Summary
Denne protokol beskriver fremstilling og kvantitativ måling af fri og proteinbundet arginin og methylargininin ved 1H-NMR-spektroskopi.
Abstract
Proteinbundet arginin er almindeligt methyleret i mange proteiner og regulerer deres funktion ved at ændre de fysisk-kemiske egenskaber, deres interaktion med andre molekyler, herunder andre proteiner eller nukleinsyrer. Dette arbejde præsenterer en let implementerbar protokol til kvantificering af arginin og dets derivater, herunder asymmetrisk og symmetrisk dimethylarginin (henholdsvis ADMA og SDMA) og monomethylarginin (MMA). Efter proteinisolering fra biologiske kropsvæsker, væv eller cellelysater beskrives en simpel metode til homogenisering, udfældning af proteiner og proteinhydrolyse. Da hydrolysaterne indeholder mange andre komponenter, såsom andre aminosyrer, lipider og nukleinsyrer, er et rensningstrin ved anvendelse af fastfaseekstraktion (SPE) afgørende. SPE kan enten udføres manuelt ved hjælp af centrifuger eller en pipetteringsrobot. Følsomheden for ADMA ved hjælp af den nuværende protokol er ca. 100 nmol / L. Den øvre detektionsgrænse for arginin er 3 mmol / L på grund af SPE-mætning. Sammenfattende beskriver denne protokol en robust metode, der spænder fra biologisk prøveforberedelse til NMR-baseret detektion, hvilket giver værdifulde tip og faldgruber til vellykket arbejde, når man studerer argininmethylomet.
Introduction
I løbet af de sidste to årtier er methylering af argininrester blevet anerkendt som en væsentlig posttranslationel modifikation af proteiner. Det påvirker grundlæggende biologiske processer som regulering af transkription, signaltransduktion og mange flere1. De vigtigste proteiner, der er involveret i reguleringen af argininmethylering, er protein argininmethyltransferaser (PRMT'er)2. De vigtigste derivater af arginin er ω-(N G,N G)-asymmetrisk dimethylarginin (ADMA), ω-(N G,N'G)-symmetrisk dimethylarginin (SDMA) og ω-N G-monomethylarginin (MMA)2.
PRMT'er bruger S-adenosyl-l-methionin til at overføre methylgrupper til den terminale guanidinogruppe (med to ækvivalente aminogrupper) af proteinbundet arginin1. Der kan skelnes mellem to hovedenzymer: Både type I og type II enzymer katalyserer det første methyleringstrin til dannelse af MMA (som derved mister sin symmetri). Efter dette trin bruger type I-enzymer (f.eks. PRMT1, 2, 3, 4, 6, 8) MMA som substrat til dannelse af ADMA, mens type II-enzymer (primært PRMT5 og PRMT9) producerer SDMA. PRMT1 var det første protein argininmethyltransferase, der blev isoleret fra pattedyrceller3. Alligevel er PRMT'er evolutionært bevaret4 hos andre dyr som ikke-pattedyrs hvirveldyr, hvirvelløse akkordater, pighuder, leddyr og nematoder cnidarians5, planter6 og protozoer, herunder svampe som gær7. I mange tilfælde fører knockout af en af PRMT'erne til tab af levedygtighed, hvilket afslører den væsentlige rolle methylerede argininarter, der er involveret i grundlæggende cellulære processer som transkription, translation, signaltransduktion, apoptose og væske-væskefaseseparation (hvilket betyder dannelsen af membranløse organeller, fx nukleoler), som regelmæssigt involverer argininrige domæner 8,9,10 . Til gengæld påvirker dette fysiologi og sygdomstilstande, herunder kræft 11,12,13, myelomatose14, hjerte-kar-sygdomme 15, viral patogenese, spinal muskelatrofi 16, diabetes mellitus 17 og aldring1. Forhøjede ADMA-niveauer i blodbanen, fx afledt af lunge18 på grund af proteinnedbrydning, menes at være forbundet med endoteldysfunktion, kronisk lungesygdom19 og andre syndromer af hjerte-kar-sygdomme20. Overekspression af PRMT'er har vist sig at fremskynde tumorigenese og er forbundet med dårlig prognose21,22. Desuden udløser ablation af PRMT6 og PRMT7 en cellulær ældningsfænotype23. Signifikant nedsat ADMA og PRMT1 er blevet fundet under aldring af WI-38 fibroblaster24.
