Summary
Kan funktionell återhämtning efter ryggmärgsskada, vuxna zebrafisk är ett främsta modellsystem för att klargöra medfödda mekanismer för neural regenerering. Här beskriver vi simning uthållighet och simning beteende analyser som funktionella avläsningar av ryggmärgsregenerering.
Abstract
På grund av deras berömda regenerativa kapacitet är vuxna zebrafiskar en främsta ryggradsmodell för att förhöra mekanismer för medfödd ryggmärgsregenerering. Efter fullständig transection av ryggmärgen, zebrafish förlänga glia och axonal broar över avhuggna vävnad, regenerera nervceller proximal till lesion och återfå sin simning kapacitet inom 8 veckor efter skada. Återhämtning av simfunktionen är således en central avläsning för funktionell ryggmärgsreparation. Här beskriver vi en uppsättning beteendeanalyser för att kvantifiera zebrafiskmotorkapaciteten inuti en sluten simtunnel. Målet med dessa metoder är att tillhandahålla kvantifierbara mätningar av simning uthållighet och simning beteende hos vuxna zebrafisk. För simning uthållighet utsätts zebrafisk för en ständigt ökande vattenströmhastighet tills utmattning och tid vid utmattning rapporteras. För bedömning av simbeteende utsätts zebrafisk för låg strömhastighet och simvideor fångas med en dorsal vy över fisken. Procentaktivitet, burst-frekvens och tid som spenderas mot vattenströmmen ger kvantifierbara avläsningar av simbeteende. Vi kvantifierade simning uthållighet och simning beteende i vilda-typ zebrafisk före skada och efter ryggmärgen transection. Vi fann att zebrafisk förlorar simfunktion efter ryggmärgstransection och gradvis återfå den kapaciteten mellan 2 och 6 veckor efter skada. De metoder som beskrivs i denna studie kan tillämpas på neurobehavioral, muskuloskeletal, skelettmuskulatur regenerering och neurala regenerering studier i vuxna zebrafisk.
Introduction
Vuxna zebrafiskar används i högsta grad för att undersöka mekanismer för neuromuskulär och muskuloskeletal utveckling och sjukdomsmodellering1,2,3. Zebrafisk kan effektivt, spontant reparera flera vävnader, inklusive hjärnan, ryggmärgen och skelettmuskeln4,5,6,7. Den anmärkningsvärda kapaciteten att regenerera neuromuskulära vävnader och modellsjukdomar lockar ett växande vetenskapligt samhälle till vuxen zebrafiskforskning1,2,3. Men medan analyser av rörelse och badbeteende finns tillgängliga och standardiseras för larv zebrafisk, finns det ett växande behov av att utveckla analoga protokoll hos vuxna fiskar8,9,10,11. Målet med denna studie är att beskriva protokoll för att kvantifiera simning uthållighet och simning beteende hos vuxna zebrafisk. Vi presenterar dessa protokoll i samband med ryggmärgsregenerering forskning. De beteendemässiga protokoll som beskrivs här är dock lika tillämpliga på studier av neurala och muskel regenerering, neuromuskulära och muskuloskeletala utveckling, liksom neuromuskulära och muskuloskeletala sjukdom modellering.
Zebrafish omvänd förlamning inom 8 veckor efter fullständig ryggmärgstransection. Till skillnad från dåligt regenerativa däggdjur visar zebrafisk proregenererande immun-, neuronal- och gliaskada svar som krävs för funktionell ryggmärg reparation12,13,14. En ultimat avläsning av funktionella ryggmärg reparation är förmågan hos lesionerade vävnad att återfå sin funktion efter skada. En serie standardiserade metoder för att bedöma funktionell regenerering hos gnagare inkluderar lokomotoriska, motoriska, sensoriska och sensorimotoriska tester15,16,17. Allmänt använda tester i mus ryggmärgsskada inkluderar lokomotor Basso Mouse Scale (BMS), forelimb motor tester, taktila sensoriska tester och grid walking sensorimotor tester15,17. I motsats till däggdjur eller larv zebrafisksystem är beteendetester hos vuxna zebrafiskar mindre utvecklade, men ändå välbehövliga för att tillgodose de växande behoven hos vävnadsregenererings- och sjukdomsmodelleringssamhällena.
Kompletta ryggmärgstransections resulterar i fullständig förlamning caudal till skadeplatsen. Kort efter skadan är förlamade djur mindre aktiva och undviker att simma så mycket som möjligt. För att kompensera för förlorad simkapacitet visar förlamade djur korta, frekventa utbrott genom att överanvända sina bröstfenor, som ligger rostral till lesion. Denna kompensatoriska simstrategi resulterar i snabb utmattning och lägre simkapacitet. När zebrafisk ryggmärgen regenererar, djur återfår en smidig oscillatory simning funktion caudal till lesion, vilket möjliggör ökad simning uthållighet och förbättrade simning beteende parametrar. Här beskriver vi metoder för att kvantifiera zebrafisk simma uthållighet vid ökande vattenström hastigheter och simma beteende vid låg ström hastigheter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vuxna zebrafiskar av stammarna Ekkwill och AB bibehölls vid Washington University Zebrafish Core Facility. Alla djurförsök utfördes i enlighet med IACUC institutionella djurprotokoll.
