Summary
Capaz de recuperarse funcionalmente después de una lesión de la médula espinal, el pez cebra adulto es un sistema modelo de primer nivel para dilucidar los mecanismos innatos de regeneración neuronal. Aquí, describimos la resistencia a la natación y los ensayos de comportamiento de natación como lecturas funcionales de la regeneración de la médula espinal.
Abstract
Debido a su reconocida capacidad regenerativa, el pez cebra adulto es un modelo de vertebrado de primer nivel para interrogar los mecanismos de regeneración innata de la médula espinal. Después de la transección completa de su médula espinal, el pez cebra extiende los puentes gliales y axonales a través del tejido cortado, regenera las neuronas proximales a la lesión y recupera sus capacidades de natación dentro de las 8 semanas posteriores a la lesión. La recuperación de la función de natación es, por lo tanto, una lectura central para la reparación funcional de la médula espinal. Aquí, describimos un conjunto de ensayos de comportamiento para cuantificar la capacidad motora del pez cebra dentro de un túnel de natación cerrado. El objetivo de estos métodos es proporcionar mediciones cuantificables de la resistencia a la natación y el comportamiento de natación en peces cebra adultos. Para la resistencia a la natación, el pez cebra está sujeto a una velocidad de corriente de agua en constante aumento hasta el agotamiento, y se informa el tiempo de agotamiento. Para la evaluación del comportamiento de natación, los peces cebra se someten a bajas velocidades de corriente y los videos de natación se capturan con una vista dorsal de los peces. El porcentaje de actividad, la frecuencia de ráfaga y el tiempo pasado contra la corriente de agua proporcionan lecturas cuantificables del comportamiento de la natación. Cuantificamos la resistencia a la natación y el comportamiento de natación en peces cebra de tipo salvaje antes de la lesión y después de la transección de la médula espinal. Encontramos que el pez cebra pierde la función de natación después de la transección de la médula espinal y recupera gradualmente esa capacidad entre 2 y 6 semanas después de la lesión. Los métodos descritos en este estudio podrían aplicarse a estudios neuroconductuales, musculoesqueléticos, de regeneración muscular esquelética y de regeneración neuronal en peces cebra adultos.
Introduction
El pez cebra adulto se utiliza eminentemente para investigar mecanismos de desarrollo neuromuscular y musculoesquelético y modelado de enfermedades1,2,3. El pez cebra es capaz de reparar de manera eficiente y espontánea múltiples tejidos, incluidos el cerebro, la médula espinal y el músculo esquelético4,5,6,7. La notable capacidad para regenerar tejidos neuromusculares y enfermedades modelo está atrayendo a una creciente comunidad científica a la investigación del pez cebra adulto1,2,3. Sin embargo, si bien los ensayos de locomoción y comportamiento de natación están disponibles y estandarizados para el pez cebra larval, existe una creciente necesidad de desarrollar protocolos análogos en peces adultos8,9,10,11. El objetivo de este estudio es describir protocolos para cuantificar la resistencia a la natación y el comportamiento de natación en peces cebra adultos. Presentamos estos protocolos en el contexto de la investigación de la regeneración de la médula espinal. Sin embargo, los protocolos conductuales descritos aquí son igualmente aplicables a los estudios de regeneración neuronal y muscular, desarrollo neuromuscular y musculoesquelético, así como al modelado de enfermedades neuromusculares y musculoesqueléticas.
El pez cebra revierte la parálisis dentro de las 8 semanas posteriores a la transección completa de la médula espinal. A diferencia de los mamíferos poco regenerativos, el pez cebra muestra respuestas pro-regenerativas de lesiones inmunes, neuronales y gliales que se requieren para la reparación funcional de la médula espinal12,13,14. Una lectura definitiva de la reparación funcional de la médula espinal es la capacidad del tejido lesionado para recuperar su función después de la lesión. Un conjunto de métodos estandarizados para evaluar la regeneración funcional en roedores incluye pruebas locomotoras, motoras, sensoriales y sensoriomotoras15,16,17. Las pruebas ampliamente utilizadas en la lesión de la médula espinal de ratón de ratón incluyen la escala locomotora Basso Mouse (BMS), las pruebas motoras de extremidades anteriores, las pruebas sensoriales táctiles y las pruebas sensoriomotoras de marcha en rejilla15,17. En contraste con los sistemas de peces cebra de mamíferos o larvas, las pruebas de comportamiento en peces cebra adultos están menos desarrolladas, pero son muy necesarias para adaptarse a las crecientes necesidades de las comunidades de regeneración de tejidos y modelado de enfermedades.
