वर्तमान वेगों के अधीन किया जाता है और मछली के पृष्ठीय दृश्य के साथ तैरने वाले वीडियो पर कब्जा कर लिया जाता है। प्रतिशत गतिविधि, फट आवृत्ति, और पानी की धारा के खिलाफ बिताया गया समय तैरने के व्यवहार के मात्रात्मक रीडआउट प्रदान करते हैं। हमने चोट से पहले और रीढ़ की हड्डी के बाद जंगली-प्रकार के ज़ेब्राफ़िश में तैरने के धीरज और तैरने के व्यवहार को परिमाणित किया। हमने पाया कि जेब्राफ़िश रीढ़ की हड्डी के ट्रांससेक्शन के बाद तैरने का कार्य खो देता है और धीरे-धीरे चोट के बाद 2 से 6 सप्ताह के बीच उस क्षमता को फिर से हासिल करता है। इस अध्ययन में वर्णित विधियों को न्यूरोबिहेवियरल, मस्कुलोस्केलेटल, कंकाल की मांसपेशियों के पुनर्जनन और वयस्क ज़ेबराफ़िश में तंत्रिका पुनर्जनन अध्ययनों पर लागू किया जा सकता है।

Introduction

वयस्क ज़ेबराफ़िश का उपयोग न्यूरोमस्कुलर और मस्कुलोस्केलेटल विकास और रोग मॉडलिंग 1,2,3 के तंत्र की जांच करने के लिए किया जाता है। ज़ेब्राफ़िश मस्तिष्क, रीढ़ की हड्डी और कंकाल की मांसपेशियों सहित कई ऊतकों की कुशल, सहज मरम्मत करने में सक्षम हैं4,5,6,7। न्यूरोमस्कुलर ऊतकों और मॉडल रोगों को पुनर्जीवित करने की उल्लेखनीय क्षमता वयस्क ज़ेब्राफ़िश अनुसंधान 1,2,3 में एक बढ़ते वैज्ञानिक समुदाय को आकर्षित कर रही है। हालांकि, जबकि लोकोमोशन और तैरने के व्यवहार के assays उपलब्ध हैं और लार्वा zebrafish के लिए मानकीकृत हैं, वयस्क मछली 8,9,10,11 में अनुरूप प्रोटोकॉल विकसित करने की बढ़ती आवश्यकता है। इस अध्ययन का लक्ष्य वयस्क ज़ेब्राफ़िश में तैरने के धीरज और तैरने के व्यवहार को मापने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करना है। हम इन प्रोटोकॉल को रीढ़ की हड्डी के पुनर्जनन अनुसंधान के संदर्भ में प्रस्तुत करते हैं। हालांकि, यहां वर्णित व्यवहार प्रोटोकॉल तंत्रिका और मांसपेशियों के उत्थान, न्यूरोमस्कुलर और मस्कुलोस्केलेटल विकास के अध्ययन के साथ-साथ न्यूरोमस्कुलर और मस्कुलोस्केलेटल रोग मॉडलिंग के अध्ययन के लिए समान रूप से लागू होते हैं।

Zebrafish रिवर्स पक्षाघात पूर्ण रीढ़ की हड्डी transection के 8 सप्ताह के भीतर. खराब पुनर्योजी स्तनधारियों के विपरीत, ज़ेबराफ़िश प्रो-पुनर्योजी प्रतिरक्षा, न्यूरोनल और ग्लियल चोट प्रतिक्रियाओं को प्रदर्शित करता है जो कार्यात्मक रीढ़ की हड्डी की मरम्मत के लिए आवश्यक हैं12,13,14। कार्यात्मक रीढ़ की हड्डी की मरम्मत का एक अंतिम रीडआउट चोट के बाद अपने कार्य को फिर से हासिल करने के लिए घाव वाले ऊतक की क्षमता है। कृन्तकों में कार्यात्मक उत्थान का आकलन करने के लिए मानकीकृत तरीकों के एक सूट में लोकोमोटर, मोटर, संवेदी और संवेदी मोटर परीक्षण 15,16,17 शामिल हैं। माउस रीढ़ की हड्डी की चोट में व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले परीक्षणों में लोकोमोटर बासो माउस स्केल (बीएमएस), फोरलिंब मोटर परीक्षण, स्पर्श संवेदी परीक्षण और ग्रिड वॉकिंग सेंसरीमोटर परीक्षण 15,17 शामिल हैं। स्तनधारी या लार्वा ज़ेब्राफ़िश सिस्टम के विपरीत, वयस्क ज़ेबराफ़िश में व्यवहार परीक्षण कम विकसित होते हैं, फिर भी ऊतक पुनर्जनन और रोग मॉडलिंग समुदायों की बढ़ती जरूरतों को समायोजित करने के लिए बहुत आवश्यक है।

पूर्ण रीढ़ की हड्डी transections चोट स्थल के लिए पूर्ण पक्षाघात caudal में परिणाम. चोट लगने के तुरंत बाद, लकवाग्रस्त जानवर कम सक्रिय होते हैं और जितना संभव हो उतना तैरने से बचते हैं। खोई हुई तैरने की क्षमता की भरपाई करने के लिए, लकवाग्रस्त जानवर अपने पेक्टोरल पंखों का अधिक उपयोग करके छोटे, लगातार फटने का प्रदर्शन करते हैं, जो घाव के लिए रोस्ट्रल झूठ बोलते हैं। इस प्रतिपूरक तैरने की रणनीति के परिणामस्वरूप तेजी से थकावट और कम तैरने की क्षमता होती है। जैसा कि ज़ेब्राफ़िश रीढ़ की हड्डी regenerates, जानवरों घाव के लिए एक चिकनी oscillatory तैराकी समारोह caudal हासिल करते हैं, तैराकी धीरज में वृद्धि और बेहतर तैराकी व्यवहार मापदंडों के लिए अनुमति देता है। यहां, हम कम वर्तमान वेगों पर पानी की वर्तमान गति बढ़ाने और तैरने के व्यवहार पर ज़ेबराफ़िश तैरने के धीरज को मापने के तरीकों का वर्णन करते हैं।

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Protocol

एक्कविल और एबी उपभेदों के वयस्क ज़ेब्राफ़िश को वाशिंगटन विश्वविद्यालय ज़ेब्राफ़िश कोर फैसिलिटी में बनाए रखा गया था। सभी पशु प्रयोगों को IACUC संस्थागत पशु प्रोटोकॉल के अनुपालन में किया गया था।

नोट:: प्रयोगात्मक सेटअप का एक उदाहरण चित्र 1A में दिखाया गया है। अंशांकन ढक्कन (अनुकूलित), तैरना धीरज ढक्कन (अनुकूलित), और तैरना व्यवहार ढक्कन (मानक, संलग्न सुरंग ढक्कन) चित्र 1 बी में दिखाया गया है। प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो चित्र 2 में प्रस्तुत किया गया है।