Udfordringen er at forstå, hvordan methylering virker i (pato)fysiologiske processer, er at identificere og kvantificere proteinargininmethylering. De fleste af de nuværende tilgange bruger antistoffer til at detektere methylerede argininer. Disse antistoffer er dog stadig kontekstspecifikke og genkender muligvis ikke forskellige motiver af argininmethylerede proteiner25,26. I den beskrevne protokol kan alle de argininderivater, der er nævnt ovenfor, kvantificeres pålideligt ved kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, dvs. alene, i kombination eller, som i de fleste tilfælde, inden for komplekse biologiske matricer som eukaryote celler (fx fra gær, mus eller human oprindelse) og væv27 samt serum28. For proteiner og disse komplekse matricer er proteinhydrolyse29 en forudsætning for at generere frie (modificerede) aminosyrer, såsom arginin, MMA, SDMA og ADMA. Fastfaseekstraktion (SPE)30 muliggør berigelse af de relevante forbindelser. Endelig tillader 1H-NMR-spektroskopi parallel påvisning af arginin og alle de vigtigste methylderivater af arginin. NMR-spektroskopi har den fordel, at den virkelig er kvantitativ, meget reproducerbar og en robust teknik31,32. De endelige NMR-målinger kan foretages efterfølgende, når mange prøver er indsamlet og klargjort. Endelig fokuserer denne protokol primært på prøveforberedelse, da dette ikke kræver et eget NMR-spektrometer. Det kan udføres i de fleste biokemiske laboratorier. Alligevel gives nogle hints om, hvilke NMR-spektroskopimålinger der skal udføres i dette arbejde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Gærproteinhydrolysater blev anvendt som prøver til de repræsentative resultater af dette arbejde. Hele protokollen er opsummeret i figur 1.
1. Fremstilling af materialer og reagenser
- Methanol/vand: Der fremstilles en blanding af to dele 99 % methanol (MeOH) og en delH2O, betegnet som MeOH/H2O. Ren MeOH og MeOH/H2O opbevares ved -20 °C for at minimere alkoholfordampning og øge prøvestabiliteten.
- Saltsyre (HCI): Fortynd 9 mol / l fra koncentreret HCI (12,0 mol / l eller 37%) samt 0,1 mol / l HCI. Den højere koncentrerede (9 mol / L) opløsning anvendes til proteinhydrolyse, mens den lavere koncentrerede (0,1 mol / L) anvendes til fastfaseekstraktion.
FORSIGTIG: Arbejd inde i stinkhætten. - Forbered en erstatningsopløsning til SPE, der indeholder 10% af en mættet ammoniakopløsning (lager: 30% w / w ammoniak), 50% methanol og 40% vand (v / v).
- NMR-buffer: 5,56 g dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4, 0,08 mol/l), 0,4 g 3-(trimethylsilyl)propionsyre-2,2,3,3-d4-natriumsalt (TSP, 5 mmol/l), 0,04 % (w/v) natriumazid (NaN3) opløses i 500 ml deuteriumdioxid (D2O) og justeres til pH 7,4 (ved hjælp af HCl eller NaOH, henholdsvis) (se materialefortegnelse). Renheden af hver ny bufferbatch kontrolleres ved NMR-spektroskopi.
BEMÆRK: Mængden af forurenende stoffer (f.eks. ethanol) skal være så lav som muligt. - Fyld papirmasserør med zirconiumoxidperler (2 ml rør og 1,4 mm perler er velegnede til de fleste applikationer, men forskellige varianter er tilgængelige) (se materialetabel). Fyld ca. 10-20 perler i hånden eller køb fyldte rør, som også er tilgængelige.
- Hold pipetterne og de respektive spidser klar i området 10-1.000 μL.