OBS: Ett exempel på den experimentella installationen visas i figur 1A. Kalibreringslocket (anpassat), bad uthållighetslocket (anpassat) och badbeteendelocket (standard, slutet tunnellock) visas i figur 1B. Det experimentella arbetsflödet presenteras i figur 2.
1. Förberedelse och kalibrering av simtunneln
- Fyll simtunneln och den omgivande bufferttanken med zebrafisksystemvatten (10 L filtrerat vatten; alkalinitet: 50-150 mg/L CaCO3; pH: 6,8-7,5; temperatur: 26-28,5 °C; nitrat < 50 mg/L; nitrit < 0,1 mg/L; och salthalt < 0,5 g/ L).
- Fyll en extra genomströmningstank med zebrafisksystemvatten (≈7,5 L). Placera simtunneln och genomflödestanken så att överskott av zebrafisksystemvatten kan strömma från bufferttanken in i flödestanken genom ett utflödesrör som är säkrat på sidan av bufferttanken.
- När tunneln och bufferttanken är fyllda utför du följande.
- Placera spolpumpen inuti bufferttanken och anslut den till den intilliggande simtunneln med PVC-rör. Placera genomströmningspumpen i genomflödestanken och anslut den till bufferttankens vägg.
- Slå på spolpumpen inuti bufferttanken och den genomströmningspump som finns i genomströmningstanken för att påbörja vattencirkulationen.
OBS: Systemet med dubbla pumpar säkerställer kontinuerligt vattenflöde in i simtunneln (från spolpumpen) och in i bufferttanken (från genomflödespumpen). - Rensa eventuella luftbubblor som fastnat i simtunneln genom att gradvis öka vattenströmshastigheten från 10 cm/s till 100 cm/s i intervaller om 10 cm/s. Minska hastigheten tillbaka till 0 cm/s i intervaller om 10 cm/s. Om du vill styra flödeshastigheten klickar du på upp- och nedpilarna i avsnittet Hastighet i programvaran för flödeshastighetskontroll (se Tabell över material).
OBS: Motorn och rotorn är anslutna till den medföljande datorn. Programvaran för flödeshastighetskontroll kommunicerar med motorn för att skapa önskad flödeshastighet. Det är valfritt att använda programvaran för flödeshastighetskontroll. Alternativet är att manuellt styra vattenströmsmotorn.
- Kalibrering
OBS: Kalibrering krävs före varje experiment.- Använd kalibreringslocket för att stänga simtunneln.
OBS: Kalibreringslocket är anpassat med en förstärkt centralöppning som passar flödesmätarsonden som används för kalibrering (bild 1B). Åtta wingnuts används för att fästa alla lock till tunneln. - Slå på den digitala flödesmätaren och anslut den till flödesmätarsonden. Placera flödesmätarsonden inuti simtunneln via kalibreringslocket. Placera bladen på flödesmätarsonden vinkelrätt mot flödets riktning.
- Kalibrera simtunnelmotorns utgång (styrd med programvaran för flödeshastighetskontroll) med hjälp av den digitala flödesmätaren. Det gör du genom att utföra följande steg.
- Öppna programvaran för flödeshastighetskontroll och klicka på Kalibrering.
- Ändra alternativen längst upp till vänster till RPM vs Spänning. Öka flödeshastigheten från 0 cm/s till 100 cm/s i steg om 5 cm/s genom att skriva värdena i avsnittet Hastighet i programvaran för flödeshastighetskontroll. Vid varje steg klickar du på "+" -knappen och registrerar den aktuella hastigheten som indikeras av den digitala flödesmätaren.
OBS: Det resulterande linjära förhållandet bör ha ett R2-värde nära 1. - För att bekräfta kalibreringen, öka vattenströmmens hastigheter från 0 till 10, 25, 50, 75 och 100 cm/s och minska sedan hastigheterna till 75, 50, 25, 10 cm/s med hjälp av upp- och nedpilarna i Uwater [cm/s] delen av flödeshastighetskontrollprogramvaran . Vid varje hastighet (från programvaran) mät och registrera motsvarande hastighet som indikeras av den digitala flödesmätaren.
- Tänk på tunneln kalibrerad och exakt om de uppmätta vattenströmhastigheterna ligger inom en avvikelse på ±2 cm/s. Om avvikelsen är längre än ±2 cm/s, upprepa steg 1.4.4 till 1.4.6 för att säkerställa korrekt kalibrering.
- Använd kalibreringslocket för att stänga simtunneln.
2. Bedömning av simning uthållighet
OBS: Experimentella grupper är indelade i grupper om 10 eller färre djur för simning uthållighet.