1. तैरना सुरंग की तैयारी और अंशांकन

  1. ज़ेब्राफ़िश सिस्टम के पानी के साथ तैरने वाली सुरंग और आसपास के बफर टैंक को भरें (10 एल फ़िल्टर किया गया पानी; क्षारीयता: 50-150 मिलीग्राम / एल CaCO3; पीएच: 6.8-7.5; तापमान: 26-28.5 डिग्री सेल्सियस; नाइट्रेट < 50 मिलीग्राम / एल; नाइट्राइट < 0.1 मिलीग्राम / एल; और लवणता < 0.5-1 ग्राम / एल)।
  2. ज़ेब्राफ़िश सिस्टम पानी (≈7.5 एल) के साथ एक अतिरिक्त प्रवाह-थ्रू टैंक भरें। तैरने की सुरंग और प्रवाह के माध्यम से टैंक के माध्यम से स्थिति के लिए अतिरिक्त zebrafish प्रणाली पानी के लिए बफर टैंक के माध्यम से प्रवाह के माध्यम से टैंक में प्रवाह के माध्यम से प्रवाह के माध्यम से प्रवाह के माध्यम से प्रवाह टैंक के लिए अनुमति देने के लिए बफर टैंक के किनारे पर सुरक्षित है.
  3. एक बार सुरंग और बफर टैंक भर जाने के बाद, निम्नलिखित प्रदर्शन करें।
    1. बफर टैंक के अंदर फ्लश पंप रखें और इसे पीवीसी ट्यूबों के साथ आसन्न तैरने वाली सुरंग से कनेक्ट करें। प्रवाह के माध्यम से पंप के माध्यम से प्रवाह के माध्यम से टैंक के अंदर रखें और इसे बफर टैंक की दीवार से कनेक्ट करें।
    2. पानी परिसंचरण शुरू करने के लिए बफर टैंक के अंदर स्थित फ्लश पंप और प्रवाह के माध्यम से टैंक में स्थित प्रवाह के माध्यम से पंप को चालू करें।
      नोट: दोहरी पंप प्रणाली तैरने की सुरंग (फ्लश पंप से) और बफर टैंक में (प्रवाह के माध्यम से पंप से) में निरंतर पानी के प्रवाह को सुनिश्चित करेगी।
    3. तैरने की सुरंग के अंदर फंसे किसी भी हवा के बुलबुले को धीरे-धीरे 10 सेमी / सेकंड से 10 सेमी / सेकंड के अंतराल में 10 सेमी / सेकंड तक पानी की धारा के वेग को बढ़ाकर साफ करें। 10 सेमी/सेकंड के अंतराल में वेग को 0 सेमी/सेकंड तक कम करें। प्रवाह वेग को नियंत्रित करने के लिए, प्रवाह वेग नियंत्रण सॉफ़्टवेयर के वेग अनुभाग में ऊपर और नीचे तीर क्लिक करें ( सामग्री तालिका देखें).
      नोट:: मोटर और रोटर के साथ कंप्यूटर से कनेक्टेड हैं। प्रवाह वेग नियंत्रण सॉफ्टवेयर वांछित प्रवाह वेग बनाने के लिए मोटर के साथ संवाद करता है। प्रवाह वेग नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग वैकल्पिक है। विकल्प मैन्युअल रूप से पानी के वर्तमान मोटर को नियंत्रित करना है।
  4. अंशांकन
    नोट:: अंशांकन प्रत्येक प्रयोग से पहले आवश्यक है।
    1. तैरने की सुरंग को बंद करने के लिए अंशांकन ढक्कन का उपयोग करें।
      नोट:: अंशांकन ढक्कन एक प्रबलित केंद्रीय उद्घाटन के साथ अनुकूलित है जो अंशांकन के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रवाह मीटर जांच को फिट करता है (चित्रा 1B)। सुरंग के सभी ढक्कनों को सुरक्षित करने के लिए आठ विंगनट्स का उपयोग किया जाता है।
    2. डिजिटल प्रवाह मीटर को चालू करें और इसे प्रवाह मीटर जांच से कनेक्ट करें। अंशांकन ढक्कन के माध्यम से तैरने की सुरंग के अंदर प्रवाह मीटर जांच रखें। प्रवाह मीटर जांच के ब्लेड को प्रवाह की दिशा के लंबवत स्थिति में रखें।
    3. डिजिटल प्रवाह मीटर का उपयोग करके तैरने वाली सुरंग मोटर (प्रवाह वेग नियंत्रण सॉफ़्टवेयर के साथ नियंत्रित) के आउटपुट को कैलिब्रेट करें। ऐसा करने के लिए, निम्न चरणों का पालन करें।
    4. प्रवाह वेग नियंत्रण सॉफ़्टवेयर खोलें और अंशांकन क्लिक करें.
    5. RPM बनाम वोल्टेज करने के लिए शीर्ष बाईं ओर विकल्प बदलें। प्रवाह वेग नियंत्रण सॉफ़्टवेयर के वेग अनुभाग में मानों को टाइप करके, प्रवाह वेग को 5 सेमी/सेकंड की वृद्धि में 0 सेमी/सेकंड से 100 सेमी/सेकंड तक बढ़ाएं। प्रत्येक चरण में, "+" बटन पर क्लिक करें और डिजिटल प्रवाह मीटर द्वारा इंगित वर्तमान वेग को रिकॉर्ड करें।
      नोट:: परिणामी रैखिक संबंध 1 के करीब एक R2 मान होना चाहिए।
    6. अंशांकन की पुष्टि करने के लिए, पानी की धारा के वेग को 0 से 10, 25, 50, 75, और 100 सेमी / सेकंड तक बढ़ाएं, और फिर प्रवाह वेग नियंत्रण सॉफ़्टवेयर के यूवाटर [सेमी / एस] अनुभाग में ऊपर और नीचे तीर का उपयोग करके 75, 50, 25, 10 सेमी / सेकंड तक वेग कम करें। प्रत्येक वेग (सॉफ़्टवेयर से) पर, डिजिटल प्रवाह मीटर द्वारा इंगित संबंधित वेग को मापें और रिकॉर्ड करें।
    7. सुरंग को कैलिब्रेटेड और सटीक पर विचार करें यदि मापा गया पानी की धारा वेग ±2 सेमी / सेकंड के विचलन के भीतर है। यदि विचलन ±2 सेमी/सेकंड से परे है, तो उचित अंशांकन सुनिश्चित करने के लिए चरण 1.4.4 से 1.4.6 तक दोहराएँ।

2. तैरने धीरज का आकलन

नोट: प्रयोगात्मक समूहों को तैरने के धीरज के लिए 10 या उससे कम जानवरों के समूहों में विभाजित किया गया है।