BEMÆRK: Meget rent vand, betegnet som H 2O, defineret ved en høj modstand på ≥18,2 MΩ · cm-1, blev brugt under hele arbejdet. Det svarer til dobbelt destilleret vand.
2. Indsamling og opbevaring af prøver
- Væskeprøverne (serum/plasma, cellekultursupernatant osv.) fryses med flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C indtil brug.
- Forbered de faste materialer som nævnt nedenfor.
- Saml cellerne fra cellekulturer (3-5 millioner celler) enten ved at indsamle klæbende celler efter vask med koldt fosfatbufret saltvand, skrabning og centrifugering eller direkte centrifugering af celler dyrket i suspension.
- Cellesupernatanterne fjernes (som kan indsamles til yderligere analyse, enten ved konsekutiv direkte måling, jf. trin 6, eller efter udfældning af opløselige proteiner, se trin 3.1), hvorefter pellets lynfryses med flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C. For yderligere behandling, se trin 3.2.
- Opbevar og opsaml vævene i henhold til formålet med undersøgelsen. For meget homogene væv, såsom leveren eller musklen, skal du analysere nogen del af det. For eksempel, i tilfælde af en musehjerne, bestemme global argininmethylering af hele hjernen eller hjernesektionerne.
BEMÆRK: Den ideelle vægt af væv, der skal behandles, er 30-60 mg. Det anbefales at fryse og pulverisere hele hjernen og bruge alikvoter deraf. Alternativt kan specifikke hjernedele (fx frontal, cerebellum, occipitale regioner eller en halvkugle, der vejer ~ 250 mg) anvendes.
3. Forberedelse af indledende prøver
BEMÆRK: Udfør arbejdet på is, og hold MeOH koldt. Prøverne skal også opbevares på is for at undgå proteinnedbrydning.
- Til flydende prøver tilsættes 400 μL iskold methanol til 200 μL af prøven. Fortsæt med trin 3.3.
BEMÆRK: Hvis der er mindre prøve til rådighed, skal du justere mængderne i overensstemmelse hermed; NMR-følsomheden er normalt høj nok til mindre prøvemængder, men skal testes individuelt. - I tilfælde af faste materialer fremstilles tilstrækkelige 1,5 ml rør til lysaterne (anvendes til centrifugering efter homogenisering).
- Cellepillerne resuspenderes forsigtigt, men grundigt, i 600 μL MeOH / H2O og overføres hele væskefasen til papirmasserørene.
- Vævet anbringes i papirmasserør (du kan veje det direkte i glassene), og der tilsættes 600 μL MeOH/H2O (til 30-60 mg; justeres, hvis vægten afviger væsentligt).
- Sæt rørene i vævshomogenisatoren (se materialetabel) og homogeniser enten en gang i 20 s med kraftig omrystning (for cellepiller, blødt væv) eller to gange i 20 s hver (eller længere om nødvendigt) med et interval på 5 minutter imellem (for stift væv).
- Efter homogenisering sættes straks prøver på isen igen og overføres hele lysaterne til nye 1,5 ml rør.
- Opbevar prøverne i mindst 30 minutter (op til flere dage) ved -20 °C før videre behandling.
- Der centrifugeres ved 10.000 x g i 30 minutter ved 4 °C. I mellemtiden skal du forberede nok 1,5 ml rør til at opsamle supernatanterne.
BEMÆRK: Denne supernatant (betegnet "(1)" i figur 1) kan kasseres, frysetørres og behandles direkte for NMR (trin 6) eller analyseres på anden måde. - I denne protokol anvendes MeOH-bundfaldet (= pellet opnået efter henholdsvis trin 3.1 eller 3.2.2) til yderligere analyse, der blandt andet indeholder komponenter såsom nukleinsyrer og lipider, argininmethylerede proteiner. Fortsæt med proteinhydrolyse eller opbevar pellets ved -20 °C i et par dage.
4. Hydrolyse af protein
- Der tilsættes 500 μl 9 mol/l HCl til hver prøve. Afkort derefter hætterne på hvert rør med en saks og læg dem i glaskulturrørene (figur 2A). Luk forsigtigt men tæt de røde hætter (hvorved forseglingen kontrolleres).