- Ställ in programvaran för flödeshastighetskontroll.
OBS: Användningen av programvaran för flödeshastighetskontroll i det här avsnittet är valfri. Alternativet är att manuellt styra vattenströmsmotorn. För manuell vattenströmskontroll, fortsätt till steg 2.3 och öka vattenströmshastigheten manuellt i de angivna stegen i steg 2.5 och 2.6.- Öppna programvaran för flödeshastighetskontroll. Klicka på rutan Experiment. Ta kontroll av Uswim och Uwater.
- Ändra flödeshastigheten i Uwater [cm/s] rutan längst ner till vänster för justering av vattenströmshastigheter.
- Om du vill starta ett automatiserat protokoll klickar du på rutan Starta loggning . I dialogfönstret som öppnas väljer du Automatiserat i listrutan.
- Om du vill välja en tidigare sparad protokollfil klickar du på filikonen bredvid Protokollfil för att öppna önskat protokoll.
- Konfigurera utdatafilen genom att klicka på filikonen bredvid Loggfil. I filutforskarens fönster som öppnas namnger du utdatafilen och sparar den på önskad plats.
- Ställ in ett fönster för delad varvtidare. Se till att ha samtidig åtkomst till programvaran för flödeshastighetskontroll och timerfönster på datorskärmen.
- Sätt upp en fisksamlingstank för att hysa utmattad fisk efter att de tagits bort från simtunneln. Fyll uppsamlingstanken med zebrafisksystemvatten (0,75 L). Fyll ett långt PVC-rör med zebrafisksystemvatten.
- Placera ena änden (slutet 1) av det förfyllda PVC-röret i uppsamlingstanken och den andra änden (slutet 2) i bufferttanken. Se till att vatten fritt kan strömma från bufferttanken in i uppsamlingstanken.
- Kläm fast PVC-rörets övre ände (slutet 2) med ett bindemedelsklämma för att förhindra vattenflöde. Använd bindemedelsklämman för att styra utflödet av vatten efter behov.
- Stäng simtunneln med hjälp av bad uthållighetslocket.
OBS: Badens uthållighetslock är anpassat med ett simtunnelfönster för att ta bort uttömd fisk från simtunneln, utan att avbryta resten av analysen (figur 1B). - Placera en grupp fiskar i simtunneln. Starta den delade varvt timern samtidigt som du justerar strömhastigheten till 0 cm/s i 5 minuter, 9 cm/s i 5 minuter och 10 cm/s i 5 minuter genom att skriva dessa värden i Uwater [cm/s] delen av programvaran för flödeshastighetskontroll.
OBS: Detta steg kommer att acklimatisera djur till simtunneln och flödesriktningen. - Efter acklimatisering av fisk startar du det automatiserade flödeshastighetskontrollprogrammet som ökar vattenströmshastigheten med 2 cm/s varje minut.
OBS: Fisken simmar tills utmattningen. Utmattad fisk skjuts mot baksidan av simtunneln. - När en fisk är uttömd, lossa fiskuppsamlingsröret, öppna simtunnelfönstret och samla fisken i uppsamlingstanken. Registrera tiden vid utmattning med hjälp av den delade varv timern.
OBS: Fisk kan ibland driva till baksidan av simtunneln utan att vara uttömd. För att säkerställa att en fisk är uttömd, knacka försiktigt på tunnelns baksida eller skapa en skugga över det området för att stimulera fisken att simma. Utmattad fisk svarar inte på den skrämmande stimulansen och ligger platt i tunnelns bakre ände. - Upprepa steg 2.7 tills all fisk är uttömd och uppsamlad i uppsamlingstanken. Klicka på knappen Nödstopp på programvaran för flödeshastighetskontroll och stoppa timern.
OBS: Dubbelkolla under hela simningen om antalet fiskar som tas bort från badtunnelkammaren matchar de registrerade tiderna. - Upprepa steg 2.5 till 2.8 för varje grupp av fisk.
OBS: Protokollet kan pausas här, men för att vara exakt till tidpunkten efter skadan rekommenderas att filmer och uthållighetssimningar utförs samma dag. Tunneln kan fortsätta cirkulera medan experimenten pausas.
3. Fånga videor för badbeteendeanalys
OBS: Endast upp till fem djur kan spåras åt gången. Om försöksgrupper är större än fem djur kan flera videor tas för varje grupp, där den första videon spårar fem eller färre djur och den andra videon spårar de andra fem eller färre djuren. För longitudinella studier som syftar till att spåra enskilda djur över tid kan fisk inhysas individuellt och spåras över flera tidpunkter. Alla skript för spårning och analys är tillgängliga via GitHub (se Tabell över material).
- Slå på den infraröda ljuspanelen som finns under simtunneln. Fäst kameran på ett takfäste ovanpå simtunneln. Justera fokus- och bländarringar.
