Summary
척수 손상 후 기능적 회복이 가능한 성인 제브라피쉬는 신경 재생의 선천적 메커니즘을 밝히는 최고의 모델 시스템입니다. 여기에서는 수영 지구력과 수영 행동 분석을 척수 재생의 기능적 판독으로 설명합니다.
Abstract
그들의 유명한 재생 능력으로 인해, 성인 제브라 피쉬는 선천적 인 척수 재생의 메커니즘을 조사하는 최고의 척추 동물 모델입니다. 척수의 완전한 횡단 후, 제브라 피쉬는 절단 된 조직을 가로 질러 신경교 및 축삭 다리를 확장하고, 병변에 근접한 뉴런을 재생하고, 부상 후 8 주 이내에 수영 능력을 회복시킵니다. 따라서 수영 기능의 회복은 기능적 척수 복구를위한 중앙 판독입니다. 여기에서는 밀폐 된 수영 터널 내부의 제브라 피쉬 모터 용량을 정량화하기위한 일련의 행동 분석을 설명합니다. 이 방법의 목표는 성인 제브라 피쉬에서 수영 지구력과 수영 행동에 대한 정량화 가능한 측정을 제공하는 것입니다. 수영 지구력을 위해, 제브라 피쉬는 고갈 될 때까지 지속적으로 증가하는 물 전류 속도를 겪게되며, 고갈시 시간이보고됩니다. 수영 행동 평가를 위해 제브라 피쉬는 낮은 전류 속도를 받으며 수영 비디오는 물고기의 등쪽 뷰로 캡처됩니다. 퍼센트 활동, 파열 빈도 및 수류에 대해 소요 된 시간은 수영 행동의 정량화 가능한 판독을 제공합니다. 우리는 부상 전과 척수 횡단 후 야생형 제브라 피쉬에서 수영 지구력과 수영 행동을 정량화했습니다. 우리는 제브라 피쉬가 척수 횡단 후 수영 기능을 잃고 부상 후 2 주에서 6 주 사이에 점차적으로 그 능력을 회복한다는 것을 발견했습니다. 이 연구에 설명 된 방법은 성인 제브라 피쉬의 신경 행동, 근골격계, 골격근 재생 및 신경 재생 연구에 적용될 수 있습니다.
Introduction
성인 제브라 피쉬는 신경 근육 및 근골격계 발달 및 질병 모델링의 메커니즘을 조사하는 데 탁월하게 사용됩니다1,2,3. 제브라피쉬는 뇌, 척수 및 골격근을 포함한 여러 조직을 효율적이고 자발적으로 복구할 수 있습니다4,5,6,7. 신경 근육 조직을 재생하고 질병을 모델링 할 수있는 놀라운 능력은 성인 제브라 피쉬 연구에 성장하는 과학 공동체를 끌어 들이고 있습니다1,2,3. 그러나 애벌레 제브라 피쉬에 대한 운동 및 수영 행동에 대한 분석이 가능하고 표준화되었지만 성인 물고기에서 유사한 프로토콜을 개발할 필요성이 커지고 있습니다8,9,10,11. 이 연구의 목표는 성인 제브라 피쉬에서 수영 지구력과 수영 행동을 정량화하는 프로토콜을 설명하는 것입니다. 우리는 척수 재생 연구의 맥락에서 이러한 프로토콜을 제시합니다. 그러나, 여기에 기술된 행동 프로토콜은 신경 및 근육 재생, 신경근 및 근골격계 발달, 뿐만 아니라 신경근 및 근골격계 질환 모델링의 연구에 동일하게 적용가능하다.
Zebrafish는 완전한 척수 횡단 후 8 주 이내에 역마비. 저조한 재생 포유류와는 달리, 제브라피쉬는 기능성 척수 복구에 필요한 재생 면역, 신경 및 신경교 손상 반응을 나타냅니다12,13,14. 기능적 척수 복구의 궁극적 인 판독은 병변 조직이 부상 후 기능을 회복 할 수있는 능력입니다. 설치류의 기능 재생을 평가하기위한 표준화 된 방법 모음에는 운동 모터, 모터, 감각 및 감각 운동 테스트15,16,17이 포함됩니다. 마우스 척수 손상에 널리 사용되는 테스트에는 운동 바소 마우스 스케일 (BMS), 앞다리 운동 테스트, 촉각 감각 테스트 및 그리드 보행 감각 운동 테스트15,17이 포함됩니다. 포유류 또는 유충 제브라 피쉬 시스템과 달리 성인 제브라 피쉬의 행동 테스트는 덜 발달되어 있지만 조직 재생 및 질병 모델링 커뮤니티의 증가하는 요구를 수용하는 데 많이 필요합니다.
완전한 척수 횡단 절제술은 부상 부위에 완전한 마비 인과를 초래합니다. 부상 직후, 마비 된 동물은 덜 활동적이며 가능한 한 수영을 피하십시오. 잃어버린 수영 능력을 보완하기 위해 마비 된 동물은 병변에 rostral에있는 가슴 지느러미를 과도하게 사용하여 짧고 빈번한 파열을 나타냅니다. 이 보상 수영 전략은 빠른 피로와 낮은 수영 능력을 초래합니다. 제브라피쉬 척수가 재생됨에 따라 동물들은 병변에 대한 부드러운 진동 수영 기능을 회복하여 수영 지구력을 높이고 수영 행동 매개 변수를 향상시킵니다. 여기에서는 제브라 피쉬 수영 내구성을 증가시키고 물 전류 속도를 높이고 낮은 전류 속도에서 수영 행동을 정량화하는 방법을 설명합니다.
