Summary
脊髄損傷後の機能回復が可能な成体ゼブラフィッシュは、神経再生の先天的なメカニズムを解明するための最高のモデルシステムです。ここでは、脊髄再生の機能的読み出しとしての水泳持久力および水泳行動アッセイについて説明する。
Abstract
彼らの有名な再生能力のために、成体のゼブラフィッシュは先天的な脊髄再生のメカニズムを調査するための最高の脊椎動物モデルです。脊髄の完全な切断に続いて、ゼブラフィッシュは切断された組織を横切ってグリアおよび軸索ブリッジを延長し、病変の近位にあるニューロンを再生し、損傷から8週間以内に泳ぐ能力を取り戻す。したがって、水泳機能の回復は、機能的な脊髄修復のための中心的な読み出しである。ここでは、密閉された水泳トンネル内のゼブラフィッシュモーター容量を定量化するための一連の行動アッセイについて説明します。これらの方法の目的は、成体ゼブラフィッシュの水泳持久力および水泳行動の定量化可能な測定値を提供することである。水泳持久力のために、ゼブラフィッシュは枯渇するまで絶えず増加する水流速度にさらされ、そして枯渇時の時間が報告される。水泳行動評価のために、ゼブラフィッシュは低電流速度にさらされ、水泳ビデオは魚の背側ビューでキャプチャされます。活動率、バースト頻度、および水流に対して費やされた時間は、水泳行動の定量化可能な読み出しを提供します。野生型ゼブラフィッシュの遊泳持久力と泳ぎ行動を、傷害前および脊髄切除後に定量化した。ゼブラフィッシュは脊髄切除後に泳ぎ機能を失い、損傷後2〜6週間で徐々にその能力を取り戻すことがわかりました。この研究で説明した方法は、成体ゼブラフィッシュの神経行動学的、筋骨格的、骨格筋再生、および神経再生研究に適用することができる。
Introduction
成体のゼブラフィッシュは、神経筋および筋骨格系の発達および疾患モデリングのメカニズムを調査するために顕著に使用されている1,2,3。ゼブラフィッシュは、脳、脊髄、骨格筋を含む複数の組織の効率的で自発的な修復が可能です4,5,6,7。神経筋組織を再生し、疾患をモデル化する驚くべき能力は、成長する科学コミュニティを成体のゼブラフィッシュ研究に引き付けています1,2,3。しかし、幼虫のゼブラフィッシュには移動行動と泳ぎ行動のアッセイが利用可能で標準化されていますが、成魚では同様のプロトコルを開発する必要性が高まっています8,9,10,11。この研究の目的は、成体のゼブラフィッシュの水泳持久力と水泳行動を定量化するためのプロトコルを記述することです。我々は、脊髄再生研究の文脈でこれらのプロトコルを提示する。しかし、ここで説明する行動プロトコルは、神経および筋肉の再生、神経筋および筋骨格の発達、ならびに神経筋および筋骨格疾患のモデリングの研究にも同様に適用可能である。
ゼブラフィッシュは、完全な脊髄切断の8週間以内に逆麻痺する。再生不良の哺乳類とは異なり、ゼブラフィッシュは機能的な脊髄修復に必要な再生促進免疫、ニューロン、グリア損傷応答を示す12,13,14。機能的な脊髄修復の究極の読み出しは、損傷後に病変組織がその機能を回復する能力である。げっ歯類の機能再生を評価するための一連の標準化された方法には、自発運動、運動、感覚、および感覚運動試験が含まれる15,16,17。マウス脊髄損傷において広く用いられている試験には、自発運動バッソマウススケール(BMS)、前肢運動試験、触覚官能試験、および格子歩行感覚運動試験が含まれる15,17。哺乳類または幼虫のゼブラフィッシュ系とは対照的に、成体のゼブラフィッシュの行動テストはあまり発達していませんが、組織再生および疾患モデリングコミュニティの増大するニーズに対応するために大いに必要とされています。
完全な脊髄切除は、損傷部位への尾部の完全な麻痺をもたらす。怪我の直後に、麻痺した動物はあまり活発ではなく、できるだけ泳ぐのを避けます。失われた泳ぎ能力を補うために、麻痺した動物は、病変に吻側にある胸びれを過剰に使用することによって、短くて頻繁なバーストを示す。この代償的な水泳戦略は、急速な疲労と低い水泳能力をもたらします。ゼブラフィッシュ脊髄が再生するにつれて、動物は病変の尾部の滑らかな振動泳ぎ機能を取り戻し、水泳持久力の増加と水泳行動パラメータの改善を可能にします。ここでは、水流速度の上昇時のゼブラフィッシュの泳ぎ持久力と低電流速度での泳ぎ行動を定量化する方法について説明する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ekkwill株およびAB株の成体ゼブラフィッシュは、ワシントン大学ゼブラフィッシュコア施設で維持された。全ての動物実験は、IACUC機関動物プロトコールに準拠して実施した。
メモ: 実験セットアップの例を 図 1A に示します。較正蓋(カスタマイズ)、水泳耐久蓋(カスタマイズ)、および水泳挙動蓋(標準、密閉トンネル蓋)を 図1Bに示す。実験ワークフローを 図 2 に示します。
1. スイムトンネルの準備と校正
- スイムトンネルと周囲のバッファータンクにゼブラフィッシュ系水(ろ過水10 L、アルカリ度:50-150 mg/L CaCO3、pH:6.8-7.5、温度:26-28.5 °C、硝酸<50 mg/L、亜硝酸塩<0.1 mg/L、塩分濃度<0.5-1 g/L)を満たします。
- 追加のフロースルータンクにゼブラフィッシュシステム水(≈7.5 L)を充填します。スイムトンネルとフロースルータンクを配置して、バッファタンクの側面に固定された流出チューブを介してバッファタンクからフロースルータンクに過剰なゼブラフィッシュシステム水が流れるようにします。
- トンネルとバッファタンクがいっぱいになったら、次の手順を実行します。