  1. प्रवाह वेग नियंत्रण सॉफ़्टवेयर सेट करें.
    नोट:: इस अनुभाग में प्रवाह वेग नियंत्रण सॉफ़्टवेयर का उपयोग वैकल्पिक है। विकल्प मैन्युअल रूप से पानी के वर्तमान मोटर को नियंत्रित करना है। मैन्युअल जल वर्तमान नियंत्रण के लिए, चरण 2.3 पर आगे बढ़ें और मैन्युअल रूप से चरण 2.5 और 2.6 में निर्दिष्ट वेतन वृद्धि में जल वर्तमान वेग बढ़ाएं।
    1. प्रवाह वेग नियंत्रण सॉफ़्टवेयर खोलें। प्रयोग लेबल वाले बॉक्स पर क्लिक करें. Uswim और Uwater को अनचेक करें।
    2. पानी की धारा वेगों को समायोजित करने के लिए नीचे बाईं ओर Uwater [सेमी / एस] बॉक्स में प्रवाह की गति बदलें।
    3. स्वचालित प्रोटोकॉल प्रारंभ करने के लिए, लॉगिंग प्रारंभ करें बॉक्स पर क्लिक करें. खुलने वाली संवाद विंडो में, ड्रॉपडाउन सूची से स्वचालित चुनें.
    4. पहले से सहेजी गई प्रोटोकॉल फ़ाइल चुनने के लिए, वांछित प्रोटोकॉल खोलने के लिए प्रोटोकॉल फ़ाइल के बगल में फ़ाइल आइकन पर क्लिक करें।
    5. लॉग फ़ाइल के आगे फ़ाइल चिह्न पर क्लिक करके आउटपुट फ़ाइल सेट करें. फ़ाइल एक्सप्लोरर विंडो में जो खुलता है, आउटपुट फ़ाइल का नाम दें और इसे वांछित स्थान पर सहेजें।
  2. कोई स्प्लिट लैप टाइमर विंडो सेट करें. कंप्यूटर स्क्रीन पर प्रवाह वेग नियंत्रण सॉफ़्टवेयर और टाइमर विंडो के लिए एक साथ पहुँच होना सुनिश्चित करें।
  3. तैरने की सुरंग से उन्हें हटाने के बाद थकी हुई मछली को घर देने के लिए एक मछली संग्रह टैंक स्थापित करें। ज़ेब्राफ़िश सिस्टम पानी (0.75 एल) के साथ संग्रह टैंक भरें। Zebrafish सिस्टम पानी के साथ एक लंबी पीवीसी ट्यूब भरें।
    1. संग्रह टैंक में पहले से भरे हुए पीवीसी ट्यूब का एक छोर (अंत 1) और बफर टैंक में दूसरा छोर (अंत 2) रखें। सुनिश्चित करें कि पानी स्वतंत्र रूप से बफर टैंक से संग्रह टैंक में प्रवाहित हो सकता है।
    2. पानी के प्रवाह को रोकने के लिए एक बाइंडर क्लिप के साथ पीवीसी ट्यूब (अंत 2) के ऊपरी छोर को क्लैंप करें। आवश्यकतानुसार पानी के बहिर्वाह को नियंत्रित करने के लिए बाइंडर क्लिप का उपयोग करें।
  4. तैरने धीरज ढक्कन का उपयोग कर तैरने सुरंग बंद करो.
    नोट: तैरना धीरज ढक्कन एक तैरने सुरंग खिड़की के साथ अनुकूलित करने के लिए तैरने सुरंग से थकी हुई मछली को हटाने के लिए, परख के बाकी हिस्सों को बाधित किए बिना (चित्रा 1 बी).
  5. तैरने वाली सुरंग के अंदर मछली के एक समूह को रखें। प्रवाह वेग नियंत्रण सॉफ़्टवेयर के Uwater [cm/s] अनुभाग में इन मानों को टाइप करके वर्तमान वेग को 5 मिनट के लिए 0 सेमी/सेकंड, 5 मिनट के लिए 9 सेमी/सेकंड, और 5 मिनट के लिए 10 सेमी/सेकंड समायोजित करते समय विभाजित लैप टाइमर प्रारंभ करें.
    नोट: यह कदम तैरने की सुरंग और प्रवाह दिशा के लिए जानवरों acclimate जाएगा।
  6. मछली के acclimation के बाद, स्वचालित प्रवाह वेग नियंत्रण कार्यक्रम शुरू करें जो हर मिनट 2 सेमी / सेकंड तक पानी के वर्तमान वेग को बढ़ाएगा।
    नोट: मछली थकावट तक तैरना होगा। थकी हुई मछलियों को तैरने वाली सुरंग के पीछे के छोर की ओर धकेल दिया जाता है।
  7. जब एक मछली समाप्त हो जाती है, तो मछली संग्रह ट्यूब को खोल दें, तैरने वाली सुरंग की खिड़की खोलें और संग्रह टैंक में मछली को इकट्ठा करें। स्प्लिट लैप टाइमर का उपयोग करके थकावट पर समय रिकॉर्ड करें।
    नोट: मछली कभी-कभी थके बिना तैरने वाली सुरंग के पीछे के छोर पर बहाव कर सकती है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि एक मछली थक गई है, धीरे से सुरंग के पीछे के छोर पर टैप करें या मछली को तैरने के लिए प्रोत्साहित करने के लिए उस क्षेत्र पर एक छाया बनाएं। थकी हुई मछली चौंका देने वाली उत्तेजना का जवाब नहीं देती है और सुरंग के पीछे के छोर पर सपाट होती है।
  8. चरण 2.7 को दोहराएं जब तक कि सभी मछलियां समाप्त न हो जाएं और संग्रह टैंक में एकत्र न हो जाएं। प्रवाह वेग नियंत्रण सॉफ़्टवेयर पर आपातकालीन रोक बटन क्लिक करें और टाइमर को रोकें।
    नोट: तैरने के दौरान डबल-चेक करें कि तैरने की सुरंग कक्ष से निकाली गई मछली की संख्या रिकॉर्ड किए गए समय से मेल खाती है या नहीं।
  9. मछली के प्रत्येक समूह के लिए चरण 2.5 से 2.8 तक दोहराएँ।
    नोट: प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है, लेकिन चोट के बाद समय बिंदु तक सटीक होने के लिए, यह अनुशंसा की जाती है कि फिल्मों और धीरज तैरने को एक ही दिन में किया जाए। सुरंग परिसंचारी जारी रख सकती है जबकि प्रयोगों को रोक दिया जाता है।

3. तैरने व्यवहार परख के लिए वीडियो पर कब्जा

नोट: एक बार में केवल पांच जानवरों को ट्रैक किया जा सकता है। यदि प्रयोगात्मक समूह पांच जानवरों से बड़े हैं, तो प्रत्येक समूह के लिए कई वीडियो लिए जा सकते हैं, जहां पहला वीडियो पांच या उससे कम जानवरों को ट्रैक करता है और दूसरा वीडियो अन्य पांच या उससे कम जानवरों को ट्रैक करता है। अनुदैर्ध्य अध्ययनों के लिए जो समय के साथ व्यक्तिगत जानवरों को ट्रैक करने का लक्ष्य रखते हैं, मछली को व्यक्तिगत रूप से रखा जा सकता है और कई समय बिंदुओं पर ट्रैक किया जा सकता है। ट्रैकिंग और विश्लेषण के लिए सभी स्क्रिप्ट GitHub के माध्यम से उपलब्ध हैं ( सामग्री की तालिका देखें)।