Las transecciones completas de la médula espinal resultan en parálisis caudal completa al sitio de la lesión. Poco después de la lesión, los animales paralizados son menos activos y evitan nadar tanto como sea posible. Para compensar la pérdida de capacidad de natación, los animales paralizados muestran ráfagas cortas y frecuentes al abusar de sus aletas pectorales, que se encuentran rostrales de la lesión. Esta estrategia de natación compensatoria da como resultado un agotamiento rápido y una menor capacidad de natación. A medida que la médula espinal del pez cebra se regenera, los animales recuperan una función de natación oscilatoria suave caudal a la lesión, lo que permite una mayor resistencia a la natación y mejores parámetros de comportamiento de natación. Aquí, describimos métodos para cuantificar la resistencia a nadar del pez cebra a velocidades de corriente de agua crecientes y el comportamiento de natación a bajas velocidades de corriente.
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Protocol
El pez cebra adulto de las cepas Ekkwill y AB se mantuvo en la instalación central de pez cebra de la Universidad de Washington. Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con los protocolos institucionales de animales de la IACUC.
NOTA: Un ejemplo de la configuración experimental se muestra en la Figura 1A. La tapa de calibración (personalizada), la tapa de resistencia a la natación (personalizada) y la tapa de comportamiento de natación (tapa de túnel estándar y cerrada) se muestran en la Figura 1B. El flujo de trabajo experimental se presenta en la Figura 2.
1. Preparación y calibración del túnel de natación
- Llene el túnel de natación y el tanque de amortiguación circundante con agua del sistema de pez cebra (agua filtrada de 10 L; alcalinidad: 50-150 mg / L CaCO3; pH: 6.8-7.5; temperatura: 26-28.5 ° C; nitrato < 50 mg / L; nitrito < 0.1 mg / L; y salinidad < 0.5-1 g / L).
- Llene un tanque de flujo adicional con agua del sistema de pez cebra (≈7.5 L). Coloque el túnel de natación y el tanque de flujo para permitir que el exceso de agua del sistema de pez cebra fluya desde el tanque de amortiguación hacia el tanque de flujo a través de un tubo de salida asegurado en el costado del tanque de amortiguación.
- Una vez que el túnel y el tanque de amortiguación estén llenos, realice lo siguiente.
- Coloque la bomba de descarga dentro del tanque de amortiguación y conéctela al túnel de natación adyacente con tubos de PVC. Coloque la bomba de flujo pasante dentro del tanque de flujo continuo y conéctela a la pared del tanque de amortiguación.
- Encienda la bomba de descarga ubicada dentro del tanque de amortiguación y la bomba de flujo a través ubicada en el tanque de flujo continuo para comenzar la circulación de agua.
NOTA: El sistema de doble bomba garantizará un flujo continuo de agua en el túnel de natación (desde la bomba de descarga) y en el tanque de amortiguación (desde la bomba de flujo continuo). - Elimine cualquier burbuja de aire atrapada dentro del túnel de natación aumentando gradualmente la velocidad de la corriente de agua de 10 cm / s a 100 cm / s en intervalos de 10 cm / s. Disminuya la velocidad de nuevo a 0 cm/s en intervalos de 10 cm/s. Para controlar la velocidad del flujo, haga clic en las flechas arriba y abajo en la sección Velocidad del software de control de velocidad de flujo (consulte tabla de materiales).
NOTA: El motor y el rotor están conectados a la computadora que lo acompaña. El software de control de velocidad de flujo se comunica con el motor para crear la velocidad de flujo deseada. El uso del software de control de velocidad de flujo es opcional. La alternativa es controlar manualmente el motor de corriente de agua.
- Calibración
NOTA: Se requiere calibración antes de cada experimento.- Utilice la tapa de calibración para cerrar el túnel de natación.
NOTA: La tapa de calibración se personaliza con una abertura central reforzada que se ajusta a la sonda del medidor de flujo utilizada para la calibración (Figura 1B). Se utilizan ocho tuercas de ala para asegurar todas las tapas del túnel. - Encienda el medidor de flujo digital y conéctelo a la sonda del medidor de flujo. Coloque la sonda del medidor de flujo dentro del túnel de natación a través de la tapa de calibración. Coloque las aspas de la sonda del medidor de flujo perpendiculares a la dirección del flujo.
- Calibre la salida del motor del túnel de natación (controlado con el software de control de velocidad de flujo) utilizando el medidor de flujo digital. Para ello, realice los pasos siguientes.
- Abra el software de control de velocidad de flujo y haga clic en Calibración.
- Cambie las opciones en la parte superior izquierda a RPM vs Voltaje. Aumente la velocidad de flujo de 0 cm/s a 100 cm/s en incrementos de 5 cm/s, escribiendo los valores en la sección Velocidad del software de control de velocidad de flujo. En cada paso, haga clic en el botón "+" y registre la velocidad actual indicada por el medidor de flujo digital.