BEMÆRK: Før brug skal du altid kontrollere hver tætning (grå PTFE-folie inde i de røde skruelåg) for korrekt tilspænding og regelmæssigt rengøre dem med vand. - Når de er færdige, anbringes rørene i et bægerglas, der er delvist fyldt med sand (for bedre varmeoverførsel), og prøverne hydrolyseres i ca. 16 timer ved 110 °C i et tørrekammer.
- Efter hydrolyse afkøles prøverne (~1 time).
- Derefter frysetørres natten over ved hjælp af en centrifuge med højt vakuum (under 100 Pa).
- Pellets opløses - hvis de er helt tørre (hvis ikke, fortsæt frysetørring) - i 1 ml 0,1 mol / l HCl og tilsæt 50 μL chloroform (CHCl3) til hvert rør; Pelleten opløses grundigt med en 1.000 μL pipette, hvorved væskerne blandes, og derefter overføres hele volumenet til et nyt rør.
FORSIGTIG: Arbejd altid med små mængder for at minimere omfattende fordampning - Derefter centrifugeres ved 8.000 x g i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Den øverste fase af den bifasiske væske indeholdende den vandopløselige fraktion (figur 2B, fraktionen med den nedre densitet) opsamles forsigtigt med en pipette og fyldes i nye rør. Brug 1,5 ml tuber til manuel SPE (pkt. 5.2) eller glasflasker til robot-SPE (pkt. 5.3 og figur 2D). Undgå spild over CHCl3 og dets indhold (figur 2C).
5. Fastfaseekstraktion (SPE)
- Før første brug rengøres SPE-cylinderampullerne to gange med 1 ml udskiftningsopløsning (trin 1.3) efterfulgt af centrifugering ved 800 x g i 1 minut ved stuetemperatur (anbragt i 15 ml rør). De kan bruges 10-20 gange hver.
- Manuel SPE
- Forkonditioner cylinderampullerne (se materialetabellen) i hver serie med 1 ml ren methanol og 2 x 1 ml PBS, hver gang efterfulgt af centrifugering ved 800 x g i 1 min ved stuetemperatur (anbragt i 15 ml rør).
- Derefter lægges prøverne (fra trin 4.7) på SPE-cylinderampullerne, og de centrifugeres ved 600 x g i 2 minutter ved stuetemperatur.
- Anvend derefter en vaskecyklus som nævnt nedenfor.
- Der tilsættes tre gange 1 ml H2O (hver efterfulgt af centrifugering i 1 min ved 800 x g ved stuetemperatur).
- Tilsæt fem gange 1 ml 0,1 mol/l HCI (hver efterfulgt af centrifugering i 1 min ved 800 x g ved stuetemperatur).
- Der tilsættes to gange 1 ml MeOH (hver efterfulgt af centrifugering i 1 minut ved 800 x g ved stuetemperatur).
- Derefter elueres arginin og dets derivater med 3 x 1 ml erstatningsopløsning (efterfulgt af centrifugering 1 min ved 800 x g ved stuetemperatur) i et enkelt 15 ml rør.
BEMÆRK: Udskiftningsopløsningen tjener som elueringsmiddel til arginin og derivater og bruges også til rengøring af patronerne (alle stoffer vaskes enten ud før eluering eller ved udskiftningsopløsningens grundlæggende pH-værdi). For at undgå kontaminering over tid bør genbrug dog begrænses (se trin 5.1).
- SPE med robotteknologi
BEMÆRK: Her leveres en pipetteringsrobot (hoveddelen bestående af en pipetternål, en vaskestation til nålen, en reagensforsyning og positioner for prøver og eluater, se materialetabel) med en patronholder til SPE-søjlerne. For andre instrumenter skal du sørge for at være fuldt udstyret med alle de nævnte ting.- Supernatanten (fra trin 4.7) fyldes direkte i hætteglas af glas med PTFE-forsegling (figur 2D), der tilberedes tilstrækkelige reagenser (100 ml af hver, dvs. erstatningsopløsning, 99 % MeOH, PBS,H2Oog 0,1 mol/l HCl), 5 ml reagensglas til eluering og vaskeopløsning til robottens nål (normalt H2O).
