Summary
Capaz de recuperação funcional após lesão medular, o zebrafish adulto é um sistema modelo de elucidar mecanismos inatas de regeneração neural. Aqui, descrevemos a resistência à natação e os ensaios de comportamento de natação como leituras funcionais da regeneração da medula espinhal.
Abstract
Devido à sua renomada capacidade regenerativa, os zebrafish adultos são um modelo de vertebrado premier para interrogar mecanismos de regeneração da medula espinhal inata. Após a transeção completa de sua medula espinhal, os zebrafish estendem pontes glial e axonal através do tecido cortado, regeneram neurônios proximal à lesão e recuperam suas capacidades de natação dentro de 8 semanas de lesão. A recuperação da função de natação é, portanto, uma leitura central para a reparação funcional da medula espinhal. Aqui, descrevemos um conjunto de ensaios comportamentais para quantificar a capacidade motora de zebrafish dentro de um túnel de natação fechado. O objetivo desses métodos é fornecer medidas quantificáveis de resistência à natação e comportamento de natação em zebrafish adultos. Para a resistência ao nado, os zebrafish são submetidos a uma velocidade de corrente de água em constante aumento até a exaustão, e o tempo de exaustão é relatado. Para avaliação do comportamento de natação, os zebrafish são submetidos a velocidades de baixa corrente e vídeos de natação são capturados com uma visão dorsal dos peixes. Por cento de atividade, frequência de explosão e tempo gasto contra a corrente de água fornecem leituras quantificáveis do comportamento de natação. Quantificamos a resistência ao nado e o comportamento de natação em zebrafish tipo selvagem antes da lesão e após a transeção da medula espinhal. Descobrimos que os zebrafish perdem a função de natação após a transeção da medula espinhal e gradualmente recuperam essa capacidade entre 2 e 6 semanas após a lesão. Os métodos descritos neste estudo poderiam ser aplicados a estudos neuroabáviois, musculoesqueléticos, regeneração muscular esquelética e regeneração neural em zebrafish adulto.
Introduction
Os zebrafish adultos são eminentemente usados para investigar mecanismos de desenvolvimento neuromuscular e musculoesquelético e modelagem de doenças1,2,3. Os zebrafish são capazes de reparar eficientes e espontâneos tecidos múltiplos, incluindo cérebro, medula espinhal e músculo esquelético4,5,6,7. A notável capacidade de regenerar tecidos neuromusculares e doenças modelo está atraindo uma comunidade científica crescente para pesquisas de zebrafish adulto1,2,3. No entanto, enquanto ensaios de locomoção e comportamento de natação estão disponíveis e padronizados para zebrafish larval, há uma necessidade crescente de desenvolver protocolos análogos em peixes adultos8,9,10,11. O objetivo deste estudo é descrever protocolos para quantificar a resistência à natação e o comportamento de natação em zebrafish adultos. Apresentamos esses protocolos no contexto da pesquisa de regeneração da medula espinhal. No entanto, os protocolos comportamentais descritos aqui são igualmente aplicáveis aos estudos de regeneração neural e muscular, desenvolvimento neuromuscular e musculoesquelético, bem como modelagem de doenças neuromusculares e musculoesqueléticos.
Zebrafish reverte paralisia dentro de 8 semanas de transeção completa da medula espinhal. Ao contrário dos mamíferos mal regenerativos, os zebrafish apresentam respostas de lesões imuno regenerativas, neuronais e glial que são necessárias para a reparação funcional da medula espinhal12,13,14. Uma leitura final da reparação funcional da medula espinhal é a capacidade do tecido lesado de recuperar sua função após a lesão. Um conjunto de métodos padronizados para avaliar a regeneração funcional em roedores inclui testes locomotor, motor, sensorial e sensorial15,16,17. Testes amplamente utilizados na lesão medular do rato incluem a escala de rato de basso locomotor (BMS), testes motores de membros dianteiros, testes sensoriais táteis e testes sensorimotores de caminhada na grade15,17. Em contraste com os sistemas de zebrafish mamíferos ou larvais, os testes comportamentais em zebrafish adultos são menos desenvolvidos, mas muito necessários para acomodar as crescentes necessidades das comunidades de regeneração tecidual e modelagem de doenças.
Transeções completas da medula espinhal resultam em paralisia completa caudal para o local da lesão. Logo após a lesão, os animais paralisados são menos ativos e evitam nadar o máximo possível. Para compensar a perda da capacidade de natação, os animais paralisados apresentam rajadas curtas e frequentes, usando demais suas barbatanas peitorais, que ficam rostral à lesão. Esta estratégia de natação compensatória resulta em exaustão rápida e menor capacidade de natação. À medida que a medula espinhal dos zebrafish se regenera, os animais recuperam uma função de natação oscilante suave caudal para a lesão, permitindo maior resistência à natação e melhores parâmetros de comportamento na natação. Aqui, descrevemos métodos para quantificar a resistência ao nado de zebrafish no aumento das velocidades de corrente de água e comportamento de natação em velocidades de baixa corrente.
