Summary
Способная к функциональному восстановлению после травмы спинного мозга, взрослая рыбка данио является ведущей модельной системой для выяснения врожденных механизмов нервной регенерации. Здесь мы описываем анализы на выносливость плавания и поведение в плавании как функциональные показания регенерации спинного мозга.
Abstract
Благодаря своей известной регенеративной способности, взрослые рыбки данио являются ведущей моделью позвоночных для изучения механизмов врожденной регенерации спинного мозга. После полной трансекции спинного мозга рыбки данио расширяют глиальные и аксональные мосты через разорванную ткань, регенерируют нейроны, близкие к поражению, и восстанавливают свои плавательные способности в течение 8 недель после травмы. Таким образом, восстановление функции плавания является центральным считыванием для функционального восстановления спинного мозга. Здесь мы описываем набор поведенческих анализов для количественной оценки двигательной способности рыбок данио внутри закрытого плавательного туннеля. Целью этих методов является обеспечение количественных измерений выносливости плавания и плавательного поведения у взрослых рыбок данио. Для выносливости в плавании рыбок данио подвергают постоянно увеличивающейся скорости течения воды до истощения, а также сообщается время при истощении. Для оценки поведения в плавании рыбок данио подвергаются скоростям низкого течения, а видео плавания захватываются с дорсальным видом рыбы. Процент активности, частота всплесков и время, проведенное против течения воды, обеспечивают количественное считывание поведения при плавании. Мы количественно оценили выносливость в плавании и поведение в плавании у рыбок данио дикого типа до травмы и после трансекции спинного мозга. Мы обнаружили, что рыбки данио теряют функцию плавания после трансекции спинного мозга и постепенно восстанавливают эту способность между 2 и 6 неделями после травмы. Методы, описанные в этом исследовании, могут быть применены к нейроповеденческим, скелетно-мышечным, скелетным мышцам и исследованиям нейронной регенерации у взрослых рыбок данио.
Introduction
Взрослые рыбки данио широко используются для исследования механизмов нервно-мышечного и опорно-двигательного развития и моделирования заболеваний1,2,3. Рыбки данио способны к эффективному, спонтанному восстановлению нескольких тканей, включая головной, спинной мозг и скелетные мышцы4,5,6,7. Замечательная способность регенерировать нервно-мышечные ткани и моделировать заболевания привлекает растущее научное сообщество к исследованиям взрослых рыбок данио1,2,3. Однако, в то время как анализы локомоции и плавательного поведения доступны и стандартизированы для личинок рыбок данио, существует растущая потребность в разработке аналогичных протоколов у взрослых рыб8,9,10,11. Целью этого исследования является описание протоколов для количественной оценки выносливости плавания и поведения в плавании у взрослых рыбок данио. Мы представляем эти протоколы в контексте исследований регенерации спинного мозга. Однако описанные здесь поведенческие протоколы в равной степени применимы к исследованиям нервной и мышечной регенерации, нервно-мышечного и опорно-двигательного развития, а также моделирования нервно-мышечных и костно-мышечных заболеваний.
Реверсивный паралич рыбок данио в течение 8 недель после полной трансекции спинного мозга. В отличие от плохо регенеративных млекопитающих, рыбки данио демонстрируют прорегенеративные иммунные, нейрональные и глиальные травмы, которые необходимы для функционального восстановления спинного мозга12,13,14. Окончательным показателем функционального восстановления спинного мозга является способность пораженной ткани восстанавливать свою функцию после травмы. Набор стандартизированных методов оценки функциональной регенерации у грызунов включает локомоторные, моторные, сенсорные и сенсомоторные тесты15,16,17. Широко используемые тесты при травме спинного мозга мыши включают локомоторную шкалу Basso Mouse Scale (BMS), моторные тесты передней конечности, тактильные сенсорные тесты и сенсомоторные тесты с сеткой ходьбы15,17. В отличие от систем данио млекопитающих или личинок, поведенческие тесты у взрослых рыбок данио менее развиты, но очень необходимы для удовлетворения растущих потребностей сообществ регенерации тканей и моделирования заболеваний.
Полные трансекции спинного мозга приводят к полному параличу каудально к месту травмы. Вскоре после травмы парализованные животные менее активны и избегают плавания, насколько это возможно. Чтобы компенсировать потерянную способность плавать, парализованные животные демонстрируют короткие, частые всплески, злоупотребляя своими грудными плавниками, которые лежат рострально к поражению. Эта компенсаторная стратегия плавания приводит к быстрому истощению и снижению плавательной способности. По мере регенерации спинного мозга рыбок данио животные восстанавливают плавную колебательную функцию плавания каудально к поражению, что позволяет повысить выносливость при плавании и улучшить параметры плавательного поведения. Здесь мы описываем методы количественной оценки выносливости рыбок данио при увеличении скоростей течения воды и плавательного поведения при низких скоростях течения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Взрослые рыбки данио из штаммов Ekkwill и AB содержались в Основном объекте данио Вашингтонского университета. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с институциональными протоколами IACUC на животных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пример экспериментальной установки показан на рисунке 1A. Калибровочная крышка (настраиваемая), крышка для выносливости плавания (настраиваемая) и крышка для плавания (стандартная, закрытая туннельная крышка) показаны на рисунке 1B. Экспериментальный рабочий процесс представлен на рисунке 2.