- Brug en applikation eller metode i robottens software baseret præcist på de trin, der er beskrevet for manuel SPE (trin 5.2).
BEMÆRK: Detaljerne kan variere meget blandt instrumentleverandører, så se softwaremanualen til den respektive robot for programmering. En pipetteringsrobot fungerer normalt ved at påføre lufttryk på patronerne i stedet for centrifugering, hvilket er den største forskel. Hvis protokollen oprettes og køres for første gang, skal du inkludere kontroller (f.eks. L-arginin med kendt koncentration) for at verificere en optimal arbejdsgang.
6. Sidste forberedelse til NMR
- Frysetørrede prøver natten over for at fuldføre tørhed for at slippe af med ammoniak og H2O.
- Hver prøve opløses i 500 μL NMR-buffer (trin 1.4) og overføres til NMR-reagensglas. Det er vigtigt, at volumenet skal være det samme i alle rør, og prøverne skal være homogene (fri for rester og lipider, som har tendens til at aggregere).
BEMÆRK: Detaljerne i NMR-spektroskopi går ud over denne metodegennemgang og er beskrevet mere detaljeret andetsteds27. Her forklares kun de vigtigste krav og trin. Kvantificeringen af arginin og dets metabolitter udføres på et 600 MHz NMR-spektrometer (se materialetabel). I princippet kan alle andre NMR-spektrometer-/NMR-feltstyrker anvendes, forudsat at NMR-signalerne for arginin og methylerede argininer kan detekteres med tilstrækkelig følsomhed og uden signaloverlapning. Ethvert sondehoved med z-aksegradienter, der kan registrere 1H-spektre, kan anvendes, forudsat at impulssekvenserne er indstillet i overensstemmelse hermed. - Optag et 1D-spektrum ved hjælp af CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill) pulssekvens33,34 (cpmgpr1d, 512 scanninger, størrelse på fid 73728, 11904.76 Hz spektralbredde på en 600 MHz NMR, genbrugsforsinkelse 4 s) med vandsignalundertrykkelse ved hjælp af presaturation.
- I disse eksperimenter fjernes 1H skalarkoblingerne ved virtuel afkobling, hvilket reducerer signaloverlapningen. Optag yderligere for specifikke spørgsmål og/eller komplekse prøver eller matricer, f.eks. 1 H-13C-heteronukleær enkelt kvantekohærens (HSQC) spektre27.
BEMÆRK: For mere komplekse matricer, hvor 1 H NMR-signaler af methylerede argininer delvis kan overlappes med 1 H NMR-signaler fra andre metabolitter (f.eks. lysin), kræves 1H homonukleare J-opløste spektre (JRES)35. - Der udføres absolut kvantificering ved at integrere de respektive topintensiteter for standarder med en kendt koncentration, f.eks. 100 μmol/arginin.
BEMÆRK: Rutinemæssigt rapporteres ADMA, SDMA og MMA (se materialetabel) som et forhold i forhold til arginin. Dette har en væsentlig fordel, at der ikke skal udføres separat normalisering (f.eks. Celleantal, vævsmasse, proteinkoncentrationer). I så fald tjener arginin som en intern standard, og relativ kvantificering er tilstrækkelig til at få biologisk relevant information. - For differentiering af SDMA og MMA, frysefryse prøverne igen være at slippe af med D2O (hvis de har været resuspenderet i NMR buffer før), som derefter erstattes af deutereret dimethylsulfoxid (d 6-DMSO), hvilket muliggør opløsning af methylresonanser27. Derfor suges prøverne fra NMR-rørene med Pasteur-pipetter, frysetørres og opløses i 500 μL d6-DMSO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rutinemæssigt anvendes 1H 1D-projektioner af 2D J-opløste (JRES), virtuelt afkoblede NMR-spektre til spidsbelastningstildelinger og kvantificeringer i vores laboratorium36. Figur 3 viser repræsentative JRES-spektre af gærproteinhydrolysater oprenset ved hjælp af denne SPE-protokol. Selvom begge stoffer er meget forskellige, kan de begge stoffer adskilles og kvantificeres i en cellulær matrix. Baseret på antallet af protoner af den specifikke methylgruppe (-CH3) eller methylen (-CH2-) ved det respektive kemiske skift muliggør 1H-NMR-spektroskopi præcis kvantificering. Som påpeget i protokollen (trin 0) er den relative kvantificering af et methyl-argininderivat sammenlignet med arginin hovedsageligt tilstrækkelig til at observere biologiske processer, f.eks. ændringer af argininmethylering som reaktion på modulationer, såsom knock-down/overekspression af gener, ændringer i næringsstoffer eller behandling med inhibitorer.