- フラッシュポンプをバッファタンク内に置き、PVCチューブで隣接するスイムトンネルに接続します。フロースルーポンプをフロースルータンク内に置き、バッファタンクの壁に接続します。
- バッファータンク内にあるフラッシュポンプとフロースルータンクにあるフロースルーポンプの電源を入れて、水の循環を開始します。
注:デュアルポンプシステムは、スイムトンネル(フラッシュポンプから)とバッファタンク(フロースルーポンプから)への継続的な水流を保証します。 - 水流速度を10cm/sから100cm/sに徐々に上げて、泳ぎトンネル内に閉じ込められた気泡を取り除きます。速度を 10 cm/s 間隔で 0 cm/s に戻します。流速を制御するには、流速制御ソフトウェアの 「速度」 セクションの上下矢印をクリックします( 材料表を参照)。
メモ: モーターとローターは、付属のコンピュータに接続されています。流速制御ソフトウェアは、モータと通信して所望の流速を作成します。流速制御ソフトウェアの使用はオプションです。代替案は、水流モーターを手動で制御することです。
- キャリブレーション
注:各実験の前にキャリブレーションが必要です。- キャリブレーション蓋を使用して、スイムトンネルを閉じます。
メモ:校正蓋は、校正に使用される流量計プローブに適合する強化された中央開口部でカスタマイズされています(図1B)。8つのウィングナットを使用して、すべての蓋をトンネルに固定します。 - デジタル流量計の電源を入れ、流量計プローブに接続します。流量計プローブは、校正蓋 を介して スイムトンネル内に配置します。流量計プローブのブレードを流れの方向に対して垂直に配置します。
- デジタル流量計を使用して、スイムトンネルモーター(流速制御ソフトウェアで制御)の出力を校正します。これを行うには、次の手順を実行します。
- 流速制御ソフトウェアを開き、[ キャリブレーション]をクリックします。
- 左上のオプションを RPM対電圧に変更します。流速制御ソフトウェアの [ 速度] セクションに 値を入力して、流速を 0 cm/s から 100 cm/s に 5 cm/s 刻みで上げます。各ステップで、「+」ボタンをクリックして、デジタル流量計によって示される現在の速度を記録します。
メモ: 結果として得られる線形関係の R2 値は 1 に近いはずです。 - キャリブレーションを確認するには、流速制御ソフトウェアのUwater [cm/s]セクションの上下矢印を使用して、水流速度を0から10、25、50、75、および100 cm/sに増やし、速度を75、50、25、10 cm/s に下げます。各速度(ソフトウェアから)で、デジタル流量計によって示される対応する速度を測定して記録します。
- 測定された水流速度が±2 cm/sの偏差内にある場合は、トンネルを校正して正確と考えてください。偏差が ±2 cm/s を超える場合は、手順 1.4.4 ~ 1.4.6 を繰り返して、適切なキャリブレーションを確認します。
- キャリブレーション蓋を使用して、スイムトンネルを閉じます。
2. 水泳持久力の評価
注:実験群は、水泳持久力のために10匹以下の動物からなる群に分かれています。
- 流速制御ソフトウェアを設定します。
メモ: このセクションの流速制御ソフトウェアの使用はオプションです。代替案は、水流モーターを手動で制御することです。手動水流制御の場合は、手順 2.3 に進み、手順 2.5 と 2.6 で指定した増分で水流速度を手動で上げます。- 流速制御ソフトウェアを開きます。[ 実験] というラベルの付いたボックスをクリックします。Uswim と Uwater の チェックを外し ます。
- 左下の Uwater [cm/s] ボックスで流速を変更して、水流速度を調整します。
- 自動プロトコルを開始するには、[ ログの開始] ボックスをクリックします。開いたダイアログウィンドウで、ドロップダウンリストから 「自動」 を選択します。
- 以前に保存したプロトコルファイルを選択するには、[ プロトコルファイル]の横にあるファイル アイコンをクリックして、目的のプロトコルを開きます。
- ログファイルの横にあるファイルアイコンをクリックして、出力 ファイルを設定します。開いたファイルエクスプローラウィンドウで、出力ファイルに名前を付け、目的の場所に保存します。
- スプリットラップタイマーウィンドウを設定します。コンピュータ画面上の流速制御ソフトウェアとタイマーウィンドウに同時にアクセスできるようにしてください。
- 水泳トンネルから取り除かれた後、疲れ果てた魚を収容するために魚の収集タンクを設置します。収集タンクにゼブラフィッシュシステムの水(0.75 L)を満たします。長いPVCチューブにゼブラフィッシュシステムの水を入れます。
- 予め充填されたPVCチューブの一端(端1)を収集タンクに入れ、他端(端2)をバッファタンクに入れます。水がバッファタンクから収集タンクに自由に流れることができることを確認してください。
- PVCチューブの上端(端2)をバインダークリップでクランプして、水の流れを防ぎます。バインダークリップを使用して、必要に応じて水の流出を制御します。
- 水泳耐久性の蓋を使用して水泳トンネルを閉じます。
注:スイム耐久リッドはスイムトンネルウィンドウでカスタマイズされており、残りのアッセイを中断することなく、スイムトンネルから疲れた魚を取り除きます(図1B)。 - 水泳トンネル内に魚の1つのグループを置きます。流速制御ソフトウェアのUwater [cm/s]セクションにこれらの値を入力して、電流速度を5分間0cm/s、5分間9cm/ s、10cm/s に調整しながら、スプリットラップタイマーを起動します。