1. Подготовка и калибровка плавательного туннеля
- Заполните плавательный туннель и окружающий буферный резервуар водой системы данио (10 л фильтрованной воды; щелочность: 50-150 мг/л CaCO3; рН: 6,8-7,5; температура: 26-28,5 °C; нитрат < 50 мг/л; нитрит < 0,1 мг/л; и соленость < 0,5-1 г/л).
- Наполните дополнительный проточный резервуар водой системы данио (≈7,5 л). Расположите плавательный туннель и проточный резервуар, чтобы избыток воды системы данио перетекал из буферного резервуара в проточный резервуар через оттоковую трубку, закрепленную на боковой стороне буферного резервуара.
- После заполнения туннеля и буферного резервуара выполните следующие действия.
- Поместите промывочный насос внутрь буферного резервуара и подключите его к соседнему плавательному туннелю с помощью труб из ПВХ. Поместите проточный насос внутрь проточного резервуара и подключите его к стенке буферного резервуара.
- Включите промывочный насос, расположенный внутри буферного резервуара, и проточный насос, расположенный в проточном резервуаре, чтобы начать циркуляцию воды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Двойная насосная система обеспечит непрерывный поток воды в плавательный туннель (из промывочного насоса) и в буферный бак (из проточного насоса). - Очистите любые пузырьки воздуха, захваченные внутри плавательного туннеля, постепенно увеличивая скорость течения воды с 10 см / с до 100 см / с с интервалом 10 см / с. Уменьшите скорость обратно до 0 см/с с интервалом 10 см/с. Чтобы контролировать скорость потока, щелкните стрелки вверх и вниз в разделе Скорость программного обеспечения для управления скоростью потока (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Двигатель и ротор подключены к сопутствующему компьютеру. Программное обеспечение для управления скоростью потока взаимодействует с двигателем для создания желаемой скорости потока. Использование программного обеспечения для управления скоростью потока является необязательным. Альтернативой является ручное управление двигателем тока воды.
- Калибровка
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед каждым экспериментом требуется калибровка.- Используйте калибровочную крышку, чтобы закрыть плавательный туннель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровочная крышка настроена с усиленным центральным отверстием, которое подходит к датчику расходомера, используемому для калибровки (рисунок 1B). Восемь крылатых гаек используются для крепления всех крышек к туннелю. - Включите цифровой расходомер и подключите его к датчику расходомера. Поместите датчик расходомера внутрь плавательного туннеля через калибровочную крышку. Расположите лопасти датчика расходомера перпендикулярно направлению потока.
- Откалибруйте выход двигателя плавательного туннеля (управляемого с помощью программного обеспечения для управления скоростью потока) с помощью цифрового расходомера. Для этого выполните следующие действия.
- Откройте программное обеспечение для управления скоростью потока и нажмите Калибровка.
- Измените параметры в левом верхнем углу на RPM vs Voltage. Увеличьте скорость потока с 0 см/с до 100 см/с с шагом 5 см/с, введя значения в разделе «Скорость » программного обеспечения для управления скоростью потока. На каждом шаге нажмите кнопку «+» и запишите текущую скорость, указанную цифровым расходомером.
ПРИМЕЧАНИЕ: Результирующая линейная зависимость должна иметь значение R2 , близкое к 1. - Для подтверждения калибровки увеличьте скорости течения воды с 0 до 10, 25, 50, 75 и 100 см/с, а затем уменьшите скорости до 75, 50, 25, 10 см/с с помощью стрелок вверх и вниз в разделе Uwater [см/с] программного обеспечения для управления скоростью потока. На каждой скорости (из программного обеспечения) измерьте и запишите соответствующую скорость, указанную цифровым расходомером.
- Считайте туннель откалиброванным и точным, если измеренные скорости течения воды находятся в пределах отклонения ±2 см/с. Если отклонение превышает ±2 см/с, повторите шаги 1.4.4-1.4.6 для обеспечения надлежащей калибровки.
- Используйте калибровочную крышку, чтобы закрыть плавательный туннель.
2. Оценка выносливости в плавании
ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальные группы делятся на группы по 10 и менее животных для выносливости в плавании.
- Настройте программное обеспечение для управления скоростью потока.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование программного обеспечения для управления скоростью потока в этом разделе является необязательным. Альтернативой является ручное управление двигателем тока воды. Для ручного управления током воды перейдите к шагу 2.3 и вручную увеличьте скорость потока воды с указанными приращениями на этапах 2.5 и 2.6.- Откройте программное обеспечение для управления скоростью потока. Установите флажок Эксперимент. Снимите флажки Усвим и Ууотер.
