Summary
I stand til funksjonell utvinning etter ryggmargsskade, er voksen sebrafisk et førsteklasses modellsystem for å belyse medfødte mekanismer for nevral regenerering. Her beskriver vi svømme utholdenhet og svømmeadferd analyser som funksjonelle avlesninger av ryggmargsregenerering.
Abstract
På grunn av deres anerkjente regenerative kapasitet er voksen sebrafisk en førsteklasses virveldyrmodell for å forhøre mekanismer for medfødt ryggmargsregenerering. Etter fullstendig transeksjon av ryggmargen strekker sebrafisk glial- og axonalbroer over avkuttet vev, regenererer nevroner proksimalt til lesjonen, og gjenvinner svømmekapasiteten innen 8 uker etter skade. Gjenoppretting av svømmefunksjon er dermed en sentral avlesning for funksjonell ryggmargsreparasjon. Her beskriver vi et sett med atferdsanalyser for å kvantifisere sebrafiskmotorkapasitet inne i en lukket svømmetunnel. Målet med disse metodene er å gi kvantifiserbare målinger av svømme utholdenhet og svømmeadferd i voksen sebrafisk. For svømme utholdenhet blir sebrafisk utsatt for en stadig økende vannstrømhastighet til utmattelse, og tid ved utmattelse rapporteres. For vurdering av svømmeadferd blir sebrafisk utsatt for lave strømhastigheter og svømmevideoer er fanget med en dorsal visning av fisken. Prosentaktivitet, burstfrekvens og tid brukt mot vannstrømmen gir kvantifiserbare avlesninger av svømmeatferd. Vi kvantifiserte svømme utholdenhet og svømmeadferd i vill type sebrafisk før skade og etter ryggmargstranseksjon. Vi fant ut at sebrafisk mister svømmefunksjonen etter ryggmargstranseksjon og gradvis gjenvinner denne kapasiteten mellom 2 og 6 uker etter skade. Metodene beskrevet i denne studien kan brukes på nevrobehavioral, muskuloskeletal, skjelettmuskulaturregenerering og nevrale regenereringsstudier hos voksne sebrafisk.
Introduction
Voksen sebrafisk brukes eminent til å undersøke mekanismer for nevromuskulær og muskuloskeletal utvikling og sykdomsmodellering1,2,3. Sebrafisk er i stand til effektiv, spontan reparasjon av flere vev, inkludert hjernen, ryggmargen og skjelettmuskelen4,5,6,7. Den bemerkelsesverdige kapasiteten til å regenerere nevromuskulært vev og modellsykdommer tiltrekker seg et voksende vitenskapelig samfunn til voksen sebrafiskforskning1,2,3. Men mens analyser av bevegelse og svømmeadferd er tilgjengelig og standardisert for larval sebrafisk, er det et økende behov for å utvikle analoge protokoller i voksenfisk8,9,10,11. Målet med denne studien er å beskrive protokoller for å kvantifisere svømme utholdenhet og svømmeadferd i voksen sebrafisk. Vi presenterer disse protokollene i sammenheng med ryggmargsregenereringsforskning. Imidlertid er atferdsprotokollene beskrevet her like anvendelige for studier av nevral og muskelregenerering, nevromuskulær og muskuloskeletal utvikling, samt nevromuskulær og muskuloskeletal sykdomsmodellering.
Sebrafisk omvendt lammelse innen 8 uker etter fullstendig ryggmargstranseksjon. I motsetning til dårlig regenerative pattedyr, viser sebrafisk pro-regenerative immun-, nevronale og glial skaderesponser som kreves for funksjonell ryggmargsreparasjon12,13,14. En ultimate avlesning av funksjonell ryggmargsreparasjon er evnen til det lesjonerte vevet til å gjenvinne sin funksjon etter skade. En pakke med standardiserte metoder for å vurdere funksjonell regenerering hos gnagere inkluderer lokomotoriske, motoriske, sensoriske og sensoriske tester15,16,17. Mye brukt tester i musen ryggmargsskade inkluderer locomotor Basso Mouse Scale (BMS), forelimb motor tester, taktile sensoriske tester, og grid walking sensorimotoriske tester15,17. I motsetning til pattedyr- eller larval sebrafisksystemer er atferdstester i voksen sebrafisk mindre utviklet, men mye nødvendig for å imøtekomme de voksende behovene til vevsregenererings- og sykdomsmodelleringssamfunnene.
Komplette ryggmargstranseksjoner resulterer i fullstendig lammelse kaudal til skadestedet. Kort tid etter skaden er lammede dyr mindre aktive og unngår å svømme så mye som mulig. For å kompensere for tapt svømmekapasitet viser lammede dyr korte, hyppige brister ved å overbruke brystfinner, som ligger rostral til lesjonen. Denne kompenserende svømmestrategien resulterer i rask utmattelse og lavere svømmekapasitet. Når sebrafiskens ryggmarg regenererer, gjenvinner dyrene en jevn oscillatorisk svømmefunksjon caudal til lesjonen, noe som gir økt svømme utholdenhet og forbedrede svømmeadferdsparametere. Her beskriver vi metoder for å kvantifisere sebrafisk svømme utholdenhet ved å øke vannstrømmens hastigheter og svømmeadferd ved lave strømhastigheter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voksen sebrafisk av Ekkwill- og AB-stammene ble opprettholdt ved Washington University Zebrafish Core Facility. Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med IACUC institusjonelle dyreprotokoller.