Obs: Fokus- och bländarinställningarna beror på avståndet mellan kameran och simtunneln, liksom ljusmiljön. - Öppna kamerainspelningsprogramvaran (se Materialförteckning). Ställ in programvaruinställningarna enligt följande.
- Klicka på 1:4-bildvisningen. Se till att synfältet täcker hela simtunneln. Inaktivera automatisk kontrast och automatisk vitbalans för att normalisera bakgrunden och kontrasten mellan grupper.
- Öppna fönstret Kameraegenskaper genom att klicka på skiftnyckelikonen. Ställ in parametrarna enligt följande: Pixel Clock: 344 MHz, Bildhastighet: 70 fps, klicka på rutan bredvid Håll för att kontrollera den, Exponeringstid: 0.290 ms. Stäng inte det här fönstret.
- Beskär inspelningsfönstret så att det endast täcker tunnelns badkammare genom att luta/vrida kameran efter behov.
- Öppna inspelningsfönstret genom att klicka på filmrulleikonen. Ställ in inspelningsinställningarna på följande sätt:
- Markera kryssrutan för maximalt antal bildrutor.
- Mata in 63 000 manuellt för antalet bildrutor.
- Markera rutan för Beräkna bildhastighet. Detta gör det möjligt för programmet att dra den bildhastighet som definieras i steg 3.2.2 (70 fps).
- Ändra JPEG-kvaliteten till 30.
- Spela in en testkörning.
- Klicka på Skapa och namnge den nya filen Testa och spara den på skrivbordet.
- Gå tillbaka till inspelningsfönstret och klicka på Spela in. Låt testfilmen köras under protokollets hela varaktighet (15 min).
- När testet är klart ser du till att det inte finns några tappade ramar och att 63 000 bildrutor registreras.
- Placera en grupp fiskar i badtunneln och stäng tunneln med ett standardlock med helt sluten lock (figur 1B).
OBS: Se till att all fisk är i tunneln innan du drar åt locket helt. Se till att det inte finns några luftbubblor under locket. Detta kommer annars att påverka resultaten. - Öppna ett nytt inspelningsfönster och namnge filen. Exempel: 2_A_1_00001_WildtypeGroupA.avi
OBS: Se till att inställningarna är enligt parametrarna i steg 3.2 och 3.3. JPEG-kvaliteten återgår alltid till standard och måste återställas för varje ny film.
VARNING: Klicka inte på spela in ännu. - Påbörja ett nytt experiment med hjälp av programvaran för flödeshastighetskontroll.
Om du vill starta ett automatiserat protokoll klickar du på rutan Starta loggning . I dialogfönstret som öppnas väljer du Automatiserat i listrutan. Om du vill välja en tidigare sparad protokollfil klickar du på filikonen bredvid Protokollfil för att öppna önskat protokoll.- För att påbörja ett manuellt protokoll, ställ in flödeshastigheten på 0 cm/s i 5 min, 10 cm/s i 5 min, följt av 20 cm/s i 5 minuter med Uwater [cm/s] i programvaran för flödeshastighetskontroll .
- Spara den nya datautdatafilen (sparas som en .csv fil) under samma namn som filmfilen och i samma mapp.
VARNING: Klicka inte på start än.
- Placera en pappershandduk eller tygbit på sidan av simtunneln för att säkerställa att alla beteenden beror på fisksimning och inte på grund av ett skrämmande svar som orsakas av rörelse i miljön.
- I snabb följd, se till att vattnet är lugnt och att inga krusningar rör sig över ramen. Klicka på Spela in i kameraprogramfönstret för att börja spela in filmfilen. Klicka på Starta i programvaran för flödeshastighetskontroll för att starta protokollet, som fortsätter oavbrutet.
- Titta på filmen för att se till att inga bildrutor tappas, att det inte finns några bubblor i synfältet och att all fisk spelas in.
- När filminspelningen är klar klickar du på Nödstopp för att avsluta flödeshastighetskontrollprotokollet. Sök efter den datautmatningsfil som sparas automatiskt. Klicka på Stäng i inspelningsfönstret för att spara filmfilen.
- Ta bort locket. Hämta försiktigt fisken och returnera dem till deras tank.
- Upprepa steg 3.5 till 3.12 för alla grupper av fisk.
- När filminspelningen är klar för alla grupper konverterar du filmer från 70 fps-videor till 20 fps-videor med MovieProcessing_v5.bat-skript . Det gör du genom att flytta skriptfilen till mappen som innehåller de obehandlade videorna. Högerklicka på filen och välj Kör.
Skriptet körs automatiskt. Ett kommandotolksfönster visas som visar skriptets förlopp. Ovanstående steg är valfritt. Det minskar antalet bildrutor i en 15 minuters video från 63 000 till 18 000 bildrutor och gör SwimBehavior_v7. R-skriptet körs snabbare. - Töm tunneln och lägg undan all utrustning.
4. Analysera filmer för bedömning av simbeteende
FILMinspelning och analys kan slutföras på separata dagar.