- Измените скорость потока в поле Uwater [см/с] в левом нижнем углу для регулировки скоростей течения воды.
- Чтобы запустить автоматический протокол, щелкните поле Начать ведение журнала . В открывшемся диалоговом окне выберите Автоматически из раскрывающегося списка.
- Чтобы выбрать ранее сохраненный файл протокола, нажмите на значок файла рядом с файлом протокола , чтобы открыть нужный протокол.
- Настройте выходной файл, щелкнув значок файла рядом с файлом журнала. В открывшемся окне проводника присвойте выходному файлу имя и сохраните его в нужном месте.
- Настройте разделенное окно таймера круга. Убедитесь, что у вас есть одновременный доступ к программному обеспечению для управления скоростью потока и окнам таймера на экране компьютера.
- Установите аквариум для сбора рыбы для размещения истощенных рыб после их удаления из плавательного туннеля. Наполните резервуар для сбора водой системы данио (0,75 л). Наполните длинную трубку из ПВХ водой системы данио.
- Поместите один конец (конец 1) предварительно заполненной трубы ПВХ в резервуар для сбора, а другой конец (конец 2) в буферный резервуар. Убедитесь, что вода может свободно течь из буферного резервуара в резервуар для сбора.
- Зажмите верхний конец трубки из ПВХ (конец 2) связующим зажимом для предотвращения потока воды. Используйте зажим связующего, чтобы контролировать отток воды по мере необходимости.
- Закройте плавательный туннель, используя крышку для выносливости плавания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Крышка плавательной выносливости настроена с окном плавательного туннеля для удаления истощенной рыбы из плавательного туннеля, не прерывая остальную часть анализа (рисунок 1B). - Поместите одну группу рыб внутрь плавательного туннеля. Запустите таймер сплит-круга, регулируя текущую скорость до 0 см/с в течение 5 мин, 9 см/с в течение 5 мин и 10 см/с в течение 5 мин, введя эти значения в разделе Uwater [см/с] программного обеспечения для управления скоростью потока.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг акклиматизирует животных к плавательному туннелю и направлению потока. - После акклиматизации рыб запустите автоматизированную программу управления скоростью потока, которая будет увеличивать скорость течения воды на 2 см / с каждый мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рыба будет плавать до изнеможения. Истощенные рыбы подталкиваются к заднему концу плавательного туннеля. - Когда рыба истощится, расстегните трубку для сбора рыбы, откройте окно плавательного туннеля и соберите рыбу в резервуар для сбора. Запишите время при исчерпании с помощью таймера сплит-круга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рыба может иногда дрейфовать к заднему концу плавательного туннеля, не будучи истощенной. Чтобы убедиться, что рыба истощена, осторожно постучите по заднему концу туннеля или создайте тень над этой областью, чтобы стимулировать рыбу плавать. Истощенные рыбы не реагируют на раздражитель испуга и ложатся плашмя на заднем конце туннеля. - Повторяйте шаг 2.7 до тех пор, пока вся рыба не будет истощена и собрана в резервуар для сбора. Нажмите кнопку «Аварийная остановка» в программном обеспечении для управления скоростью потока и остановите таймер.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дважды проверяйте на протяжении всего заплыва, соответствует ли количество рыбы, извлеченной из камеры плавательного туннеля, зарегистрированному времени. - Повторите шаги 2.5-2.8 для каждой группы рыб.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол может быть приостановлен, но, чтобы быть точным до точки времени после травмы, рекомендуется, чтобы фильмы и заплывы на выносливость выполнялись в один и тот же день. Туннель может продолжать циркулировать, пока эксперименты приостановлены.
3. Захват видео для анализа поведения в плавании
ПРИМЕЧАНИЕ: Одновременно можно отслеживать до пяти животных. Если экспериментальные группы больше пяти животных, для каждой группы можно снять несколько видеороликов, где первое видео отслеживает пять или менее животных, а второе видео отслеживает других пять или менее животных. Для продольных исследований, направленных на отслеживание отдельных животных с течением времени, рыбы могут быть индивидуально размещены и отслежены в нескольких временных точках. Все скрипты для отслеживания и анализа доступны через GitHub (см. Таблицу материалов).
- Включите панель инфракрасного света, расположенную под плавательным туннелем. Закрепите камеру на потолочном креплении поверх плавательного туннеля. Отрегулируйте фокусировку и кольца диафрагмы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки фокусировки и диафрагмы зависят от расстояния между камерой и плавательным туннелем, а также от световой среды. - Откройте программное обеспечение для записи с камеры (см. Таблицу материалов). Задайте параметры программного обеспечения следующим образом.
- Щелкните дисплей с соотношением сторон 1:4. Убедитесь, что поле зрения охватывает весь плавательный туннель. Отключите автоматическую контрастность и автоматический баланс белого, чтобы нормализовать фон и контрастность между группами.