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Protocol
Zebrafish adultos das cepas Ekkwill e AB foram mantidos no Centro de Zebrafish da Universidade de Washington. Todos os experimentos em animais foram realizados em conformidade com os protocolos institucionais de animais da IACUC.
NOTA: Um exemplo da configuração experimental é mostrado na Figura 1A. A tampa de calibração (personalizada), a tampa de resistência ao natação (personalizada) e a tampa de comportamento de natação (tampa padrão e fechada do túnel) são mostradas na Figura 1B. O fluxo de trabalho experimental é apresentado na Figura 2.
1. Preparação e calibração do túnel de natação
- Encha o túnel de natação e o tanque tampão circundante com água do sistema de zebrafish (10 L de água filtrada; alcalinidade: 50-150 mg/L CaCO3; pH: 6,8-7,5; temperatura: 26-28,5 °C; nitrato < 50 mg/L; nitrito < 0,1 mg/L; e salinidade < 0,5-1 g/L).
- Encha um tanque adicional de fluxo com água do sistema de zebrafish (≈7,5 L). Posicione o túnel de natação e o tanque de fluxo para permitir que o excesso de água do sistema de zebrafish flua do tanque tampão para o tanque de fluxo através de um tubo de saída fixado na lateral do tanque tampão.
- Uma vez que o túnel e o tanque tampão estejam cheios, realize o seguinte.
- Coloque a bomba de descarga dentro do tanque tampão e conecte-a ao túnel de natação adjacente com tubos de PVC. Coloque a bomba de fluxo dentro do tanque de fluxo e conecte-a à parede do tanque tampão.
- Ligue a bomba de descarga localizada dentro do tanque tampão e a bomba de fluxo localizada no tanque de fluxo para iniciar a circulação de água.
NOTA: O sistema de bomba dupla garantirá o fluxo contínuo de água para o túnel de natação (a partir da bomba de descarga) e para o tanque tampão (a partir da bomba de fluxo). - Limpe todas as bolhas de ar presas dentro do túnel de natação, aumentando gradualmente a velocidade da corrente de água de 10 cm/s para 100 cm/s em intervalos de 10 cm/s. Diminua a velocidade de volta para 0 cm/s em intervalos de 10 cm/s. Para controlar a velocidade de fluxo, clique nas setas para cima e para baixo na seção Velocity do software de controle de velocidade de fluxo (ver Tabela de Materiais).
NOTA: O motor e o rotor estão conectados ao computador que acompanha. O software de controle de velocidade de fluxo se comunica com o motor para criar a velocidade de fluxo desejada. O uso do software de controle de velocidade de fluxo é opcional. A alternativa é controlar manualmente o motor de corrente de água.
- Calibração
NOTA: A calibração é necessária antes de cada experimento.- Use a tampa de calibração para fechar o túnel de natação.
NOTA: A tampa de calibração é personalizada com uma abertura central reforçada que se encaixa na sonda do medidor de fluxo usada para calibração (Figura 1B). Oito asas são usadas para proteger todas as tampas do túnel. - Ligue o medidor de fluxo digital e conecte-o à sonda do medidor de fluxo. Coloque a sonda do medidor de fluxo dentro do túnel de natação através da tampa de calibração. Posicione as lâminas da sonda do medidor de fluxo perpendicularmente à direção do fluxo.
- Calibrar a saída do motor do túnel de natação (controlado com o software de controle de velocidade de fluxo) usando o medidor de fluxo digital. Para fazer isso, execute as seguintes etapas.
- Abra o software de controle de velocidade de fluxo e clique em Calibração.
- Altere as opções no canto superior esquerdo para RPM vs Voltagem. Aumente a velocidade de fluxo de 0 cm/s para 100 cm/s em incrementos de 5 cm/s, digitando os valores na seção Velocity do software de controle de velocidade de fluxo. Em cada passo, clique no botão "+" e regise a velocidade atual indicada pelo medidor de fluxo digital.
NOTA: A relação linear resultante deve ter um valor R2 próximo de 1. - Para confirmar a calibração, aumente as velocidades da corrente de água de 0 a 10, 25, 50, 75 e 100 cm/s, e depois diminua as velocidades para 75, 50, 25, 10 cm/s usando as setas para cima e para baixo na seção Uwater [cm/s] do software de controle de velocidade de fluxo. A cada velocidade (do software), meça e regisse a velocidade correspondente indicada pelo medidor de fluxo digital.