- Öppna skriptet Tracking_v2.ijm i Fiji och klicka på Kör för att starta programmet. I fönstret som dyker upp väljer du mappen som innehåller simbeteendefilmerna för att spåra och klicka på Öppna. Leta efter bildruta 1 i den första filmen, en dialogruta och roi-chefen (region of interest) som kommer upp.
- Följ anvisningarna i dialogrutan. Skapa en ROI längst ner i badtunnelkammaren och klicka på OK. Se till att inga svarta hörn syns.
Tröskelfönstret öppnas tillsammans med en redigerad, trösklar ram 1. - Ändra färgschemat från B&W till Rött. Justera maxvärdet tills bildruta 1 visar fisken i rött och inget annat. Registrera tröskelvärdet. Klicka på OK i dialogrutan.
Programmet körs automatiskt. Avkastningen som gjordes för bildruta 1 kommer att väljas och omarkeras kontinuerligt för efterföljande bildrutor. Ett framstegsfält kommer att övervaka processen längst ned till höger i Fiji-fönstret . Spårning tar cirka 40 min per film. När alla filmer spåras kommer Fiji-programmet att sluta. Avkastningen på investeringen slutar att väljas. Mappen som innehåller filmerna kommer nu att ha en _raw.csv-fil för varje film. Fiji kan stängas vid denna tidpunkt. - Justera, sammanställa och skaffa beskrivande statistik
- Öppna swim Behavior_v7. R-manus i R Studio.
- Klicka på Källa i det övre högra hörnet av skriptavsnittet. I ett nytt fönster som öppnas väljer du mappen som innehåller _raw.csv filer som genereras av Fiji. Klicka på Öppna.
Programmet körs automatiskt. - Klicka på Ja om de angivna siffrorna är korrekta i en dialogruta som dyker upp och ber om att bekräfta antalet fiskar i varje film.
Om du klickar på Nej visas ett meddelande där du ber om att filmerna ska spåras igen med en ny ROI och tröskel. Om Ja klickades fortsätter programmet. - I det nya fönstret som öppnas och fråga om den icke-simmande fisken ska tas bort klickar du på Ja eller Nej.
OBS: Icke-simmande fisk definieras som fisk med mindre än 50% aktivitet vid 10 cm/s. Det rekommenderas inte att icke-simmande fisk avlägsnas. - I ett nytt popup-fönster som frågar om grupperna är olindade och om användaren vill kombinera grupper, avblinda eller kombinera grupper om det finns mer än en kontrollgrupp.
- När ett svar har getts för föregående fråga, se till att programmet ger ett meddelande Justera fil X av Y, där X är den aktuella filen som justeras och Y är det totala antalet filer att justera. Det tar cirka 30 s för varje fil att justeras.
- När filerna har justerats söker du efter en ny .csv fil som genereras med samma namn (_aligned.csv). Kontrollera att data kombineras, statistik körs och diagram utdatadiagram kombineras. Sök efter analysfilerna som genereras i en ny mapp med etiketten Resultat i den överordnade mappen som innehåller _raw.csv - och _aligned.csv-filerna .
- I mappen Resultat söker du efter två mappar med namnet Diagnostik och diagram och fyra .csv filer med namnet BulkData_Avg, BulkData_Full, SummaryData_Avg och SummaryData_Full.
OBS: Den SummaryData_Full.csv innehåller individuella data för varje fisk i varje grupp vid varje tidpunkt. Dessa data ritas automatiskt men kan extraheras och ritas någon annanstans.- Kontrollera att mappen Diagram innehåller de diagram som genereras av programmet och .csv filer som innehåller datapunkterna för varje diagram.
- Kontrollera att mappen Diagnostik innehåller en enda .csv fil med diagnostikdata för justerade filer.
OBS: Kolumner i filen Diagnostik.csv innehåller följande: a) Antalet bildrutor som innehåller extra objekt, som bör vara mindre än 100. För många bildrutor med extra objekt tyder på ett problem med spårningen. b)Antalet bildrutor med saknade eller sammanfogade objekt. Det är normalt att det här måttet är högt. Fisk som inte har regenererats väl kommer ofta att sopas till baksidan av tunneln och kommer att räknas som saknad. c) Ramar med fler än 240 bildpunkter. Det här antalet ökar med antalet objekt (fiskar) i en enda film. En detaljerad förklaring av hur beteendemåtten beräknades finns i kompletterande fil 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi satte upp simtunneln enligt beskrivningen i avsnitt 1 i detta protokoll (figur 1). Vi bedömde simning uthållighet (avsnitt 2 i detta protokoll) samt simning beteende (avsnitt 3 och 4 i detta protokoll) av vuxna zebrafisk vid baslinjen och efter ryggmärgsskada (figur 2).