- Откройте окно Свойства камеры , щелкнув значок гаечного ключа. Установите параметры следующим образом: Pixel Clock: 344 MHz, Frame Rate: 70 fps, нажмите на поле рядом с Hold , чтобы проверить это, Время экспозиции: 0.290 ms. Не закрывайте это окно.
- Обрежьте окно записи , чтобы охватить только плавательную камеру туннеля, наклоняя / поворачивая камеру по мере необходимости.
- Откройте окно записи , нажав на значок катушки фильма. Установите параметры записи следующим образом:
- Установите флажок для максимального количества кадров.
- Вручную введите 63 000 кадров для количества кадров.
- Установите флажок Calc. Частота кадров. Это позволяет программе извлекать частоту кадров, определенную на шаге 3.2.2 (70 кадров в секунду).
- Измените качество JPEG на 30.
- Запишите тестовый запуск.
- Нажмите «Создать», назовите новый файл Test и сохраните его на рабочем столе.
- Вернитесь в окно записи и нажмите кнопку Запись. Пусть тестовый фильм будет работать в течение всего срока действия протокола (15 минут).
- После завершения теста убедитесь, что нет пропущенных кадров и что записано 63 000 кадров.
- Поместите группу рыб в плавательный туннель и закройте туннель, используя стандартную полностью закрытую крышку (рисунок 1B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вся рыба находится в туннеле, прежде чем полностью затянуть крышку. Убедитесь, что под крышкой нет пузырьков воздуха. В противном случае это повлияет на результаты. - Откройте новое окно записи и присвойте файлу имя. Пример: 2_A_1_00001_WildtypeGroupA.avi
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что настройки соответствуют параметрам шагов 3.2 и 3.3. Качество JPEG всегда будет возвращаться к значению по умолчанию и должно быть сброшено для каждого нового фильма.
ВНИМАНИЕ: Пока не нажимайте кнопку запись. - Начните новый эксперимент с помощью программного обеспечения для управления скоростью потока.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы запустить автоматический протокол, установите флажок Начать ведение журнала . В открывшемся диалоговом окне выберите Автоматически из раскрывающегося списка. Чтобы выбрать ранее сохраненный файл протокола, нажмите на значок файла рядом с файлом протокола , чтобы открыть нужный протокол.- Чтобы начать ручной протокол, установите скорость потока на 0 см / с в течение 5 мин, 10 см / с в течение 5 минут, а затем 20 см / с в течение 5 минут с помощью блока Uwater [см / с] в программном обеспечении для управления скоростью потока.
- Сохраните новый выходной файл данных (будет сохранен как файл .csv) под тем же именем, что и файл фильма, и в той же папке.
ВНИМАНИЕ: Пока не нажимайте кнопку Пуск.
- Поместите бумажное полотенце или кусок ткани на сторону плавательного туннеля, чтобы убедиться, что все поведение связано с плаванием рыбы, а не с реакцией испуга, вызванной движением в окружающей среде.
- В быстрой последовательности убедитесь, что вода спокойная и нет ряби, движущейся по кадру. Нажмите кнопку Запись в окне программного обеспечения камеры, чтобы начать запись файла фильма. Нажмите кнопку Пуск в программном обеспечении для управления скоростью потока, чтобы запустить протокол, который будет продолжаться непрерывно.
- Посмотрите фильм, чтобы убедиться, что кадры не сброшены, что в поле зрения нет пузырьков и что все рыбы записаны.
- Как только запись видео будет завершена, нажмите «Аварийная остановка», чтобы завершить протокол управления скоростью потока. Проверьте наличие выходного файла данных, который сохраняется автоматически. Нажмите кнопку Закрыть в окне записи , чтобы сохранить файл фильма.
- Снимите крышку. Осторожно извлеките рыбу и верните ее в свой аквариум.
- Повторите шаги с 3.5 по 3.12 для всех групп рыб.
- После завершения записи фильма для всех групп конвертируйте фильмы с видео 70 кадров в секунду в видео с частотой 20 кадров в секунду с помощью сценария MovieProcessing_v5.bat . Для этого переместите файл скрипта в папку, содержащую необработанные видео. Щелкните правой кнопкой мыши файл и выберите Выполнить.
ПРИМЕЧАНИЕ: Скрипт запускается автоматически. Появится окно командной строки, показывающее ход выполнения сценария. Приведенный выше шаг является необязательным. Это уменьшает количество кадров в 15-минутном видео с 63 000 до 18 000 кадров и делает SwimBehavior_v7. Скрипт R выполняется быстрее. - Очистите туннель и уберите все оборудование.
4. Анализ фильмов для оценки плавательного поведения
ПРИМЕЧАНИЕ: Запись и анализ видео могут быть завершены в отдельные дни.