- Considere o túnel calibrado e preciso se as velocidades de corrente de água medidas estiverem dentro de um desvio de ±2 cm/s. Se o desvio estiver além ±2 cm/s, repita as etapas 1.4.4 a 1.4.6 para garantir a calibração adequada.
- Use a tampa de calibração para fechar o túnel de natação.
2. Avaliação da resistência ao nado
NOTA: Grupos experimentais são divididos em grupos de 10 ou menos animais para resistência à natação.
- Configure o software de controle de velocidade de fluxo.
NOTA: O uso do software de controle de velocidade de fluxo nesta seção é opcional. A alternativa é controlar manualmente o motor de corrente de água. Para o controle manual da corrente de água, proceda à etapa 2.3 e aumente manualmente a velocidade da corrente de água nos incrementos especificados nas etapas 2.5 e 2.6.- Abra o software de controle de velocidade de fluxo. Clique na caixa rotulada experiment. Desmarque Uswim e Uwater.
- Altere a velocidade de fluxo na caixa Uwater [cm/s] no canto inferior esquerdo para ajustar as velocidades de corrente de água.
- Para iniciar um protocolo automatizado, clique na caixa Iniciar registro . Na janela de diálogo que abre, escolha Automatizado na lista suspensa.
- Para escolher um arquivo de protocolo previamente salvo, clique no ícone de arquivo ao lado do Arquivo de Protocolo para abrir o protocolo desejado.
- Configure o arquivo de saída clicando no ícone de arquivo ao lado do Arquivo log. Na janela do explorador de arquivos que abre, nomeie o arquivo de saída e salve-o no local desejado.
- Configure uma janela de temporizador de volta dividida. Certifique-se de ter acesso simultâneo ao software de controle de velocidade de fluxo e às janelas do temporizador na tela do computador.
- Montar um tanque de coleta de peixes para abrigar peixes exaustos após sua remoção do túnel de natação. Encha o tanque de coleta com água do sistema de zebrafish (0,75 L). Encha um longo tubo de PVC com água do sistema de zebrafish.
- Coloque uma extremidade (final 1) do tubo de PVC pré-preenchido no tanque de coleta e a outra extremidade (extremidade 2) no tanque tampão. Certifique-se de que a água pode fluir livremente do tanque tampão para o tanque de coleta.
- Fixar a extremidade superior do tubo de PVC (extremidade 2) com um clipe de aglutinante para evitar o fluxo de água. Use o clipe de encadernação para controlar o fluxo de água conforme necessário.
- Feche o túnel de natação usando a tampa de resistência de natação.
NOTA: A tampa de resistência ao nado é personalizada com uma janela de túnel de natação para remover peixes exaustos do túnel de natação, sem interromper o resto do ensaio (Figura 1B). - Coloque um grupo de peixes dentro do túnel de natação. Inicie o temporizador de volta dividida enquanto ajusta a velocidade atual para 0 cm/s para 5 min, 9 cm/s para 5 min e 10 cm/s por 5 minutos digitando esses valores na seção Uwater [cm/s] do software de controle de velocidade de fluxo.
NOTA: Esta etapa irá aclimatar os animais ao túnel de natação e à direção de fluxo. - Após a aclimatação dos peixes, inicie o programa automatizado de controle de velocidade de fluxo que aumentará a velocidade da corrente de água em 2 cm/s a cada minuto.
NOTA: Os peixes nadarão até a exaustão. Peixes exaustos são empurrados para a parte de trás do túnel de natação. - Quando um peixe estiver exausto, despreste o tubo de coleta de peixes, abra a janela do túnel de natação e colete os peixes no tanque de coleta. Registo o tempo de exaustão usando o temporizador de volta dividida.
NOTA: Os peixes podem ocasionalmente derivar para a parte de trás do túnel de natação sem estar exausto. Para garantir que um peixe esteja exausto, bata suavemente na parte de trás do túnel ou crie uma sombra sobre aquela área para estimular o peixe a nadar. Peixes exaustos não respondem ao estímulo do início e estão deitados na parte de trás do túnel. - Repita o passo 2.7 até que todos os peixes estejam exaustos e recolhidos no tanque de coleta. Clique no botão Parar de Emergência no software de controle de velocidade de fluxo e pare o temporizador.
NOTA: Verifique duas vezes ao longo da natação se o número de peixes removidos da câmara do túnel de natação corresponde aos tempos registrados. - Repita as etapas 2,5 a 2,8 para cada grupo de peixes.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui, mas para ser preciso ao ponto de tempo após a lesão, recomenda-se que filmes e natação de resistência sejam realizados no mesmo dia. O túnel pode continuar circulando enquanto os experimentos são pausados.
