Summary
Omurilik yaralanmasından sonra fonksiyonel iyileşme yeteneğine sahip olan yetişkin zebra balığı, doğuştan gelen nöral rejenerasyon mekanizmalarını aydınlatmak için önde gelen bir model sistemidir. Burada, yüzme dayanıklılığını ve yüzme davranışı testlerini omurilik rejenerasyonunun fonksiyonel okumaları olarak tanımlıyoruz.
Abstract
Ünlü rejeneratif kapasiteleri nedeniyle, yetişkin zebra balığı, doğuştan gelen omurilik rejenerasyonunun mekanizmalarını sorgulamak için önde gelen bir omurgalı modelidir. Omuriliklerinin tamamen transeksiyonunu takiben, zebra balığı kopmuş doku boyunca glial ve aksonal köprüleri genişletir, lezyona proksimal nöronları yeniler ve yaralanmadan sonraki 8 hafta içinde yüzme kapasitelerini yeniden kazanırlar. Yüzme fonksiyonunun geri kazanılması bu nedenle fonksiyonel omurilik onarımı için merkezi bir okumadır. Burada, kapalı bir yüzme tüneli içindeki zebra balığı motor kapasitesini ölçmek için bir dizi davranışsal tahlil tarif ediyoruz. Bu yöntemlerin amacı, yetişkin zebra balıklarında yüzme dayanıklılığı ve yüzme davranışının ölçülebilir ölçümlerini sağlamaktır. Yüzme dayanıklılığı için, zebra balığı tükenene kadar sürekli artan bir su akımı hızına maruz kalır ve tükenme süresi bildirilir. Yüzme davranışı değerlendirmesi için, zebra balığı düşük akım hızlarına maruz bırakılır ve yüzme videoları balığın sırt görünümü ile yakalanır. Yüzde aktivitesi, patlama sıklığı ve su akımına karşı harcanan zaman, yüzme davranışının ölçülebilir okumalarını sağlar. Vahşi tip zebra balıklarında yaralanmadan önce ve omurilik transeksiyonundan sonra yüzme dayanıklılığını ve yüzme davranışını ölçtük. Zebra balıklarının omurilik transeksiyonundan sonra yüzme fonksiyonunu kaybettiğini ve yaralanma sonrası 2 ila 6 hafta arasında bu kapasiteyi kademeli olarak geri kazandığını bulduk. Bu çalışmada açıklanan yöntemler, yetişkin zebra balıklarında nörodavranışsal, kas-iskelet sistemi, iskelet kası rejenerasyonu ve nöral rejenerasyon çalışmalarına uygulanabilir.
Introduction
Yetişkin zebra balığı, nöromüsküler ve kas-iskelet sistemi gelişim mekanizmalarını ve hastalık modellemesini araştırmak için son derece kullanılır1,2,3. Zebra balığı, beyin, omurilik ve iskelet kası dahil olmak üzere birçok dokunun etkili, kendiliğinden onarımını yapabilir4,5,6,7. Nöromüsküler dokuları yenilemek ve hastalıkları modellemek için olağanüstü kapasite, büyüyen bir bilimsel topluluğu yetişkin zebra balığı araştırmalarına çekmektedir1,2,3. Bununla birlikte, larva zebra balığı için hareket ve yüzme davranışı tahlilleri mevcut ve standartlaştırılmış olsa da, yetişkin balıklarda benzer protokoller geliştirmeye yönelik artan bir ihtiyaç vardır8,9,10,11. Bu çalışmanın amacı, yetişkin zebra balıklarında yüzme dayanıklılığını ve yüzme davranışını ölçmek için protokolleri tanımlamaktır. Bu protokolleri omurilik rejenerasyonu araştırmaları bağlamında sunuyoruz. Bununla birlikte, burada açıklanan davranışsal protokoller, nöral ve kas rejenerasyonu, nöromüsküler ve kas-iskelet sistemi gelişiminin yanı sıra nöromüsküler ve kas-iskelet sistemi hastalık modellemesi çalışmalarına eşit derecede uygulanabilir.
Zebra balığı, tam omurilik transeksiyonundan sonraki 8 hafta içinde felci tersine çevirir. Kötü rejeneratif memelilerin aksine, zebra balığı fonksiyonel omurilik onarımı için gerekli olan pro-rejeneratif immün, nöronal ve glial yaralanma yanıtlarını gösterir12,13,14. Fonksiyonel omurilik onarımının nihai bir okuması, lezyonlu dokunun yaralanma sonrası işlevini yeniden kazanma yeteneğidir. Kemirgenlerde fonksiyonel rejenerasyonu değerlendirmek için bir dizi standartlaştırılmış yöntem lokomotor, motor, duyusal ve sensorimotor testleri içerir15,16,17. Fare omurilik yaralanmasında yaygın olarak kullanılan testler arasında lokomotor Basso Fare Skalası (BMS), ön ayak motor testleri, dokunsal duyusal testler ve ızgara yürüme sensorimotor testleri bulunmaktadır15,17. Memeli veya larva zebra balığı sistemlerinin aksine, yetişkin zebra balıklarında davranışsal testler daha az gelişmiştir, ancak doku yenilenmesi ve hastalık modelleme topluluklarının artan ihtiyaçlarını karşılamak için çok ihtiyaç duyulmaktadır.