  1. तैरने की सुरंग के नीचे स्थित इन्फ्रारेड लाइट पैनल को चालू करें। तैरने की सुरंग के शीर्ष पर एक छत माउंट पर कैमरे को सुरक्षित करें। फ़ोकस और एपर्चर के छल्ले समायोजित करें.
    नोट: फ़ोकस और एपर्चर सेटिंग्स कैमरे और तैरने वाली सुरंग के बीच की दूरी के साथ-साथ प्रकाश वातावरण पर निर्भर करती हैं।
  2. कैमरा रिकॉर्डिंग सॉफ़्टवेयर खोलें ( सामग्री की तालिका देखें)। सॉफ़्टवेयर सेटिंग्स निम्नानुसार सेट करें.
    1. 1:4 पहलू प्रदर्शन पर क्लिक करें। सुनिश्चित करें कि दृश्य का क्षेत्र पूरे तैरने वाली सुरंग को कवर करता है। पृष्ठभूमि को सामान्य बनाने के लिए ऑटो-कंट्रास्ट और ऑटो-व्हाइट संतुलन को बंद करें और समूहों में कंट्रास्ट करें।
    2. रिंच आइकन पर क्लिक करके कैमरा गुण विंडो खोलें। पैरामीटर निम्नानुसार सेट करें: पिक्सेल घड़ी: 344 मेगाहर्ट्ज, फ्रेम दर: 70 एफपीएस, इसे जांचने के लिए होल्ड के बगल में स्थित बॉक्स पर क्लिक करें, एक्सपोज़र समय: 0.290 एमएस। इस विंडो को बंद न करें।
    3. रिकॉर्डिंग विंडो को क्रॉप करने के लिए सुरंग के केवल तैरने कक्ष को कवर करने के लिए /
  3. फिल्म रील आइकन पर क्लिक करके रिकॉर्डिंग विंडो खोलें। रिकॉर्डिंग सेटिंग्स निम्नानुसार सेट करें:
    1. फ़्रेमों की अधिकतम संख्या के लिए बॉक्स चेक करें.
    2. मैन्युअल रूप से फ़्रेम की संख्या के लिए 63,000 इनपुट।
    3. Calc. फ़्रेम दर के लिए बॉक्स चेक करें. यह प्रोग्राम को चरण 3.2.2 (70 एफपीएस) में परिभाषित फ्रेम दर को खींचने की अनुमति देता है।
    4. JPEG गुणवत्ता को 30 में बदलें.
  4. कोई परीक्षण रन रिकॉर्ड करें.
    1. Create पर क्लिक करें और नई फ़ाइल टेस्ट का नाम दें और इसे डेस्कटॉप पर सहेजें।
    2. रिकॉर्डिंग विंडो पर वापस जाएँ और रिकॉर्ड करें क्लिक करें. परीक्षण चलचित्र प्रोटोकॉल की पूरी अवधि (15 मिनट) के लिए चलने दें।
    3. एक बार परीक्षण समाप्त हो जाने के बाद, सुनिश्चित करें कि कोई गिरा हुआ फ्रेम नहीं है और 63,000 फ्रेम दर्ज किए गए हैं।
  5. तैरने वाली सुरंग में मछली का एक समूह रखें और एक मानक पूरी तरह से संलग्न ढक्कन (चित्रा 1 बी) का उपयोग करके सुरंग को बंद करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि ढक्कन को पूरी तरह से कसने से पहले सभी मछलियां सुरंग में हैं। सुनिश्चित करें कि ढक्कन के नीचे कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं। यह अन्यथा परिणामों को प्रभावित करेगा।
  6. एक नई रिकॉर्डिंग विंडो खोलें और फ़ाइल का नाम दें. उदाहरण: 2_A_1_00001_WildtypeGroupA.avi
    नोट:: सुनिश्चित करें कि सेटिंग्स चरण 3.2 और 3.3 में पैरामीटर के अनुसार हैं। जेपीईजी गुणवत्ता हमेशा डिफ़ॉल्ट पर वापस जाएगी और प्रत्येक नई फिल्म के लिए रीसेट करने की आवश्यकता है।
    चेतावनी: अभी तक रिकॉर्ड क्लिक न करें.
  7. प्रवाह वेग नियंत्रण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके एक नया प्रयोग शुरू करें।
    नोट:: कोई स्वचालित प्रोटोकॉल प्रारंभ करने के लिए, लॉगिंग प्रारंभ करें बॉक्स क्लिक करें। खुलने वाली संवाद विंडो में, ड्रॉपडाउन सूची से स्वचालित चुनें. पहले से सहेजी गई प्रोटोकॉल फ़ाइल चुनने के लिए, वांछित प्रोटोकॉल खोलने के लिए प्रोटोकॉल फ़ाइल के बगल में फ़ाइल आइकन पर क्लिक करें।
    1. एक मैनुअल प्रोटोकॉल शुरू करने के लिए, प्रवाह गति को 5 मिनट के लिए 0 सेमी / सेकंड, 5 मिनट के लिए 10 सेमी / सेकंड पर सेट करें, इसके बाद प्रवाह वेग नियंत्रण सॉफ्टवेयर में यूवाटर [सेमी / एस] बॉक्स का उपयोग करके 5 मिनट के लिए 20 सेमी / सेकंड।
    2. नई डेटा आउटपुट फ़ाइल सहेजें (एक .csv फ़ाइल के रूप में सहेजी जाएगी) चलचित्र फ़ाइल के समान नाम के तहत और एक ही फ़ोल्डर में।
      चेतावनी: अभी तक प्रारंभ करें क्लिक न करें.
  8. तैरने की सुरंग के किनारे पर एक पेपर तौलिया या कपड़े का टुकड़ा रखें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सभी व्यवहार मछली की तैराकी के कारण हैं और पर्यावरण में आंदोलन के कारण होने वाली चौंकाने वाली प्रतिक्रिया के कारण नहीं हैं।
  9. त्वरित उत्तराधिकार में, सुनिश्चित करें कि पानी शांत है और कोई लहर फ्रेम में आगे नहीं बढ़ रही है। चलचित्र फ़ाइल रिकॉर्ड करना प्रारंभ करने के लिए कैमरा सॉफ़्टवेयर विंडो में रिकॉर्ड करें क्लिक करें. प्रोटोकॉल को प्रारंभ करने के लिए प्रवाह वेग नियंत्रण सॉफ़्टवेयर में प्रारंभ करें क्लिक करें , जो निर्बाध रूप से जारी रहेगा.
  10. यह सुनिश्चित करने के लिए फिल्म देखें कि कोई फ्रेम नहीं गिराया गया है, कि दृश्य के क्षेत्र में कोई बुलबुले नहीं हैं, और यह कि सभी मछलियां रिकॉर्ड की गई हैं।
  11. एक बार फिल्म रिकॉर्डिंग पूरी हो जाने के बाद, प्रवाह वेग नियंत्रण प्रोटोकॉल को समाप्त करने के लिए आपातकालीन स्टॉप पर क्लिक करें। स्वचालित रूप से सहेजी गई डेटा आउटपुट फ़ाइल की जाँच करें. चलचित्र फ़ाइल सहेजने के लिए रिकॉर्डिंग विंडो पर बंद करें क्लिक करें.
  12. ढक्कन निकालें। सावधानी से मछली को पुनः प्राप्त करें और उन्हें अपने टैंक में वापस कर दें।
  13. मछली के सभी समूहों के लिए चरण 3.5 से 3.12 को दोहराएँ।
  14. एक बार जब फिल्म रिकॉर्डिंग सभी समूहों के लिए समाप्त हो जाती है, तो MovieProcessing_v5.bat स्क्रिप्ट के साथ 70 एफपीएस वीडियो से 20 एफपीएस वीडियो में फिल्मों को परिवर्तित करें। ऐसा करने के लिए, स्क्रिप्ट फ़ाइल को कच्चे वीडियो वाले फ़ोल्डर में ले जाएँ। फ़ाइल पर राइट-क्लिक करें और चलाएँ चुनें।
    नोट:: स्क्रिप्ट स्वचालित रूप से चलता है। एक कमांड प्रॉम्प्ट विंडो स्क्रिप्ट की प्रगति को दिखाते हुए आएगी। उपर्युक्त चरण वैकल्पिक है। यह 15 मिनट के वीडियो में फ्रेम की संख्या को 63,000 से 18,000 फ्रेम तक कम कर देता है और SwimBehavior_v7 बनाता है। आर स्क्रिप्ट अधिक तेज़ी से चलती है।
  15. सुरंग को खाली करें और सभी उपकरणों को दूर रख दें।