注:このステップは、動物を水泳トンネルと流れの方向に順応させます。 - 魚の順応に続いて、毎分2cm/sの水流速度を増加させる自動流速制御プログラムを起動します。
注:魚は疲れるまで泳ぎます。疲れ果てた魚は、泳ぎトンネルの後端に向かって押し出されます。 - 魚が使い果たされたら、魚の収集チューブのクランプを外し、水泳トンネルの窓を開けて、魚を収集タンクに集めます。スプリットラップタイマーを使用して疲労時のタイムを記録します。
注:魚は時々疲れずに水泳トンネルの後端に漂流することができます。魚が疲れ果てていることを確認するには、トンネルの後端をそっとタップするか、その領域に影を作成して魚が泳ぐように刺激します。疲れ果てた魚は驚愕の刺激に反応せず、トンネルの後端に平らに横たわっています。 - すべての魚が使い果たされ、収集タンクに集められるまで、手順2.7を繰り返します。流速制御ソフトウェアの 非常停止 ボタンをクリックし、タイマーを停止します。
注:水泳トンネルチャンバーから取り除かれた魚の数が記録された時間と一致するかどうか、水泳を通して再確認してください。 - 魚のグループごとに手順2.5〜2.8を繰り返します。
注:プロトコルはここで一時停止することができますが、怪我後の時点を正確に把握するために、映画と持久力水泳は同じ日に行うことをお勧めします。トンネルは、実験が一時停止されている間も循環し続けることができます。
3. 水泳行動アッセイのためのビデオのキャプチャ
注: 一度に追跡できる動物は 5 匹までです。実験グループが5匹より大きい場合、最初のビデオが5匹以下の動物を追跡し、2番目のビデオが他の5匹以下の動物を追跡するグループごとに複数のビデオを撮影することができます。個々の動物を経時的に追跡することを目的とした縦断的研究の場合、魚を個々に飼育し、複数の時点にわたって追跡することができる。追跡と分析のためのすべてのスクリプトは、GitHub 経由で 入手できます ( 資料表を参照)。
- スイムトンネルの下にある赤外線ライトパネルをオンにします。スイムトンネルの上部にある天井のマウントにカメラを固定します。フォーカスリングと絞りリングを調整します。
メモ:フォーカスと絞りの設定は、カメラとスイムトンネル間の距離、および光環境によって異なります。 - カメラ録画ソフトウェアを開きます( 材料表を参照)。ソフトウェアの設定を次のように設定します。
- 1:4 アスペクト表示をクリックします。視野が水泳トンネル全体を覆っていることを確認してください。自動コントラストと自動ホワイトバランスをオフにして、グループ間で背景とコントラストを正規化します。
- レンチアイコンをクリックして [カメラのプロパティ ]ウィンドウを開きます。 ピクセルクロック:344 MHz、 フレームレート:70 fps、 ホールド の横にあるボックスをクリックして確認します、 露出時間:0.290ミリ秒。このウィンドウを閉じないでください。
- 録画ウィンドウをトリミングして、必要に応じてカメラを傾けたり回したりして、トンネルの水泳室だけをカバーします。
- フィルムリールアイコンをクリックして、 録画ウィンドウ を開きます。録画設定を次のように設定します。
- フレームの最大数のチェックボックスをオンにします。
- フレーム数として 63,000 を手動で入力します。
- 「計算フレームレート」のチェックボックスをオンにします。これにより、プログラムはステップ 3.2.2 (70 fps) で定義されたフレームレートをプルできます。
- JPEG 品質を 30 に変更します。
- テストの実行を記録します。
- [ 作成 ]をクリックし、新しいファイルに Test という名前を付けてデスクトップに保存します。
- 記録ウィンドウに戻り、[ 記録] をクリックします。テストムービーをプロトコルの全期間(15分)実行させます。
- テストが終了したら、ドロップされたフレームがなく、63,000 フレームが記録されていることを確認します。
- 魚のグループを水泳トンネルに入れ、標準的な完全に密閉された蓋を使用してトンネルを閉じます(図1B)。
メモ:蓋を完全に締める前に、すべての魚がトンネル内にいることを確認してください。蓋の下に気泡がないことを確認します。それ以外の場合、これは結果に影響します。 - 新しい記録ウィンドウを開き、ファイルに名前を付けます。例: 2_A_1_00001_WildtypeGroupA.avi
メモ: 設定が手順 3.2 および 3.3 のパラメータに従っていることを確認します。 JPEG品質 は常にデフォルトに戻り、新しいムービーごとにリセットする必要があります。
警告: まだ [記録] をクリックしないでください。 - 流速制御ソフトウェアを使用して新しい実験を開始します。
メモ: 自動プロトコルを開始するには、[ ログ記録の開始] ボックスをクリックします。開いたダイアログウィンドウで、ドロップダウンリストから 「自動」 を選択します。以前に保存したプロトコルファイルを選択するには、[ プロトコルファイル]の横にあるファイル アイコンをクリックして、目的のプロトコルを開きます。- 手動プロトコルを開始するには、流速制御ソフトウェアのUwater [cm/s]ボックスを使用して、流速を5分間0cm/s、5分間10cm/s、続いて5分間 20cm/s に設定します。
- 新しいデータ出力ファイル(.csvファイルとして保存されます)をムービーファイルと同じ名前で同じフォルダに保存します。