För att fastställa baslinjemotorisk funktion undersökte vi simning uthållighet av vilda zebrafisk under ökande vattenström hastigheter (figur 3A). I denna analys simmade zebrafisk av vild typ i 41 minuter innan den blev utmattad. Fisk utsattes sedan för fullständiga ryggmärgstransections som tidigare beskrivits och simning uthållighet analyser utfördes6. Efter bedövning zebrafisk med MS-222 görs ett litet snitt med fin sax för att transect ryggmärgen 4 mm caudal till hjärnstammen regionen. En fullständig omkastning bekräftades visuellt. För att bekräfta förlusten av simkapacitet efter ryggmärgskirurgi bedömdes skadade djur 2 eller 3 dagar efter skada (dpi). Vid denna tidpunkt är zebrafisk helt förlamad caudal till lesionsplatsen. Simning uthållighet bedömdes vid 2, 4 och 6 veckor efter skada (wpi). Vid 2 wpi förlorade lesionerad fisk 60% av sin simning uthållighet kapacitet (figur 3A). Regenererande fisk återfick gradvis bad uthållighet vid 4 och 6 wpi. Dessa resultat anges att vilda zebrafisk kan återfå simning uthållighet kapacitet efter ryggmärgsskada.
För att undersöka zebrafisk simning beteende under ryggmärg regenerering, spårade vi simbeteendet hos vilda djur vid 0 cm/s vattenström hastighet eller under konstant, låg ström hastigheter på 10 och 20 cm/s (figur 3B). Genomsnittliga spår av fiskposition i simtunnelkammaren användes för visuell bedömning av simbeteende vid låg nuvarande hastigheter (figur 3B). I denna analys simmade oskadda kontroller stadigt i den främre delen av simtunnelkammaren (närmare vattenströmmens källa), vilket motsvarar ett förhöjt Y-läge (figur 3B). Däremot, vid 2 wpi, kunde skadad fisk inte upprätthålla stadig simkapacitet mot strömmen. Följaktligen är deras simbanor mer oregelbundna med en total minskning av Y-positionen (figur 3B). Y-positionen ökade vid 4 och 6 wpi, vilket indikerar att regenererande djur gradvis återfick sin förmåga att simma framför simtunnelkammaren. För att kvantifiera parametrar för simbeteende beräknade vi procentaktiviteten, positionen i simtunneln (Y-läge) och tiden simmade mot strömmen (bild 3C-E). I förhållande till oskadda kontroller var lesionerade djur vid 2 wpi markant mindre aktiva (figur 3C), stannade i den bakre kvadranten i simtunneln (figur 3D) och förlorade sin förmåga att simma mot låg strömhastigheter (figur 3E). Överensstämmer med deras medfödda förmåga att uppnå funktionell återhämtning, lesionerade djur gradvis normaliserade simning beteende parametrar vid 4 och 6 wpi (figur 3C-E). Parametrarna för simning uthållighet och simning beteende tillsammans erbjöd kvantifierbara avläsningar av simfunktion och funktionell ryggmärg reparation i zebrafisk.
Bild 1: Simtunneln och anpassade lock. (A) Representativa bilder av simtunneln som ställts in, inklusive zoomade över- och sidovyer av simtunnelkammaren. B) Bilder av badtunnellocken som används för de olika tillämpningar som beskrivs i detta protokoll. Ett standardlock för simtunnel används för simbeteendeanalyser (avsnitt 3 i detta protokoll). Ett modifierat badtunnellock som rymmer en handhållen digital flödesmätare används för kalibrering (avsnitt 1 i detta protokoll). Ett modifierat bad uthållighetslock, som innehåller ett avtagbart lock i den bakre änden av simtunnelkammaren, gör det möjligt att avlägsna utmattad fisk under simning uthållighetstestning (avsnitt 2 i detta protokoll). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Experimentell pipeline för analys för simning uthållighet och simning beteende hos vuxna zebrafisk. För simning uthållighet simmade fisken mot en ökande vattenström tills utmattning. För simbeteende bedöms simparametrar i avsaknad av och vid låg strömhastighet. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Funktionell återhämtning hos zebrafisk av vild typ efter ryggmärgsskada. A) Motorisk funktion som bestäms av swim endurance-analyser för zebrafisk av vild typ vid baslinjen och 2, 4 och 6 wpi. Prickar betecknar enskilda djur från två oberoende experiment. (B) Badbeteendeanalyser spårade zebrafisk av vild typ under lågvattenströmshastigheter. Den genomsnittliga Y-positionen visas vid varje tidpunkt under hela spårningen (0 cm/s i 5 min, 10 cm/s i 5 min och 20 cm/s i 5 min). (C-E) Procentaktivitet (C), genomsnittlig Y-position i tunneln (D) och tiden simmade mot flödet (E) kvantifierades vid 20 cm/s. För alla kvantifieringar visas två oberoende experiment. n = 30 i tillstånd före skadan. n = 23 vid 2 wpi, n = 20 vid 4 wpi, n = 18 vid 6 wpi. Enkelriktad ANOVA användes för statistiska analyser. Felstaplar representerar standardfelet för medelvärdet (SEM). *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001; P < 0,0001. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Kompletterande fil 1: Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vuxna zebrafiskar är ett populärt ryggradssystem för modellering av mänskliga sjukdomar och studiemekanismer för vävnadsregenerering. CRISPR/Cas9 genomredigering har revolutionerat omvända genetiska studier för modellering av sjukdomar hos zebrafisk; Storskalig genetik hos vuxna zebrafiskar har dock hindrats av biologiska och tekniska utmaningar, inklusive otillgängligheten av vuxna zebrafiskvävnader för fenotypning med hög genomströmning. Med tanke på den komplexa anatomin hos vuxna zebrafiskar krävs långvarig histologisk bearbetning för att erhålla och analysera vävnadsarkitektur. De bad uthållighet och simning beteende analyser som beskrivs i denna studie kan användas för att förscreena för neurala, muskulösa eller skelett fenotyper vid en medium genomströmning före histologi. Dessutom, som studier av vävnad regenerering syftar till att förbättra funktionella vävnad reparation, de protokoll som beskrivs i denna studie kommer att vara allmänt tillämpliga, om inte nödvändigt, för studier av neurala, muskulösa och skelettregenerering forskning.