Som vist tidligere27 kan L-arginin og ADMA godt diskrimineres af deres forskellige karakteristiske kemiske skift ved henholdsvis 3,25 og 3,02 ppm. SDMA- og MMA-methylprotoner afslører overlappende toppe iD 2 O (NMR-bufferen beskrevet i trin 1.4) ved et kemisk skift på 2,85 ppm. Hvis der er en top til stede i den respektive position, kan man adskille SDMA og MMA ved at opløse prøverne i d 6-DMSO som beskrevet i trin6.6 i protokollen. Ved hjælp af denne tilgang kan 1H NMR kemiske skift af SDMA og MMA adskilles og kvantificeres med karakteristiske kemiske skift ved 2,76 ppm (SDMA) og 2,74 ppm (MMA)27. Figur 3B viser repræsentative data for SDMA og MMA (begge 100 μmol/L) i henholdsvis D2O og d6-DMSO. Tilsvarende data om SMDA og MMA påvist i forskellige celler og væv er blevet rapporteret for nylig27. Som beskrevet i trin 6.4-6.5 i protokollen kan referencestandarder for kendte koncentrationer anvendes til kvantificering. Alle referencestandarder, der er nævnt i teksten, er kommercielt tilgængelige.
Figur 1: Oversigt over prøveforberedelse. Skema, der afslører de væsentlige trin fra prøveindsamling til NMR-måling. De sorte bokse henviser til nummereringen i protokolafsnittene. Derudover vises det omtrentlige antal dage (varierende alt efter antallet af prøver). Inhomogene væskeprøver kan centrifugeres, før MeOH tilsættes (trin 3.1) for at fjerne resterne (ikke vist). Supernatanten efter indledende centrifugering (1), der indeholder f.eks. intracellulære metabolitter eller ikke-proteinbundne argininmetabolitter, kan opbevares ved -20 °C til yderligere analyse. Rutinemæssigt analyseres MeOH-pellets (2) yderligere. Forkortelser: CHCl3, chloroform; HCI, saltsyre; MeOH, methanol; NMR, kernemagnetisk resonans; o/n, natten over; SN, supernatant; SPE, fastfaseekstraktion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Håndtering af proteinhydrolysater og forberedelse til fastfaseekstraktion. (A) Bægerglas fyldt med sand, glasrør, skruelåg med grå polytetrafluorethylen (PTFE) forseglingsfolie og prøver i 1,5 ml rør efter afskæring af hætterne. B) Rør efter centrifugering (trin 4.6) og (C) efter fjernelse af den vandige supernatant (trin 4.7): Der kan være noget resterende vand (~50 μL) tilbage. Den sorte rest indeholder uopløselige, trækullede organiske rester. Stadig, nogle prøver kan indeholde farvede stoffer (D), som ikke forstyrrer L-arginin måling. Dette skyldes til dels fastfaseekstraktion (SPE) bagefter, enten ved hjælp af på hinanden følgende centrifugeringstrin (E) eller en pipetteringsrobot (F). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Typiske NMR-spektre af L-arginin og dets methylderivater. 1 H 1D projicerede J-opløste NMR-spektre kunne let skelne mellem δ-(CH2)-protonerne af L-arginin (3,25 ppm) og ω-N-CH-3-protonerne af asymmetrisk dimethylarginin (ADMA, ved3,02 ppm). Prøver fra gærpiller (A), der afslører varierende mængder ADMA, kan kvantificeres ved at integrere signalintensiteter, selv i nærvær af store mængder arginin (bemærk, at den fulde arginintop ikke er vist). (B) Da ω-(N G,N'G)-symmetrisk dimethylarginin (SDMA) og ω-N G-monomethylarginin (MMA) næppe kan skelnes i deuteriumoxidbuffer (D 2 O), skal prøverne opløses i deutereret dimethylsulfoxid (d6-DMSO), hvor toppene (i dette tilfælde 100 μmol/L af hvert stof) let kan skelnes fra hinanden (toppe ved 2,75 og2,76ppm. henholdsvis) og kvantificeres. Alle spektrogrammer blev eksporteret direkte fra NMR-spektrometerets styringssoftware. Softwaren afslører de primære resultater, som skal kontrolleres, før en mere detaljeret analyse, herunder statistik over mange prøver, udføres. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I det følgende afsnit ligger det primære fokus på selve metoden; De biologiske implikationer af argininmethylering er beskrevet i afsnittet Indledning.