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Protocol
Ekkwill과 AB 균주의 성인 제브라 피쉬는 워싱턴 대학 제브라피쉬 코어 시설에서 유지되었다. 모든 동물 실험은 IACUC 기관 동물 프로토콜에 따라 수행되었다.
참고: 실험 설정의 예는 그림 1A에 나와 있습니다. 보정 뚜껑(사용자 지정), 수영 지구력 뚜껑(사용자 지정) 및 수영 행동 뚜껑(표준, 밀폐된 터널 뚜껑)은 그림 1B에 나와 있습니다. 실험 워크플로우는 그림 2에 나와 있습니다.
1. 수영 터널 준비 및 교정
- 수영 터널과 주변 완충 탱크에 제브라피쉬 시스템 물 (10 L 여과수, 알칼리도 : 50-150 mg / L CaCO3, pH : 6.8-7.5, 온도 : 26-28.5 °C; 질산염 < 50 mg / L; 아질산염 < 0.1 mg / L, 염도 < 0.5-1 g / L)을 채 웁니다.
- 추가 유동 탱크에 제브라피쉬 시스템 물 (≈7.5 L)을 채 웁니다. 수영 터널과 유동 탱크를 배치하여 과도한 제브라피쉬 시스템 물이 버퍼 탱크에서 버퍼 탱크의 측면에 고정 된 유출 튜브를 통해 유동 탱크로 흐를 수 있도록하십시오.
- 터널과 버퍼 탱크가 채워지면 다음을 수행하십시오.
- 플러시 펌프를 버퍼 탱크 내부에 넣고 PVC 튜브로 인접한 수영 터널에 연결하십시오. 플로우 스루 펌프를 플로우 스루 탱크 내부에 놓고 버퍼 탱크의 벽에 연결하십시오.
- 버퍼 탱크 내부에있는 플러시 펌프와 플로우 스루 탱크에 위치한 플로우 스루 펌프를 켜서 물 순환을 시작하십시오.
참고: 이중 펌프 시스템은 수영 터널(플러시 펌프에서)과 버퍼 탱크(플로우 스루 펌프에서)로 지속적인 물 흐름을 보장합니다. - 수영 터널 내부에 갇힌 기포를 10cm/s의 간격으로 10cm/s에서 100cm/s로 점진적으로 증가시켜 기포를 제거합니다. 속도를 10cm/s 간격으로 다시 0cm/s로 줄입니다. 유속을 제어하려면 유속 제어 소프트웨어의 속도 섹션에서 위쪽 및 아래쪽 화살표를 클릭합니다( 재료 표 참조).
주: 모터와 로터는 함께 제공되는 컴퓨터에 연결되어 있습니다. 유속 제어 소프트웨어는 모터와 통신하여 원하는 유속을 생성합니다. 유속 제어 소프트웨어의 사용은 선택 사항입니다. 대안은 수동으로 물 전류 모터를 제어하는 것입니다.
- 교정
참고: 각 실험 전에 교정이 필요합니다.- 보정 뚜껑을 사용하여 수영 터널을 닫습니다.
주: 교정 뚜껑은 교정에 사용되는 유량계 프로브에 맞는 강화된 중앙 개구부로 사용자 정의됩니다(그림 1B). 여덟 개의 윙넛은 터널에 모든 뚜껑을 고정하는 데 사용됩니다. - 디지털 유량계를 켜고 유량계 프로브에 연결합니다. 유량계 프로브를 교정 뚜껑을 통해 수영 터널 내부에 놓습니다. 유량계 프로브의 블레이드를 흐름 방향에 수직으로 배치합니다.
- 디지털 유량계를 사용하여 수영 터널 모터 (유속 제어 소프트웨어로 제어)의 출력을 보정하십시오. 이렇게 하려면 다음 단계를 수행하십시오.
- 유속 제어 소프트웨어를 열고 보정을 클릭합니다.
- 왼쪽 상단의 옵션을 RPM 대 전압으로 변경하십시오. 유속 제어 소프트웨어의 속도 섹션에 값을 입력하여 5cm/s 단위로 0cm/s에서 100cm/s로 유속을 늘립니다. 각 단계에서 "+"버튼을 클릭하고 디지털 유량계로 표시된 현재 속도를 기록하십시오.
참고: 결과 선형 관계는 R2 값이 1에 가까워야 합니다. - 보정을 확인하려면 유속 제어 소프트웨어의 Uwater[cm/s] 섹션에 있는 위쪽 및 아래쪽 화살표를 사용하여 물 전류 속도를 0, 10, 25, 50, 75 및 100cm/s로 늘린 다음 속도를 75, 50, 25, 10cm/s 로 줄입니다. 각 속도(소프트웨어에서)에서 디지털 유량계로 표시된 해당 속도를 측정하고 기록합니다.
- 측정된 물 전류 속도가 ±2cm/s의 편차 내에 있는 경우 터널을 보정하고 정확하게 고려하십시오. 편차가 ±2cm/s를 초과하면 1.4.4~1.4.6단계를 반복하여 적절한 보정을 보장합니다.