MERK: Et eksempel på det eksperimentelle oppsettet vises i figur 1A. Kalibreringslokket (tilpasset), utholdenhetslokket for svømming (tilpasset) og svømmeadferdslokket (standard, vedlagt tunnellokk) er vist i figur 1B. Den eksperimentelle arbeidsflyten presenteres i figur 2.
1. Forberedelse og kalibrering av svømmetunnel
- Fyll svømmetunnelen og den omkringliggende buffertanken med sebrafisksystemvann (10 L filtrert vann; alkalitet: 50-150 mg/L CaCO3; pH: 6,8-7,5; temperatur: 26-28,5 °C; nitrat < 50 mg/l; nitritt < 0,1 mg/l; og saltholdighet < 0,5-1 g/l).
- Fyll en ekstra gjennomstrømningstank med sebrafisksystemvann (≈7,5 L). Plasser svømmetunnelen og gjennomstrømningstanken slik at overflødig sebrafisksystem vann kan strømme fra buffertanken inn i gjennomstrømningstanken gjennom et utløpsrør festet på siden av buffertanken.
- Når tunnel- og buffertanken er fylt, utfører du følgende.
- Plasser spylepumpen inne i buffertanken og koble den til den tilstøtende svømmetunnelen med PVC-rør. Plasser gjennomstrømningspumpen inne i gjennomstrømningstanken og koble den til veggen på buffertanken.
- Slå på spylepumpen inne i buffertanken og gjennomstrømningspumpen i gjennomstrømningstanken for å starte vannsirkulasjonen.
MERK: Det doble pumpesystemet sikrer kontinuerlig vannstrøm inn i svømmetunnelen (fra spylepumpen) og inn i buffertanken (fra gjennomstrømningspumpen). - Fjern eventuelle luftbobler som er fanget inne i svømmetunnelen ved gradvis å øke vannstrømmens hastighet fra 10 cm / s til 100 cm / s i intervaller på 10 cm / s. Reduser hastigheten tilbake til 0 cm/s i intervaller på 10 cm/s. Hvis du vil kontrollere flythastigheten, klikker du pil opp og pil ned i Hastighet-delen av programvaren for flythastighetskontroll (se Tabell over materialer).
MERK: Motoren og rotoren er koblet til den medfølgende datamaskinen. Programvaren for strømningshastighetskontroll kommuniserer med motoren for å skape ønsket strømningshastighet. Bruk av programvaren for flythastighetskontroll er valgfritt. Alternativet er å manuelt kontrollere vannstrømmotoren.
- Kalibrering
MERK: Kalibrering er nødvendig før hvert eksperiment.- Bruk kalibreringslokket til å lukke svømmetunnelen.
MERK: Kalibreringslokket er tilpasset med en forsterket sentralåpning som passer til strømningsmålersonden som brukes til kalibrering (figur 1B). Åtte vingenøtter brukes til å feste alle lokkene til tunnelen. - Slå på den digitale strømningsmåleren og koble den til strømningsmålersonden. Plasser strømningsmålersonden inne i svømmetunnelen via kalibreringslokket. Plasser bladene på strømningsmålersonden vinkelrett på strømningsretningen.
- Kalibrer utgangen på svømmetunnelmotoren (styrt med programvaren for strømningshastighetskontroll) ved hjelp av den digitale strømningsmåleren. Hvis du vil gjøre dette, utfører du følgende trinn.
- Åpne programvaren for flythastighetskontroll, og klikk Kalibrering.
- Endre alternativene øverst til venstre til RPM vs Spenning. Øk strømningshastigheten fra 0 cm/s til 100 cm/s i trinn på 5 cm/s ved å skrive inn verdiene i Hastighet-delen av programvaren for strømningshastighetskontroll. På hvert trinn klikker du på "+" -knappen og registrerer gjeldende hastighet angitt av den digitale strømningsmåleren.
MERK: Den resulterende lineære relasjonen må ha en R2-verdi nær 1. - For å bekrefte kalibrering, øk vannstrømhastighetene fra 0 til 10, 25, 50, 75 og 100 cm/s, og reduser deretter hastigheten til 75, 50, 25, 10 cm/s ved hjelp av opp- og nedpilene i Uwater[cm/s]- delen av programvaren for strømningshastighetskontroll. Ved hver hastighet (fra programvaren) måler og registrerer du den tilsvarende hastigheten som indikeres av den digitale strømningsmåleren.
- Vurder tunnelen kalibrert og nøyaktig hvis de målte vannstrømhastighetene er innenfor et avvik på ±2 cm/s. Hvis avviket er utenfor ±2 cm/s, gjentar du trinn 1,4,4 til 1,4,6 for å sikre riktig kalibrering.
- Bruk kalibreringslokket til å lukke svømmetunnelen.