NOTA: La relación lineal resultante debe tener un valor R2 cercano a 1. - Para confirmar la calibración, aumente las velocidades de la corriente de agua de 0 a 10, 25, 50, 75 y 100 cm / s, y luego disminuya las velocidades a 75, 50, 25, 10 cm / s utilizando las flechas hacia arriba y hacia abajo en la sección Uwater [cm / s] del software de control de velocidad de flujo. A cada velocidad (desde el software), mida y registre la velocidad correspondiente indicada por el medidor de flujo digital.
- Considere el túnel calibrado y preciso si las velocidades de corriente de agua medidas están dentro de una desviación de ±2 cm / s. Si la desviación supera los ±2 cm/s, repita los pasos 1.4.4 a 1.4.6 para garantizar una calibración adecuada.
- Utilice la tapa de calibración para cerrar el túnel de natación.
2. Evaluación de la resistencia a la natación
NOTA: Los grupos experimentales se dividen en grupos de 10 o menos animales para la resistencia a la natación.
- Configure el software de control de velocidad de flujo.
NOTA: El uso del software de control de velocidad de flujo en esta sección es opcional. La alternativa es controlar manualmente el motor de corriente de agua. Para el control manual de la corriente de agua, continúe con el paso 2.3 y aumente manualmente la velocidad de la corriente de agua en los incrementos especificados en los pasos 2.5 y 2.6.- Abra el software de control de velocidad de flujo. Haga clic en el cuadro con la etiqueta Experimento. Desmarque Uswim y Uwater.
- Cambie la velocidad del flujo en el cuadro Uwater [cm/s] en la parte inferior izquierda para ajustar las velocidades de la corriente de agua.
- Para comenzar un protocolo automatizado, haga clic en el cuadro Iniciar registro . En la ventana de diálogo que se abre, elija Automatizado en la lista desplegable.
- Para elegir un archivo de protocolo guardado previamente, haga clic en el icono de archivo junto a Archivo de protocolo para abrir el protocolo deseado.
- Configure el archivo de salida haciendo clic en el icono de archivo junto a Archivo de registro. En la ventana del explorador de archivos que se abre, asigne un nombre al archivo de salida y guárdelo en la ubicación deseada.
- Configure una ventana de temporizador de vuelta dividida. Asegúrese de tener acceso simultáneo al software de control de velocidad de flujo y a las ventanas del temporizador en la pantalla de la computadora.
- Instale un tanque de recolección de peces para albergar peces agotados después de su eliminación del túnel de natación. Llene el tanque de recolección con agua del sistema de pez cebra (0.75 L). Llene un tubo largo de PVC con agua del sistema de pez cebra.
- Coloque un extremo (extremo 1) del tubo de PVC prellenado en el tanque de recolección y el otro extremo (extremo 2) en el tanque de amortiguación. Asegúrese de que el agua pueda fluir libremente desde el tanque de amortiguación hacia el tanque de recolección.
- Sujete el extremo superior del tubo de PVC (extremo 2) con un clip aglutinante para evitar el flujo de agua. Utilice el clip aglutinante para controlar la salida de agua según sea necesario.
- Cierre el túnel de natación con la tapa de resistencia a la natación.
NOTA: La tapa de resistencia a la natación se personaliza con una ventana de túnel de natación para eliminar los peces agotados del túnel de natación, sin interrumpir el resto del ensayo (Figura 1B). - Coloque un grupo de peces dentro del túnel de natación. Inicie el temporizador de vuelta dividida mientras ajusta la velocidad de corriente a 0 cm/s durante 5 min, 9 cm/s durante 5 min y 10 cm/s durante 5 min escribiendo estos valores en la sección Uwater [cm/s] del software de control de velocidad de flujo.
NOTA: Este paso aclimatará a los animales al túnel de natación y a la dirección del flujo. - Después de la aclimatación de los peces, inicie el programa automatizado de control de velocidad de flujo que aumentará la velocidad de la corriente de agua en 2 cm / s cada minuto.
NOTA: Los peces nadarán hasta el agotamiento. Los peces agotados son empujados hacia el extremo posterior del túnel de natación. - Cuando un pez esté agotado, desenganche el tubo de recolección de peces, abra la ventana del túnel de natación y recoja los peces en el tanque de recolección. Registre el tiempo de agotamiento utilizando el temporizador de vuelta dividida.
NOTA: Los peces ocasionalmente pueden desplazarse a la parte posterior del túnel de natación sin agotarse. Para asegurarse de que un pez esté agotado, toque suavemente el extremo posterior del túnel o cree una sombra sobre esa área para estimular a los peces a nadar. Los peces agotados no responden al estímulo de sobresalto y yacen planos en el extremo posterior del túnel. - Repita el paso 2.7 hasta que todos los peces se agoten y se recojan en el tanque de recolección. Haga clic en el botón Parada de emergencia en el software de control de velocidad de flujo y detenga el temporizador.