Tam omurilik transeksiyonları, yaralanma bölgesine tam felç kaudal ile sonuçlanır. Yaralanmadan kısa bir süre sonra, felçli hayvanlar daha az aktiftir ve mümkün olduğunca yüzmekten kaçınırlar. Kayıp yüzme kapasitesini telafi etmek için, felçli hayvanlar, lezyona rostral olarak uzanan pektoral yüzgeçlerini aşırı kullanarak kısa, sık sık patlamalar gösterirler. Bu telafi edici yüzme stratejisi, hızlı tükenme ve daha düşük yüzme kapasitesi ile sonuçlanır. Zebra balığı omuriliği yenilendikçe, hayvanlar lezyona kaudal olarak pürüzsüz bir salınımlı yüzme fonksiyonu kazanırlar, bu da yüzme dayanıklılığının artmasına ve yüzme davranışı parametrelerinin iyileştirilmesine olanak tanır. Burada, zebra balıklarının artan su akım hızlarında yüzme dayanıklılığını ve düşük akım hızlarında yüzme davranışını ölçmek için yöntemler açıklıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ekkwill ve AB suşlarının yetişkin zebra balığı, Washington Üniversitesi Zebra Balığı Çekirdek Tesisi'nde muhafaza edildi. Tüm hayvan deneyleri IACUC kurumsal hayvan protokollerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
NOT: Deney düzeneğinin bir örneği Şekil 1A'da gösterilmiştir. Kalibrasyon kapağı (özelleştirilmiş), yüzmeye dayanıklılık kapağı (özelleştirilmiş) ve yüzme davranışı kapağı (standart, kapalı tünel kapağı) Şekil 1B'de gösterilmiştir. Deneysel iş akışı Şekil 2'de sunulmuştur.
1. Yüzme tüneli hazırlama ve kalibrasyonu
- Yüzme tünelini ve çevresindeki tampon tankını zebra balığı sistemi suyuyla doldurun (10 L filtrelenmiş su; alkalinite: 50-150 mg / L CaCO3; pH: 6.8-7.5; sıcaklık: 26-28.5 ° C; nitrat < 50 mg / L; nitrit < 0.1 mg / L; ve tuzluluk 0.5-1 g / L'<).
- Ek bir akış tankını zebra balığı sistemi suyuyla doldurun (≈7,5 L). Fazla zebra balığı sistemi suyunun tampon tankından akış tankına, tampon tankının yan tarafına sabitlenmiş bir çıkış borusundan akmasına izin vermek için yüzme tünelini ve akış tankını konumlandırın.
- Tünel ve tampon tankı doldurulduktan sonra, aşağıdakileri gerçekleştirin.
- Yıkama pompasını tampon tankının içine yerleştirin ve PVC borularla bitişik yüzme tüneline bağlayın. Akış pompasını akış tankının içine yerleştirin ve tampon tankının duvarına bağlayın.
- Su sirkülasyonunu başlatmak için tampon tankının içinde bulunan yıkama pompasını ve akış tankında bulunan akış pompasını açın.
NOT: Çift pompa sistemi, yüzme tüneline (yıkama pompasından) ve tampon tankına (akış pompasından) sürekli su akışı sağlayacaktır. - Yüzme tüneli içinde sıkışan hava kabarcıklarını, su akım hızını 10 cm / s'den 100 cm / s'ye 10 cm / s aralıklarla kademeli olarak artırarak temizleyin. Hızı 10 cm/s aralıklarla 0 cm/s'ye düşürün. Akış hızını kontrol etmek için, akış hızı kontrol yazılımının Hız bölümündeki yukarı ve aşağı okları tıklatın (bkz.
NOT: Motor ve rotor beraberindeki bilgisayara bağlanır. Akış hızı kontrol yazılımı, istenen akış hızını oluşturmak için motorla iletişim kurar. Akış hızı kontrol yazılımının kullanımı isteğe bağlıdır. Alternatif, su akımı motorunu manuel olarak kontrol etmektir.
- Kalibrasyon
NOT: Her deneyden önce kalibrasyon gereklidir.- Yüzme tünelini kapatmak için kalibrasyon kapağını kullanın.
NOT: Kalibrasyon kapağı, kalibrasyon için kullanılan debimetre probuna uyan güçlendirilmiş bir merkezi açıklıkla özelleştirilmiştir (Şekil 1B). Tüm kapakları tünele sabitlemek için sekiz kanat somunu kullanılır. - Dijital debimetreyi açın ve debimetre probuna bağlayın. Debimetre probunu kalibrasyon kapağından yüzme tünelinin içine yerleştirin. Debimetre probunun bıçaklarını akış yönüne dik olarak konumlandırın.
- Dijital debimetreyi kullanarak yüzme tüneli motorunun çıkışını (akış hızı kontrol yazılımı ile kontrol edilir) kalibre edin. Bunu yapmak için aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
- Akış hızı kontrol yazılımını açın ve Kalibrasyon'a tıklayın.
- Sol üstteki seçenekleri RPM vs Voltaj olarak değiştirin. Akış hızı kontrol yazılımının Hız bölümüne değerleri yazarak akış hızını 5 cm/s'lik artışlarla 0 cm/s'den 100 cm/s'ye yükseltin. Her adımda, "+" düğmesine tıklayın ve dijital debimetre tarafından belirtilen geçerli hızı kaydedin.
NOT: Ortaya çıkan doğrusal ilişki, 1'e yakın bir R2 değerine sahip olmalıdır. - Kalibrasyonu onaylamak için, su akımı hızlarını 0'dan 10, 25, 50, 75 ve 100 cm/s'ye yükseltin ve ardından akış hızı kontrol yazılımının Uwater [cm /s] bölümündeki yukarı ve aşağı okları kullanarak hızları 75, 50, 25, 10 cm/s'ye düşürün. Her hızda (yazılımdan), dijital akış ölçer tarafından belirtilen karşılık gelen hızı ölçün ve kaydedin.
- Ölçülen su akımı hızları ±2 cm/sn sapma içindeyse tünelin kalibre edilmiş ve doğru olduğunu düşünün. Sapma ±2 cm/s'nin üzerindeyse, doğru kalibrasyonu sağlamak için 1.4.4 ila 1.4.6 arasındaki adımları tekrarlayın.
- Yüzme tünelini kapatmak için kalibrasyon kapağını kullanın.
2. Yüzme dayanıklılığının değerlendirilmesi
NOT: Deney grupları, yüzme dayanıklılığı için 10 veya daha az hayvandan oluşan gruplara ayrılmıştır.