- Откройте сценарий Tracking_v2.ijm на Фиджи и нажмите кнопку Выполнить, чтобы начать программу. В появившемся окне выберите папку, содержащую фильмы о поведении плавания для отслеживания, и нажмите кнопку Открыть. Найдите кадр 1 первого фильма, диалоговое окно и менеджер интересующей области (ROI), который появится.
- Следуйте инструкциям, приведенным в диалоговом окне. Создайте рентабельность инвестиций в нижней части камеры плавательного туннеля и нажмите кнопку «ОК». Убедитесь, что черные углы не видны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Откроется пороговое окно вместе с отредактированным, пороговым кадром 1. - Измените цветовую схему с черно-белой на красную. Отрегулируйте максимальное значение до тех пор, пока кадр 1 не покажет рыбу красным цветом и ничего больше. Запишите пороговое значение. Нажмите кнопку ОК в диалоговом окне.
ПРИМЕЧАНИЕ: Программа запустится автоматически. Окупаемость инвестиций, созданная для кадра 1, будет непрерывно выбираться и отменяться для последующих кадров. Индикатор выполнения будет отслеживать процесс в правом нижнем углу окна Фиджи . Отслеживание занимает около 40 минут на фильм. Когда все фильмы будут отслежены, программа Фиджи остановится. Roi перестанет выбираться. Папка, содержащая фильмы, теперь будет иметь файл _raw.csv для каждого фильма. Фиджи может быть закрыто на этом этапе. - Выравнивание, сборка и получение описательной статистики
- Откройте плавательный Behavior_v7. Скрипт R в R Studio.
- Нажмите на Источник в правом верхнем углу раздела скрипта. В открывшемся новом окне выберите папку, содержащую _raw.csv файлы, созданные Фиджи. Нажмите кнопку Открыть.
ПРИМЕЧАНИЕ: Программа запустится автоматически. - В появившемся диалоговом окне с запросом на подтверждение количества рыб в каждом фильме нажмите кнопку Да , если указанные цифры верны, или кнопку Нет , если цифры неправильные.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если нажать кнопку Нет , появится сообщение с просьбой повторно отследить фильмы с новой рентабельностью инвестиций и пороговым значением. Если нажать кнопку Да , программа продолжит работу. - В открывшемся новом окне с вопросом, следует ли удалить неплавающую рыбу, нажмите кнопку Да или Нет.
ПРИМЕЧАНИЕ: Неплавающая рыба определяется как рыба с активностью менее 50% при 10 см/с. Не рекомендуется удалять неплавающих рыб. - В новом всплывающем окне, которое спрашивает, являются ли группы неослепленными и хочет ли пользователь объединить какие-либо группы, снять ослепление или объединить группы, если существует более одной контрольной группы.
- После ответа на предыдущий вопрос убедитесь, что программа выдает сообщение Выравнивание файла X из Y, где X — текущий выравниваемый файл, а Y — общее количество файлов для выравнивания. Для выравнивания каждого файла требуется около 30 с.
- После выравнивания файлов проверьте наличие нового .csv файла, созданного с тем же именем (_aligned.csv). Убедитесь, что программа объединяет данные, выполняет статистику и строит выходные графики. Проверьте наличие файлов анализа, созданных в новой папке с меткой Результаты в родительской папке, содержащей файлы _raw.csv и _aligned.csv .
- В папке Результаты проверьте наличие двух папок с именем Диагностика и Графики и четырех .csv файлов с именами BulkData_Avg, BulkData_Full, SummaryData_Avg и SummaryData_Full.
ПРИМЕЧАНИЕ: SummaryData_Full.csv содержит индивидуальные данные по каждой рыбе в каждой группе в каждый момент времени. Эти данные автоматически строятся, но могут быть извлечены и построены в другом месте.- Убедитесь, что папка Graphs содержит графики, созданные программой, и .csv файлы, содержащие точки данных для каждого графа.
- Убедитесь, что папка «Диагностика » содержит один файл .csv с диагностическими данными для выровненных файлов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Столбцы в файле Diagnostics.csv включают следующее: a) Количество кадров, содержащих дополнительные объекты, которое должно быть меньше 100. Слишком много кадров с дополнительными объектами наводят на мысль о проблеме с отслеживанием. b)Количество кадров с отсутствующими или объединенными объектами. Это нормально, что эта метрика высока. Рыба, которая не восстановилась хорошо, часто будет сметена в заднюю часть туннеля и будет считаться отсутствующей. c) Кадры с прыжками более 240 пикселей. Это число увеличивается с количеством объектов (рыб) в одном фильме. Подробное объяснение того, как были рассчитаны метрики поведения, приведено в дополнительном файле 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы настроили плавательный туннель, как описано в разделе 1 этого протокола (рисунок 1). Мы оценили выносливость в плавании (раздел 2 этого протокола), а также поведение в плавании (разделы 3 и 4 этого протокола) взрослых рыбок данио на исходном уровне и после травмы спинного мозга (рисунок 2).