NOTA: Verifique dos veces a lo largo de la natación si el número de peces retirados de la cámara del túnel de natación coincide con los tiempos registrados. - Repita los pasos 2.5 a 2.8 para cada grupo de peces.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí, pero para ser precisos hasta el punto de tiempo después de la lesión, se recomienda que las películas y los nados de resistencia se realicen el mismo día. El túnel puede continuar circulando mientras los experimentos se detienen.
3. Captura de videos para el ensayo de comportamiento de natación
NOTA: Solo se puede rastrear hasta cinco animales a la vez. Si los grupos experimentales son más grandes que cinco animales, se pueden tomar varios videos para cada grupo, donde el primer video rastrea cinco o menos animales y el segundo video rastrea a los otros cinco o menos animales. Para los estudios longitudinales que tienen como objetivo rastrear animales individuales a lo largo del tiempo, los peces se pueden alojar y rastrear individualmente en múltiples puntos de tiempo. Todos los scripts para el seguimiento y el análisis están disponibles a través de GitHub (consulte la Tabla de materiales).
- Encienda el panel de luz infrarroja ubicado debajo del túnel de natación. Asegure la cámara en un soporte de techo en la parte superior del túnel de natación. Ajuste los anillos de enfoque y apertura.
NOTA: Los ajustes de enfoque y apertura dependen de la distancia entre la cámara y el túnel de natación, así como del entorno de luz. - Abra el software de grabación de la cámara (consulte la Tabla de materiales). Establezca la configuración del software de la siguiente manera.
- Haga clic en la pantalla de aspecto 1:4. Asegúrese de que el campo de visión cubra todo el túnel de natación. Desactive el contraste automático y el balance de blancos automático para normalizar el fondo y el contraste entre grupos.
- Abra la ventana Propiedades de la cámara haciendo clic en el icono de llave inglesa. Establezca los parámetros de la siguiente manera: Reloj de píxeles: 344 MHz, Velocidad de fotogramas: 70 fps, haga clic en la casilla junto a Mantener para verificarlo, Tiempo de exposición: 0.290 ms. No cierre esta ventana.
- Recorte la ventana de grabación para cubrir solo la cámara de natación del túnel inclinando / girando la cámara según sea necesario.
- Abra la ventana de grabación haciendo clic en el icono del carrete de película. Establezca la configuración de grabación de la siguiente manera:
- Marque la casilla para el número máximo de fotogramas.
- Ingrese manualmente 63,000 para el número de cuadros.
- Marque la casilla Calc. Frame Rate. Esto permite al programa extraer la velocidad de fotogramas definida en el paso 3.2.2 (70 fps).
- Cambie la calidad JPEG a 30.
- Registre una ejecución de prueba.
- Haga clic en Crear y asigne un nombre al nuevo archivo Prueba y guárdelo en el escritorio.
- Vuelva a la ventana de grabación y haga clic en Grabar. Deje que la película de prueba se ejecute durante toda la duración del protocolo (15 min).
- Una vez finalizada la prueba, asegúrese de que no haya fotogramas caídos y que se registren 63.000 fotogramas.
- Coloque un grupo de peces en el túnel de natación y cierre el túnel con una tapa estándar completamente cerrada (Figura 1B).
NOTA: Asegúrese de que todos los peces estén en el túnel antes de apretar completamente la tapa. Asegúrese de que no haya burbujas de aire debajo de la tapa. De lo contrario, esto afectará los resultados. - Abra una nueva ventana de grabación y asigne un nombre al archivo. Ejemplo: 2_A_1_00001_WildtypeGroupA.avi
NOTA: Asegúrese de que la configuración está de acuerdo con los parámetros de los pasos 3.2 y 3.3. La calidad JPEG siempre volverá a la predeterminada y debe restablecerse para cada nueva película.
PRECAUCIÓN: No haga clic en grabar todavía. - Comience un nuevo experimento utilizando el software de control de velocidad de flujo.
Nota : para iniciar un protocolo automatizado, haga clic en el cuadro Iniciar registro . En la ventana de diálogo que se abre, elija Automatizado en la lista desplegable. Para elegir un archivo de protocolo guardado previamente, haga clic en el icono de archivo junto a Archivo de protocolo para abrir el protocolo deseado.- Para comenzar un protocolo manual, establezca la velocidad de flujo en 0 cm / s durante 5 min, 10 cm / s durante 5 min, seguido de 20 cm / s durante 5 min usando la caja Uwater [cm / s] en el software de control de velocidad de flujo.
- Guarde el nuevo archivo de salida de datos (se guardará como un archivo .csv) con el mismo nombre que el archivo de película y en la misma carpeta.
PRECAUCIÓN: No haga clic en inicio todavía.
- Coloque una toalla de papel o un trozo de tela en el costado del túnel de natación para asegurarse de que todos los comportamientos se deban a la natación de los peces y no a una respuesta de sobresalto causada por el movimiento en el medio ambiente.