2. Vurdering av svømme utholdenhet
MERK: Eksperimentelle grupper er delt inn i grupper på 10 eller færre dyr for svømme utholdenhet.
- Konfigurer programvaren for flythastighetskontroll.
MERK: Bruk av programvaren for flythastighetskontroll i denne delen er valgfritt. Alternativet er å manuelt kontrollere vannstrømmotoren. For manuell vannstrømkontroll, fortsett til trinn 2.3 og øk vannstrømmens hastighet manuelt i de angitte trinnene i trinn 2.5 og 2.6.- Åpne programvaren for flythastighetskontroll. Klikk boksen merket Eksperiment. Fjern merket for Uswim og Uwater.
- Endre strømningshastigheten i Uwater [cm/s]- boksen nederst til venstre for justering av vannstrømhastigheter.
- Hvis du vil starte en automatisert protokoll, klikker du Start logging - boksen. Velg Automatisert fra rullegardinlisten i dialogvinduet som åpnes.
- For å velge en tidligere lagret protokollfil, klikk på filikonet ved siden av Protokollfil for å åpne ønsket protokoll.
- Sett opp utdatafilen ved å klikke på filikonet ved siden av Loggfil. I filutforskervinduet som åpnes, navngir du utdatafilen og lagrer den på ønsket sted.
- Sett opp et tidsvindu for delt runde. Sørg for å ha samtidig tilgang til programvaren for flythastighetskontroll og tidtakervinduer på dataskjermen.
- Sett opp en fiskeoppsamlingstank for å huse utmattet fisk etter fjerning fra svømmetunnelen. Fyll oppsamlingstanken med sebrafisksystemvann (0,75 L). Fyll et langt PVC-rør med sebrafisksystemvann.
- Plasser den ene enden (ende 1) av det forhåndsfylte PVC-røret i oppsamlingstanken og den andre enden (ende 2) i buffertanken. Pass på at vann fritt kan strømme fra buffertanken inn i oppsamlingstanken.
- Klem den øvre enden av PVC-røret (ende 2) med en bindemiddelklemme for å hindre vannstrøm. Bruk dokumentordnerklemmen til å kontrollere utstrømningen av vann etter behov.
- Lukk svømmetunnelen med svømmelokket.
MERK: Svømmelokket er tilpasset med et svømmetunnelvindu for å fjerne utmattet fisk fra svømmetunnelen, uten å forstyrre resten av analysen (figur 1B). - Plasser en gruppe fisk inne i svømmetunnelen. Start tidtakeren for delt runde mens du justerer gjeldende hastighet til 0 cm/s i 5 minutter, 9 cm/s i 5 minutter og 10 cm/s i 5 minutter ved å skrive inn disse verdiene i Uwater [cm/s]- delen av programvaren for strømningshastighetskontroll.
MERK: Dette trinnet vil akklimatisere dyr til svømmetunnelen og strømningsretningen. - Etter akklimatisering av fisk, start det automatiserte strømningshastighetskontrollprogrammet som vil øke vannstrømhastigheten med 2 cm / s hvert min.
MERK: Fisken vil svømme til utmattelse. Utmattet fisk skyves mot bakenden av svømmetunnelen. - Når en fisk er utmattet, løsner du fiskeoppsamlingsrøret, åpner svømmetunnelvinduet og samler fisken i oppsamlingstanken. Registrer tiden ved utmattelse ved hjelp av den delte rundetidtakeren.
MERK: Fisk kan av og til drive til bakenden av svømmetunnelen uten å være utmattet. For å sikre at en fisk er utmattet, trykk forsiktig på bakenden av tunnelen eller lag en skygge over det området for å stimulere fisken til å svømme. Utmattet fisk reagerer ikke på startle stimulansen og ligger flatt i bakenden av tunnelen. - Gjenta trinn 2.7 til all fisken er utmattet og samlet i oppsamlingstanken. Klikk på Nødstopp-knappen på programvaren for flythastighetskontroll og stopp tidtakeren.
MERK: Dobbeltsjekk gjennom hele svømmeturen om antall fisk som fjernes fra svømmetunnelkammeret samsvarer med tidene som er registrert. - Gjenta trinn 2,5 til 2,8 for hver fiskegruppe.
MERK: Protokollen kan settes på pause her, men for å være nøyaktig til det tidspunktet etter skade, anbefales det at filmer og utholdenhet svømmer utføres på samme dag. Tunnelen kan fortsette å sirkulere mens forsøkene stanses midlertidig.
3. Fange videoer for svømmeadferdsanalyse
MERK: Bare opptil fem dyr kan spores om gangen. Hvis eksperimentelle grupper er større enn fem dyr, kan det tas flere videoer for hver gruppe, der den første videoen sporer fem eller færre dyr, og den andre videoen sporer de andre fem eller færre dyrene. For langsgående studier som tar sikte på å spore individuelle dyr over tid, kan fisk plasseres og spores individuelt over flere tidspunkter. Alle skript for sporing og analyse er tilgjengelige via GitHub (se Materialtabell).
- Slå på det infrarøde lyspanelet under svømmetunnelen. Fest kameraet på en takmontering på toppen av svømmetunnelen. Juster fokus og blenderringer.