4. तैरने के व्यवहार के आकलन के लिए फिल्मों का विश्लेषण

नोट: मूवी रिकॉर्डिंग और विश्लेषण अलग-अलग दिनों में पूरा किया जा सकता है।

  1. फिजी में Tracking_v2.ijm स्क्रिप्ट खोलें और प्रोग्राम शुरू करने के लिए चलाएँ क्लिक करें। पॉप अप करने वाली विंडो में, ट्रैक करने के लिए तैरने के व्यवहार चलचित्रों वाले फ़ोल्डर का चयन करें और खोलें क्लिक करें. पहली फिल्म के फ्रेम 1, एक संवाद बॉक्स, और ब्याज के क्षेत्र (ROI) प्रबंधक के लिए देखो जो ऊपर आ जाएगा।
  2. संवाद बॉक्स में दिए गए निर्देशों का पालन करें। तैरने सुरंग कक्ष के नीचे का एक ROI बनाएँ और ठीकक्लिक करें। सुनिश्चित करें कि कोई काला कोनों को नहीं देखा जाता है।
    नोट:: थ्रेशोल्ड विंडो एक संपादित, थ्रेशोल्ड फ़्रेम 1 के साथ खुलेगा।
  3. रंग योजना को B&W से लाल में बदलें. अधिकतम मान को समायोजित करें जब तक कि फ्रेम 1 लाल रंग में मछली को नहीं दिखाता है और कुछ और नहीं। थ्रेशोल्ड रिकॉर्ड करें. संवाद बॉक्स में ठीक क्लिक करें.
    नोट:: प्रोग्राम स्वचालित रूप से चलेगा। फ्रेम 1 के लिए बनाया गया था जो ROI लगातार चयनित किया जाएगा और बाद के फ्रेम के लिए अचयनित किया जाएगा। एक प्रगति पट्टी फिजी विंडो के निचले-दाएं कोने में प्रक्रिया की निगरानी करेगी। ट्रैकिंग में प्रति फिल्म लगभग 40 मिनट लगते हैं। जब सभी फिल्मों को ट्रैक किया जाता है, तो फिजी कार्यक्रम बंद हो जाएगा। आरओआई का चयन करना बंद कर देगा। फिल्मों वाले फ़ोल्डर में अब प्रत्येक फिल्म के लिए एक _raw.csv फ़ाइल होगी। फिजी को इस बिंदु पर बंद किया जा सकता है।
  4. वर्णनात्मक आँकड़े संरेखित करना, असेंबल करना और प्राप्त करना
    1. तैरना Behavior_v7 खोलें। आर स्टूडियो में आर स्क्रिप्ट।
    2. स्क्रिप्ट अनुभाग के ऊपरी-दाएँ कोने में स्रोत पर क्लिक करें. खुलने वाली एक नई विंडो में, फिजी द्वारा जनरेट की गई _raw.csv फ़ाइलों वाले फ़ोल्डर का चयन करें। क्लिक करें,खोलें.
      नोट:: प्रोग्राम स्वचालित रूप से चलेगा।
    3. प्रत्येक चलचित्र में मछलियों की संख्या की पुष्टि करने के लिए पूछने वाले संवाद बॉक्स में, यदि दी गई संख्याएँ सही हैं, तो हाँ क्लिक करें, या यदि संख्याएँ ग़लत हैं, तो नहीं क्लिक करें.
      नोट:: यदि नहीं क्लिक किया गया था, तो एक संदेश पॉप अप होगा कि फिल्मों को एक नए ROI और थ्रेशोल्ड के साथ फिर से ट्रैक किया जाए। यदि हाँ क्लिक किया गया था, तो प्रोग्राम आगे बढ़ेगा।
    4. नई विंडो में जो यह पूछने के लिए खुलती है कि गैर-तैराकी मछली को हटा दिया जाना चाहिए या नहीं, हाँ या नहीं क्लिक करें।
      नोट: गैर-तैराकी मछली को 10 सेमी / सेकंड पर 50% से कम गतिविधि वाली मछली के रूप में परिभाषित किया गया है। यह अनुशंसा नहीं की जाती है कि गैर-तैराकी मछली को हटा दिया जाए।
    5. एक नई पॉप-अप विंडो में जो पूछता है कि क्या समूह अनब्लाइंड किए गए हैं और क्या उपयोगकर्ता किसी भी समूह को संयोजित करना चाहता है, अनब्लाइंड या एक से अधिक नियंत्रण समूह होने पर समूहों को संयोजित करना चाहता है।
    6. पिछले प्रश्न के लिए एक प्रतिक्रिया दिए जाने के बाद, सुनिश्चित करें कि प्रोग्राम एक संदेश देता है Y की फ़ाइल X को संरेखित करना, जहां X वर्तमान फ़ाइल को संरेखित किया जा रहा है और Y संरेखित करने के लिए फ़ाइलों की कुल संख्या है। प्रत्येक फ़ाइल को संरेखित करने के लिए लगभग 30 s लगता है।
  5. एक बार जब फ़ाइलें संरेखित हो जाती हैं, तो उसी नाम (_aligned.csv) के साथ उत्पन्न एक नई .csv फ़ाइल की जांच करें। सुनिश्चित करें कि प्रोग्राम डेटा को जोड़ता है, आँकड़े चलाता है, और आउटपुट ग्राफ़ प्लॉट करता है। _raw.csv और _aligned.csv फ़ाइलों वाले पैरेंट फ़ोल्डर में परिणाम लेबल किए गए किसी नए फ़ोल्डर में जनरेट की गई विश्लेषण फ़ाइलों की जाँच करें.
  6. परिणाम फ़ोल्डर में, डायग्नोस्टिक्स और ग्राफ़नाम के दो फ़ोल्डरों और BulkData_Avg, BulkData_Full, SummaryData_Avg और SummaryData_Full नाम की चार .csv फ़ाइलों की जाँच करें.
    नोट:: SummaryData_Full.csv प्रत्येक समय बिंदु पर प्रत्येक समूह में प्रत्येक मछली के लिए अलग-अलग डेटा है। यह डेटा स्वचालित रूप से प्लॉट किया गया है लेकिन इसे कहीं और निकाला और प्लॉट किया जा सकता है।
    1. सुनिश्चित करें कि ग्राफ़ फ़ोल्डर में प्रोग्राम द्वारा जनरेट किए गए ग्राफ़ और प्रत्येक ग्राफ़ के लिए डेटा बिंदुओं वाली फ़ाइलों .csv हैं.
    2. सुनिश्चित करें कि निदान फ़ोल्डर संरेखित फ़ाइलों के लिए नैदानिक डेटा के साथ एक एकल .csv फ़ाइल है।
      नोट:: निदान.csv फ़ाइल में स्तंभों में निम्न शामिल हैं: a) अतिरिक्त ऑब्जेक्ट्स वाले फ़्रेमों की संख्या, जो 100 से कम होनी चाहिए. अतिरिक्त वस्तुओं के साथ बहुत सारे फ्रेम ट्रैकिंग के साथ एक समस्या का सुझाव देते हैं। b) अनुपलब्ध या मर्ज की गई वस्तुओं के साथ फ़्रेमों की संख्या. इस मीट्रिक के लिए उच्च होना सामान्य है। मछली है कि अच्छी तरह से regenerated नहीं किया है अक्सर सुरंग के पीछे करने के लिए बह जाएगा और लापता के रूप में गिना जाएगा. ग) 240 से अधिक पिक्सेल कूदता के साथ फ्रेम्स. यह संख्या एक ही फिल्म में वस्तुओं (मछली) की संख्या के साथ बढ़ती है। व्यवहार मैट्रिक्स की गणना कैसे की गई थी, इसका एक विस्तृत विवरण अनुपूरक फ़ाइल 1 में प्रदान किया गया है।