- En una sucesión rápida, asegúrese de que el agua esté tranquila y que no se muevan ondas a través del marco. Haga clic en Grabar en la ventana del software de la cámara para comenzar a grabar el archivo de película. Haga clic en Inicio en el software de control de velocidad de flujo para iniciar el protocolo, que continuará sin interrupciones.
- Mire la película para asegurarse de que no se caigan fotogramas, que no haya burbujas en el campo de visión y que todos los peces estén registrados.
- Una vez completada la grabación de la película, haga clic en Parada de emergencia para finalizar el protocolo de control de velocidad de flujo. Compruebe si hay el archivo de salida de datos que se guarda automáticamente. Haga clic en Cerrar en la ventana de grabación para guardar el archivo de película.
- Retire la tapa. Recupere cuidadosamente los peces y devuélvalos a su tanque.
- Repita los pasos 3.5 a 3.12 para todos los grupos de peces.
- Una vez que finalice la grabación de la película para todos los grupos, convierta películas de videos de 70 fps a videos de 20 fps con el guión MovieProcessing_v5.bat . Para ello, mueva el archivo de script a la carpeta que contiene los vídeos sin procesar. Haga clic derecho en el archivo y elija Ejecutar.
Nota : el script se ejecuta automáticamente. Aparecerá una ventana del símbolo del sistema que muestra el progreso del script. El paso anterior es opcional. Reduce el número de fotogramas en un video de 15 minutos de 63,000 a 18,000 cuadros y hace que la SwimBehavior_v7. El script R se ejecuta más rápidamente. - Vacíe el túnel y guarde todo el equipo.
4. Análisis de películas para la evaluación del comportamiento de natación
NOTA: La grabación y el análisis de películas se pueden completar en días separados.
- Abra el script Tracking_v2.ijm en Fiji y haga clic en Ejecutar para comenzar el programa. En la ventana que aparece, elija la carpeta que contiene las películas de comportamiento de natación para realizar un seguimiento y haga clic en Abrir. Busque el fotograma 1 de la primera película, un cuadro de diálogo y el administrador de región de interés (ROI) que aparecerá.
- Siga las instrucciones indicadas en el cuadro de diálogo. Cree un ROI de la parte inferior de la cámara del túnel de natación y haga clic en Aceptar. Asegúrese de que no se vean esquinas negras.
NOTA: La ventana de umbral se abrirá junto con un fotograma 1 editado y con umbral. - Cambie el esquema de color de B&W a Rojo. Ajuste el valor máximo hasta que el fotograma 1 muestre el pez en rojo y nada más. Registre el umbral. Haga clic en Aceptar en el cuadro de diálogo.
NOTA: El programa se ejecutará automáticamente. El ROI que se realizó para el fotograma 1 se seleccionará y no se seleccionará continuamente para los fotogramas posteriores. Una barra de progreso supervisará el proceso en la esquina inferior derecha de la ventana de Fiji . El seguimiento tarda unos 40 minutos por película. Cuando se rastreen todas las películas, el programa de Fiji se detendrá. El ROI dejará de ser seleccionado. La carpeta que contiene las películas ahora tendrá un archivo _raw.csv para cada película. Fiji puede cerrarse en este momento. - Alinear, ensamblar y adquirir estadísticas descriptivas
- Abra el Behavior_v7 de natación. Script R en R Studio.
- Haga clic en Fuente en la esquina superior derecha de la sección de script. En una nueva ventana que se abre, elija la carpeta que contiene los archivos _raw.csv generados por Fiji. Haga clic en Abrir.
NOTA: El programa se ejecutará automáticamente. - En un cuadro de diálogo que aparece pidiendo que se confirme el número de peces de cada película, haga clic en Sí si los números indicados son correctos o en No si los números son incorrectos.
NOTA: Si se hizo clic en No , aparecerá un mensaje solicitando que se vuelvan a rastrear las películas con un nuevo ROI y umbral. Si se hizo clic en Sí , el programa continuará. - En la nueva ventana que se abre preguntando si se deben eliminar los peces que no nadan, haga clic en Sí o No.
NOTA: Los peces que no nadan se definen como peces con menos del 50% de actividad a 10 cm / s. No se recomienda que se eliminen los peces que no nadan. - En una nueva ventana emergente que pregunta si los grupos no están cegados y si al usuario le gustaría combinar algún grupo, desenmascarar o combinar grupos si hay más de un grupo de control.
- Después de dar una respuesta para la pregunta anterior, asegúrese de que el programa da un mensaje Alineando el archivo X de Y, donde X es el archivo actual que se está alineando e Y es el número total de archivos a alinear. Se necesitan aproximadamente 30 s para que cada archivo se alinee.
- Una vez alineados los archivos, compruebe si hay un nuevo archivo de .csv generado con el mismo nombre (_aligned.csv). Asegúrese de que el programa combina los datos, ejecuta estadísticas y traza gráficos de salida. Compruebe si hay los archivos de análisis generados en una nueva carpeta denominada Resultados dentro de la carpeta principal que contiene los archivos _raw.csv y _aligned.csv .