3. Captura de vídeos para ensaio de comportamento de natação
NOTA: Apenas até cinco animais podem ser rastreados por vez. Se grupos experimentais forem maiores que cinco animais, vários vídeos podem ser feitos para cada grupo, onde o primeiro vídeo rastreia cinco ou menos animais e o segundo vídeo rastreia os outros cinco ou menos animais. Para estudos longitudinais que visam rastrear animais individuais ao longo do tempo, os peixes podem ser alojados individualmente e rastreados em vários pontos de tempo. Todos os scripts para rastreamento e análise estão disponíveis via GitHub (ver Tabela de Materiais).
- Ligue o painel de luz infravermelha localizado sob o túnel de natação. Proteja a câmera em um suporte de teto em cima do túnel de natação. Ajuste os anéis de foco e abertura.
NOTA: As configurações de foco e abertura dependem da distância entre a câmera e o túnel de natação, bem como do ambiente de luz. - Abra o software de gravação da câmera (ver Tabela de Materiais). Defina as configurações do software da seguinte forma.
- Clique no visor de aspecto 1:4. Certifique-se de que o campo de visão cubra todo o túnel de natação. Desligue o contraste automático e o equilíbrio automático do branco para normalizar o fundo e o contraste entre os grupos.
- Abra a janela Propriedades da câmera clicando no ícone da chave. Defina os parâmetros da seguinte forma: Pixel Clock: 344 MHz, Frame Rate: 70 fps, clique na caixa ao lado de Hold para verificar, Tempo de Exposição: 0.290 ms. Não feche essa janela.
- Crop a janela de gravação para cobrir apenas a câmara de natação do túnel inclinando/girando a câmera conforme necessário.
- Abra a janela de gravação clicando no ícone do rolo de filme. Defina as configurações de gravação da seguinte forma:
- Verifique na caixa o número máximo de quadros.
- Insira manualmente 63.000 para o número de quadros.
- Verifique a caixa para Calc. Taxa de quadros. Isso permite que o programa puxe a taxa de quadros definida na etapa 3.2.2 (70 fps).
- Mude a qualidade JPEG para 30.
- Grave um teste.
- Clique em Criar e nomeie o novo teste de arquivo e salve-o na área de trabalho.
- Volte para a janela de gravação e clique em Gravar. Deixe o filme de teste ser executado durante toda a duração do protocolo (15 min).
- Uma vez terminado o teste, certifique-se de que não há quadros descartados e que 63.000 quadros sejam gravados.
- Coloque um grupo de peixes no túnel de natação e feche o túnel usando uma tampa padrão totalmente fechada (Figura 1B).
NOTA: Certifique-se de que todos os peixes estão no túnel antes de apertar totalmente a tampa. Certifique-se de que não há bolhas de ar sob a tampa. Isso afetará os resultados. - Abra uma nova janela de gravação e nomeie o arquivo. Exemplo: 2_A_1_00001_WildtypeGroupA.avi
NOTA: Certifique-se de que as configurações estão de acordo com os parâmetros das etapas 3.2 e 3.3. A Qualidade JPEG sempre voltará ao padrão e precisa ser redefinida para cada novo filme.
ATENÇÃO: Não clique em gravar ainda. - Inicie um novo experimento usando o software de controle de velocidade de fluxo.
NOTA: Para iniciar um protocolo automatizado, clique na caixa Iniciar registro . Na janela de diálogo que abre, escolha Automatizado na lista suspensa. Para escolher um arquivo de protocolo previamente salvo, clique no ícone de arquivo ao lado do Arquivo de Protocolo para abrir o protocolo desejado.- Para iniciar um protocolo manual, defina a velocidade de fluxo para 0 cm/s para 5 min, 10 cm/s por 5 min, seguido por 20 cm/s por 5 min usando a caixa Uwater [cm/s] no software de controle de velocidade de fluxo.
- Salve o novo arquivo de saída de dados (será salvo como um arquivo .csv) com o mesmo nome do arquivo de filme e na mesma pasta.
ATENÇÃO: Não clique em iniciar ainda.
- Coloque uma toalha de papel ou um pedaço de tecido na lateral do túnel de natação para garantir que todos os comportamentos sejam devido à natação de peixes e não devido a uma resposta de esquecimento causada pelo movimento no ambiente.
- Em rápida sucessão, certifique-se de que a água está calma e nenhuma ondulação está se movendo através do quadro. Clique em Gravar na janela do software da câmera para começar a gravar o arquivo do filme. Clique em Iniciar no software de controle de velocidade de fluxo para iniciar o protocolo, que continuará ininterrupto.