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Representative Results

हमने इस प्रोटोकॉल (चित्रा 1) के अनुभाग 1 में वर्णित तैरने वाली सुरंग स्थापित की है। हमने तैरने की सहनशक्ति (इस प्रोटोकॉल के अनुभाग 2) के साथ-साथ बेसलाइन पर और रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद वयस्क ज़ेब्राफ़िश के तैरने के व्यवहार (इस प्रोटोकॉल के अनुभाग 3 और 4) का आकलन किया (चित्रा 2)।

बेसलाइन मोटर फ़ंक्शन स्थापित करने के लिए, हमने बढ़ते पानी के वर्तमान वेग (चित्रा 3 ए) के तहत जंगली-प्रकार के ज़ेब्राफ़िश के तैरने के धीरज की जांच की। इस परख में, जंगली प्रकार zebrafish 41 मिनट के लिए तैराकी से पहले थक गया हो रही है. मछली को तब पूरी तरह से रीढ़ की हड्डी के transections के अधीन किया गया था जैसा कि पहले वर्णित है और तैरने धीरज assays प्रदर्शन किया गया था6. एमएस -222 का उपयोग करके ज़ेब्राफ़िश को बेहोश करने के बाद, रीढ़ की हड्डी को ब्रेनस्टेम क्षेत्र में 4 मिमी पुच्छल को ट्रांसेक्ट करने के लिए ठीक कैंची के साथ एक छोटा सा चीरा बनाया जाता है। एक पूर्ण transection नेत्रहीन पुष्टि की गई थी। रीढ़ की हड्डी की सर्जरी के बाद तैरने की क्षमता के नुकसान की पुष्टि करने के लिए, घायल जानवरों को चोट के बाद 2 या 3 दिनों (डीपीआई) में मूल्यांकन किया गया था। इस समय बिंदु पर, ज़ेबराफ़िश घाव स्थल पर पूरी तरह से लकवाग्रस्त पुच्छल हैं। तैरने की सहनशक्ति का मूल्यांकन 2, 4, और 6 सप्ताह के बाद चोट (डब्ल्यूपीआई) पर किया गया था। 2 wpi पर, घाव वाली मछली ने अपनी तैरने की धीरज क्षमता का 60% खो दिया (चित्रा 3 ए)। पुनर्जीवित मछली ने धीरे-धीरे 4 और 6 wpi पर तैरने की सहनशक्ति हासिल की। इन परिणामों ने संकेत दिया कि जंगली प्रकार के ज़ेबराफ़िश रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद तैरने की धीरज क्षमता को फिर से हासिल करने में सक्षम हैं।

रीढ़ की हड्डी के पुनर्जनन के दौरान ज़ेब्राफ़िश तैरने के व्यवहार की जांच करने के लिए, हमने जंगली प्रकार के जानवरों के तैरने के व्यवहार को 0 सेमी / एस पानी के वर्तमान वेग पर या 10 और 20 सेमी / सेकंड (चित्रा 3 बी) के निरंतर, कम वर्तमान वेगों के तहत ट्रैक किया। तैरने की सुरंग कक्ष में मछली की स्थिति के औसत पटरियों का उपयोग कम वर्तमान वेग (चित्रा 3 बी) पर तैरने के व्यवहार के दृश्य मूल्यांकन के लिए किया गया था। इस परख में, uninjured नियंत्रण तैरने सुरंग कक्ष के सामने के हिस्से में तेजी से तैरा (पानी की धारा के स्रोत के करीब), जो एक ऊंचा वाई स्थिति (चित्रा 3 बी) से मेल खाती है. इसके विपरीत, 2 डब्ल्यूपीआई पर, घायल मछली वर्तमान के खिलाफ स्थिर तैरने की क्षमता बनाए रखने में सक्षम नहीं थी। नतीजतन, उनके तैरने वाले ट्रैक वाई स्थिति (चित्रा 3 बी) में समग्र कमी के साथ अधिक अनियमित हैं। वाई स्थिति 4 और 6 डब्ल्यूपीआई पर बढ़ी, यह दर्शाता है कि जानवरों को पुनर्जीवित करने से धीरे-धीरे तैरने की सुरंग कक्ष के सामने तैरने की उनकी क्षमता फिर से हासिल हो गई। तैरने के व्यवहार मापदंडों को मापने के लिए, हमने प्रतिशत गतिविधि की गणना की, तैरने वाली सुरंग (वाई स्थिति) में स्थिति, और समय वर्तमान (चित्रा 3 सी-ई) के खिलाफ तैरा। घायल नियंत्रणों के सापेक्ष, 2 wpi पर घायल जानवर स्पष्ट रूप से कम सक्रिय थे (चित्रा 3 C), तैरने वाली सुरंग (चित्रा 3 डी) के पीछे के चतुर्थांश में रुक गए, और कम वर्तमान वेग (चित्रा 3 ई) के खिलाफ तैरने की अपनी क्षमता खो दी। कार्यात्मक वसूली प्राप्त करने के लिए उनकी जन्मजात क्षमता के अनुरूप, घाव वाले जानवरों ने धीरे-धीरे 4 और 6 wpi (चित्रा 3 C-E) पर तैराकी व्यवहार मापदंडों को सामान्यीकृत किया। तैरने धीरज और तैरने के व्यवहार मापदंडों ने एक साथ ज़ेब्राफ़िश में तैरने के कार्य और कार्यात्मक रीढ़ की हड्डी की मरम्मत के मात्रात्मक रीडआउट की पेशकश की।