- Akış hızı kontrol yazılımını kurun.
NOT: Bu bölümdeki akış hızı kontrol yazılımının kullanımı isteğe bağlıdır. Alternatif, su akımı motorunu manuel olarak kontrol etmektir. Manuel su akımı kontrolü için, adım 2.3'e ilerleyin ve 2.5 ve 2.6 adımlarında belirtilen artışlarda su akım hızını manuel olarak artırın.- Akış hızı kontrol yazılımını açın. Deneme etiketli kutuyu tıklayın. Uswim ve Uwater'ın işaretini kaldırın.
- Su akım hızlarını ayarlamak için sol alttaki Uwater [cm/s] kutusundaki akış hızını değiştirin.
- Otomatik bir protokole başlamak için, Günlüğü Başlat kutusunu tıklatın. Açılan iletişim penceresinde, açılır listeden Otomatik'i seçin.
- Önceden kaydedilmiş bir protokol dosyasını seçmek için, istediğiniz protokolü açmak üzere Protokol Dosyası'nın yanındaki dosya simgesine tıklayın.
- Günlük Dosyası'nın yanındaki dosya simgesine tıklayarak çıktı dosyasını ayarlayın. Açılan dosya gezgini penceresinde, çıktı dosyasını adlandırın ve istediğiniz konuma kaydedin.
- Bölünmüş bir tur zamanlayıcı penceresi ayarlayın. Bilgisayar ekranındaki akış hızı kontrol yazılımına ve zamanlayıcı pencerelerine aynı anda erişebildiğinizden emin olun.
- Yüzme tünelinden çıkarıldıktan sonra yorgun balıkları barındırmak için bir balık toplama tankı kurun. Toplama tankını zebra balığı sistem suyuyla (0,75 L) doldurun. Uzun bir PVC tüpü zebra balığı sistem suyuyla doldurun.
- Önceden doldurulmuş PVC borunun bir ucunu (uç 1) toplama tankına, diğer ucunu (uç 2) tampon tankına yerleştirin. Suyun tampon tankından toplama tankına serbestçe akabildiğinden emin olun.
- Su akışını önlemek için PVC borunun üst ucunu (uç 2) bir bağlayıcı klipsle kelepçeleyin. Gerektiğinde su çıkışını kontrol etmek için bağlayıcı klipsi kullanın.
- Yüzme dayanıklılık kapağını kullanarak yüzme tünelini kapatın.
NOT: Yüzme dayanıklılığı kapağı, tahlilin geri kalanını kesintiye uğratmadan yorgun balıkları yüzme tünelinden çıkarmak için bir yüzme tüneli penceresi ile özelleştirilmiştir (Şekil 1B). - Yüzme tünelinin içine bir grup balık yerleştirin. Akış hızı kontrol yazılımının Uwater [cm/s] bölümüne bu değerleri yazarak akım hızını 5 dakika boyunca 0 cm/sn, 5 dakika boyunca 9 cm/s ve 5 dakika boyunca 10 cm/sn olarak ayarlarken bölünmüş tur zamanlayıcısını çalıştırın.
NOT: Bu adım, hayvanları yüzme tüneline ve akış yönüne alıştıracaktır. - Balıkların alışmasını takiben, su akımı hızını dakikada 2 cm / s artıracak otomatik akış hızı kontrol programını başlatın.
NOT: Balıklar tükenene kadar yüzecektir. Yorgun balıklar yüzme tünelinin arka ucuna doğru itilir. - Bir balık tükendiğinde, balık toplama tüpünü açın, yüzme tüneli penceresini açın ve balıkları toplama tankında toplayın. Bölünmüş tur zamanlayıcısını kullanarak tükenme süresini kaydedin.
NOT: Balıklar bazen tükenmeden yüzme tünelinin arka ucuna sürüklenebilir. Bir balığın tükendiğinden emin olmak için, tünelin arka ucuna hafifçe dokunun veya balıkları yüzmeye teşvik etmek için o alanın üzerinde bir gölge oluşturun. Yorgun balıklar ürkütücü uyarana cevap vermez ve tünelin arka ucunda düz durur. - Tüm balıklar tükenene ve toplama tankında toplanana kadar adım 2.7'yi tekrarlayın. Akış hızı kontrol yazılımındaki Acil Stop düğmesine tıklayın ve zamanlayıcıyı durdurun.
NOT: Yüzme tüneli odasından çıkarılan balık sayısının kaydedilen sürelerle eşleşip eşleşmediğini yüzme boyunca iki kez kontrol edin. - Her balık grubu için 2,5 ile 2,8 arasındaki adımları yineleyin.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir, ancak yaralanmadan sonraki zaman noktasına kadar doğru olması için, filmlerin ve dayanıklılık yüzmelerinin aynı gün yapılması önerilir. Deneyler duraklatılırken tünel dolaşmaya devam edebilir.
3. Yüzme davranışı testi için video çekme
NOT: Aynı anda en fazla beş hayvan izlenebilir. Deney grupları beşten büyükse, her grup için ilk videonun beş veya daha az hayvanı, ikinci videonun ise diğer beş veya daha az hayvanı izlediği birden fazla video çekilebilir. Zaman içinde bireysel hayvanları izlemeyi amaçlayan uzunlamasına çalışmalar için, balıklar bireysel olarak barındırılabilir ve birden fazla zaman noktasında izlenebilir. İzleme ve analiz için tüm betikler GitHub üzerinden kullanılabilir (bkz.
- Yüzme tünelinin altında bulunan Kızılötesi ışık panelini açın. Kamerayı yüzme tünelinin üstündeki tavana monte edilmiş bir yere sabitleyin. Netleme ve diyafram halkalarını ayarlayın.
NOT: Netleme ve diyafram ayarları, fotoğraf makinesi ile yüzme tüneli arasındaki mesafeye ve ışık ortamına bağlıdır. - Kamera kayıt yazılımını açın (bkz. Yazılım ayarlarını aşağıdaki gibi ayarlayın.