Для установления базовой двигательной функции мы изучили выносливость к плаванию рыбок данио дикого типа при увеличении скоростей течения воды (рисунок 3A). В этом анализе дикие рыбки данио плавали в течение 41 минуты, прежде чем истощиться. Затем рыбу подвергали полной транссекции спинного мозга, как описано ранее, и проводили анализы на выносливость плавания6. После обезболивания рыбок данио с помощью MS-222 делается небольшой разрез тонкими ножницами для трансекции спинного мозга на 4 мм каудально в область ствола мозга. Полная трансекция была подтверждена визуально. Чтобы подтвердить потерю плавательной способности после операции на спинном мозге, травмированных животных оценивали через 2 или 3 дня после травмы (dpi). В этот момент времени рыбки данио полностью парализованы каудально к месту поражения. Выносливость в плавании оценивалась через 2, 4 и 6 недель после травмы (WPI). При 2 wpi пораженные рыбы потеряли 60% своей способности к плаванию (рисунок 3A). Регенерирующие рыбы постепенно восстанавливали выносливость в плавании на 4 и 6 wpi. Эти результаты показали, что рыбки данио дикого типа способны восстановить способность к плаванию после травмы спинного мозга.
Чтобы изучить поведение рыбок данио во время регенерации спинного мозга, мы отслеживали поведение диких животных при скорости течения воды 0 см / с или при постоянных скоростях низкого течения 10 и 20 см / с (рисунок 3B). Для визуальной оценки плавательного поведения на малых скоростях течения использовались средние следы положения рыбы в камере плавательного туннеля (рис. 3В). В этом анализе неповрежденные органы управления неуклонно плавали в передней части камеры плавательного туннеля (ближе к источнику течения воды), что соответствует приподнятому положению Y (рисунок 3B). Напротив, при 2 wpi травмированные рыбы не смогли поддерживать устойчивую способность плавать против течения. Следовательно, их плавательные дорожки более нерегулярны с общим уменьшением положения Y (рисунок 3B). Положение Y увеличивалось на 4 и 6 wpi, что указывает на то, что регенерирующие животные постепенно восстанавливали свою способность плавать в передней части камеры плавательного туннеля. Чтобы количественно оценить параметры поведения при плавании, мы рассчитали процент активности, положение в плавательном туннеле (положение Y) и время плавания против течения (рисунок 3C-E). По сравнению с невредимыми контрольными группами, пораженные животные при 2 wpi были заметно менее активны (рисунок 3C), заглохли в заднем квадранте плавательного туннеля (рисунок 3D) и потеряли способность плавать против скоростей низкого течения (рисунок 3E). В соответствии со своей врожденной способностью к достижению функционального восстановления, пораженные животные постепенно нормализовали параметры плавательного поведения при 4 и 6 wpi (рисунок 3C-E). Параметры выносливости и плавательного поведения вместе предлагали количественные показания функции плавания и функционального восстановления спинного мозга у рыбок данио.
Рисунок 1: Настройка туннеля плавания и настраиваемые крышки. (A) Репрезентативные изображения установленного плавательного туннеля, включая увеличенный вид сверху и сбоку камеры плавательного туннеля. (B) Изображения крышек плавательных туннелей, используемых для различных применений, описанных в настоящем протоколе. Стандартная, полностью закрытая крышка плавательного туннеля используется для анализа поведения при плавании (раздел 3 настоящего протокола). Для калибровки используется модифицированная крышка плавательного туннеля, в которой размещается портативный цифровой расходомер (раздел 1 этого протокола). Модифицированная крышка для выносливости плавания, содержащая съемную крышку на заднем конце камеры плавательного туннеля, позволяет удалять истощенных рыб во время испытаний на выносливость в плавании (раздел 2 настоящего протокола). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Экспериментальный трубопровод для анализа выносливости плавания и поведения в плавании у взрослых рыбок данио. Для выносливости к плаванию рыбы плавали против нарастающего течения воды до истощения. Для плавательного поведения параметры плавания оценивают при отсутствии и при малых скоростях течения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Функциональное восстановление у рыбок данио дикого типа после травмы спинного мозга. (A) Двигательная функция, определяемая анализами выносливости плавания для рыбок данио дикого типа на исходном уровне и 2, 4 и 6 wpi. Точки обозначают отдельных животных из двух независимых экспериментов. (B) Анализы плавательного поведения отслеживали диких рыбок данио при низких скоростях течения воды. Среднее положение Y отображается в каждой точке времени на протяжении всего трекинга (0 см/с в течение 5 мин, 10 см/с в течение 5 мин и 20 см/с в течение 5 мин). (С-Е) Процент активности (C), среднее положение Y в туннеле (D) и время плавания против потока (E) были количественно оценены на уровне 20 см/с. Для всех количественных показателей показаны два независимых эксперимента. n = 30 в состоянии, предшествовавшем травме; n = 23 при 2 wpi, n = 20 при 4 wpi, n = 18 при 6 wpi. Односторонняя ANOVA использовалась для статистического анализа. Полосы погрешностей представляют стандартную погрешность среднего значения (SEM). *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001; P < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Взрослые рыбки данио являются популярной позвоночной системой для моделирования заболеваний человека и изучения механизмов регенерации тканей. Редактирование генома CRISPR/Cas9 произвело революцию в обратных генетических исследованиях для моделирования заболеваний у рыбок данио; однако крупномасштабной генетике взрослых рыбок данио препятствуют биологические и технические проблемы, в том числе недоступность тканей взрослых рыбок данио к высокопроизводительному фенотипированию. Учитывая сложную анатомию взрослых рыбок данио, для получения и анализа архитектуры тканей требуется длительная гистологическая обработка. Анализы на выносливость в плавании и поведение в плавании, описанные в этом исследовании, могут быть использованы для предварительного скрининга нервных, мышечных или скелетных фенотипов со средней пропускной способностью перед гистологией. Более того, поскольку исследования регенерации тканей направлены на улучшение функционального восстановления тканей, протоколы, описанные в этом исследовании, будут широко применимы, если не существенны, для исследований нервной, мышечной и скелетной регенерации.