- En la carpeta Resultados , busque dos carpetas denominadas Diagnósticos y gráficos y cuatro archivos de .csv denominados BulkData_Avg, BulkData_Full, SummaryData_Avg y SummaryData_Full.
NOTA: El SummaryData_Full.csv contiene los datos individuales de cada pez en cada grupo en cada punto de tiempo. Estos datos se trazan automáticamente, pero se pueden extraer y trazar en otro lugar.- Asegúrese de que la carpeta Gráficos contiene los gráficos generados por el programa y .csv archivos que contienen los puntos de datos para cada gráfico.
- Asegúrese de que la carpeta Diagnósticos contiene un único archivo .csv con datos de diagnóstico para los archivos alineados.
NOTA: Las columnas del archivo Diagnostics.csv incluyen lo siguiente: a) El número de fotogramas que contienen objetos adicionales, que debe ser inferior a 100. Demasiados fotogramas con objetos adicionales sugieren un problema con el seguimiento. b) El número de fotogramas con objetos faltantes o fusionados. Es normal que esta métrica sea alta. Los peces que no se han regenerado bien con frecuencia serán arrastrados a la parte posterior del túnel y se contarán como desaparecidos. c) Fotogramas con saltos de más de 240 píxeles. Este número aumenta con el número de objetos (peces) en una sola película. Una explicación detallada de cómo se calcularon las métricas de comportamiento se proporciona en el Archivo Suplementario 1.
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Representative Results
Configuramos el túnel de natación como se describe en la sección 1 de este protocolo (Figura 1). Se evaluó la resistencia a la natación (sección 2 de este protocolo), así como el comportamiento de natación (secciones 3 y 4 de este protocolo) del pez cebra adulto al inicio y después de la lesión de la médula espinal (Figura 2).
Para establecer la función motora de referencia, examinamos la resistencia a la natación del pez cebra de tipo salvaje bajo velocidades crecientes de corriente de agua (Figura 3A). En este ensayo, el pez cebra de tipo salvaje nadó durante 41 minutos antes de agotarse. Los peces fueron sometidos a transecciones completas de la médula espinal como se describió anteriormente y se realizaron ensayos de resistencia a la natación6. Después de anestesiar el pez cebra con MS-222, se realiza una pequeña incisión con tijeras finas para transectar la médula espinal 4 mm caudal a la región del tronco encefálico. Se confirmó visualmente una transección completa. Para confirmar la pérdida de la capacidad de natación después de la cirugía de la médula espinal, los animales lesionados se evaluaron a los 2 o 3 días después de la lesión (dpi). En este punto de tiempo, el pez cebra está completamente paralizado caudal al sitio de la lesión. La resistencia a la natación se evaluó a las 2, 4 y 6 semanas después de la lesión (wpi). A 2 wpi, los peces lesionados perdieron el 60% de su capacidad de resistencia a la natación (Figura 3A). Los peces regeneradores recuperaron gradualmente la resistencia a nadar a 4 y 6 wpi. Estos resultados indicaron que el pez cebra de tipo salvaje es capaz de recuperar la capacidad de resistencia a la natación después de una lesión de la médula espinal.
Para examinar el comportamiento de nado del pez cebra durante la regeneración de la médula espinal, rastreamos el comportamiento de natación de animales de tipo salvaje a una velocidad de corriente de agua de 0 cm / s o bajo velocidades de corriente constantes y bajas de 10 y 20 cm / s (Figura 3B). Se utilizaron pistas promedio de la posición de los peces en la cámara del túnel de natación para la evaluación visual del comportamiento de la natación a bajas velocidades de corriente (Figura 3B). En este ensayo, los controles ilesos nadaron constantemente en la parte delantera de la cámara del túnel de natación (más cerca de la fuente de corriente de agua), lo que corresponde a una posición Y elevada (Figura 3B). En contraste, a 2 wpi, los peces heridos no pudieron mantener una capacidad de natación constante contra la corriente. En consecuencia, sus pistas de natación son más irregulares con una disminución general en la posición Y (Figura 3B). La posición Y aumentó a 4 y 6 wpi, lo que indica que los animales regeneradores recuperaron gradualmente su capacidad de nadar en la parte delantera de la cámara del túnel de natación. Para cuantificar los parámetros de comportamiento de natación, calculamos el porcentaje de actividad, la posición en el túnel de natación (posición Y) y el tiempo nadado contra la corriente (Figura 3C-E). En relación con los controles no lesionados, los animales lesionados a 2 wpi fueron marcadamente menos activos (Figura 3C), se estancaron en el cuadrante posterior del túnel de natación (Figura 3D) y perdieron su capacidad de nadar contra bajas velocidades de corriente (Figura 3E). De acuerdo con su capacidad innata para lograr la recuperación funcional, los animales lesionados normalizaron gradualmente los parámetros de comportamiento de natación a 4 y 6 wpi (Figura 3C-E). Los parámetros de resistencia a la natación y comportamiento de natación juntos ofrecieron lecturas cuantificables de la función de natación y la reparación funcional de la médula espinal en el pez cebra.