MERK: Innstillinger for fokus og blenderåpning avhenger av avstanden mellom kameraet og svømmetunnelen, samt lysmiljøet. - Åpne programvaren for kameraopptak (se Tabell over materialer). Angi programvareinnstillingene på følgende måte.
- Klikk visningen med 1:4-størrelse. Kontroller at synsfeltet dekker hele svømmetunnelen. Deaktiver automatisk kontrast og automatisk hvitbalanse for å normalisere bakgrunnen og kontrasten på tvers av grupper.
- Åpne vinduet Egenskaper for kamera ved å klikke på skiftenøkkelikonet. Angi parametrene som følger: Pixel Clock: 344 MHz, Bildefrekvens: 70 fps, klikk på boksen ved siden av Hold for å sjekke det, Eksponeringstid: 0.290 ms. Ikke lukk dette vinduet.
- Beskjær opptaksvinduet slik at det bare dekker svømmekammeret i tunnelen ved å vippe/dreie kameraet etter behov.
- Åpne innspillingsvinduet ved å klikke på filmrullikonet. Angi innspillingsinnstillingene på følgende måte:
- Merk av i boksen for maksimalt antall rammer.
- Skriv inn 63 000 manuelt for antall bilder.
- Merk av i boksen for Beregn bildefrekvens. Dette gjør at programmet kan trekke bildefrekvensen som er definert i trinn 3.2.2 (70 fps).
- Endre JPEG-kvaliteten til 30.
- Ta opp en testkjøring.
- Klikk på Opprett og gi den nye filen navnet Test og lagre den på skrivebordet.
- Gå tilbake til innspillingsvinduet, og klikk spill inn. La testfilmen kjøre under hele protokollens varighet (15 min).
- Når testen er ferdig, må du kontrollere at det ikke er noen tapte rammer, og at 63 000 bilder er tatt opp.
- Plasser en gruppe fisk i svømmetunnelen og lukk tunnelen med et standard fullt lukket lokk (figur 1B).
MERK: Sørg for at all fisken er i tunnelen før du strammer lokket helt. Pass på at det ikke er luftbobler under lokket. Dette vil ellers påvirke resultatene. - Åpne et nytt opptaksvindu og gi filen et navn. Eksempel: 2_A_1_00001_WildtypeGroupA.avi
MERK: Kontroller at innstillingene er i henhold til parameterne i trinn 3.2 og 3.3. JPEG-kvaliteten vil alltid gå tilbake til standard og må tilbakestilles for hver nye film.
FORSIKTIG: Ikke klikk på posten ennå. - Start et nytt eksperiment ved hjelp av programvaren for flythastighetskontroll.
MERK: For å starte en automatisert protokoll, klikk på Start logging-boksen . Velg Automatisert fra rullegardinlisten i dialogvinduet som åpnes. For å velge en tidligere lagret protokollfil, klikk på filikonet ved siden av Protokollfil for å åpne ønsket protokoll.- For å starte en manuell protokoll, sett strømningshastigheten til 0 cm/s i 5 min, 10 cm/s i 5 minutter, etterfulgt av 20 cm/s i 5 minutter ved hjelp av Uwater [cm/s]- boksen i programvaren for strømningshastighetskontroll.
- Lagre den nye utdatafilen (lagres som en .csv fil) med samme navn som filmfilen og i samme mappe.
FORSIKTIG: Ikke klikk start ennå.
- Legg et papirhåndkle eller et stykke stoff på siden av svømmetunnelen for å sikre at all oppførsel skyldes fiskesvømming og ikke på grunn av en startle respons forårsaket av bevegelse i miljøet.
- I rask rekkefølge må du sørge for at vannet er rolig og ingen krusninger beveger seg over rammen. Klikk spill inn i kameraprogramvarevinduet for å starte innspillingen av filmfilen. Klikk Start i programvaren for flythastighetskontroll for å starte protokollen, som vil fortsette uavbrutt.
- Se filmen for å sikre at ingen rammer slippes, at det ikke er noen bobler i synsfeltet, og at all fisk er registrert.
- Når filmopptaket er fullført, klikker du på Nødstopp for å avslutte flythastighetskontrollprotokollen. Se etter utdatafilen som lagres automatisk. Klikk Lukk i innspillingsvinduet for å lagre filmfilen.
- Ta av lokket. Hent fisken forsiktig og returner dem til tanken.
- Gjenta trinn 3,5 til 3,12 for alle grupper av fisk.
- Når filmopptaket er ferdig for alle gruppene, konverterer du filmer fra 70 fps-videoer til 20 fps-videoer med MovieProcessing_v5.bat skript. Dette gjør du ved å flytte skriptfilen til mappen som inneholder råvideoene. Høyreklikk på filen og velg Kjør.
MERK: Skriptet kjøres automatisk. Et ledetekstvindu vil dukke opp som viser fremdriften til skriptet. Trinnet ovenfor er valgfritt. Det reduserer antall bilder i en 15 min video fra 63,000 til 18,000 bilder og gjør SwimBehavior_v7. R-skript kjører raskere. - Tøm tunnelen og legg bort alt utstyret.