- 1:4 en boy ekranını tıklatın. Görüş alanının tüm yüzme tünelini kapladığından emin olun. Arka planı normalleştirmek ve gruplar arasında kontrastı normalleştirmek için otomatik kontrastı ve otomatik beyaz dengesini kapatın.
- İngiliz anahtarı simgesine tıklayarak Kamera Özellikleri penceresini açın. Parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: Piksel Saati: 344 MHz, Kare Hızı: 70 fps, kontrol etmek için Beklet'in yanındaki kutuya tıklayın, Pozlama Süresi: 0.290 ms. Bu pencereyi kapatmayın.
- Kayıt Penceresini, kamerayı gerektiği gibi eğerek/döndürerek tünelin yalnızca yüzme odasını kaplayacak şekilde kırpın.
- Film makarası simgesine tıklayarak Kayıt Penceresini açın. Kayıt ayarlarını aşağıdaki gibi ayarlayın:
- Maksimum kare sayısı için kutuyu işaretleyin.
- Kare sayısı için manuel olarak 63.000 girin.
- Hesaplama Kare Hızı kutusunu işaretleyin. Bu, programın adım 3.2.2'de (70 fps) tanımlanan kare hızını çekmesini sağlar.
- JPEG Kalitesini 30 olarak değiştirin.
- Bir test çalışması kaydedin.
- Oluştur'a tıklayın ve yeni dosyayı Test olarak adlandırın ve masaüstüne kaydedin.
- Kayıt penceresine geri dönün ve Kaydet'i tıklayın. Test filminin protokolün tüm süresi boyunca çalışmasına izin verin (15 dakika).
- Test bittiğinde, bırakılan kare olmadığından ve 63.000 karenin kaydedildiğinden emin olun.
- Yüzme tüneline bir grup balık yerleştirin ve standart tamamen kapalı bir kapak kullanarak tüneli kapatın (Şekil 1B).
NOT: Kapağı tamamen sıkmadan önce tüm balıkların tünelde olduğundan emin olun. Kapağın altında hava kabarcığı olmadığından emin olun. Aksi takdirde bu, sonuçları etkileyecektir. - Yeni bir kayıt penceresi açın ve dosyayı adlandırın. Örnek: 2_A_1_00001_WildtypeGroupA.avi
NOT: Ayarların adım 3.2 ve 3.3'teki parametrelere göre olduğundan emin olun. JPEG Kalitesi her zaman varsayılana geri döner ve her yeni film için sıfırlanması gerekir.
DİKKAT: Henüz kayd'ı tıklamayın. - Akış hızı kontrol yazılımını kullanarak yeni bir deneye başlayın.
Not: otomatik bir protokol başlatmak için Günlüğü Başlat kutusunu tıklatın. Açılan iletişim penceresinde, açılır listeden Otomatik'i seçin. Önceden kaydedilmiş bir protokol dosyasını seçmek için, istediğiniz protokolü açmak üzere Protokol Dosyası'nın yanındaki dosya simgesine tıklayın.- Manuel bir protokole başlamak için, akış hızı kontrol yazılımındaki Uwater [cm/s] kutusunu kullanarak akış hızını 5 dakika boyunca 0 cm/s, 5 dakika boyunca 10 cm/sn ve ardından 5 dakika boyunca 20 cm/s olarak ayarlayın.
- Yeni veri çıktı dosyasını (.csv dosyası olarak kaydedilecektir) film dosyasıyla aynı ad altında ve aynı klasöre kaydedin.
DİKKAT: Henüz başlat'ı tıklamayın.
- Tüm davranışların balık yüzmesinden kaynaklandığından ve ortamdaki hareketin neden olduğu irkilme tepkisinden kaynaklanmadığından emin olmak için yüzme tünelinin yanına bir kağıt havlu veya kumaş parçası yerleştirin.
- Hızlı bir şekilde art arda suyun sakin olduğundan ve çerçeve boyunca dalgalanma olmadığından emin olun. Film dosyasını kaydetmeye başlamak için kamera yazılımı penceresinde Kaydet'i tıklatın. Kesintisiz devam edecek olan protokolü başlatmak için akış hızı kontrol yazılımında Başlat'a tıklayın.
- Hiçbir karenin düşmediğinden, görüş alanında kabarcık olmadığından ve tüm balıkların kaydedildiğinden emin olmak için filmi izleyin.
- Film kaydı tamamlandıktan sonra, akış hızı kontrol protokolünü sonlandırmak için Acil Durdurma'ya tıklayın. Otomatik olarak kaydedilen veri çıktı dosyasını denetleyin. Film dosyasını kaydetmek için Kayıt Penceresinde Kapat'ı tıklatın.
- Kapağı çıkarın. Balıkları dikkatlice alın ve tanklarına geri gönderin.
- Tüm balık grupları için 3,5 ile 3,12 arasındaki adımları yineleyin.
- Tüm gruplar için film kaydı tamamlandıktan sonra, MovieProcessing_v5.bat komut dosyasıyla filmleri 70 fps videolardan 20 fps videolara dönüştürün. Bunu yapmak için, komut dosyasını ham videoları içeren klasöre taşıyın. Dosyaya sağ tıklayın ve Çalıştır'ı seçin.
NOT: Komut dosyası otomatik olarak çalışır. Komut dosyasının ilerlemesini gösteren bir komut istemi penceresi açılacaktır. Yukarıdaki adım isteğe bağlıdır. 15 dakikalık bir videodaki kare sayısını 63.000'den 18.000 kareye düşürür ve SwimBehavior_v7 hale getirir. R betiği daha hızlı çalışır. - Tüneli boşaltın ve tüm ekipmanı bir kenara koyun.
4. Yüzme davranışı değerlendirmesi için filmleri analiz etme
NOT: Film kaydı ve analizi ayrı günlerde tamamlanabilir.