Funktionella rörelse analyser har varit integrerad i vår förståelse av neurala utveckling och regenerering. Standard lokomotoriska analyser är allmänt tillgängliga hos ryggradsdjur, inklusive råttor, möss och larv zebrafisk. Mus- och råtta modellsystem har beteendemässiga och funktionella rörelseanalyser som BMS16 respektive BBB17,18. På samma sätt har en mängd protokoll beskrivits för att mäta rörelse, skrämmande svar och beteende i larv zebrafisk. Dessa protokoll är effektiva för att avslöja beteendemässiga skillnader mellan experimentella grupper i ljusa och mörka miljöer, rovdjursflykt och aktivitet19,20,21. Här beskriver vi kvantifierbara, reproducerbara metoder för att mäta funktionella återhämtning efter ryggmärgsskada i vuxna zebrafish.
Observera att denna studie uppvisar flera begränsningar. För det första är beteendestudier i hög grad beroende av genetiska och miljömässiga faktorer. För att kontrollera genetisk variabilitet använde vi syskon för att kontrollera ålder, kön och den genetiska bakgrunden över experimentella grupper22,23. För att kontrollera miljöfaktorer såg vi till att experiment utförs vid samma tid på dagen, under kontrollerade temperatur- och ljusförhållanden20. För det andra, medan badbeteendeanalysen är mindre känslig för partisk analys, bestämmer forskaren som kör swim endurance-analysen när en fisk når utmattning och fortsätter att ta bort utmattad fisk från simtunnelkammaren utan att avbryta resten av fiskkohorten. Således utfördes våra simning uthållighetsexperiment av en enda forskare som är blind för experimentella förhållanden. Det är särskilt viktigt att undvika variabilitet mellan forskare och forskare för longitudinella studier av experimentella grupper över tid. Slutligen kan kollisioner mellan fisk komplicera spårningsanalysen i simbeteendeanalyser. Vi rekommenderar därför att du utför badbeteendeanalyser för grupper om fem eller färre fiskar för att minimera risken för kollisioner mellan fisk.
Med tanke på kritiska steg noterar vi att skadad fisk kan vara bräcklig, särskilt i de tidiga dagarna efter skadan. Vi rekommenderar därför att du hanterar fisk med extrem försiktighet. För bad uthållighetsanalyser minskar insamling av fisk med PVC-röret så snabbt som möjligt, antingen huvud eller svans först, risken för sekundära skador under insamlingsprocessen. För simbeteendeanalyser kan spolpumpen ibland skapa vågor, förvränga filmerna och orsaka analysfel. I detta fall kan spolpumpen stängas av en kort stund. Vi rekommenderar dock inte att spolpumpen stängs av under längre tid för att säkerställa att vatten ständigt cirkulerar mellan simtunnelkammaren och bufferttanken. Övervakning av filminspelning möjliggör omedelbar avslutning och omstart av filmen om en bildruta har tappats eller en fisk avviker från inspelningsområdet. I ytterligare överväganden, när du utför spårningsanalysen, om R-koden ger ett fel under filbearbetning, är det mest sannolika problemet vid namngivningen av filerna. Programmet är gjort för att fungera under en mycket specifik namnstrategi: Timepoint_Group_Subgroup_Stock number_Anything annat (till exempel 0_A_1_00001_WildtypeGroupA.avi). Med namngivningen kan flera tidspunkter, grupper och undergrupper ritas och justeras tillsammans. Slutligen, medan kontrollpunkter har byggts in i analysskriptet för att säkerställa korrekt spårning, är det viktigt att noggrant kontrollera analys utdata. Programmet frågar automatiskt om fisknumret är korrekt och uppmanar filmer för omanalys om fisknumret är felaktigt. Raka artefakter kan visas i positionsplanen Genomsnittlig Y, vilket indikerar att ett extra objekt har identifierats som en fisk. I det här fallet är det bästa tillvägagångssättet att noggrant titta på filmen för att utesluta extra artefakter som tenderar att visas med högre flödeshastighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar Washington University Zebrafish Shared Resource för djurvård. Denna forskning stöddes av NIH (R01 NS113915 till M.H.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoSwim software | Loligo Systems | MI10000 | Optional - for Automatic control of current velocity |
| Customized lid | Loligo Systems | MI10001 | This customized lid is used for swim endurance |