Figura 1: Configuración del túnel de natación y tapas personalizadas. (A) Imágenes representativas de la configuración del túnel de natación, incluidas las vistas superiores y laterales ampliadas de la cámara del túnel de natación. (B) Imágenes de las tapas del túnel de natación utilizadas para las diversas aplicaciones descritas en este protocolo. Se utiliza una tapa de túnel de natación estándar y completamente cerrada para los ensayos de comportamiento de natación (sección 3 de este protocolo). Para la calibración se utiliza una tapa de túnel de natación modificada que acomoda un medidor de flujo digital de mano (sección 1 de este protocolo). Una tapa de resistencia a la natación modificada, que contiene una tapa extraíble en el extremo posterior de la cámara del túnel de natación, permite la eliminación de peces agotados durante las pruebas de resistencia a la natación (sección 2 de este protocolo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Tubería experimental para evaluar la resistencia a la natación y el comportamiento de natación en peces cebra adultos. Para la resistencia a la natación, los peces nadaron contra una corriente de agua creciente hasta el agotamiento. Para el comportamiento de natación, los parámetros de natación se evalúan en ausencia y a bajas velocidades de corriente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Recuperación funcional en pez cebra de tipo salvaje después de una lesión de la médula espinal. (A) Función motora determinada por ensayos de resistencia a la natación para peces cebra de tipo salvaje en la línea de base y 2, 4 y 6 wpi. Los puntos denotan animales individuales de dos experimentos independientes. (B) Los ensayos de comportamiento de natación rastrearon peces cebra de tipo salvaje bajo bajas velocidades de corriente de agua. La posición Y promedio se muestra en cada punto de tiempo a lo largo del seguimiento (0 cm / s durante 5 min, 10 cm / s durante 5 min y 20 cm / s durante 5 min). (C-E) El porcentaje de actividad (C), la posición promedio Y en el túnel (D) y el tiempo nadado contra el flujo (E) se cuantificaron a 20 cm / s. Para todas las cuantificaciones, se muestran dos experimentos independientes. n = 30 en la condición previa a la lesión; n = 23 en 2 wpi, n = 20 en 4 wpi, n = 18 en 6 wpi. Se utilizó ANOVA unidireccional para los análisis estadísticos. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001; P < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo complementario 1: Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El pez cebra adulto es un sistema popular de vertebrados para modelar enfermedades humanas y estudiar mecanismos de regeneración de tejidos. La edición del genoma CRISPR/Cas9 ha revolucionado los estudios genéticos inversos para modelar enfermedades en peces cebra; sin embargo, la genética a gran escala en peces cebra adultos se ha visto obstaculizada por desafíos biológicos y técnicos, incluida la falta de disponibilidad de tejidos adultos de pez cebra para fenotipos de alto rendimiento. Dada la compleja anatomía del pez cebra adulto, se requiere un procesamiento histológico prolongado para obtener y analizar la arquitectura del tejido. Los ensayos de resistencia a la natación y comportamiento de natación descritos en este estudio se pueden usar para detectar fenotipos neurales, musculares o esqueléticos a un rendimiento medio antes de la histología. Además, como los estudios de regeneración de tejidos tienen como objetivo mejorar la reparación funcional de tejidos, los protocolos descritos en este estudio serán ampliamente aplicables, si no esenciales, para estudios de investigación de regeneración neural, muscular y esquelética.
Los ensayos de locomoción funcional han sido parte integral de nuestra comprensión del desarrollo y la regeneración neuronal. Los ensayos locomotores estándar están ampliamente disponibles en especies de vertebrados, incluidas ratas, ratones y larvas de pez cebra. Los sistemas modelo de ratón y rata tienen ensayos de locomoción conductual y funcional como el BMS16 y el BBB17,18, respectivamente. Del mismo modo, se han descrito una serie de protocolos para medir la locomoción, la respuesta de sobresalto y el comportamiento en larvas de pez cebra. Estos protocolos son eficientes para revelar diferencias de comportamiento entre grupos experimentales en ambientes claros y oscuros, evasión de depredadores y actividad19,20,21. Aquí, describimos métodos cuantificables y reproducibles para medir la recuperación funcional después de una lesión de la médula espinal en peces cebra adultos.