- Fiji'de Tracking_v2.ijm komut dosyasını açın ve programı başlatmak için Çalıştır'ı tıklatın. Açılan pencerede, izlenecek yüzme davranışı filmlerini içeren klasörü seçin ve Aç'ı tıklayın. İlk filmin 1. karesini, bir iletişim kutusunu ve ortaya çıkacak olan ilgi alanı (ROI) yöneticisini arayın.
- İletişim kutusunda verilen yönergeleri izleyin. Yüzme tüneli odasının alt kısmında bir yatırım getirisi oluşturun ve Tamam'ı tıklatın. Siyah köşelerin görülmediğinden emin olun.
NOT: Eşik penceresi, düzenlenmiş, eşikli bir Çerçeve 1 ile birlikte açılır. - Renk düzenini S& B'den Kırmızı'ya değiştirin. Maksimum Değeri , çerçeve 1 balığı kırmızı renkte gösterene ve başka hiçbir şey göstermeyene kadar ayarlayın. Eşiği kaydedin. İletişim kutusunda Tamam'ı tıklatın.
NOT: Program otomatik olarak çalışacaktır. Çerçeve 1 için yapılan yatırım getirisi, sonraki kareler için sürekli olarak seçilir ve seçilmez. Bir ilerleme çubuğu, Fiji penceresinin sağ alt köşesindeki işlemi izleyecektir. İzleme, film başına yaklaşık 40 dakika sürer. Tüm filmler izlendiğinde, Fiji programı duracaktır. Yatırım getirisi seçilmeyi durdurur. Filmleri içeren klasörde artık her film için bir _raw.csv dosyası olacaktır. Fiji bu noktada kapatılabilir. - Açıklayıcı istatistikleri hizalama, birleştirme ve edinme
- Yüzme Behavior_v7 açın. R Studio'da R komut dosyası.
- Komut dosyası bölümünün sağ üst köşesindeki Kaynak'a tıklayın. Açılan yeni bir pencerede, Fiji tarafından oluşturulan _raw.csv dosyalarını içeren klasörü seçin. Aç'ı tıklayın.
NOT: Program otomatik olarak çalışacaktır. - Her filmdeki balık sayısını onaylamanızı isteyen bir iletişim kutusunda, verilen sayılar doğruysa Evet'i tıklatın veya sayılar yanlışsa Hayır'ı tıklatın.
NOT: Hayır'a tıklandıysa, filmlerin yeni bir YG ve eşik ile yeniden izlenmesini isteyen bir mesaj açılır. Evet tıklatılırsa, program devam eder. - Yüzme yapmayan balıkların kaldırılması gerekip gerekmediğini soran yeni pencerede, Evet veya Hayır'ı tıklatın.
NOT: Yüzme yapmayan balıklar, 10 cm/s'de aktivitesi %50'den az olan balıklar olarak tanımlanır. Yüzme bilmeyen balıkların çıkarılması önerilmez. - Grupların kör edilmemiş olup olmadığını ve kullanıcının herhangi bir grubu birleştirmek isteyip istemediğini soran yeni bir açılır pencerede, birden fazla kontrol grubu varsa kör olmayan veya grupları birleştirmek isteyip istemediğini sorar.
- Önceki soru için bir yanıt verildikten sonra, programın X'in hizalanmakta olan geçerli dosya olduğu ve Y'nin hizalanacak toplam dosya sayısı olduğu Y'nin X dosyasını hizalama mesajı verdiğinden emin olun. Her dosyanın hizalanması yaklaşık 30 s sürer.
- Dosyalar hizalandıktan sonra, aynı adla (.csv) oluşturulan yeni bir _aligned.csv dosyası olup olmadığını denetleyin. Programın verileri birleştirdiğinden, istatistikleri çalıştırdığından ve çıktı grafiklerini çizdiğinden emin olun. _raw.csv ve _aligned.csv dosyalarını içeren üst klasördeki Sonuçlar etiketli yeni bir klasörde oluşturulan analiz dosyalarını denetleyin.
- Sonuçlar klasöründe, Tanılama ve Grafikler adlı iki klasör ve .csv, BulkData_Avg, BulkData_Full ve SummaryData_Avg adlı dört SummaryData_Full dosyası olup olmadığını denetleyin.
NOT: SummaryData_Full.csv, her zaman noktasında her gruptaki her balık için ayrı ayrı verileri içerir. Bu veriler otomatik olarak çizilir, ancak başka bir yerde çıkarılabilir ve çizilebilir.- Grafikler klasörünün program tarafından oluşturulan grafikleri ve her grafiğin veri noktalarını içeren .csv dosyalarını içerdiğinden emin olun.
- Tanılama klasörünün, hizalanmış dosyalar için tanılama verilerini içeren tek bir .csv dosyası içerdiğinden emin olun.
NOT: Tanılama.csv dosyasındaki sütunlar aşağıdakileri içerir: a) 100'den az olması gereken fazladan nesneler içeren kare sayısı. Ekstra nesneler içeren çok fazla kare, izleme ile ilgili bir sorun olduğunu gösterir. b) Eksik veya birleştirilmiş nesneleri olan çerçevelerin sayısı. Bu metriğin yüksek olması normaldir. İyi yenilenmemiş balıklar sık sık tünelin arkasına süpürülecek ve kayıp sayılacaktır. c) 240 pikselden fazla atlama içeren kareler. Bu sayı, tek bir filmdeki nesnelerin (balık) sayısıyla artar. Davranış metriklerinin nasıl hesaplandığına ilişkin ayrıntılı bir açıklama Ek Dosya 1'de verilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yüzme tünelini bu protokolün 1. bölümünde açıklandığı gibi kurduk (Şekil 1). Yetişkin zebra balıklarının yüzme dayanıklılığını (bu protokolün 2. bölümü) ve yüzme davranışlarını (bu protokolün 3. ve 4. bölümleri) başlangıçta ve omurilik yaralanmasından sonra değerlendirdik (Şekil 2).