警告: まだ開始をクリックしないでください。
- ペーパータオルまたは布片を水泳トンネルの側面に置き、すべての行動が魚の泳ぎによるものであり、環境内の動きによって引き起こされる驚愕反応によるものではないことを確認します。
- 素早く連続して、水が穏やかで、フレームを横切って波紋が動いていないことを確認してください。カメラソフトウェアウィンドウで[録画]をクリックして、ムービーファイルの 録画 を開始します。流速制御ソフトウェアで [ 開始 ] をクリックしてプロトコルを開始します。プロトコルは中断されずに続行されます。
- 映画を見て、フレームがドロップされていないこと、視野に泡がないこと、およびすべての魚が記録されていることを確認してください。
- 動画撮影が完了したら、[緊急停止]をクリックして流速制御プロトコルを終了します。自動的に保存されるデータ出力ファイルを確認します。録画ウィンドウの[閉じる]をクリックして、ムービーファイルを保存します。
- 蓋を外します。慎重に魚を回収し、彼らのタンクに戻します。
- すべての魚のグループについて、手順3.5~3.12を繰り返します。
- すべてのグループの動画録画が完了したら、 MovieProcessing_v5.bat スクリプトを使用して映画を70 fpsビデオから20 fpsビデオに変換します。これを行うには、スクリプトファイルを生のビデオを含むフォルダに移動します。ファイルを右クリックし、[ 実行] を選択します。
メモ: スクリプトは自動的に実行されます。スクリプトの進行状況を示すコマンドプロンプトウィンドウが表示されます。上記の手順はオプションです。15 分間のビデオのフレーム数を 63,000 フレームから 18,000 フレームに減らし、SwimBehavior_v7にします。R スクリプトはより迅速に実行されます。 - トンネルを空にし、すべての機器を片付けます。
4. 水泳行動評価のための動画分析
注:ムービーの録画と分析は、別々の日に完了できます。
- フィジーで Tracking_v2.ijm スクリプトを開き、[実行] をクリックしてプログラムを開始します。ポップアップするウィンドウで、追跡するスイムビヘイビアムービーを含むフォルダを選択し、[開く]をクリックします。最初のムービーのフレーム 1、ダイアログ ボックス、および表示される関心領域 (ROI) マネージャーを探します。
- ダイアログボックスの指示に従います。スイムトンネルチャンバーの底部のROIを作成し、[OK]をクリックします。黒い角が見えないことを確認します。
メモ: しきい値ウィンドウが開き、編集され、しきい値が設定されたフレーム 1 が表示されます。 - 配色を B&W から Red に変更 します。フレーム1が魚を赤で表示し、それ以外は何も表示しなくなるまで 、最大値 を調整します。しきい値を記録します。ダイアログボックスで「OK」 をクリックします。
メモ: プログラムは自動的に実行されます。フレーム 1 に対して作成された ROI は、後続のフレームに対して継続的に選択され、選択解除されます。プログレスバーは、 フィジー ウィンドウの右下隅にあるプロセスを監視します。トラッキングには映画ごとに約40分かかります。すべての映画が追跡されると、 フィジー プログラムは停止します。ROI の選択は停止します。ムービーを含むフォルダに、各ムービーの _raw.csv ファイルが含まれるようになりました。フィジーはこの時点で閉鎖することができます。 - 記述統計量の整列、アセンブル、および取得
- スイムBehavior_v7を開きます。 R Studio の R スクリプト。
- スクリプトセクションの右上隅にある[ソース]をクリックします。開いた新しいウィンドウで、Fijiによって生成された_raw.csvファイルを含むフォルダを選択します。「開く」をクリックします。
メモ:プログラムは自動的に実行されます。 - 各ムービーの魚の数を確認するポップアップダイアログボックスで、指定された数字が正しい場合は「 はい 」をクリックし、数字が正しくない場合は 「いいえ 」をクリックします。
注: [いいえ ]をクリックすると、ムービーを新しいROIとしきい値で再追跡するように求めるメッセージがポップアップ表示されます。[ はい ]をクリックすると、プログラムが続行されます。 - 泳いでいない魚を削除するかどうかを尋ねる新しいウィンドウで、[はい]または[いいえ]をクリックします。
注:非水泳魚は、10 cm / sで50%未満の活動を持つ魚と定義されます。泳いでいない魚を取り除くことはお勧めできません。 - 新しいポップアップ・ウィンドウで、グループが非盲検化されているかどうか、およびユーザーがグループを結合するか、非盲検にするか、複数のコントロール・グループがある場合はグループを結合するかを尋ねます。
- 前の質問に対する応答が出たら、プログラムが「ファイル X を Y に整列しています」というメッセージ (X は位置合わせ中の現行ファイル、Y は位置合わせするファイルの合計数) を出します。各ファイルが整列されるまでに約 30 秒かかります。
- ファイルが整列したら、同じ名前(.csv)で生成された新しい_aligned.csvファイルを確認します。プログラムがデータを結合し、統計を実行し、出力グラフをプロットしていることを確認します。_raw.csvファイルと_aligned.csvファイルを含む親フォルダ内の [結果] というラベルの付いた新しいフォルダに生成された解析ファイルを確認します。