Tenga en cuenta que este estudio presenta varias limitaciones. En primer lugar, los estudios conductuales dependen en gran medida de factores genéticos y ambientales. Para controlar la variabilidad genética, utilizamos hermanos para controlar la edad, el sexo y los antecedentes genéticos en todos los grupos experimentales22,23. Para controlar los factores ambientales, nos aseguramos de que los experimentos se realicen a la misma hora del día, bajo condiciones controladas de temperatura e iluminación20. En segundo lugar, mientras que el ensayo de comportamiento de natación es menos sensible al análisis sesgado, el investigador que ejecuta el ensayo de resistencia a la natación determina cuándo un pez llega al agotamiento y procede a eliminar los peces agotados de la cámara del túnel de natación sin interrumpir al resto de la cohorte de peces. Por lo tanto, nuestros experimentos de resistencia a la natación fueron realizados por un solo investigador que está cegado a las condiciones experimentales. Es particularmente importante evitar la variabilidad de investigador a investigador para estudios longitudinales de grupos experimentales a lo largo del tiempo. Finalmente, las colisiones entre peces pueden complicar el análisis de seguimiento en los ensayos de comportamiento de natación. Por lo tanto, recomendamos realizar ensayos de comportamiento de natación para grupos de cinco o menos peces para minimizar las posibilidades de colisiones entre peces.
Teniendo en cuenta los pasos críticos, observamos que los peces lesionados pueden ser frágiles, especialmente en los primeros días después de la lesión. Por lo tanto, recomendamos manipular el pescado con extremo cuidado. Para los ensayos de resistencia a la natación, recolectar peces con el tubo de PVC lo más rápido posible, ya sea primero en la cabeza o en la cola, reduce la posibilidad de lesiones secundarias durante el proceso de recolección. Para los ensayos de comportamiento de natación, la bomba de descarga puede ocasionalmente crear olas, distorsionando las películas y causando errores de análisis. En este caso, la bomba de descarga se puede apagar brevemente. Sin embargo, no recomendamos apagar la bomba de descarga durante largos tiempos para garantizar que el agua circule constantemente entre la cámara del túnel de natación y el tanque de amortiguación. El monitoreo de la grabación de películas permite la terminación inmediata y el reinicio de la película si se ha caído un fotograma o un pez se desvía del área de grabación. En consideraciones adicionales, al realizar el análisis de seguimiento, si el código R da un error durante el procesamiento de archivos, el problema más probable está en la nomenclatura de los archivos. El programa está hecho para funcionar bajo una estrategia de nomenclatura muy específica: Timepoint_Group_Subgroup_Stock number_Anything más (por ejemplo, 0_A_1_00001_WildtypeGroupA.avi). Esta nomenclatura permite trazar y alinear varios puntos de tiempo, grupos y subgrupos. Finalmente, si bien los puntos de control se han incorporado en el script de análisis para garantizar un seguimiento adecuado, es importante verificar cuidadosamente el resultado del análisis. El programa preguntará automáticamente si el número de pez es correcto y solicitará películas para volver a analizar si el número de pez es incorrecto. Los artefactos en línea recta pueden aparecer en la gráfica de posición Y promedio, lo que indica que un objeto adicional ha sido reconocido como un pez. En este caso, el mejor curso de acción es mirar cuidadosamente la película para excluir artefactos adicionales que tienden a aparecer a una velocidad de flujo más alta.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos al Recurso Compartido de Pez Cebra de la Universidad de Washington por el cuidado de los animales. Esta investigación fue apoyada por el NIH (R01 NS113915 a M.H.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoSwim software | Loligo Systems | MI10000 | Optional - for Automatic control of current velocity |
| Customized lid | Loligo Systems | MI10001 | This customized lid is used for swim endurance |
| DAQ-BT | Loligo Systems | SW10600 | Optional - for Automatic control of current velocity |
| Eheim pump | Loligo Systems | PU10160 | 20 L/min. This pump is placed in theflow-through tank. |
| Fiji | Fiji | Freely available through Image J (Fiji) | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Flowtherm | Loligo Systems | AC10000 | Handheld digital flow meter - for calibration |
| High Speed Camera | Loligo Systems | VE10380 | USB 3.0 color video camera (4MP) |
| IR light panel | Loligo Systems | VE10775 | 450 x 210 mm, placed under the swim tunnel chamber |
| Monofocal lens | Loligo Systems | VE10388 | 25mm manual lens |
| PVC Tubing | VWR | 60985-534 | 5/16 x 7/16" Wall thickness: 1/16" |
| R Studio | R Studio | Freely available. Version 3.6 with extra packages. | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Swim tunnel respirometer | Loligo Systems | SW10060 | 5L (120V/60Hz). The system includes the swim chamber, motor, manual control of water current velocity, 1 pump placed inside the chamber, standard swim tunnel lid for swim behavior, and modified swim tunnel lid for calibration |
| uEye Cockpit | IDS | Freely available software to control camera parameters | Alternative cameras and accompanying softwares could be used |
| Vane wheel flow probe | Loligo Systems | AC10002 | Digital flow probe - for calibration |
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