Figure 1
चित्रा 1: तैरना सुरंग सेट अप और अनुकूलित ढक्कन. (ए) तैरने सुरंग कक्ष के ऊपर और साइड दृश्यों को ज़ूम किए गए सहित स्थापित तैराकी सुरंग की प्रतिनिधि छवियां। (बी) इस प्रोटोकॉल में वर्णित विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले तैरने वाली सुरंग ढक्कनों की छवियां। एक मानक, पूरी तरह से संलग्न तैरने वाली सुरंग ढक्कन का उपयोग तैरने के व्यवहार के लिए किया जाता है (इस प्रोटोकॉल के अनुभाग 3)। एक संशोधित तैरना सुरंग ढक्कन जो एक हैंडहेल्ड डिजिटल प्रवाह मीटर को समायोजित करता है, अंशांकन के लिए उपयोग किया जाता है (इस प्रोटोकॉल का खंड 1)। एक संशोधित तैरना धीरज ढक्कन, जिसमें तैरने की सुरंग कक्ष के पीछे के छोर पर एक हटाने योग्य ढक्कन होता है, तैरने के धीरज परीक्षण (इस प्रोटोकॉल के खंड 2) के दौरान थकी हुई मछली को हटाने की अनुमति देता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: प्रयोगात्मक पाइपलाइन तैरने धीरज और वयस्क zebrafish में व्यवहार तैरने के लिए परख करने के लिए. तैरने के धीरज के लिए, मछली थकावट तक एक बढ़ती पानी की धारा के खिलाफ तैरती है। तैरने के व्यवहार के लिए, तैरने के मापदंडों की अनुपस्थिति में और कम वर्तमान वेगों पर मूल्यांकन किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद जंगली प्रकार के ज़ेब्राफ़िश में कार्यात्मक वसूली। (ए) बेसलाइन और 2, 4, और 6 डब्ल्यूपीआई पर जंगली प्रकार के ज़ेब्राफ़िश के लिए तैरने धीरज assays द्वारा निर्धारित मोटर समारोह। डॉट्स दो स्वतंत्र प्रयोगों से अलग-अलग जानवरों को दर्शाते हैं। (बी) तैरना व्यवहार assays कम पानी वर्तमान वेग के तहत जंगली प्रकार zebrafish ट्रैक. औसत Y स्थिति को ट्रैकिंग के दौरान प्रत्येक समय बिंदु पर दिखाया गया है (5 मिनट के लिए 0 सेमी / सेकंड, 5 मिनट के लिए 10 सेमी / सेकंड, और 5 मिनट के लिए 20 सेमी / सेकंड)। (C-E) प्रतिशत गतिविधि (सी), सुरंग (डी) में औसत वाई स्थिति, और प्रवाह (ई) के खिलाफ तैरने का समय 20 सेमी / सेकंड पर परिमाणित किया गया था। सभी परिमाणीकरणों के लिए, दो स्वतंत्र प्रयोग दिखाए गए हैं। एन = 30 पूर्व चोट की स्थिति में; n = 23 पर 2 wpi, n = 20 पर 4 wpi, n = 18 पर 6 wpi. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए एक तरफ़ा एनोवा का उपयोग किया गया था। त्रुटि पट्टियाँ माध्य (SEM) की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं. * पी < 0.05; ** पी < 0.01; पी < 0.001; पी < 0.0001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 1: कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

वयस्क ज़ेबराफ़िश मानव रोगों के मॉडलिंग और ऊतक पुनर्जनन के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक लोकप्रिय कशेरुक प्रणाली है। CRISPR / Cas9 जीनोम संपादन ने ज़ेब्राफ़िश में मॉडलिंग रोग के लिए रिवर्स आनुवंशिक अध्ययन में क्रांति ला दी है; हालांकि, वयस्क ज़ेबराफ़िश में बड़े पैमाने पर आनुवांशिकी को जैविक और तकनीकी चुनौतियों से बाधित किया गया है, जिसमें वयस्क ज़ेब्राफ़िश ऊतकों की अनुपलब्धता उच्च-थ्रूपुट फेनोटाइपिंग के लिए शामिल है। वयस्क ज़ेब्राफ़िश की जटिल शरीर रचना को देखते हुए, ऊतक वास्तुकला को प्राप्त करने और विश्लेषण करने के लिए लंबे समय तक हिस्टोलॉजिकल प्रसंस्करण की आवश्यकता होती है। इस अध्ययन में वर्णित तैरने धीरज और तैरने के व्यवहार का उपयोग हिस्टोलॉजी से पहले एक माध्यम थ्रूपुट पर तंत्रिका, मांसपेशियों, या कंकाल फेनोटाइप के लिए पूर्व-स्क्रीन के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, जैसा कि ऊतक पुनर्जनन के अध्ययन का उद्देश्य कार्यात्मक ऊतक की मरम्मत में सुधार करना है, इस अध्ययन में वर्णित प्रोटोकॉल व्यापक रूप से लागू होंगे, यदि आवश्यक नहीं है, तो तंत्रिका, मांसपेशियों और कंकाल पुनर्जनन अनुसंधान के अध्ययन के लिए।

कार्यात्मक लोकोमोशन assays तंत्रिका विकास और उत्थान की हमारी समझ के लिए अभिन्न अंग रहा है। मानक लोकोमोटर एसेस कशेरुक प्रजातियों में व्यापक रूप से उपलब्ध हैं, जिनमें चूहे, चूहे और लार्वा ज़ेबराफ़िश शामिल हैं। माउस और चूहे मॉडल प्रणालियों में क्रमशः BMS16 और BBB17,18 जैसे व्यवहार और कार्यात्मक लोकोमोशन assays होते हैं। इसी तरह, लार्वा ज़ेबराफ़िश में लोकोमोशन, चौंका देने वाली प्रतिक्रिया और व्यवहार को मापने के लिए प्रोटोकॉल के एक मेजबान का वर्णन किया गया है। ये प्रोटोकॉल प्रकाश और अंधेरे वातावरण, शिकारी चोरी और गतिविधि 19,20,21 में प्रयोगात्मक समूहों के बीच व्यवहारिक मतभेदों को प्रकट करने के लिए कुशल हैं। यहां, हम वयस्क ज़ेब्राफ़िश में रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद कार्यात्मक वसूली को मापने के लिए मात्रात्मक, पुन: प्रस्तुत करने योग्य तरीकों का वर्णन करते हैं।