Функциональные локомоционные анализы были неотъемлемой частью нашего понимания развития и регенерации нейронов. Стандартные локомоторные анализы широко доступны у видов позвоночных, включая крыс, мышей и личинок рыбок данио. Мышиные и крысиные модельные системы имеют поведенческие и функциональные локомоционные анализы, такие как BMS16 и BBB17,18 соответственно. Аналогичным образом, было описано множество протоколов для измерения локомоции, реакции испуга и поведения у личинок рыбок данио. Эти протоколы эффективны для выявления поведенческих различий между экспериментальными группами в светлой и темной среде, уклонения хищников и активности19,20,21. Здесь мы описываем поддающиеся количественной оценке, воспроизводимые методы измерения функционального восстановления после травмы спинного мозга у взрослых рыбок данио.
Обратите внимание, что это исследование имеет несколько ограничений. Во-первых, поведенческие исследования сильно зависят от генетических и экологических факторов. Чтобы контролировать генетическую изменчивость, мы использовали братьев и сестер для контроля возраста, пола и генетического фона в экспериментальных группах22,23. Чтобы контролировать факторы окружающей среды, мы позаботились о том, чтобы эксперименты проводились в одно и то же время суток, при контролируемой температуре и условиях освещения20. Во-вторых, в то время как анализ поведения при плавании менее чувствителен к предвзятому анализу, исследователь, проводящий анализ на выносливость плавания, определяет, когда рыба достигает истощения, и приступает к удалению истощенной рыбы из камеры плавательного туннеля, не прерывая остальную часть когорты рыб. Таким образом, наши эксперименты на выносливость в плавании были выполнены одним исследователем, который ослеплен экспериментальными условиями. Особенно важно избегать изменчивости от исследователя к исследователю для продольных исследований экспериментальных групп с течением времени. Наконец, столкновения между рыбами могут усложнить анализ отслеживания в анализах поведения при плавании. Поэтому мы рекомендуем проводить анализы плавательного поведения для групп из пяти или менее рыб, чтобы свести к минимуму вероятность столкновений между рыбами.
Рассматривая критические шаги, мы отмечаем, что травмированная рыба может быть хрупкой, особенно в первые дни после травмы. Поэтому мы рекомендуем обращаться с рыбой с особой осторожностью. Для анализов на выносливость в плавании сбор рыбы с помощью трубки ПВХ как можно быстрее, сначала головой или хвостом, снижает вероятность вторичных травм во время процесса сбора. Для анализа поведения при плавании промывочный насос может иногда создавать волны, искажая фильмы и вызывая ошибки анализа. В этом случае промывочный насос можно ненадолго отключить. Тем не менее, мы не рекомендуем отключать промывочный насос на длительное время, чтобы обеспечить постоянную циркуляцию воды между камерой плавательного туннеля и буферным резервуаром. Мониторинг записи видео позволяет немедленно завершить и перезапустить фильм, если кадр был отброшен или рыба отклоняется от области записи. Кроме того, при выполнении анализа отслеживания, если код R выдает ошибку во время обработки файла, наиболее вероятной проблемой является именование файлов. Программа создана для работы в соответствии с очень специфической стратегией именования: Timepoint_Group_Subgroup_Stock number_Anything другое (например, 0_A_1_00001_WildtypeGroupA.avi). Такое именование позволяет строить и выравнивать несколько временных точек, групп и подгрупп. Наконец, хотя контрольные точки были встроены в сценарий анализа для обеспечения надлежащего отслеживания, важно тщательно проверять результаты анализа. Программа автоматически спросит, правильный ли номер рыбы, и предложит фильмы для повторного анализа, если номер рыбы неправильный. Прямолинейные артефакты могут появляться на графике среднего положения Y, указывая на то, что дополнительный объект был распознан как рыба. В этом случае лучшим вариантом действий является тщательный просмотр фильма, чтобы исключить дополнительные артефакты, которые, как правило, появляются с более высокой скоростью потока.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Вашингтонского университета Zebrafish Shared Resource за уход за животными. Это исследование было поддержано NIH (R01 NS113915 до M.H.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoSwim software | Loligo Systems | MI10000 | Optional - for Automatic control of current velocity |