- [結果] フォルダー内で、[診断] と [グラフ] という名前の 2 つのフォルダーと、.csv、BulkData_Avg、BulkData_Full、および SummaryData_Avg という名前の 4 つのSummaryData_Fullファイルを確認します。
注: SummaryData_Full.csv には、各時点における各グループの各魚の個別のデータが含まれています。このデータは自動的にプロットされますが、他の場所で抽出してプロットすることもできます。- Graphs フォルダーに、プログラムによって生成されたグラフと、各グラフのデータ ポイントを含む.csv ファイルが含まれていることを確認します。
- Diagnostics フォルダーに、整列されたファイルの診断データを含む 1 つの.csvファイルが含まれていることを確認します。
メモ: Diagnostics.csv ファイルの列には、次のものが含まれます: a) 余分なオブジェクトを含むフレームの数 (100 未満にする必要があります)。余分なオブジェクトを含むフレームが多すぎると、トラッキングに問題がある可能性があります。b)オブジェクトが欠落またはマージされたフレームの数。このメトリックが高いのは正常です。うまく再生していない魚は、頻繁にトンネルの後ろに掃引され、行方不明としてカウントされます。c) 240 ピクセルを超えるジャンプを持つフレーム。この数は、1 つのムービー内のオブジェクト(魚)の数とともに増加します。動作メトリックの計算方法の詳細については、 補足ファイル 1 を参照してください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
このプロトコルのセクション 1 で説明されているように、水泳トンネルをセットアップしました (図 1)。我々は、ベースライン時および脊髄損傷後の成体ゼブラフィッシュの水泳持久力(このプロトコルのセクション2)および水泳行動(このプロトコルのセクション3および4)を評価した(図2)。
ベースライン運動機能を確立するために、我々は、増水速度下での野生型ゼブラフィッシュの遊泳耐久性を調べた(図3A)。このアッセイでは、野生型ゼブラフィッシュは疲れ果てる前に41分間泳いだ。次いで、魚を前述のように完全な脊髄切除に供し、水泳持久力アッセイを実施した6。MS-222を用いてゼブラフィッシュを麻酔した後、細かいはさみで小さな切開を行い、尾部4mmの脊髄を脳幹領域にトランセクトする。完全な切片が目視で確認された。脊髄手術後の水泳能力の喪失を確認するために、傷害動物を、損傷後2または3日(dpi)で評価した。この時点で、ゼブラフィッシュは病変部位への尾部を完全に麻痺させている。水泳持久力は、傷害後2、4、および6週間(wpi)で評価された。2 wpiでは、病変した魚は泳ぐ持久力の60%を失った(図3A)。再生した魚は徐々に4と6 wpiで泳ぐ持久力を取り戻しました。これらの結果は、野生型ゼブラフィッシュが脊髄損傷後に水泳持久力を取り戻すことができることを示した。
脊髄再生中のゼブラフィッシュの泳ぎ行動を調べるために、我々は野生型動物の泳ぎ行動を0cm/sの水流速度または10cm/sおよび20cm/sの一定低電流速度下で追跡した(図3B)。スイムトンネルチャンバー内の魚の位置の平均軌跡を、低電流速度でのスイム行動の視覚的評価に使用した(図3B)。このアッセイでは、負傷していないコントロールは、上昇したY位置に対応する水泳トンネルチャンバの前部(水流源に近い)で着実に泳いでいました(図3B)。対照的に、2 wpiでは、負傷した魚は流れに対して安定した泳ぎ能力を維持することができませんでした。その結果、それらのスイムトラックはより不規則になり、Y位置が全体的に減少します(図3B)。Y位置は4および6 wpiで増加し、再生動物が徐々に水泳トンネルチャンバーの前で泳ぐ能力を取り戻したことを示している。水泳行動パラメータを定量化するために、活動率、水泳トンネル内の位置(Y位置)、および電流に対して泳いだ時間を計算しました(図3C-E)。無傷の対照と比較して、2 wpiの病変動物は著しく活動性が低く(図3C)、水泳トンネルの後部象限で失速し(図3D)、低電流速度に対して泳ぐ能力を失った(図3E)。機能回復を達成する生来の能力と一致して、病変動物は4および6 wpiで徐々に泳ぎ行動パラメータを正規化した(図3C-E)。水泳持久力と水泳行動パラメータは、ゼブラフィッシュの水泳機能と機能的な脊髄修復の定量化可能な読み出しを提供しました。
図1:スイムトンネルのセットアップとカスタマイズされた蓋。 (A)スイムトンネル設置の代表的な画像(スイムトンネルチャンバーの上面図と側面図を拡大表示したもの)(B)このプロトコルに記載されている様々な用途に使用される水泳トンネル蓋の画像。標準的な、完全に密閉された水泳トンネル蓋は、水泳行動アッセイに使用されます(このプロトコルのセクション3)。ハンドヘルドデジタル流量計を収容する修正された水泳トンネル蓋が校正に使用されます(このプロトコルのセクション1)。スイムトンネルチャンバーの後端に取り外し可能な蓋を含む修正された水泳耐久性リッドは、スイム耐久試験中に疲労した魚の除去を可能にする(このプロトコルのセクション2)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:成体ゼブラフィッシュの水泳持久力および水泳行動をアッセイするための実験パイプライン。 水泳の持久力のために、魚は枯渇するまで増加する水流に対して泳ぎました。