For det første kan væv med forskellig stivhed have brug for justering af prøvelyse: celler fra cellekultur (herunder bakterier, gær osv.) og væv som hjerne, ung lever, glat muskel osv. Kan hurtigt homogeniseres. For væv med høj stivhed (herunder lever hos ældre forsøgspersoner, arterier, knogler osv.) skal homogeniseringen udføres to gange (se trin 3.2.3). Ikke desto mindre bør denne proces ikke fortsættes oftere, selvom nogle uopløselige rester er tilbage. I stedet centrifugeres prøverne i 10 minutter ved 10 000 x g , og supernatanterne indsamles til yderligere analyse (for at minimere nedbrydningen af prøverne).
På hvert trin, hvor prøverne fryses (i første omgang efter tilsætning af MeOH henholdsvis trin 3.3, 3.4 eller 3.5) eller efter frysetørring (trin 4.4 og 6.1), kan prøverne opbevares i et par dage før yderligere behandling. Desuden kan supernatanten fra trin 3.4 (efter homogenisering, betegnet som "(1)" i figur 1) også opbevares til yderligere analyse, f.eks. til måling af andre metabolitter end methylargininer36,37,38.
På den ene side involverer kritiske trin prøveopbevaring, da nedbrydning af proteiner kan ændre resultatet. Hvis proteinnedbrydning sker før MeOH-udfældning, kan arginin og dets methylderivater undervurderes. Derfor er opbevaring af prøver afgørende, f.eks. før og efter celle- eller vævslyse ved -20 °C eller, når det er muligt, ved -80 °C. Før eller efter homogenisering (trin 3.2) opbevares prøverne på is.
På den anden side ændrer methanolforbehandling af prøver for at udfælde proteiner ikke arginins methyleringsmønster. Dette blev testet med lysozym- og Escherichia coli-proteinekstrakter (som ikke indeholder methyleret arginin)27. Tidligere rapporter har imidlertid vist, at MeOH kan methylere de terminale carboxylgrupper af glutamat og aspartat39.
Ved proteinhydrolyse skal det sikres, at tætningerne på skruelågene er intakte (trin 4.1). Hvis ikke, kan fordampning af HCI påvirke tørrekammeret. Koncentrationen af analysanderne ændres dog muligvis ikke kritisk, fordi de ikke fordamper, og resterende HCI fordampes senere ved frysetørring. Lavere koncentrationer af HCI, f.eks. 6 mol/l, kan anvendes, men kan kræve længere hydrolysetid. Efter hydrolyse kan prøverne behandles ved stuetemperatur. Korrekt fjernelse af lipider er dog afgørende. Lipider kan danne bifasiske blandinger i vand (eller henholdsvis D2O) senere under NMR-måling. Disse inhomogeniteter fører til udvidelse af NMR-toppen og kan potentielt påvirke NMR-eksperimenters kvalitet og følsomhed.