| Customized lid | Loligo Systems | MI10001 | This customized lid is used for swim endurance |
| DAQ-BT | Loligo Systems | SW10600 | Optional - for Automatic control of current velocity |
| Eheim pump | Loligo Systems | PU10160 | 20 L/min. This pump is placed in theflow-through tank. |
| Fiji | Fiji | Freely available through Image J (Fiji) | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Flowtherm | Loligo Systems | AC10000 | Handheld digital flow meter - for calibration |
| High Speed Camera | Loligo Systems | VE10380 | USB 3.0 color video camera (4MP) |
| IR light panel | Loligo Systems | VE10775 | 450 x 210 mm, placed under the swim tunnel chamber |
| Monofocal lens | Loligo Systems | VE10388 | 25mm manual lens |
| PVC Tubing | VWR | 60985-534 | 5/16 x 7/16" Wall thickness: 1/16" |
| R Studio | R Studio | Freely available. Version 3.6 with extra packages. | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Swim tunnel respirometer | Loligo Systems | SW10060 | 5L (120V/60Hz). The system includes the swim chamber, motor, manual control of water current velocity, 1 pump placed inside the chamber, standard swim tunnel lid for swim behavior, and modified swim tunnel lid for calibration |
| uEye Cockpit | IDS | Freely available software to control camera parameters | Alternative cameras and accompanying softwares could be used |
| Vane wheel flow probe | Loligo Systems | AC10002 | Digital flow probe - for calibration |
References
- Becker, C. G., Becker, T. Neuronal regeneration from ependymo-radial glial cells: cook, little pot, cook. Developmental Cell. 32 (4), 516-527 (2015).
- Mokalled, M. H., Poss, K. D.
- Orger, M. B., de Polavieja, G. G. Zebrafish behavior: opportunities and challenges. Annual Review of Neuroscience. 40, 125-147 (2017).
- Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Mokalled, M. H., et al. Injury-induced ctgfa directs glial bridging and spinal cord regeneration in zebrafish. Science. 354 (6312), 630-634 (2016).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Developmental Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).
- Wolman, M. A., et al. A genome-wide screen identifies PAPP-AA-mediated IGFR signaling as a novel regulator of habituation learning. Neuron. 85 (6), 1200-1211 (2015).
- Granato, M., et al. Genes controlling and mediating locomotion behavior of the zebrafish embryo and larva. Development. 123, 399-413 (1996).
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (23), 10545-10549 (1995).
- Moens, C. B., Yan, Y. L., Appel, B., Force, A. G., Kimmel, C. B. Valentino: a zebrafish gene required for normal hindbrain segmentation. Development. 122 (12), 3981-3990 (1996).
- Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
- Reimer, M. M., et al. Motor neuron regeneration in adult zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (34), 8510-8516 (2008).
- Klatt Shaw, D., et al. Localized EMT reprograms glial progenitors to promote spinal cord repair. Developmental Cell. 56 (5), 613-626 (2021).
- Ahmed, R. U., Alam, M., Zheng, Y. P. Experimental spinal cord injury and behavioral tests in laboratory rats. Heliyon. 5 (3), 01324 (2019).
- Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Fatemi, G., Faden, A. I. A combined scoring method to assess behavioral recovery after mouse spinal cord injury. Neuroscience Research. 67 (2), 117-125 (2010).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Scheff, S. W., Saucier, D. A., Cain, M. E. A statistical method for analyzing rating scale data: the BBB locomotor score. Journal of Neurotrauma. 19 (10), 1251-1260 (2002).
- Li, Q., et al. Differential behavioral responses of zebrafish larvae to yohimbine treatment. Psychopharmacology (Berl). 232 (1), 197-208 (2015).
- Wakamatsu, Y., Ogino, K., Hirata, H. Swimming capability of zebrafish is governed by water temperature, caudal fin length and genetic background. Scientific Reports. 9 (1), 16307 (2019).
- Ahmed, O., Seguin, D., Gerlai, R. An automated predator avoidance task in zebrafish. Behavioral Brain Research. 216 (1), 166-171 (2011).
- Conradsen, C., McGuigan, K. Sexually dimorphic morphology and swimming performance relationships in wild-type zebrafish Danio rerio. Journal of Fish Biology. 87 (5), 1219-1233 (2015).
- Leris, I., Sfakianakis, D. G., Kentouri, M. Are zebrafish Danio rerio males better swimmers than females. Journal of Fish Biology. 83 (5), 1381-1386 (2013).