4. Analysere filmer for vurdering av svømmeatferd
MERK: Filmopptak og analyse kan fullføres på separate dager.
- Åpne skriptet Tracking_v2.ijm i Fiji , og klikk Kjør for å starte programmet. I vinduet som dukker opp, velger du mappen som inneholder svømmevirkemåtefilmene som skal spores, og klikker på Åpne. Se etter ramme 1 av den første filmen, en dialogboks og området av interesse (ROI) manager som vil komme opp.
- Følg instruksjonene i dialogboksen . Opprett en avkastning på bunnen av svømmetunnelkammeret, og klikk OK. Pass på at ingen svarte hjørner blir sett.
MERK: Terskelvinduet åpnes sammen med en redigert, terskelsterket ramme 1. - Endre fargevalget fra Svart-hvitt til Rød. Juster maksverdien til ramme 1 viser fisken i rødt og ingenting annet. Registrer terskelen. Klikk OK i dialogboksen.
MERK: Programmet kjøres automatisk. Avkastningen som ble laget for ramme 1, velges kontinuerlig og velges ikke for etterfølgende rammer. En fremdriftslinje vil overvåke prosessen nederst til høyre i Fiji-vinduet . Sporing tar omtrent 40 minutter per film. Når alle filmene spores, stopper Fiji-programmet . Avkastningen vil slutte å bli valgt. Mappen som inneholder filmene, vil nå ha en _raw.csv fil for hver film. Fiji kan være stengt på dette tidspunktet. - Justere, sette sammen og anskaffe beskrivende statistikk
- Åpne Behavior_v7 Swim. R-skript i R Studio.
- Klikk på Kilde øverst til høyre i skriptdelen. I et nytt vindu som åpnes, velger du mappen som inneholder _raw.csv filene som genereres av Fiji. Klikk Åpne.
MERK: Programmet kjøres automatisk. - I en dialogboks der du blir bedt om å bekrefte antall fisk i hver film, klikker du Ja hvis de angitte tallene er riktige, eller klikker Nei hvis tallene er feil.
MERK: Hvis Nei ble klikket på, vises en melding der du blir bedt om å spore filmene på nytt med en ny avkastning og terskelverdi. Hvis Ja ble klikket, fortsetter programmet. - I det nye vinduet som åpnes og spør om den ikke-svømmende fisken skal fjernes, klikker du på Ja eller Nei.
MERK: Ikke-svømmende fisk er definert som fisk med mindre enn 50% aktivitet ved 10 cm/s. Det anbefales ikke at ikke-svømmende fisk fjernes. - I et nytt popup-vindu der du blir spurt om gruppene er uforet, og om brukeren vil kombinere grupper, uforstyrrede eller kombinere grupper hvis det er mer enn én kontrollgruppe.
- Når et svar er gitt for det forrige spørsmålet, må du kontrollere at programmet gir en melding Justere fil X av Y, der X er den gjeldende filen som justeres, og Y er det totale antallet filer som skal justeres. Det tar omtrent 30 s før hver fil justeres.
- Når filene er justert, ser du etter en ny .csv fil generert med samme navn (_aligned.csv). Kontroller at programmet kombinerer dataene, kjører statistikk og tegner inn utdatadiagrammer. Se etter analysefilene som er generert i en ny mappe kalt Resultater i den overordnede mappen som inneholder _raw.csv - og _aligned.csv-filene .
- Se etter to mapper med navnet Diagnose og grafer og fire .csv filer med navnet BulkData_Avg, BulkData_Full, SummaryData_Avg og SummaryData_Full, i Resultater-mappen.
MERK: Den SummaryData_Full.csv inneholder de individuelle dataene for hver fisk i hver gruppe på hvert tidspunkt. Disse dataene tegnes automatisk inn, men kan trekkes ut og tegnes inn et annet sted.- Kontroller at Graphs-mappen inneholder grafene som genereres av programmet, og .csv filer som inneholder datapunktene for hvert diagram.
- Kontroller at Diagnose-mappen inneholder én enkelt .csv fil med diagnosedata for justerte filer.
MERK: Kolonner i filen Diagnostics.csv inneholder følgende: a) Antall rammer som inneholder ekstra objekter, som skal være mindre enn 100. For mange rammer med ekstra objekter antyder et problem med sporingen. b)Antall rammer med manglende eller sammenslåtte objekter. Det er normalt at denne målingen er høy. Fisk som ikke har regenerert godt vil ofte bli feid til baksiden av tunnelen og vil bli regnet som savnet. c) Rammer med mer enn 240-pikslers hopp. Dette tallet øker med antall objekter (fisk) i en enkelt film. En detaljert forklaring av hvordan atferdsmålingene ble beregnet, finnes i Tilleggsfil 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi setter opp svømmetunnelen som beskrevet i avsnitt 1 i denne protokollen (figur 1). Vi vurderte svømme utholdenhet (avsnitt 2 i denne protokollen) samt svømmeadferd (avsnitt 3 og 4 i denne protokollen) av voksen sebrafisk ved baseline og etter ryggmargsskade (figur 2).