- Assista ao filme para ter certeza de que nenhum quadro é descartado, que não há bolhas no campo de visão, e que todos os peixes são registrados.
- Uma vez que a gravação do filme seja concluída, clique em Parar de Emergência para terminar o protocolo de controle de velocidade de fluxo. Verifique se há o arquivo de saída de dados salvo automaticamente. Clique em Fechar na janela de gravação para salvar o arquivo do filme.
- Retire a tampa. Recupere cuidadosamente os peixes e devolva-os ao tanque.
- Repita as etapas 3.5 a 3.12 para todos os grupos de peixes.
- Uma vez que a gravação do filme seja concluída para todos os grupos, converta filmes de vídeos de 70 fps para vídeos de 20 fps com o script MovieProcessing_v5.bat . Para fazer isso, mova o arquivo de script para a pasta contendo os vídeos brutos. Clique com o botão direito do mouse no arquivo e escolha Executar.
NOTA: O script é executado automaticamente. Uma janela de comando virá mostrando o progresso do script. O passo acima é opcional. Ele reduz o número de quadros em um vídeo de 15 minutos de 63.000 para 18.000 quadros e faz com que o SwimBehavior_v7. O script R é executado mais rapidamente. - Esvazie o túnel e guarde todo o equipamento.
4. Analisando filmes para avaliação do comportamento na natação
NOTA: A gravação e análise do filme podem ser concluídas em dias separados.
- Abra o script Tracking_v2.ijm em Fiji e clique em Executar para iniciar o programa. Na janela que aparece, escolha a pasta que contém os filmes de comportamento de natação para rastrear e clicar em Abrir. Procure o quadro 1 do primeiro filme, uma caixa de diálogo e o gerente da região de interesse (ROI) que virá à tona.
- Siga as instruções dadas na caixa de diálogo. Crie um ROI na parte inferior da câmara do túnel de natação e clique em OK. Certifique-se de que não são vistos cantos pretos.
NOTA: A janela limiar será aberta juntamente com um quadro editado e limiar 1. - Mude o esquema de cores de B&W para Vermelho. Ajuste o Valor Máximo até que o quadro 1 mostre o peixe em vermelho e nada mais. Regisso limiar. Clique em OK na caixa de diálogo.
NOTA: O programa será executado automaticamente. O ROI que foi feito para o Quadro 1 será continuamente selecionado e não selecionado para quadros subsequentes. Uma barra de progresso monitorará o processo no canto inferior direito da janela Fiji . O rastreamento leva cerca de 40 minutos por filme. Quando todos os filmes forem rastreados, o programa fiji vai parar. O ROI deixará de ser selecionado. A pasta que contém os filmes agora terá um arquivo _raw.csv para cada filme. Fiji pode ser fechada neste momento. - Alinhar, montar e adquirir estatísticas descritivas
- Abra o Behavior_v7 de natação. R script em R Studio.
- Clique em Fonte no canto superior direito da seção script. Em uma nova janela que se abre, escolha a pasta que contém os arquivos _raw.csv gerados por Fiji. Clique em Abrir.
NOTA: O programa será executado automaticamente. - Em uma caixa de diálogo que aparece pedindo para confirmar o número de peixes em cada filme, clique em Sim se os números dados estiverem corretos ou clique em Não se os números estiverem incorretos.
NOTA: Se Não foi clicado, uma mensagem aparecerá pedindo que os filmes sejam re-rastreados com um novo ROI e um limiar. Se Yes foi clicado, o programa prosseguirá. - Na nova janela que abre perguntando se os peixes que não nadam devem ser removidos, clique em Sim ou Não.
NOTA: Peixes não nadando são definidos como peixes com menos de 50% de atividade a 10 cm/s. Não é recomendável que peixes não nadando sejam removidos. - Em uma nova janela pop-up que pergunta se os grupos não são cegos e se o usuário gostaria de combinar grupos, não cegos ou combinar grupos se houver mais de um grupo de controle.
- Após uma resposta ser dada para a pergunta anterior, certifique-se de que o programa dá uma mensagem Alinhando o arquivo X de Y, onde X é o arquivo atual sendo alinhado e Y é o número total de arquivos para alinhar. É preciso cerca de 30 s para cada arquivo ser alinhado.
- Uma vez que os arquivos estejam alinhados, verifique se há um novo arquivo .csv gerado com o mesmo nome (_aligned.csv). Certifique-se de que o programa combina os dados, executa estatísticas e plota gráficos de saída. Verifique os arquivos de análise gerados em uma nova pasta rotulada Resultados dentro da pasta pai que contém os arquivos _raw.csv e _aligned.csv .