ध्यान दें कि यह अध्ययन कई सीमाओं को प्रस्तुत करता है। सबसे पहले, व्यवहारिक अध्ययन आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारकों पर अत्यधिक निर्भर हैं। आनुवांशिक परिवर्तनशीलता को नियंत्रित करने के लिए, हमने उम्र, लिंग और प्रयोगात्मक समूहों में आनुवंशिक पृष्ठभूमि के लिए नियंत्रण करने के लिए भाई-बहनों का उपयोग किया22,23। पर्यावरणीय कारकों को नियंत्रित करने के लिए, हमने यह सुनिश्चित किया कि प्रयोग दिन के एक ही समय में किए जाते हैं, नियंत्रित तापमान और प्रकाश की स्थिति में। दूसरा, जबकि तैरना व्यवहार परख पक्षपाती विश्लेषण के लिए कम संवेदनशील है, तैराकी धीरज परख चलाने वाले शोधकर्ता निर्धारित करता है कि जब एक मछली थकावट तक पहुंचती है और मछली कोहोर्ट के बाकी हिस्सों को बाधित किए बिना तैरने वाली सुरंग कक्ष से थकी हुई मछली को हटाने के लिए आगे बढ़ती है। इस प्रकार, हमारे तैरने धीरज प्रयोगों को एक एकल शोधकर्ता द्वारा किया गया था जो प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए अंधा हो गया है। समय के साथ प्रयोगात्मक समूहों के अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए शोधकर्ता-से-शोधकर्ता परिवर्तनशीलता से बचना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। अंत में, मछली के बीच टकराव तैरने के व्यवहार assays में ट्रैकिंग विश्लेषण को जटिल कर सकते हैं। इस प्रकार हम मछली के बीच टकराव की संभावना को कम करने के लिए पांच या उससे कम मछली के समूहों के लिए तैरने के व्यवहार का प्रदर्शन करने की सलाह देते हैं।

महत्वपूर्ण चरणों को ध्यान में रखते हुए, हम ध्यान देते हैं कि घायल मछली विशेष रूप से चोट के बाद शुरुआती दिनों में नाजुक हो सकती है। इस प्रकार हम अत्यधिक देखभाल के साथ मछली को संभालने की सलाह देते हैं। तैरने धीरज assays के लिए, पीवीसी ट्यूब के साथ मछली इकट्ठा जितनी जल्दी हो सके, या तो सिर या पूंछ पहले, संग्रह प्रक्रिया के दौरान माध्यमिक चोटों की संभावना को कम कर देता है। तैरने के व्यवहार के लिए, फ्लश पंप कभी-कभी तरंगें बना सकता है, फिल्मों को विकृत कर सकता है और विश्लेषण त्रुटियों का कारण बन सकता है। इस मामले में, फ्लश पंप को संक्षेप में बंद किया जा सकता है। हालांकि, हम यह सुनिश्चित करने के लिए विस्तारित समय के लिए फ्लश पंप को बंद करने की सलाह नहीं देते हैं कि पानी तैरने की सुरंग कक्ष और बफर टैंक के बीच लगातार घूम रहा है। फिल्म रिकॉर्डिंग की निगरानी तत्काल समाप्ति और फिल्म के पुनरारंभ के लिए अनुमति देता है यदि एक फ्रेम गिरा दिया गया है या एक मछली रिकॉर्डिंग क्षेत्र से strays. अतिरिक्त विचारों में, ट्रैकिंग विश्लेषण करते समय, यदि आर कोड फ़ाइल प्रोसेसिंग के दौरान कोई त्रुटि देता है, तो सबसे अधिक संभावित समस्या फ़ाइलों के नामकरण में होती है। कार्यक्रम को एक बहुत ही विशिष्ट नामकरण रणनीति के तहत कार्य करने के लिए बनाया गया है: Timepoint_Group_Subgroup_Stock number_Anything और (उदाहरण के लिए, 0_A_1_00001_WildtypeGroupA.avi)। यह नामकरण एकाधिक समय बिंदुओं, समूहों और उपसमूहों को प्लॉट करने और एक साथ संरेखित करने की अनुमति देता है। अंत में, जबकि उचित ट्रैकिंग सुनिश्चित करने के लिए विश्लेषण स्क्रिप्ट में चेकपॉइंट्स बनाए गए हैं, विश्लेषण आउटपुट की सावधानीपूर्वक जांच करना महत्वपूर्ण है। कार्यक्रम स्वचालित रूप से पूछेगा कि मछली की संख्या सही है या नहीं, और मछली की संख्या गलत होने पर पुन: विश्लेषण के लिए फिल्मों को संकेत देगा। सीधी रेखा की कलाकृतियां औसत वाई स्थिति प्लॉट में दिखाई दे सकती हैं, यह दर्शाती हैं कि एक अतिरिक्त वस्तु को मछली के रूप में पहचाना गया है। इस उदाहरण में, कार्रवाई का सबसे अच्छा कोर्स अतिरिक्त कलाकृतियों को बाहर करने के लिए फिल्म को ध्यान से देखना है जो उच्च प्रवाह की गति से दिखाई देते हैं।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम जानवरों की देखभाल के लिए वाशिंगटन विश्वविद्यालय Zebrafish साझा संसाधन धन्यवाद. इस शोध को एनआईएच (R01 NS113915 से M.H.M. तक) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AutoSwim software Loligo Systems MI10000 Optional - for Automatic control of current velocity
Customized lid Loligo Systems MI10001 This customized lid is used for swim endurance
DAQ-BT Loligo Systems SW10600 Optional - for Automatic control of current velocity
Eheim pump Loligo Systems PU10160 20 L/min. This pump is placed in theflow-through tank.
Fiji Fiji Freely available through Image J (Fiji) Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior
Flowtherm Loligo Systems AC10000 Handheld digital flow meter - for calibration
High Speed Camera Loligo Systems VE10380 USB 3.0 color video camera (4MP)
IR light panel Loligo Systems VE10775 450 x 210 mm, placed under the swim tunnel  chamber
Monofocal lens Loligo Systems VE10388 25mm manual lens
PVC Tubing VWR 60985-534 5/16 x 7/16"  Wall thickness: 1/16"
R Studio R Studio Freely available. Version 3.6 with extra packages. Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior
Swim tunnel respirometer Loligo Systems SW10060 5L (120V/60Hz). The system includes the swim chamber, motor, manual control of water current velocity, 1 pump placed inside the chamber, standard swim tunnel lid for swim behavior, and modified swim tunnel lid for calibration
uEye Cockpit IDS Freely available software to control camera parameters Alternative cameras and accompanying softwares could be used
Vane wheel flow probe Loligo Systems AC10002 Digital flow probe - for calibration

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 177
वयस्क Zebrafish में तैरना धीरज और तैरना व्यवहार का आकलन
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Burris, B., Jensen, N., Mokalled, M. H. Assessment of Swim Endurance and Swim Behavior in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (177), e63240, doi:10.3791/63240 (2021).

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