For å etablere baseline motorfunksjon undersøkte vi svømme utholdenheten til villfisk under økende vannstrømhastigheter (figur 3A). I denne analysen svømte vill-type sebrafisk i 41 min før den ble utmattet. Fisk ble deretter utsatt for komplette ryggmargstranseksjoner som tidligere beskrevet og svømme utholdenhetsanalyser ble utført6. Etter bedøvelse av sebrafisk ved hjelp av MS-222, er et lite snitt laget med fin saks for å transektere ryggmargen 4 mm kaudal til hjernestammeområdet. En fullstendig transeksjon ble bekreftet visuelt. For å bekrefte tap av svømmekapasitet etter ryggmargskirurgi ble skadde dyr vurdert til 2 eller 3 dager etter skade (dpi). På dette tidspunktet er sebrafisk helt lammet kaudal til lesjonsstedet. Svømme utholdenhet ble vurdert ved 2, 4 og 6 uker etter skade (wpi). Ved 2 wpi mistet lesjonert fisk 60% av svømme utholdenhetskapasiteten (figur 3A). Regenererende fisk gjenvunnet gradvis svømme utholdenhet på 4 og 6 wpi. Disse resultatene indikerte at vill-type sebrafisk er i stand til å gjenvinne svømme utholdenhet kapasitet etter ryggmargsskade.
For å undersøke sebrafisksvømmingsatferd under regenerering av ryggmargen, sporet vi svømmeatferden til ville dyr ved 0 cm / s vannstrømhastighet eller under konstant, lav strømhastighet på 10 og 20 cm / s (figur 3B). Gjennomsnittlige spor av fiskeposisjon i svømmetunnelkammeret ble brukt til visuell vurdering av svømmeatferd ved lavstrømshastighet (figur 3B). I denne analysen svømte uskadede kontroller jevnt i den fremre delen av svømmetunnelkammeret (nærmere kilden til vannstrømmen), som tilsvarer en forhøyet Y-posisjon (figur 3B). I motsetning, ved 2 wpi, var skadet fisk ikke i stand til å opprettholde jevn svømmekapasitet mot strømmen. Følgelig er svømmebanene deres mer uregelmessige med en generell reduksjon i Y-posisjon (figur 3B). Y-posisjonen økte med 4 og 6 wpi, noe som indikerer at regenererende dyr gradvis gjenvunnet sin evne til å svømme foran svømmetunnelkammeret. For å kvantifisere svømmeadferdsparametere beregnet vi prosentaktiviteten, posisjonen i svømmetunnelen (Y-posisjon) og tiden svømte mot strømmen (figur 3C-E). I forhold til uskadede kontroller var lesjonerte dyr ved 2 wpi markert mindre aktive (figur 3C), stoppet i den bakre kvadranten i svømmetunnelen (figur 3D), og mistet evnen til å svømme mot lave strømhastigheter (figur 3E). I samsvar med deres medfødte evne til å oppnå funksjonell utvinning, normaliserte lesjonerte dyr gradvis svømmeadferdsparametere ved 4 og 6 wpi (figur 3C-E). Svømme utholdenhet og svømmeadferd parametere sammen tilbød kvantifiserbare avlesninger av svømmefunksjon og funksjonell ryggmargsreparasjon i sebrafisk.
Figur 1: Badetunneloppsett og tilpassede lokk. (A) Representative bilder av svømmetunnelen satt opp, inkludert zoomet topp og sidevisning av svømmetunnelkammeret. (B) Bilder av svømmetunnellokkene som brukes til de ulike bruksområdene som er beskrevet i denne protokollen. Et standard, fullt lukket svømmetunnellokk brukes til svømmeadferdsanalyser (avsnitt 3 i denne protokollen). Et modifisert svømmetunnellokk som har plass til en håndholdt digital strømningsmåler, brukes til kalibrering (avsnitt 1 i denne protokollen). Et modifisert svømmelokk, som inneholder et avtagbart lokk i den bakre enden av svømmetunnelkammeret, gjør det mulig å fjerne utmattet fisk under svømmetesting (avsnitt 2 i denne protokollen). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Eksperimentell rørledning for å analyse for svømme utholdenhet og svømmeadferd i voksen sebrafisk. For svømme utholdenhet svømte fisken mot en økende vannstrøm til utmattelse. For svømmeadferd vurderes svømmeparametere i fravær av og ved lave strømhastigheter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Funksjonell restitusjon i villfisk etter ryggmargsskade. (A) Motorisk funksjon bestemt av svømme utholdenhetsanalyser for vill-type sebrafisk ved baseline og 2, 4 og 6 wpi. Prikker betegner individuelle dyr fra to uavhengige eksperimenter. (B) Svømmeadferdsanalyser sporet villtype sebrafisk under lavvannsstrømhastigheter. Den gjennomsnittlige Y-posisjonen vises ved hvert tidspunkt gjennom hele sporingen (0 cm/s i 5 minutter, 10 cm/s i 5 min og 20 cm/s i 5 minutter). (C-E) Prosentaktivitet (C), gjennomsnittlig Y-posisjon i tunnelen (D) og tidssvømt mot strømmen (E) ble kvantifisert ved 20 cm/s. For alle kvantifiseringer vises to uavhengige eksperimenter. n = 30 i pre-skade tilstand; n = 23 ved 2 ppt, n = 20 ved 4 ppt, n = 18 ved 6 ppt. Enveis ANOVA ble brukt til statistiske analyser. Feilfelt representerer standardfeilen for gjennomsnittet (SEM). *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001; P < 0.0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voksen sebrafisk er et populært virveldyrsystem for modellering av menneskelige sykdommer og studiemekanismer for vevregenerering. CRISPR/Cas9 genomredigering har revolusjonert omvendt genetiske studier for modellering av sykdom hos sebrafisk; Imidlertid har storskala genetikk i voksen sebrafisk blitt hindret av biologiske og tekniske utfordringer, inkludert utilgjengeligheten av voksne sebrafiskvev til høygjennomstrømning fenotyping. Gitt den komplekse anatomien til voksen sebrafisk, er langvarig histologisk behandling nødvendig for å skaffe og analysere vevsarkitektur. Svømme utholdenhet og svømmeadferd analyser beskrevet i denne studien kan brukes til å pre-screen for neural, muskuløs eller skjelett fenotyper på en middels gjennomstrømning før histologi. Videre, som studier av vev regenerering tar sikte på å forbedre funksjonell vev reparasjon, protokollene beskrevet i denne studien vil være allment anvendelig, om ikke viktig, for studier av neural, muskuløs, og skjelett regenerering forskning.