- Na pasta Resultados , verifique se há duas pastas chamadas Diagnósticos e Gráficos e quatro arquivos .csv chamados BulkData_Avg, BulkData_Full, SummaryData_Avg e SummaryData_Full.
NOTA: O SummaryData_Full.csv contém os dados individuais de cada peixe em cada grupo em cada ponto de tempo. Esses dados são automaticamente plotados, mas podem ser extraídos e plotados em outros lugares.- Certifique-se de que a pasta Gráficos contenha os gráficos gerados pelo programa e .csv arquivos contendo os pontos de dados de cada gráfico.
- Certifique-se de que a pasta Diagnósticos contém um único arquivo .csv com dados de diagnóstico para arquivos alinhados.
NOTA: As colunas no arquivo Diagnóstico.csv incluem o seguinte: a) O número de quadros contendo objetos extras, que devem ser inferiores a 100. Muitos quadros com objetos extras sugerem um problema com o rastreamento. b)O número de quadros com objetos perdidos ou mesclados. É normal que essa métrica seja alta. Peixes que não se regeneraram bem serão frequentemente varridos para a parte de trás do túnel e serão contados como desaparecidos. c) Quadros com mais de 240 pixels de saltos. Esse número aumenta com o número de objetos (peixes) em um único filme. Uma explicação detalhada de como as métricas de comportamento foram calculadas está prevista no Arquivo Complementar 1.
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Representative Results
Montamos o túnel de natação como descrito na seção 1 deste protocolo (Figura 1). Avaliamos a resistência à natação (seção 2 deste protocolo) bem como o comportamento de natação (seções 3 e 4 deste protocolo) de zebrafish adulto na linha de base e após lesão medular (Figura 2).
Para estabelecer a função motora da linha de base, examinamos a resistência ao nado de zebrafish tipo selvagem sob velocidades crescentes de corrente de água (Figura 3A). Neste ensaio, zebrafish tipo selvagem nadou por 41 minutos antes de ficar exausto. Os peixes foram então submetidos a trans seções completas da medula espinhal, conforme descrito anteriormente e foram realizados ensaios de resistência à natação6. Após anesthetizar zebrafish usando MS-222, uma pequena incisão é feita com uma tesoura fina para transectar a medula espinhal 4 mm caudal para a região do tronco cerebral. Uma transeção completa foi confirmada visualmente. Para confirmar a perda da capacidade de natação após cirurgia na medula espinhal, os animais feridos foram avaliados em 2 ou 3 dias após a lesão (dpi). Neste momento, os zebrafish estão completamente paralisados caudal para o local da lesão. A resistência na natação foi avaliada aos 2, 4 e 6 semanas de pós-lesão (wpi). Aos 2 wpi, os peixes lesionados perderam 60% da capacidade de resistência ao nado (Figura 3A). Peixe regenerador gradualmente recuperou a resistência na natação em 4 e 6 wpi. Esses resultados indicaram que os zebrafish do tipo selvagem são capazes de recuperar a capacidade de resistência à natação após lesão na medula espinhal.
Para examinar o comportamento de natação de zebrafish durante a regeneração da medula espinhal, rastreamos o comportamento de natação de animais do tipo selvagem a 0 cm/s de velocidade de corrente de água ou sob velocidades constantes e de baixa corrente de 10 e 20 cm/s (Figura 3B). Foram utilizadas faixas médias de posição de peixe na câmara do túnel de natação para avaliação visual do comportamento de natação em velocidades de baixa corrente (Figura 3B). Neste ensaio, controles ilesos nadavam constantemente na parte frontal da câmara do túnel de natação (mais perto da fonte de corrente de água), que corresponde a uma posição Y elevada (Figura 3B). Em contrapartida, aos 2 wpi, os peixes feridos não foram capazes de manter a capacidade de natação constante contra a corrente. Consequentemente, suas pistas de natação são mais irregulares com uma diminuição geral na posição Y (Figura 3B). A posição y aumentou em 4 e 6 wpi, indicando que animais regeneradores gradualmente recuperaram sua capacidade de nadar na frente da câmara do túnel de natação. Para quantificar os parâmetros de comportamento de natação, calculamos a atividade percentual, posição no túnel de natação (posição Y) e o tempo nadou contra a corrente (Figura 3C-E). Em relação aos controles não feridos, os animais lesados em 2 wpi eram marcadamente menos ativos (Figura 3C), parados no quadrante traseiro do túnel de natação (Figura 3D), e perderam sua capacidade de nadar contra velocidades de baixa corrente (Figura 3E). Consistente com sua capacidade inata de alcançar a recuperação funcional, os animais lesados gradualmente normalizaram parâmetros de comportamento de natação em 4 e 6 wpi (Figura 3C-E). Os parâmetros de resistência à natação e comportamento de natação juntos ofereceram leituras quantificáveis da função de natação e reparo funcional da medula espinhal em zebrafish.