スイム動作の場合、スイムパラメータは、非存在下および低電流速度で評価されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:脊髄損傷後の野生型ゼブラフィッシュの機能回復 (a)運動機能は、ベースラインおよび2、4、および6 wpiにおける野生型ゼブラフィッシュの水泳持久力アッセイによって決定される。ドットは、2つの独立した実験からの個々の動物を示す。(B)泳ぎ行動アッセイは、低水流速度下で野生型ゼブラフィッシュを追跡した。平均Y位置は、追跡中の各時点で表示されます(5分間0cm/s、5分間で10cm/s、5分間で20cm/s)。(C-E)活性パーセント(C)、トンネル内の平均Y位置(D)、および流れに対して泳いだ時間(E)を20cm/sで定量化した。すべての定量について、2つの独立した実験が示されている。傷害前の状態でn=30;n = 23 で 23、4 wpi で n = 20、6 wpi で n = 18。一元配置分散分析は統計分析に使用されました。エラーバーは平均の標準誤差(SEM)を表します。*P < 0.05;**P < 0.01;P < 0.001;P < 0.0001.この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
成体ゼブラフィッシュは、ヒトの疾患をモデル化し、組織再生のメカニズムを研究するための一般的な脊椎動物システムである。CRISPR/Cas9ゲノム編集は、ゼブラフィッシュの疾患をモデル化するための逆遺伝学的研究に革命をもたらしました。しかし、成体ゼブラフィッシュにおける大規模な遺伝学は、成体ゼブラフィッシュ組織がハイスループット表現型に利用できないことを含む、生物学的および技術的課題によって妨げられてきた。成体ゼブラフィッシュの複雑な解剖学的構造を考えると、組織構造を取得して分析するには、長期間の組織学的処理が必要である。本研究で説明した水泳持久力および水泳行動アッセイは、組織学の前に中程度のスループットで神経、筋肉、または骨格表現型を事前にスクリーニングするために使用することができる。さらに、組織再生の研究は機能的な組織修復を改善することを目的としているため、この研究で説明したプロトコルは、必須ではないにしても、神経、筋肉、および骨格再生の研究に広く適用できます。
機能的移動アッセイは、神経の発達と再生の理解に不可欠でした。標準的な自発運動アッセイは、ラット、マウス、および幼虫ゼブラフィッシュを含む脊椎動物種において広く利用可能である。マウスおよびラットモデル系は、それぞれBMS16およびBBB17、18などの行動的および機能的移動アッセイを有する。同様に、ゼブラフィッシュの幼虫における移動、驚愕反応、および行動を測定するために、多数のプロトコルが記載されている。これらのプロトコルは、明暗環境、捕食者の回避、および活動における実験グループ間の行動の違いを明らかにするのに効率的です19,20,21。ここでは、成体ゼブラフィッシュの脊髄損傷後の機能回復を測定するための定量化可能で再現可能な方法について説明する。
この研究にはいくつかの制限があることに注意してください。第一に、行動研究は遺伝的および環境的要因に大きく依存している。遺伝的多様性を制御するために、我々は兄弟姉妹を用いて、実験群全体の年齢、性別、遺伝的背景を制御した22,23。環境要因を制御するために、我々は実験が制御された温度と照明条件下で、一日の同じ時間に行われるようにしました20。第二に、水泳行動アッセイは偏った分析に対してあまり敏感ではありませんが、水泳持久力アッセイを実行する研究者は、魚がいつ枯渇に達し、残りの魚コホートを中断することなく水泳トンネルチャンバーから枯渇した魚を取り除くために進むかを決定します。したがって、私たちの水泳持久力実験は、実験条件に盲目的にされた一人の研究者によって行われました。時間の経過に伴う実験グループの縦断的研究において、研究者間の変動を避けることは特に重要です。最後に、魚同士の衝突は、水泳行動アッセイにおける追跡分析を複雑にする可能性があります。したがって、魚同士の衝突の可能性を最小限に抑えるために、5 匹以下の魚のグループに対して水泳行動アッセイを実行することをお勧めします。
重要なステップを考慮して、我々は、負傷した魚は、特に傷害後の初期の頃には壊れやすい可能性があることに留意する。したがって、魚は細心の注意を払って取り扱うことをお勧めします。水泳持久力アッセイでは、頭部または尾部のいずれかを最初にPVCチューブでできるだけ早く魚を採取すると、収集プロセス中に二次傷害を受ける可能性が低くなります。水泳挙動アッセイの場合、フラッシュポンプは時折波を生成し、ムービーを歪め、分析エラーを引き起こす可能性があります。この場合、フラッシュポンプを一時的にオフにすることができます。ただし、スイムトンネルチャンバーとバッファタンクの間で水が常に循環していることを確認するために、フラッシュポンプを長時間オフにすることはお勧めしません。ムービー録画を監視すると、フレームがドロップされた場合や、記録領域から魚が迷子になった場合に、ムービーを即座に終了して再起動できます。追加の考慮事項として、追跡分析の実行中に R コードでエラーが発生した場合、最も可能性の高い問題はファイルの命名にあります。プログラムは、非常に特殊な命名方針 (Timepoint_Group_Subgroup_Stock number_Anything など) の下で機能するように0_A_1_00001_WildtypeGroupA.aviされます。この名前付けにより、複数のタイムポイント、グループ、およびサブグループをプロットして整列させることができます。最後に、適切な追跡を確実にするためにチェックポイントが分析スクリプトに組み込まれていますが、分析出力を慎重に確認することが重要です。プログラムは自動的に魚の数が正しいかどうかを尋ね、魚の数が正しくない場合は映画に再分析を促します。直線アーチファクトが平均 Y 位置プロットに表示され、余分なオブジェクトが魚として認識されたことを示す場合があります。この場合、最善の行動は、ムービーを注意深く見て、より高い流速で表示される傾向がある余分なアーティファクトを除外することです。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