Funksjonelle bevegelsesanalyser har vært integrert i vår forståelse av nevral utvikling og regenerering. Standard lokomotoriske analyser er allment tilgjengelige i virveldyrarter, inkludert rotter, mus og larval sebrafisk. Mus- og rottemodellsystemer har atferdsmessige og funksjonelle bevegelsesanalyser som henholdsvis BMS16 og BBB17,18. På samme måte har en rekke protokoller blitt beskrevet for å måle bevegelse, startle respons og oppførsel i larval sebrafisk. Disse protokollene er effektive for å avdekke atferdsforskjeller mellom eksperimentelle grupper i lyse og mørke miljøer, rovdyrunndragelse og aktivitet19,20,21. Her beskriver vi kvantifiserbare, reproduserbare metoder for å måle funksjonell utvinning etter ryggmargsskade hos voksen sebrafisk.
Merk at denne studien presenterer flere begrensninger. For det første er atferdsstudier svært avhengige av genetiske og miljømessige faktorer. For å kontrollere for genetisk variasjon brukte vi søsken til å kontrollere alder, kjønn og genetisk bakgrunn på tvers av eksperimentelle grupper22,23. For å kontrollere miljøfaktorer sørget vi for at eksperimenter utføres samtidig på dagen, under kontrollerte temperatur- og lysforhold20. For det andre, mens svømmeadferdsanalysen er mindre følsom for partisk analyse, bestemmer forskeren som kjører svømme-utholdenhetsanalysen når en fisk når utmattelse og fortsetter å fjerne utmattet fisk fra svømmetunnelkammeret uten å forstyrre resten av fiskekohorten. Dermed ble våre svømme utholdenhet eksperimenter utført av en enkelt forsker som er blindet for eksperimentelle forhold. Det er spesielt viktig å unngå forsker-til-forsker-variasjon for langsgående studier av eksperimentelle grupper over tid. Til slutt kan kollisjoner mellom fisk komplisere sporingsanalysen i svømmeadferdsanalyser. Vi anbefaler derfor å utføre svømmeadferdsanalyser for grupper på fem eller færre fisk for å minimere sjansene for kollisjoner mellom fisk.
Når det gjelder kritiske trinn, merker vi at skadet fisk kan være skjøre, spesielt i de tidlige dagene etter skade. Vi anbefaler derfor å håndtere fisk med stor forsiktighet. For svømme utholdenhetsanalyser reduserer innsamling av fisk med PVC-røret så raskt som mulig, enten hode eller hale først, sjansen for sekundære skader under innsamlingsprosessen. For svømmeadferdsanalyser kan spylepumpen av og til lage bølger, forvrenge filmene og forårsake analysefeil. I dette tilfellet kan spylepumpen slås av kort. Vi anbefaler imidlertid ikke å slå av spylepumpen i lengre perioder for å sikre at vann hele tiden sirkulerer mellom svømmetunnelkammeret og buffertanken. Overvåking av filmopptak gir umiddelbar avslutning og omstart av filmen hvis en ramme er droppet eller en fisk går bort fra innspillingsområdet. I ytterligere betraktninger, mens du utfører sporingsanalysen, hvis R-koden gir en feil under filbehandling, er det mest sannsynlige problemet å navngi filene. Programmet er laget for å fungere under en veldig spesifikk navngivningsstrategi: Timepoint_Group_Subgroup_Stock number_Anything annet (for eksempel 0_A_1_00001_WildtypeGroupA.avi). Med dette navnet kan flere tidspunkter, grupper og undergrupper tegnes inn og justeres sammen. Til slutt, mens sjekkpunkter er innebygd i analyseskriptet for å sikre riktig sporing, er det viktig å nøye sjekke analyseutgangen. Programmet vil automatisk spørre om fiskenummeret er riktig, og be filmer om å analysere på nytt hvis fiskenummeret er feil. Rettlinjede artefakter kan vises i plasseringsplottet Gjennomsnitt Y, noe som angir at et ekstra objekt er gjenkjent som en fisk. I dette tilfellet er det beste handlingsforløpet å nøye se filmen for å utelukke ekstra artefakter som har en tendens til å vises med høyere strømningshastighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Washington University Zebrafish Shared Resource for dyrepleie. Denne forskningen ble støttet av NIH (R01 NS113915 til M.H.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoSwim software | Loligo Systems | MI10000 | Optional - for Automatic control of current velocity |
| Customized lid | Loligo Systems | MI10001 | This customized lid is used for swim endurance |
| DAQ-BT | Loligo Systems | SW10600 | Optional - for Automatic control of current velocity |