Figura 1: Configuração do túnel de natação e tampas personalizadas. (A) Imagens representativas do túnel de natação configuradas, incluindo vistas superiores e laterais ampliadas da câmara do túnel de natação. (B) Imagens das tampas do túnel de natação utilizadas para as várias aplicações descritas neste protocolo. Uma tampa de túnel de natação padrão e totalmente fechada é usada para ensaios de comportamento de natação (seção 3 deste protocolo). Uma tampa modificada do túnel de natação que acomoda um medidor de fluxo digital portátil é usada para calibração (seção 1 deste protocolo). Uma tampa modificada de resistência à natação, contendo uma tampa removível na extremidade posterior da câmara do túnel de natação, permite a remoção de peixes exaustos durante o teste de resistência ao nado (seção 2 deste protocolo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Tubulação experimental para avaliar a resistência ao natação e comportamento de natação em zebrafish adulto. Para a resistência na natação, os peixes nadaram contra uma corrente de água crescente até a exaustão. Para o comportamento da natação, os parâmetros de natação são avaliados na ausência e em baixas velocidades de corrente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Recuperação funcional em zebrafish tipo selvagem após lesão medular. (A) Função motora determinada por ensaios de resistência à natação para zebrafish tipo selvagem na linha de base e 2, 4 e 6 wpi. Pontos denotam animais individuais de dois experimentos independentes. (B) Ensaios de comportamento de natação rastrearam zebrafish do tipo selvagem sob velocidades de baixa corrente de água. A posição média Y é mostrada em cada ponto de tempo ao longo do rastreamento (0 cm/s para 5 min, 10 cm/s para 5 min e 20 cm/s por 5 min). (C-E) Por cento de atividade (C), posição média Y no túnel (D) e tempo nadou contra o fluxo (E) foram quantificados a 20 cm/s. Para todas as quantificações, dois experimentos independentes são mostrados. n = 30 na condição pré-lesão; n = 23 a 2 wpi, n = 20 a 4 wpi, n = 18 a 6 wpi. A ANOVA unidirecional foi utilizada para análises estatísticas. As barras de erro representam o Erro Padrão da Média (SEM). *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001; P < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo suplementar 1: Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
Os zebrafish adultos são um sistema de vertebrados popular para modelar doenças humanas e estudar mecanismos de regeneração tecidual. A edição do genoma CRISPR/Cas9 revolucionou estudos genéticos reversos para modelagem de doenças em zebrafish; no entanto, a genética em larga escala em zebrafish adulto tem sido dificultada por desafios biológicos e técnicos, incluindo a indisponibilidade de tecidos adultos de zebrafish para fenotipagem de alto rendimento. Dada a complexa anatomia dos zebrafish adultos, o processamento histológico prolongado é necessário para obter e analisar a arquitetura tecidual. Os ensaios de resistência à natação e comportamento de natação descritos neste estudo podem ser usados para pré-tela para fenótipos neurais, musculares ou esqueléticos em um rendimento médio antes da histologia. Além disso, como os estudos de regeneração tecidual visam melhorar a reparação do tecido funcional, os protocolos descritos neste estudo serão amplamente aplicáveis, se não essenciais, para estudos de pesquisa de regeneração neural, muscular e esquelética.
Ensaios de locomoção funcional têm sido parte integrante da nossa compreensão do desenvolvimento neural e da regeneração. Ensaios locomotores padrão estão amplamente disponíveis em espécies de vertebrados, incluindo ratos, camundongos e zebrafish larval. Os sistemas de modelos de mouse e rato possuem ensaios de locomoção comportamental e funcional, como o BMS16 e o BBB17,18, respectivamente. Da mesma forma, uma série de protocolos foram descritos para medir a locomoção, a resposta do assustado e o comportamento em zebrafish larval. Esses protocolos são eficientes para revelar diferenças comportamentais entre grupos experimentais em ambientes claros e escuros, evasão de predadores e atividade19,20,21. Aqui, descrevemos métodos quantificáveis e reprodutíveis para medir a recuperação funcional após lesão medular em zebrafish adulto.