- 보정 뚜껑을 사용하여 수영 터널을 닫습니다.
2. 수영 지구력 평가
참고 : 실험 그룹은 수영 지구력을 위해 10 명 이하의 동물 그룹으로 나뉩니다.
- 유속 제어 소프트웨어를 설정합니다.
참고: 이 섹션의 유속 제어 소프트웨어 사용은 선택 사항입니다. 대안은 수동으로 물 전류 모터를 제어하는 것입니다. 수동 물 전류 제어의 경우 2.3단계로 진행하고 2.5단계와 2.6단계에서 지정된 단위로 물 전류 속도를 수동으로 증가시킵니다.- 유속 제어 소프트웨어를 엽니다. 실험이라고 표시된 상자를 클릭합니다. Uswim과 Uwater의 선택을 취소 하십시오.
- 물 전류 속도를 조정하기 위해 왼쪽 하단의 Uwater [cm/s] 상자에서 유속을 변경합니다.
- 자동화된 프로토콜을 시작하려면 로깅 시작 상자를 클릭합니다. 대화 상자 창이 열리면 드롭다운 목록에서 자동화 를 선택합니다.
- 이전에 저장한 프로토콜 파일을 선택하려면 프로토콜 파일 옆에 있는 파일 아이콘을 클릭하여 원하는 프로토콜을 엽니다.
- 로그 파일 옆에 있는 파일 아이콘을 클릭하여 출력 파일을 설정합니다. 파일 탐색기 창이 열리면 출력 파일의 이름을 지정하고 원하는 위치에 저장합니다.
- 분할 랩 타이머 창을 설정합니다. 컴퓨터 화면의 유속 제어 소프트웨어 및 타이머 창에 동시에 액세스할 수 있어야 합니다.
- 수영 터널에서 제거 된 후 지친 물고기를 수용하기 위해 물고기 수집 탱크를 설치하십시오. 수집 탱크에 제브라 피쉬 시스템 물 (0.75 L)을 채 웁니다. 긴 PVC 튜브를 제브라 피쉬 시스템 물로 채 웁니다.
- 미리 채워진 PVC 튜브의 한쪽 끝 (끝 1)을 수집 탱크에 놓고 다른 쪽 끝 (끝 2)을 버퍼 탱크에 놓습니다. 물이 버퍼 탱크에서 수집 탱크로 자유롭게 흐를 수 있는지 확인하십시오.
- PVC 튜브의 상단부(끝 2)를 바인더 클립으로 클램프하여 물의 흐름을 방지합니다. 필요에 따라 바인더 클립을 사용하여 물의 유출을 제어하십시오.
- 수영 지구력 뚜껑을 사용하여 수영 터널을 닫습니다.
참고: 수영 지구력 뚜껑은 수영 터널 창으로 사용자 정의되어 나머지 분석을 방해하지 않고 수영 터널에서 지친 물고기를 제거합니다(그림 1B). - 수영 터널 안에 물고기 한 그룹을 배치하십시오. 유속 제어 소프트웨어의 Uwater [cm/s] 섹션에 이러한 값을 입력하여 현재 속도를 5분 동안 0cm/s, 5분 동안 9cm/s, 5분 동안 10cm/s 로 조정하면서 분할 랩 타이머를 시작합니다.
참고 :이 단계는 동물을 수영 터널과 흐름 방향에 적응시킵니다. - 물고기의 순응에 따라, 매 분마다 물 전류 속도를 2cm / s만큼 증가시키는 자동화 된 유속 제어 프로그램을 시작하십시오.
참고 : 물고기는 고갈 될 때까지 수영합니다. 지친 물고기는 수영 터널의 뒤쪽 끝으로 밀려납니다. - 물고기가 고갈되면 물고기 수집 튜브의 클램프를 풀고 수영 터널 창을 열고 수집 탱크에서 물고기를 수집하십시오. 스플릿 랩 타이머를 사용하여 고갈 시간을 기록하십시오.
참고 : 물고기는 때때로 지치지 않고 수영 터널의 뒤쪽 끝으로 표류 할 수 있습니다. 물고기가 고갈되도록하려면 터널의 뒤쪽 끝을 부드럽게 두드리거나 그 지역 위에 그림자를 만들어 물고기가 수영하도록 자극하십시오. 지친 물고기는 깜짝 놀랄만한 자극에 반응하지 않고 터널의 뒤쪽 끝에 평평하게 누워 있습니다. - 모든 물고기가 소진되어 수집 탱크에 수집 될 때까지 2.7 단계를 반복하십시오. 유속 제어 소프트웨어에서 비상 정지 버튼을 클릭하고 타이머를 중지하십시오.
참고 : 수영 터널 챔버에서 제거 된 물고기의 수가 기록 된 시간과 일치하는지 수영 전반에 걸쳐 다시 확인하십시오. - 각 물고기 그룹에 대해 2.5-2.8단계를 반복합니다.
참고 : 프로토콜은 여기에서 일시 중지 할 수 있지만 부상 후 시점까지 정확하려면 같은 날에 영화와 지구력 수영을 수행하는 것이 좋습니다. 터널은 실험이 일시 중지되는 동안 계속 순환할 수 있습니다.