私たちは、動物の世話のためにワシントン大学ゼブラフィッシュ共有リソースに感謝します。この研究はNIH(R01 NS113915からM.H..M)の支援を受けた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoSwim software | Loligo Systems | MI10000 | Optional - for Automatic control of current velocity |
| Customized lid | Loligo Systems | MI10001 | This customized lid is used for swim endurance |
| DAQ-BT | Loligo Systems | SW10600 | Optional - for Automatic control of current velocity |
| Eheim pump | Loligo Systems | PU10160 | 20 L/min. This pump is placed in theflow-through tank. |
| Fiji | Fiji | Freely available through Image J (Fiji) | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Flowtherm | Loligo Systems | AC10000 | Handheld digital flow meter - for calibration |
| High Speed Camera | Loligo Systems | VE10380 | USB 3.0 color video camera (4MP) |
| IR light panel | Loligo Systems | VE10775 | 450 x 210 mm, placed under the swim tunnel chamber |
| Monofocal lens | Loligo Systems | VE10388 | 25mm manual lens |
| PVC Tubing | VWR | 60985-534 | 5/16 x 7/16" Wall thickness: 1/16" |
| R Studio | R Studio | Freely available. Version 3.6 with extra packages. | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Swim tunnel respirometer | Loligo Systems | SW10060 | 5L (120V/60Hz). The system includes the swim chamber, motor, manual control of water current velocity, 1 pump placed inside the chamber, standard swim tunnel lid for swim behavior, and modified swim tunnel lid for calibration |
| uEye Cockpit | IDS | Freely available software to control camera parameters | Alternative cameras and accompanying softwares could be used |
| Vane wheel flow probe | Loligo Systems | AC10002 | Digital flow probe - for calibration |
References
- Becker, C. G., Becker, T. Neuronal regeneration from ependymo-radial glial cells: cook, little pot, cook. Developmental Cell. 32 (4), 516-527 (2015).
- Mokalled, M. H., Poss, K. D.
- Orger, M. B., de Polavieja, G. G. Zebrafish behavior: opportunities and challenges. Annual Review of Neuroscience. 40, 125-147 (2017).
- Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Mokalled, M. H., et al. Injury-induced ctgfa directs glial bridging and spinal cord regeneration in zebrafish. Science. 354 (6312), 630-634 (2016).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Developmental Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).