Note-se que este estudo apresenta várias limitações. Em primeiro lugar, os estudos comportamentais são altamente dependentes de fatores genéticos e ambientais. Para controlar a variabilidade genética, usamos irmãos para controlar a idade, o sexo e o fundo genético entre os grupos experimentais22,23. Para controlar os fatores ambientais, garantimos que os experimentos sejam realizados na mesma hora do dia, sob condições controladas de temperatura e iluminação20. Em segundo lugar, enquanto o ensaio de comportamento de natação é menos sensível à análise tendenciosa, o pesquisador que executa o ensaio de resistência à natação determina quando um peixe atinge a exaustão e prossegue para remover peixes exaustos da câmara do túnel de natação sem interromper o resto da coorte de peixes. Assim, nossos experimentos de resistência à natação foram realizados por um único pesquisador que está cego para condições experimentais. É particularmente importante evitar a variabilidade pesquisador-pesquisador para estudos longitudinais de grupos experimentais ao longo do tempo. Finalmente, colisões entre peixes podem complicar a análise de rastreamento em ensaios de comportamento de natação. Recomendamos, assim, a realização de ensaios de comportamento de natação para grupos de cinco ou menos peixes para minimizar as chances de colisões entre peixes.
Em consideração aos passos críticos, notamos que os peixes feridos podem ser frágeis especialmente nos primeiros dias após a lesão. Assim, recomendamos manusear peixes com extremo cuidado. Para ensaios de resistência à natação, coletar peixes com o tubo de PVC o mais rápido possível, seja cabeça ou cauda primeiro, reduz a chance de lesões secundárias durante o processo de coleta. Para ensaios de comportamento de natação, a bomba de descarga pode ocasionalmente criar ondas, distorcendo os filmes e causando erros de análise. Neste caso, a bomba de descarga pode ser brevemente desligada. No entanto, não recomendamos desligar a bomba de descarga por tempo estendido para garantir que a água esteja circulando constantemente entre a câmara do túnel de natação e o tanque tampão. O monitoramento da gravação do filme permite o término imediato e a reinicialização do filme se um quadro foi derrubado ou um peixe se desviar da área de gravação. Em considerações adicionais, ao realizar a análise de rastreamento, se o código R der um erro durante o processamento do arquivo, o problema mais provável está na nomeação dos arquivos. O programa é feito para funcionar sob uma estratégia de nomeação muito específica: Timepoint_Group_Subgroup_Stock number_Anything outra (por exemplo, 0_A_1_00001_WildtypeGroupA.avi). Essa nomeação permite que vários pontos de tempo, grupos e subgrupos sejam plotados e alinhados. Finalmente, embora os pontos de verificação tenham sido incorporados no script de análise para garantir o rastreamento adequado, é importante verificar cuidadosamente a saída de análise. O programa perguntará automaticamente se o número do peixe está correto e solicitará a re-análise se o número do peixe estiver incorreto. Artefatos de linha reta podem aparecer no gráfico de posição Média Y, indicando que um objeto extra foi reconhecido como um peixe. Neste caso, o melhor curso de ação é assistir cuidadosamente ao filme para excluir artefatos extras que tendem a aparecer a uma velocidade de fluxo mais alta.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos ao Recurso Compartilhado de Zebrafish da Universidade de Washington pelo cuidado com os animais. Esta pesquisa foi apoiada pelo NIH (R01 NS113915 a M.H.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoSwim software | Loligo Systems | MI10000 | Optional - for Automatic control of current velocity |
| Customized lid | Loligo Systems | MI10001 | This customized lid is used for swim endurance |
| DAQ-BT | Loligo Systems | SW10600 | Optional - for Automatic control of current velocity |
| Eheim pump | Loligo Systems | PU10160 | 20 L/min. This pump is placed in theflow-through tank. |
| Fiji | Fiji | Freely available through Image J (Fiji) | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Flowtherm | Loligo Systems | AC10000 | Handheld digital flow meter - for calibration |
| High Speed Camera | Loligo Systems | VE10380 | USB 3.0 color video camera (4MP) |
| IR light panel | Loligo Systems | VE10775 | 450 x 210 mm, placed under the swim tunnel chamber |
| Monofocal lens | Loligo Systems | VE10388 | 25mm manual lens |
| PVC Tubing | VWR | 60985-534 | 5/16 x 7/16" Wall thickness: 1/16" |
| R Studio | R Studio | Freely available. Version 3.6 with extra packages. | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Swim tunnel respirometer | Loligo Systems | SW10060 | 5L (120V/60Hz). The system includes the swim chamber, motor, manual control of water current velocity, 1 pump placed inside the chamber, standard swim tunnel lid for swim behavior, and modified swim tunnel lid for calibration |
| uEye Cockpit | IDS | Freely available software to control camera parameters | Alternative cameras and accompanying softwares could be used |
| Vane wheel flow probe | Loligo Systems | AC10002 | Digital flow probe - for calibration |
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