3. 수영 행동 분석을위한 비디오 캡처
참고: 한 번에 최대 다섯 마리의 동물만 추적할 수 있습니다. 실험 그룹이 다섯 마리보다 큰 경우 각 그룹에 대해 여러 비디오를 촬영할 수 있으며, 첫 번째 비디오는 다섯 개 이하의 동물을 추적하고 두 번째 비디오는 다른 다섯 개 이하의 동물을 추적합니다. 시간이 지남에 따라 개별 동물을 추적하는 것을 목표로하는 종단 연구의 경우, 물고기는 여러 시간대에 걸쳐 개별적으로 수용되고 추적 될 수 있습니다. 추적 및 분석을 위한 모든 스크립트는 GitHub를 통해 사용할 수 있습니다(자료 표 참조).
- 수영 터널 아래에있는 적외선 조명 패널을 켭니다. 수영 터널 상단의 천장 마운트에 카메라를 고정하십시오. 초점과 조리개 링을 조정합니다.
참고: 초점 및 조리개 설정은 카메라와 수영 터널 사이의 거리와 조명 환경에 따라 다릅니다. - 카메라 녹화 소프트웨어를 엽니다( 자료표 참조). 다음과 같이 소프트웨어 설정을 설정합니다.
- 1:4 가로 세로 표시를 클릭합니다. 시야가 전체 수영 터널을 덮고 있는지 확인하십시오. 자동 대비 및 자동 화이트 밸런스를 끄고 그룹 간 배경과 대비를 정규화합니다.
- 렌치 아이콘을 클릭하여 카메라 속성 창을 엽니다. 매개 변수를 다음과 같이 설정하십시오 : 픽셀 클럭 : 344 MHz, 프레임 속도 : 70 fps, 보류 옆에있는 상자를 클릭하여 확인하십시오, 노출 시간 : 0.290ms. 이 창을 닫지 마십시오.
- 필요에 따라 카메라를 기울이거나 돌려서 터널의 수영실만 덮도록 녹화 창을 자릅니다.
- 필름 릴 아이콘을 클릭하여 녹화 창을 엽니다. 다음과 같이 녹화 설정을 설정합니다.
- 상자에 최대 프레임 수를 선택합니다.
- 프레임 수에 대해 수동으로 63,000 을 입력합니다.
- Calc. 프레임 속도 확인란을 선택합니다. 이를 통해 프로그램은 3.2.2 단계에서 정의 된 프레임 속도 (70fps)를 가져올 수 있습니다.
- JPEG 품질을 30으로 변경합니다.
- 테스트 실행을 기록합니다.
- 만들기를 클릭하고 새 파일 이름을 테스트하고 바탕 화면에 저장하십시오.
- 녹음 창으로 돌아가서 기록을 클릭하십시오. 테스트 동영상을 프로토콜의 전체 기간(15분) 동안 실행되도록 합니다.
- 테스트가 완료되면 프레임이 삭제되지 않고 63,000프레임이 기록되었는지 확인합니다.
- 수영 터널에 물고기 무리를 놓고 완전히 밀폐된 표준 뚜껑을 사용하여 터널을 닫습니다(그림 1B).
참고: 뚜껑을 완전히 조이기 전에 모든 물고기가 터널에 있는지 확인하십시오. 뚜껑 아래에 기포가 없는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 결과에 영향을 미칩니다. - 새 녹화 창을 열고 파일 이름을 지정합니다. 예: 2_A_1_00001_WildtypeGroupA.avi
참고: 설정이 3.2단계 및 3.3단계의 매개 변수에 따라 설정되었는지 확인하십시오. JPEG 품질 은 항상 기본값으로 돌아가며 새 동영상마다 재설정해야 합니다.
주의: 아직 레코드를 클릭하지 마십시오. - 유속 제어 소프트웨어를 사용하여 새로운 실험을 시작합니다.
참고: 자동화된 프로토콜을 시작하려면 로깅 시작 상자를 클릭하십시오. 대화 상자 창이 열리면 드롭다운 목록에서 자동화 를 선택합니다. 이전에 저장한 프로토콜 파일을 선택하려면 프로토콜 파일 옆에 있는 파일 아이콘을 클릭하여 원하는 프로토콜을 엽니다.- 수동 프로토콜을 시작하려면 유속 제어 소프트웨어의 Uwater[cm/s] 상자를 사용하여 5분 동안 0cm/s, 5분 동안 10cm/s, 5분 동안 20cm/s 로 유량을 설정합니다.
- 새 데이터 출력 파일(.csv 파일로 저장됨)을 동영상 파일과 동일한 이름으로 동일한 폴더에 저장합니다.
주의: 아직 시작을 클릭하지 마십시오.
- 수영 터널 측면에 종이 타월 또는 직물 조각을 놓아 모든 행동이 물고기 수영으로 인한 것이지 환경에서의 움직임으로 인한 놀라운 반응 때문이 아닌지 확인하십시오.
- 빠른 연속으로, 물이 차분하고 잔물결이 프레임을 가로 질러 움직이지 않는지 확인하십시오. 카메라 소프트웨어 창에서 녹화를 클릭하여 동영상 파일 녹화 를 시작합니다. 유속 제어 소프트웨어에서 시작 을 클릭하여 프로토콜을 시작하면 중단 없이 계속됩니다.