| DAQ-BT | Loligo Systems | SW10600 | Optional - for Automatic control of current velocity |
| Eheim pump | Loligo Systems | PU10160 | 20 L/min. This pump is placed in theflow-through tank. |
| Fiji | Fiji | Freely available through Image J (Fiji) | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Flowtherm | Loligo Systems | AC10000 | Handheld digital flow meter - for calibration |
| High Speed Camera | Loligo Systems | VE10380 | USB 3.0 color video camera (4MP) |
| IR light panel | Loligo Systems | VE10775 | 450 x 210 mm, placed under the swim tunnel chamber |
| Monofocal lens | Loligo Systems | VE10388 | 25mm manual lens |
| PVC Tubing | VWR | 60985-534 | 5/16 x 7/16" Wall thickness: 1/16" |
| R Studio | R Studio | Freely available. Version 3.6 with extra packages. | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Swim tunnel respirometer | Loligo Systems | SW10060 | 5L (120V/60Hz). The system includes the swim chamber, motor, manual control of water current velocity, 1 pump placed inside the chamber, standard swim tunnel lid for swim behavior, and modified swim tunnel lid for calibration |
| uEye Cockpit | IDS | Freely available software to control camera parameters | Alternative cameras and accompanying softwares could be used |
| Vane wheel flow probe | Loligo Systems | AC10002 | Digital flow probe - for calibration |
References
- Becker, C. G., Becker, T. Neuronal regeneration from ependymo-radial glial cells: cook, little pot, cook. Developmental Cell. 32 (4), 516-527 (2015).
- Mokalled, M. H., Poss, K. D.
- Orger, M. B., de Polavieja, G. G. Zebrafish behavior: opportunities and challenges. Annual Review of Neuroscience. 40, 125-147 (2017).
- Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Mokalled, M. H., et al. Injury-induced ctgfa directs glial bridging and spinal cord regeneration in zebrafish. Science. 354 (6312), 630-634 (2016).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Developmental Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).
- Wolman, M. A., et al. A genome-wide screen identifies PAPP-AA-mediated IGFR signaling as a novel regulator of habituation learning. Neuron. 85 (6), 1200-1211 (2015).
- Granato, M., et al. Genes controlling and mediating locomotion behavior of the zebrafish embryo and larva. Development. 123, 399-413 (1996).
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (23), 10545-10549 (1995).
- Moens, C. B., Yan, Y. L., Appel, B., Force, A. G., Kimmel, C. B. Valentino: a zebrafish gene required for normal hindbrain segmentation. Development. 122 (12), 3981-3990 (1996).
- Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
- Reimer, M. M., et al. Motor neuron regeneration in adult zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (34), 8510-8516 (2008).
- Klatt Shaw, D., et al. Localized EMT reprograms glial progenitors to promote spinal cord repair. Developmental Cell. 56 (5), 613-626 (2021).
- Ahmed, R. U., Alam, M., Zheng, Y. P. Experimental spinal cord injury and behavioral tests in laboratory rats. Heliyon. 5 (3), 01324 (2019).
- Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Fatemi, G., Faden, A. I. A combined scoring method to assess behavioral recovery after mouse spinal cord injury. Neuroscience Research. 67 (2), 117-125 (2010).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Scheff, S. W., Saucier, D. A., Cain, M. E. A statistical method for analyzing rating scale data: the BBB locomotor score. Journal of Neurotrauma. 19 (10), 1251-1260 (2002).
- Li, Q., et al. Differential behavioral responses of zebrafish larvae to yohimbine treatment. Psychopharmacology (Berl). 232 (1), 197-208 (2015).
- Wakamatsu, Y., Ogino, K., Hirata, H. Swimming capability of zebrafish is governed by water temperature, caudal fin length and genetic background. Scientific Reports. 9 (1), 16307 (2019).
- Ahmed, O., Seguin, D., Gerlai, R. An automated predator avoidance task in zebrafish. Behavioral Brain Research. 216 (1), 166-171 (2011).
- Conradsen, C., McGuigan, K. Sexually dimorphic morphology and swimming performance relationships in wild-type zebrafish Danio rerio. Journal of Fish Biology. 87 (5), 1219-1233 (2015).
- Leris, I., Sfakianakis, D. G., Kentouri, M. Are zebrafish Danio rerio males better swimmers than females. Journal of Fish Biology. 83 (5), 1381-1386 (2013).