- Wolman, M. A., et al. A genome-wide screen identifies PAPP-AA-mediated IGFR signaling as a novel regulator of habituation learning. Neuron. 85 (6), 1200-1211 (2015).
- Granato, M., et al. Genes controlling and mediating locomotion behavior of the zebrafish embryo and larva. Development. 123, 399-413 (1996).
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (23), 10545-10549 (1995).
- Moens, C. B., Yan, Y. L., Appel, B., Force, A. G., Kimmel, C. B. Valentino: a zebrafish gene required for normal hindbrain segmentation. Development. 122 (12), 3981-3990 (1996).
- Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
- Reimer, M. M., et al. Motor neuron regeneration in adult zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (34), 8510-8516 (2008).
- Klatt Shaw, D., et al. Localized EMT reprograms glial progenitors to promote spinal cord repair. Developmental Cell. 56 (5), 613-626 (2021).
- Ahmed, R. U., Alam, M., Zheng, Y. P. Experimental spinal cord injury and behavioral tests in laboratory rats. Heliyon. 5 (3), 01324 (2019).
- Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Fatemi, G., Faden, A. I. A combined scoring method to assess behavioral recovery after mouse spinal cord injury. Neuroscience Research. 67 (2), 117-125 (2010).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Scheff, S. W., Saucier, D. A., Cain, M. E. A statistical method for analyzing rating scale data: the BBB locomotor score. Journal of Neurotrauma. 19 (10), 1251-1260 (2002).
- Li, Q., et al. Differential behavioral responses of zebrafish larvae to yohimbine treatment. Psychopharmacology (Berl). 232 (1), 197-208 (2015).
- Wakamatsu, Y., Ogino, K., Hirata, H. Swimming capability of zebrafish is governed by water temperature, caudal fin length and genetic background. Scientific Reports. 9 (1), 16307 (2019).
- Ahmed, O., Seguin, D., Gerlai, R. An automated predator avoidance task in zebrafish. Behavioral Brain Research. 216 (1), 166-171 (2011).
- Conradsen, C., McGuigan, K. Sexually dimorphic morphology and swimming performance relationships in wild-type zebrafish Danio rerio. Journal of Fish Biology. 87 (5), 1219-1233 (2015).
- Leris, I., Sfakianakis, D. G., Kentouri, M. Are zebrafish Danio rerio males better swimmers than females. Journal of Fish Biology. 83 (5), 1381-1386 (2013).