- 영화를보고 프레임이 떨어지지 않았는지 확인하고, 시야에 거품이 없으며, 모든 물고기가 기록되어 있는지 확인하십시오.
- 동영상 녹화가 완료되면 비상 정지를 클릭하여 유속 제어 프로토콜을 종료하십시오. 자동으로 저장되는 데이터 출력 파일을 확인합니다. 녹화 창에서 닫기를 클릭하여 동영상 파일을 저장합니다.
- 뚜껑을 분리합니다. 조심스럽게 물고기를 회수하여 탱크로 돌려 보내십시오.
- 모든 물고기 그룹에 대해 3.5~3.12단계를 반복합니다.
- 모든 그룹에 대한 동영상 녹화가 완료되면 MovieProcessing_v5.bat 스크립트를 사용하여 동영상을 70fps 비디오에서 20fps 비디오로 변환합니다. 이렇게 하려면 스크립트 파일을 원시 비디오가 들어 있는 폴더로 이동합니다. 파일을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 실행을 선택합니다.
참고: 스크립트가 자동으로 실행됩니다. 스크립트의 진행 상황을 보여주는 명령 프롬프트 창이 나타납니다. 위의 단계는 선택 사항입니다. 15분 비디오의 프레임 수를 63,000프레임에서 18,000프레임으로 줄이고 SwimBehavior_v7합니다. R 스크립트가 더 빠르게 실행됩니다. - 터널을 비우고 모든 장비를 치우십시오.
4. 수영 행동 평가를 위한 영화 분석
참고: 동영상 녹화 및 분석은 별도의 날에 완료할 수 있습니다.
- 피지에서 Tracking_v2.ijm 스크립트를 열고 실행을 클릭하여 프로그램을 시작하십시오. 팝업 창에서 추적 할 수영 행동 동영상이 포함 된 폴더를 선택하고 열기를 클릭하십시오. 첫 번째 동영상의 프레임 1, 대화 상자 및 나타날 관심 영역(ROI) 관리자를 찾습니다.
- 대화 상자에 제공된 지침을 따릅니다. 수영 터널 챔버 하단의 ROI를 만들고 확인을 클릭합니다. 검은색 모서리가 보이지 않는지 확인합니다.
참고: 임계값 창이 편집되고 임계값이 지정된 프레임 1과 함께 열립니다. - 색 구성표를 B&W 에서 빨간색으로 변경합니다. 프레임 1에 물고기가 빨간색으로 표시되고 다른 것은 표시되지 않을 때까지 최대 값을 조정합니다. 임계값을 기록합니다. 대화 상자에서 확인을 클릭합니다.
참고: 프로그램이 자동으로 실행됩니다. 프레임 1에 대해 만들어진 ROI는 후속 프레임에 대해 지속적으로 선택되고 선택되지 않습니다. 진행률 표시줄은 피지 창의 오른쪽 하단에 있는 프로세스를 모니터링합니다. 추적에는 영화 당 약 40 분이 걸립니다. 모든 영화가 추적되면 피지 프로그램이 중지됩니다. ROI는 선택되지 않습니다. 이제 동영상이 포함된 폴더에는 각 동영상에 대한 _raw.csv 파일이 있습니다. 피지는이 시점에서 닫힐 수 있습니다. - 설명 통계 정렬, 조립 및 획득
- 수영 Behavior_v7을 엽니 다. R 스튜디오의 R 스크립트.
- 스크립트 섹션의 오른쪽 위 모서리에 있는 Source를 클릭합니다. 새 창이 열리면 Fiji에서 생성 한 _raw.csv 파일이 포함 된 폴더를 선택하십시오. 열기를 클릭합니다.
참고: 프로그램이 자동으로 실행됩니다. - 각 동영상의 물고기 수를 확인하라는 메시지가 나타나는 대화 상자에서 주어진 숫자가 정확하면 예를 클릭하거나 숫자가 올바르지 않으면 아니요 를 클릭합니다.
참고: 아니요 를 클릭하면 동영상을 새 ROI 및 임계값으로 다시 추적하라는 메시지가 나타납니다. 예(Yes)를 클릭하면 프로그램이 계속 진행됩니다. - 수영하지 않는 물고기를 제거해야 하는지 여부를 묻는 새 창이 열리면 예 또는 아니요를 클릭합니다.
참고 : 수영하지 않는 물고기는 10cm / s에서 50 % 미만의 활동을하는 물고기로 정의됩니다. 수영하지 않는 물고기는 제거하지 않는 것이 좋습니다. - 그룹이 맹검이 아닌지, 사용자가 두 개 이상의 제어 그룹이있는 경우 그룹을 결합할지 여부를 묻는 새로운 팝업 창에서 맹검이지 않거나 그룹을 결합합니다.
- 이전 질문에 대한 응답이 제공된 후 프로그램이 Y의 파일 X 정렬이라는 메시지를 표시하는지 확인합니다. 여기서 X는 정렬되는 현재 파일이고 Y는 정렬할 파일의 총 수입니다. 각 파일을 정렬하는 데 약 30초가 걸립니다.
- 파일이 정렬되면 동일한 이름(.csv)으로 생성된 새 _aligned.csv 파일을 확인합니다. 프로그램이 데이터를 결합하고, 통계를 실행하고, 출력 그래프를 플롯하는지 확인합니다. _raw.csv 및 _aligned.csv 파일이 들어 있는 상위 폴더 내의 결과(Results)라는 레이블이 지정된 새 폴더에 생성된 분석 파일을 확인합니다.