Temel motor fonksiyonunu oluşturmak için, vahşi tip zebra balıklarının artan su akımı hızları altında yüzme dayanıklılığını inceledik (Şekil 3A). Bu tahlilde, vahşi tip zebra balığı tükenmeden önce 41 dakika yüzdü. Balıklar daha sonra daha önce tarif edildiği gibi tam omurilik transeksiyonlarına tabi tutuldu ve yüzme dayanıklılık testleri yapıldı6. Zebra balıklarını MS-222 kullanarak anestezi yaptıktan sonra, omuriliği 4 mm kaudal beyin sapı bölgesine transekte etmek için ince makasla küçük bir kesi yapılır. Tam bir transeksiyon görsel olarak onaylandı. Omurilik cerrahisinden sonra yüzme kapasitesinin kaybını doğrulamak için, yaralı hayvanlar yaralanma sonrası 2 veya 3 gün içinde değerlendirildi (dpi). Bu noktada, zebra balığı lezyon bölgesine tamamen felç olur. Yüzme dayanıklılığı, yaralanma sonrası 2, 4 ve 6 haftada (wpi) değerlendirildi. 2 wpi'de, lezyonlu balıklar yüzme dayanıklılık kapasitelerinin% 60'ını kaybetti (Şekil 3A). Yenileyen balıklar yavaş yavaş 4 ve 6 wpi'de yüzme dayanıklılığını geri kazandı. Bu sonuçlar, vahşi tip zebra balıklarının omurilik yaralanmasından sonra yüzme dayanıklılık kapasitesini yeniden kazanabildiğini göstermiştir.
Zebra balıklarının omurilik rejenerasyonu sırasında yüzme davranışlarını incelemek için, vahşi tip hayvanların yüzme davranışlarını 0 cm / s su akımı hızında veya 10 cm ve 20 cm / s'lik sabit, düşük akım hızları altında izledik (Şekil 3B). Yüzme tüneli odasındaki balıkların pozisyonlarının ortalama izleri, düşük akım hızlarında yüzme davranışının görsel olarak değerlendirilmesi için kullanılmıştır (Şekil 3B). Bu tahlilde, yaralanmamış kontroller, yüzme tüneli odasının ön kısmında (su akımı kaynağına daha yakın) sabit bir şekilde yüzdü, bu da yüksek bir Y pozisyonuna karşılık geldi (Şekil 3B). Buna karşılık, 2 wpi'de, yaralı balıklar akıntıya karşı sabit yüzme kapasitesini koruyamadılar. Sonuç olarak, yüzme parkurları Y pozisyonunda genel bir azalma ile daha düzensizdir (Şekil 3B). Y pozisyonu 4 ve 6 wpi'de artmıştır, bu da yenilenen hayvanların yavaş yavaş yüzme tüneli odasının önünde yüzme yeteneklerini yeniden kazandıklarını göstermektedir. Yüzme davranışı parametrelerini ölçmek için, yüzde aktivitesini, yüzme tünelindeki konumu (Y pozisyonu) ve akıntıya karşı yüzdüğü zamanı (Şekil 3C-E) hesapladık. Yaralanmamış kontrollere göre, 2 wpi'deki lezyonlu hayvanlar belirgin şekilde daha az aktifti (Şekil 3C), yüzme tünelinin arka çeyreğinde durdu (Şekil 3D) ve düşük akım hızlarına karşı yüzme yeteneklerini kaybetti (Şekil 3E). Fonksiyonel iyileşme elde etmek için doğuştan gelen yetenekleriyle tutarlı olarak, lezyonlu hayvanlar 4 ve 6 wpi'de yüzme davranışı parametrelerini kademeli olarak normalleştirdiler (Şekil 3C-E). Yüzme dayanıklılığı ve yüzme davranışı parametreleri birlikte zebra balıklarında yüzme fonksiyonu ve fonksiyonel omurilik onarımı hakkında ölçülebilir okumalar sundu.
Resim 1: Yüzme tüneli kurulumu ve özelleştirilmiş kapaklar. (A) Yüzme tüneli odasının yakınlaştırılmış üst ve yan görünümleri de dahil olmak üzere kurulan yüzme tünelinin temsili görüntüleri. (B) Bu protokolde açıklanan çeşitli uygulamalar için kullanılan yüzme tüneli kapaklarının görüntüleri. Yüzme davranışı testleri için standart, tamamen kapalı bir yüzme tüneli kapağı kullanılır (bu protokolün 3. bölümü). Kalibrasyon için el tipi dijital debimetreyi barındıran modifiye edilmiş bir yüzme tüneli kapağı kullanılır (bu protokolün 1. bölümü). Yüzme tüneli odasının arka ucunda çıkarılabilir bir kapak içeren modifiye edilmiş bir yüzme dayanıklılık kapağı, yüzme dayanıklılık testi sırasında yorgun balıkların çıkarılmasına izin verir (bu protokolün 2. bölümü). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Yetişkin zebra balıklarında yüzme dayanıklılığı ve yüzme davranışı için tahlil yapmak için deneysel boru hattı. Yüzme dayanıklılığı için, balıklar tükenene kadar artan su akımına karşı yüzdüler. Yüzme davranışı için, yüzme parametreleri düşük akım hızlarının yokluğunda ve düşük akım hızlarında değerlendirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Omurilik yaralanmasından sonra vahşi tip zebra balıklarında fonksiyonel iyileşme. (A) Başlangıçta vahşi tip zebra balığı için yüzme dayanıklılığı testleri ve 2, 4 ve 6 wpi ile belirlenen motor fonksiyonu. Noktalar, iki bağımsız deneyden bireysel hayvanları gösterir. (B) Yüzme davranışı testleri, düşük su akımı hızları altında vahşi tip zebra balıklarını izledi. Ortalama Y konumu, izleme boyunca her zaman noktasında gösterilir (5 dakika için 0 cm/sn, 5 dakika için 10 cm/sn ve 5 dakika boyunca 20 cm/sn). (C-E) Yüzde aktivite (C), tüneldeki ortalama Y konumu (D) ve akışa karşı yüzen zaman (E) 20 cm / s'de ölçüldü. Tüm nicelemeler için iki bağımsız deney gösterilmiştir. n = yaralanma öncesi durumda 30; n = 2 wpi'de 23, 4 wpi'de n = 20, 6 wpi'de n = 18. İstatistiksel analizler için tek yönlü ANOVA kullanıldı. Hata çubukları, Ortalama Standart Hata'yı (SEM) temsil eder. *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001; P 0.0001 <. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yetişkin zebra balığı, insan hastalıklarını modellemek ve doku rejenerasyon mekanizmalarını incelemek için popüler bir omurgalı sistemidir. CRISPR / Cas9 genom düzenlemesi, zebra balıklarında hastalığın modellenmesi için ters genetik çalışmalarda devrim yarattı; Bununla birlikte, yetişkin zebra balıklarında büyük ölçekli genetik, yetişkin zebra balığı dokularının yüksek verimli fenotiplemeye uygun olmaması da dahil olmak üzere biyolojik ve teknik zorluklar nedeniyle engellenmiştir. Yetişkin zebra balıklarının karmaşık anatomisi göz önüne alındığında, doku mimarisini elde etmek ve analiz etmek için uzun süreli histolojik işlem gereklidir. Bu çalışmada açıklanan yüzme dayanıklılığı ve yüzme davranışı testleri, histolojiden önce orta bir verimde nöral, kas veya iskelet fenotiplerini ön taramak için kullanılabilir. Ayrıca, doku rejenerasyonu çalışmaları fonksiyonel doku onarımını iyileştirmeyi amaçladığından, bu çalışmada açıklanan protokoller, gerekli olmasa da, nöral, kas ve iskelet rejenerasyonu araştırmaları çalışmaları için yaygın olarak uygulanabilir olacaktır.
Fonksiyonel lokomotif testleri, nöral gelişim ve rejenerasyon anlayışımızın ayrılmaz bir parçası olmuştur. Standart lokomotor testler, sıçanlar, fareler ve larva zebra balığı dahil olmak üzere omurgalı türlerde yaygın olarak bulunur. Fare ve sıçan modeli sistemleri sırasıyla BMS16 ve BBB17,18 gibi davranışsal ve fonksiyonel hareket tahlillerine sahiptir. Benzer şekilde, larva zebra balığında hareket, irkilme tepkisi ve davranışı ölçmek için bir dizi protokol tanımlanmıştır. Bu protokoller, açık ve karanlık ortamlardaki deney grupları arasındaki davranışsal farklılıkları, avcıdan kaçınmayı ve aktiviteyi ortaya çıkarmak için etkilidir19,20,21. Burada, yetişkin zebra balıklarında omurilik yaralanmasından sonra fonksiyonel iyileşmeyi ölçmek için ölçülebilir, tekrarlanabilir yöntemleri açıklıyoruz.
Bu çalışmanın çeşitli sınırlamalar sunduğunu unutmayın. İlk olarak, davranışsal çalışmalar genetik ve çevresel faktörlere büyük ölçüde bağımlıdır. Genetik değişkenliği kontrol etmek için, deney gruplarında yaş, cinsiyet ve genetik arka planı kontrol etmek için kardeşleri kullandık22,23. Çevresel faktörleri kontrol etmek için, deneylerin günün aynı saatinde, kontrollü sıcaklık ve aydınlatma koşulları altında yapıldığından emin olduk20. İkincisi, yüzme davranışı testi önyargılı analize daha az duyarlı olsa da, yüzme dayanıklılığı testini yürüten araştırmacı, bir balığın ne zaman tükendiğini belirler ve tükenmiş balıkları balık kohortunun geri kalanını kesintiye uğratmadan yüzme tüneli odasından çıkarmaya devam eder. Böylece, yüzme dayanıklılık deneylerimiz, deneysel koşullara kör olan tek bir araştırmacı tarafından gerçekleştirildi. Zaman içinde deney gruplarının uzunlamasına çalışmaları için araştırmacıdan araştırmacıya değişkenlikten kaçınmak özellikle önemlidir. Son olarak, balıklar arasındaki çarpışmalar, yüzme davranışı testlerinde izleme analizini zorlaştırabilir. Bu nedenle, balıklar arasında çarpışma olasılığını en aza indirmek için beş veya daha az balıktan oluşan gruplar için yüzme davranışı testleri yapmanızı öneririz.