| Eheim pump | Loligo Systems | PU10160 | 20 L/min. This pump is placed in theflow-through tank. |
| Fiji | Fiji | Freely available through Image J (Fiji) | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Flowtherm | Loligo Systems | AC10000 | Handheld digital flow meter - for calibration |
| High Speed Camera | Loligo Systems | VE10380 | USB 3.0 color video camera (4MP) |
| IR light panel | Loligo Systems | VE10775 | 450 x 210 mm, placed under the swim tunnel chamber |
| Monofocal lens | Loligo Systems | VE10388 | 25mm manual lens |
| PVC Tubing | VWR | 60985-534 | 5/16 x 7/16" Wall thickness: 1/16" |
| R Studio | R Studio | Freely available. Version 3.6 with extra packages. | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Swim tunnel respirometer | Loligo Systems | SW10060 | 5L (120V/60Hz). The system includes the swim chamber, motor, manual control of water current velocity, 1 pump placed inside the chamber, standard swim tunnel lid for swim behavior, and modified swim tunnel lid for calibration |
| uEye Cockpit | IDS | Freely available software to control camera parameters | Alternative cameras and accompanying softwares could be used |
| Vane wheel flow probe | Loligo Systems | AC10002 | Digital flow probe - for calibration |
References
- Becker, C. G., Becker, T. Neuronal regeneration from ependymo-radial glial cells: cook, little pot, cook. Developmental Cell. 32 (4), 516-527 (2015).
- Mokalled, M. H., Poss, K. D.
- Orger, M. B., de Polavieja, G. G. Zebrafish behavior: opportunities and challenges. Annual Review of Neuroscience. 40, 125-147 (2017).
- Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Mokalled, M. H., et al. Injury-induced ctgfa directs glial bridging and spinal cord regeneration in zebrafish. Science. 354 (6312), 630-634 (2016).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Developmental Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).
- Wolman, M. A., et al. A genome-wide screen identifies PAPP-AA-mediated IGFR signaling as a novel regulator of habituation learning. Neuron. 85 (6), 1200-1211 (2015).
- Granato, M., et al. Genes controlling and mediating locomotion behavior of the zebrafish embryo and larva. Development. 123, 399-413 (1996).
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (23), 10545-10549 (1995).
- Moens, C. B., Yan, Y. L., Appel, B., Force, A. G., Kimmel, C. B. Valentino: a zebrafish gene required for normal hindbrain segmentation. Development. 122 (12), 3981-3990 (1996).
- Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
- Reimer, M. M., et al. Motor neuron regeneration in adult zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (34), 8510-8516 (2008).
- Klatt Shaw, D., et al. Localized EMT reprograms glial progenitors to promote spinal cord repair. Developmental Cell. 56 (5), 613-626 (2021).
- Ahmed, R. U., Alam, M., Zheng, Y. P. Experimental spinal cord injury and behavioral tests in laboratory rats. Heliyon. 5 (3), 01324 (2019).
- Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Fatemi, G., Faden, A. I. A combined scoring method to assess behavioral recovery after mouse spinal cord injury. Neuroscience Research. 67 (2), 117-125 (2010).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Scheff, S. W., Saucier, D. A., Cain, M. E. A statistical method for analyzing rating scale data: the BBB locomotor score. Journal of Neurotrauma. 19 (10), 1251-1260 (2002).
- Li, Q., et al. Differential behavioral responses of zebrafish larvae to yohimbine treatment. Psychopharmacology (Berl). 232 (1), 197-208 (2015).
- Wakamatsu, Y., Ogino, K., Hirata, H. Swimming capability of zebrafish is governed by water temperature, caudal fin length and genetic background. Scientific Reports. 9 (1), 16307 (2019).
- Ahmed, O., Seguin, D., Gerlai, R. An automated predator avoidance task in zebrafish. Behavioral Brain Research. 216 (1), 166-171 (2011).
- Conradsen, C., McGuigan, K. Sexually dimorphic morphology and swimming performance relationships in wild-type zebrafish Danio rerio. Journal of Fish Biology. 87 (5), 1219-1233 (2015).
- Leris, I., Sfakianakis, D. G., Kentouri, M. Are zebrafish Danio rerio males better swimmers than females. Journal of Fish Biology. 83 (5), 1381-1386 (2013).