- 결과 폴더 내에서 진단 및 그래프라는 두 개의 폴더와 .csv, BulkData_Avg, BulkData_Full 및 SummaryData_Avg라는 네 개의 SummaryData_Full 파일이 있는지 확인합니다.
참고: SummaryData_Full.csv 에는 각 시점에서 각 그룹의 각 물고기에 대한 개별 데이터가 포함되어 있습니다. 이 데이터는 자동으로 플로팅되지만 다른 곳에서 추출하고 플로팅할 수 있습니다.- Graphs 폴더에 프로그램에서 생성된 그래프와 각 그래프의 데이터 요소가 포함된 파일.csv 포함되어 있는지 확인합니다.
- 진단 폴더에 정렬된 파일에 대한 진단 데이터가 있는 단일 .csv 파일이 포함되어 있는지 확인합니다.
참고: 진단.csv 파일의 열에는 a) 추가 개체가 포함된 프레임 수로, 100개 미만이어야 합니다. 추가 개체가 있는 프레임이 너무 많으면 추적에 문제가 있음을 알 수 있습니다. b) 누락되거나 병합 된 객체가있는 프레임 수. 이 메트릭이 높은 것은 정상입니다. 잘 재생되지 않은 물고기는 터널 뒤쪽으로 자주 휩쓸려 실종 된 것으로 간주됩니다. c) 240 픽셀 이상의 점프가있는 프레임. 이 숫자는 단일 동영상의 개체(물고기) 수에 따라 증가합니다. 행동 메트릭이 계산되는 방법에 대한 자세한 설명은 보충 파일 1에 나와 있습니다.
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Representative Results
이 프로토콜의 섹션 1에 설명된 대로 수영 터널을 설정했습니다(그림 1). 우리는 기준선과 척수 손상 후 성인 제브라 피쉬의 수영 행동 (이 프로토콜의 섹션 2)과 수영 행동 (이 프로토콜의 섹션 3 및 4)을 평가했습니다 (그림 2).
기준 운동 기능을 확립하기 위해, 우리는 증가하는 물 전류 속도에서 야생형 제브라피쉬의 수영 내구성을 조사했습니다 (그림 3A). 이 분석에서 야생형 제브라피쉬는 지치기 전에 41분 동안 수영을 했다. 이어서, 물고기는 앞서 기술된 바와 같이 완전한 척수 횡단절편을 실시하였고, 수영 지구력 분석이 수행되었다6. MS-222를 사용하여 제브라 피쉬를 마취 한 후, 미세한 가위로 작은 절개를 수행하여 척수 4mm 꼬리를 뇌간 영역으로 횡단시킵니다. 완전한 횡단이 시각적으로 확인되었다. 척수 수술 후 수영 능력의 상실을 확인하기 위해, 부상당한 동물을 손상 후 2 또는 3 일 (dpi)에 평가하였다. 이 시점에서, 제브라 피쉬는 병변 부위에 완전히 마비 된 꼬리입니다. 수영 지구력은 부상 후 2, 4 및 6 주 (wpi)에서 평가되었습니다. 2 wpi에서 병변 된 물고기는 수영 지구력의 60 %를 잃었습니다 (그림 3A). 재생 물고기는 점차적으로 4 및 6 wpi에서 수영 지구력을 회복했습니다. 이 결과는 야생형 제브라피쉬가 척수 손상 후 수영 지구력을 회복할 수 있음을 나타냅니다.
척수 재생 중 제브라피쉬 수영 행동을 조사하기 위해 우리는 0cm/s의 수류 속도 또는 10 및 20cm/s의 일정하고 낮은 전류 속도에서 야생형 동물의 수영 행동을 추적했습니다(그림 3B). 수영 터널 챔버에서의 물고기 위치의 평균 트랙은 낮은 전류 속도에서의 수영 행동의 시각적 평가에 사용되었다 (그림 3B). 이 분석에서, 부상을 입지 않은 대조군은 상승된 Y 위치에 해당하는 수영 터널 챔버의 앞 부분(수류원에 더 가까움)에서 꾸준히 수영합니다(그림 3B). 대조적으로, 2 wpi에서, 부상당한 물고기는 현재에 대해 꾸준한 수영 능력을 유지할 수 없었습니다. 결과적으로, 그들의 수영 트랙은 Y 위치의 전반적인 감소와 함께 더 불규칙합니다 (그림 3B). Y 위치는 4 및 6 wpi에서 증가하여 재생 동물이 점차 수영 터널 챔버 앞에서 수영 할 수있는 능력을 회복했음을 나타냅니다. 수영 행동 파라미터를 정량화하기 위해, 우리는 활동 퍼센트, 수영 터널에서의 위치(Y 위치) 및 현재에 대한 수영 시간을 계산했습니다(그림 3C-E). 부상을 입지 않은 대조군에 비해 2wpi의 병변 동물은 현저하게 덜 활동적이었고(그림 3C), 수영 터널의 뒤쪽 사분면에 정체되었고(그림 3D), 낮은 전류 속도에서 수영하는 능력을 잃었습니다(그림 3E). 기능적 회복을 달성하는 타고난 능력과 일관되게 병변 동물은 4 및 6 wpi에서 수영 행동 매개 변수를 점차적으로 정상화했습니다 (그림 3C-E). 수영 지구력과 수영 행동 매개 변수는 함께 제브라 피쉬에서 수영 기능과 기능적 척수 복구에 대한 정량화 가능한 판독을 제공했습니다.