Kritik adımlar göz önüne alındığında, yaralı balıkların özellikle yaralanmadan sonraki ilk günlerde kırılgan olabileceğini not ediyoruz. Bu nedenle balıkları çok dikkatli kullanmanızı öneririz. Yüzme dayanıklılık testleri için, PVC tüp ile balıkların mümkün olduğunca çabuk, önce baş veya kuyruk olarak toplanması, toplama işlemi sırasında ikincil yaralanma olasılığını azaltır. Yüzme davranışı testleri için, yıkama pompası zaman zaman dalgalar oluşturabilir, filmleri bozabilir ve analiz hatalarına neden olabilir. Bu durumda, yıkama pompası kısa bir süre için kapatılabilir. Bununla birlikte, suyun yüzme tüneli haznesi ile tampon tankı arasında sürekli olarak dolaşmasını sağlamak için yıkama pompasının uzun süre kapatılmasını önermiyoruz. Film kaydının izlenmesi, bir kare düşürülürse veya bir balık kayıt alanından saparsa filmin derhal sonlandırılmasına ve yeniden başlatılmasına olanak tanır. Ek olarak, izleme analizini gerçekleştirirken, R kodu dosya işleme sırasında bir hata verirse, en olası sorun dosyaların adlandırılmasıdır. Program çok özel bir adlandırma stratejisi altında çalışacak şekilde yapılmıştır: başka Timepoint_Group_Subgroup_Stock number_Anything (örneğin, 0_A_1_00001_WildtypeGroupA.avi). Bu adlandırma, birden çok zaman noktasının, grubun ve alt grubun çizilmesine ve birlikte hizalanmasına olanak tanır. Son olarak, doğru izlemeyi sağlamak için kontrol noktaları analiz komut dosyasına yerleştirilmiş olsa da, analiz çıktısını dikkatlice kontrol etmek önemlidir. Program otomatik olarak balık numarasının doğru olup olmadığını soracak ve balık sayısının yanlış olup olmadığını yeniden analiz etmek için filmler isteyecektir. Ortalama Y konumu grafiğinde düz çizgili yapılar görünebilir ve bu da fazladan bir nesnenin balık olarak tanındığını gösterir. Bu durumda, en iyi eylem yolu, daha yüksek bir akış hızında görünme eğiliminde olan ekstra yapıları hariç tutmak için filmi dikkatlice izlemektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Hayvan bakımı için Washington Üniversitesi Zebra Balığı Ortak Kaynağına teşekkür ederiz. Bu araştırma NIH (R01 NS113915 ila M.H.M.) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoSwim software | Loligo Systems | MI10000 | Optional - for Automatic control of current velocity |
| Customized lid | Loligo Systems | MI10001 | This customized lid is used for swim endurance |
| DAQ-BT | Loligo Systems | SW10600 | Optional - for Automatic control of current velocity |
| Eheim pump | Loligo Systems | PU10160 | 20 L/min. This pump is placed in theflow-through tank. |
| Fiji | Fiji | Freely available through Image J (Fiji) | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Flowtherm | Loligo Systems | AC10000 | Handheld digital flow meter - for calibration |
| High Speed Camera | Loligo Systems | VE10380 | USB 3.0 color video camera (4MP) |
| IR light panel | Loligo Systems | VE10775 | 450 x 210 mm, placed under the swim tunnel chamber |
| Monofocal lens | Loligo Systems | VE10388 | 25mm manual lens |
| PVC Tubing | VWR | 60985-534 | 5/16 x 7/16" Wall thickness: 1/16" |
| R Studio | R Studio | Freely available. Version 3.6 with extra packages. | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Swim tunnel respirometer | Loligo Systems | SW10060 | 5L (120V/60Hz). The system includes the swim chamber, motor, manual control of water current velocity, 1 pump placed inside the chamber, standard swim tunnel lid for swim behavior, and modified swim tunnel lid for calibration |
| uEye Cockpit | IDS | Freely available software to control camera parameters | Alternative cameras and accompanying softwares could be used |
| Vane wheel flow probe | Loligo Systems | AC10002 | Digital flow probe - for calibration |
References
- Becker, C. G., Becker, T. Neuronal regeneration from ependymo-radial glial cells: cook, little pot, cook. Developmental Cell. 32 (4), 516-527 (2015).
- Mokalled, M. H., Poss, K. D. A regeneration toolkit. Developmental Cell. 47 (3), 267-280 (2018).
- Orger, M. B., de Polavieja, G. G. Zebrafish behavior: opportunities and challenges. Annual Review of Neuroscience. 40, 125-147 (2017).
- Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Mokalled, M. H., et al. Injury-induced ctgfa directs glial bridging and spinal cord regeneration in zebrafish. Science. 354 (6312), 630-634 (2016).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Developmental Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).
- Wolman, M. A., et al. A genome-wide screen identifies PAPP-AA-mediated IGFR signaling as a novel regulator of habituation learning. Neuron. 85 (6), 1200-1211 (2015).
- Granato, M., et al. Genes controlling and mediating locomotion behavior of the zebrafish embryo and larva. Development. 123, 399-413 (1996).
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (23), 10545-10549 (1995).
- Moens, C. B., Yan, Y. L., Appel, B., Force, A. G., Kimmel, C. B. Valentino: a zebrafish gene required for normal hindbrain segmentation. Development. 122 (12), 3981-3990 (1996).
- Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
- Reimer, M. M., et al. Motor neuron regeneration in adult zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (34), 8510-8516 (2008).
- Klatt Shaw, D., et al. Localized EMT reprograms glial progenitors to promote spinal cord repair. Developmental Cell. 56 (5), 613-626 (2021).
- Ahmed, R. U., Alam, M., Zheng, Y. P. Experimental spinal cord injury and behavioral tests in laboratory rats. Heliyon. 5 (3), 01324 (2019).
- Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Fatemi, G., Faden, A. I. A combined scoring method to assess behavioral recovery after mouse spinal cord injury. Neuroscience Research. 67 (2), 117-125 (2010).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Scheff, S. W., Saucier, D. A., Cain, M. E. A statistical method for analyzing rating scale data: the BBB locomotor score. Journal of Neurotrauma. 19 (10), 1251-1260 (2002).
- Li, Q., et al. Differential behavioral responses of zebrafish larvae to yohimbine treatment. Psychopharmacology (Berl). 232 (1), 197-208 (2015).
- Wakamatsu, Y., Ogino, K., Hirata, H. Swimming capability of zebrafish is governed by water temperature, caudal fin length and genetic background. Scientific Reports. 9 (1), 16307 (2019).
- Ahmed, O., Seguin, D., Gerlai, R. An automated predator avoidance task in zebrafish. Behavioral Brain Research. 216 (1), 166-171 (2011).
- Conradsen, C., McGuigan, K. Sexually dimorphic morphology and swimming performance relationships in wild-type zebrafish Danio rerio. Journal of Fish Biology. 87 (5), 1219-1233 (2015).
- Leris, I., Sfakianakis, D. G., Kentouri, M. Are zebrafish Danio rerio males better swimmers than females. Journal of Fish Biology. 83 (5), 1381-1386 (2013).