그림 1: 수영 터널 설정 및 맞춤형 뚜껑. (A) 수영 터널 챔버의 확대 된 상단 및 측면 뷰를 포함하여 설정된 수영 터널의 대표 이미지. (b) 이 프로토콜에 설명된 다양한 용도에 사용되는 수영 터널 뚜껑의 이미지. 표준적이고 완전히 밀폐 된 수영 터널 뚜껑은 수영 행동 분석에 사용됩니다 (이 프로토콜의 섹션 3). 핸드헬드 디지털 유량계를 수용하는 수정된 수영 터널 뚜껑이 교정에 사용됩니다(이 프로토콜의 섹션 1). 수영 터널 챔버의 후부 끝에 탈착식 뚜껑이 들어있는 수정 된 수영 지구력 뚜껑을 사용하면 수영 내구성 테스트 중에 지친 물고기를 제거 할 수 있습니다 (이 프로토콜의 섹션 2). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 성인 제브라 피쉬에서 수영 지구력 및 수영 행동을 분석하기위한 실험 파이프 라인. 수영 지구력을 위해, 물고기는 고갈 될 때까지 증가하는 수류에 대항하여 수영합니다. 수영 행동의 경우, 수영 매개 변수는 낮은 전류 속도가없는 상태에서 평가됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 척수 손상 후 야생형 제브라피쉬의 기능 회복. (A) 기준선 및 2, 4 및 6 wpi에서 야생형 제브라피쉬에 대한 수영 지구력 분석에 의해 결정된 운동 기능. 점들은 두 개의 독립적인 실험으로부터 개별 동물을 나타낸다. (B) 수영 행동 분석은 낮은 수류 속도에서 야생형 제브라피쉬를 추적했다. 평균 Y 위치는 추적 전반에 걸쳐 각 시점마다 표시됩니다(5분의 경우 0cm/s, 5분의 경우 10cm/s, 5분의 경우 20cm/s). (C-E) 퍼센트 활동 (C), 터널 (D)에서의 평균 Y 위치 및 흐름 (E)에 대한 시간 수영은 20cm / s로 정량화되었습니다. 모든 정량화에 대해 두 개의 독립적인 실험이 표시됩니다. n=30 부상 전 상태에서; n = 23 at 2 wpi, n = 20 at 4 wpi, n = 18 at 6 wpi. 단방향 ANOVA를 통계 분석에 사용하였다. 오차 막대는 평균의 표준 오차(SEM)를 나타낸다. *P < 0.05; **P < 0.01; P < 0.001; P < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
성인 제브라 피쉬는 인간의 질병을 모델링하고 조직 재생 메커니즘을 연구하는 데 인기있는 척추 동물 시스템입니다. CRISPR / Cas9 게놈 편집은 제브라 피쉬에서 질병을 모델링하기위한 역 유전 연구에 혁명을 일으켰습니다. 그러나 성인 제브라 피쉬의 대규모 유전학은 성인 제브라 피쉬 조직을 고처리량 표현형으로 사용할 수 없다는 것을 포함하여 생물학적 및 기술적 과제로 인해 방해 받고 있습니다. 성인 제브라 피쉬의 복잡한 해부학을 감안할 때, 조직 구조를 얻고 분석하기 위해서는 장기간의 조직 학적 처리가 필요합니다. 본 연구에 기술된 수영 지구력 및 수영 행동 분석은 조직학 전에 중간 처리량에서 신경, 근육 또는 골격 표현형을 사전 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 더욱이, 조직 재생의 연구가 기능적 조직 수복을 개선시키는 것을 목표로함에 따라, 본 연구에 기술된 프로토콜은 신경, 근육 및 골격 재생 연구의 연구를 위해 필수적이지는 않더라도 널리 적용될 것이다.
기능적 운동 분석은 신경 발달과 재생에 대한 우리의 이해에 필수적이었습니다. 표준 운동 분석은 쥐, 생쥐 및 애벌레 제브라 피쉬를 포함한 척추 동물 종에서 널리 이용 가능합니다. 마우스 및 래트 모델 시스템은 각각 BMS16 및 BBB17,18과 같은 행동 및 기능적 운동 검정을 갖는다. 마찬가지로, 애벌레 제브라 피쉬의 운동, 깜짝 놀랄만한 반응 및 행동을 측정하기 위해 많은 프로토콜이 설명되었습니다. 이러한 프로토콜은 밝고 어두운 환경, 포식자 회피 및 활동19,20,21에서 실험 그룹 간의 행동 차이를 드러내는 데 효율적입니다. 여기에서는 성인 제브라 피쉬에서 척수 손상 후 기능적 회복을 측정하기위한 정량적이고 재현 가능한 방법을 설명합니다.
이 연구는 몇 가지 제한 사항을 제시합니다. 첫째, 행동 연구는 유전 적 및 환경 적 요인에 크게 의존합니다. 유전 적 변동성을 통제하기 위해 우리는 형제 자매를 사용하여 실험 그룹22,23의 나이, 성별 및 유전 적 배경을 통제했습니다. 환경 요인을 제어하기 위해 우리는 통제 된 온도 및 조명 조건 하에서 하루 중 동시에 실험이 수행되도록했습니다20. 둘째, 수영 행동 분석은 편향 분석에 덜 민감하지만 수영 지구력 분석을 실행하는 연구원은 물고기가 고갈에 도달했을 때를 결정하고 나머지 물고기 코호트를 방해하지 않고 수영 터널 챔버에서 지친 물고기를 제거합니다. 따라서, 우리의 수영 지구력 실험은 실험 조건에 눈이 먼 단일 연구원에 의해 수행되었습니다. 시간이 지남에 따라 실험 그룹의 종단 연구에 대한 연구자 대 연구자 변동성을 피하는 것이 특히 중요합니다. 마지막으로, 물고기 간의 충돌은 수영 행동 분석에서 추적 분석을 복잡하게 만들 수 있습니다. 따라서 물고기 간의 충돌 가능성을 최소화하기 위해 다섯 마리 이하의 물고기 그룹에 대한 수영 행동 분석을 수행하는 것이 좋습니다.
중요한 단계를 고려할 때, 우리는 부상당한 물고기가 특히 부상 후 초기에 깨지기 쉽다는 것을 주목합니다. 따라서 물고기를 극도의주의를 기울여 다루는 것이 좋습니다. 수영 지구력 분석의 경우, 머리 또는 꼬리를 먼저 PVC 튜브로 가능한 한 빨리 수집하면 수집 과정에서 이차 부상의 가능성이 줄어 듭니다. 수영 행동 분석의 경우, 플러시 펌프는 때때로 파도를 생성하여 영화를 왜곡하고 분석 오류를 일으킬 수 있습니다. 이 경우 플러시 펌프를 잠깐 끌 수 있습니다. 그러나 수영 터널 챔버와 버퍼 탱크 사이에서 물이 지속적으로 순환하는지 확인하기 위해 플러시 펌프를 장시간 끄는 것은 권장하지 않습니다. 동영상 녹화를 모니터링하면 프레임이 떨어졌거나 물고기가 녹화 영역에서 멀어지는 경우 동영상을 즉시 종료하고 다시 시작할 수 있습니다. 추가 고려 사항에서 추적 분석을 수행하는 동안 R 코드에서 파일 처리 중에 오류가 발생하는 경우 파일 이름 지정에 가장 큰 문제가 있습니다. 이 프로그램은 매우 구체적인 명명 전략에 따라 작동하도록 만들어졌습니다 : 다른 Timepoint_Group_Subgroup_Stock number_Anything (예 : 0_A_1_00001_WildtypeGroupA.avi). 이 이름을 지정하면 여러 시점, 그룹 및 하위 그룹을 함께 플로팅하고 정렬할 수 있습니다. 마지막으로, 적절한 추적을 보장하기 위해 분석 스크립트에 체크포인트가 내장되어 있지만 분석 출력을 주의 깊게 확인하는 것이 중요합니다. 이 프로그램은 자동으로 물고기 번호가 정확한지 여부를 묻고 물고기 번호가 올바르지 않은 경우 재분석을 위해 영화를 프롬프트합니다. 직선 아티팩트가 평균 Y 위치 플롯에 나타날 수 있으며, 이는 추가 개체가 물고기로 인식되었음을 나타냅니다. 이 경우 가장 좋은 방법은 더 높은 흐름 속도로 나타나는 경향이있는 추가 아티팩트를 제외하기 위해 영화를주의 깊게 보는 것입니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 동물 보호를위한 워싱턴 대학 Zebrafish 공유 자원에 감사드립니다. 이 연구는 NIH (R01 NS113915 ~ M.H.M.)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoSwim software | Loligo Systems | MI10000 | Optional - for Automatic control of current velocity |
| Customized lid | Loligo Systems | MI10001 | This customized lid is used for swim endurance |
| DAQ-BT | Loligo Systems | SW10600 | Optional - for Automatic control of current velocity |
| Eheim pump | Loligo Systems | PU10160 | 20 L/min. This pump is placed in theflow-through tank. |
| Fiji | Fiji | Freely available through Image J (Fiji) | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Flowtherm | Loligo Systems | AC10000 | Handheld digital flow meter - for calibration |
| High Speed Camera | Loligo Systems | VE10380 | USB 3.0 color video camera (4MP) |
| IR light panel | Loligo Systems | VE10775 | 450 x 210 mm, placed under the swim tunnel chamber |
| Monofocal lens | Loligo Systems | VE10388 | 25mm manual lens |
| PVC Tubing | VWR | 60985-534 | 5/16 x 7/16" Wall thickness: 1/16" |
| R Studio | R Studio | Freely available. Version 3.6 with extra packages. | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Swim tunnel respirometer | Loligo Systems | SW10060 | 5L (120V/60Hz). The system includes the swim chamber, motor, manual control of water current velocity, 1 pump placed inside the chamber, standard swim tunnel lid for swim behavior, and modified swim tunnel lid for calibration |
| uEye Cockpit | IDS | Freely available software to control camera parameters | Alternative cameras and accompanying softwares could be used |
| Vane wheel flow probe | Loligo Systems | AC10002 | Digital flow probe - for calibration |
References
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