Hvis der ikke er nogen pipetteringsrobot til rådighed for SPE, er det investeringen værd (den kan også bruges til andre formål). Prøverne på SPE-pipetteringsrobotten behandles sekventielt, og i den nuværende opsætning tager en prøve ~ 40 minutter for en komplet kørsel. På grund af begrænsninger i reagenskapaciteten (dvs. 100 ml) kan kun 19 prøver behandles på én gang (tager ~ 13 timer samlet). Alligevel er den praktiske tid meget kortere end for den manuelle SPE-procedure og kræver mindre materiale. I denne periode kan prøver opbevares i robotten ved stuetemperatur indtil frysetørring. Tilsvarende produkter kan erstatte de brugte SPE-matricer og cylinderampuller. Ikke desto mindre anbefales det at evaluere SPE-protokollen og justere den om nødvendigt.
Detektionsgrænsen for ADMA er ~100 nmol/l som tidligere evalueret ved serielle fortyndinger og ved hjælp af de rapporterede NMR-måletider. På den anden side kan høje argininkoncentrationer også overvurdere forholdet mellem ADMA og arginin (som normalt ligger i området 5% -15%). Dette skyldes, at over 3 mmol / L arginin; SPE-kolonnebindingskapaciteten kan nå mætning27. Til kontrol af følsomhed og specificitet af hele arbejdsgangen i tilfælde af uventede resultater (f.eks. ingen toppe eller overlappende toppe i 1H-NMR-spektrene ved de rapporterede kemiske skift) er standarder for ADMA, SDMA og MMA tilgængelige fra kommercielle leverandører (se materialetabel). Hvis et laboratorium ikke har noget NMR-spektrometer, kan alle trin, herunder endelig frysetørring (trin 6.1), udføres i det respektive laboratorium, og prøver kan sendes til et NMR-anlæg til analyse.
Sammenlignet med andre metoder, såsom massespektrometri, er der ikke behov for mærkning af analysanderne, og det kan udføres uden interne standarder for kvantificering. På den anden side er følsomheden af NMR lidt lavere, hvilket i de fleste biologiske tilfælde dog ikke spiller nogen rolle, ligesom arginin og dets methylderivater let kan påvises i alle former for eukaryote celler eller væv. Som tidligere nævnt er 3 millioner celler nok til at kvantificere proteinbundet ADMA - flere celler, der let kan opnås med de fleste cellelinjer. I tilfælde af langsomt voksende, umodificerede primære celler af menneskelig oprindelse som voksne stamceller40 kan celler dyrkes i en længere periode eller samles fra separate forsøg. Det samme gælder for vævsprøver. ~30 mg væv, svarende til mange organer, f.eks. hos mus (helt eller delvist, f.eks. små muskler) eller biopsiprøve, er tilstrækkeligt til at forberede tilstrækkeligt lysat og proteinhydrolysat til NMR-måling27. Andre metoder til måling af protein argininmethylering omfatter anvendelse af enzymkoblede luminescensassays41 eller 3H-mærkede S-adenosyl-methionin (SAM)42. Følsomheden er høj og kan øges ved at bruge 14C-mærket SAM, men på bekostning af øgede omkostninger. Derudover forårsager brugen af radioaktive stoffer (herunder væsker til scintillationstælling) særlig affaldshåndtering, hvilket ikke er nødvendigt ved hjælp af den nuværende protokol.
En komplementær metode til denne protokol, ved hjælp af 2D heteronukleær NMR-spektroskopi, kan afsløre stedspecifikke methyleringsmønstre inden for isolerede proteiner. Den er for nylig blevet offentliggjort, herunder en detaljeret beskrivelse af påvisningen af methyl-argininer ved NMR-spektroskopi generelt43. Den nuværende protokol giver ikke oplysninger om stedspecifik argininmethylering i proteiner. Alligevel ændres global methylering på cellulært og fysiologisk niveau, herunder cellevækst og differentiering, aldring, kræft 1,2,12, kardiovaskulær20 og neurodegenerative sygdomme 8,44. Detaljerne om de nøjagtige involverede mekanismer er stadig ikke fuldt ud forstået, og mulige lægemiddelkandidater, der interfererer med protein-argininmethylering11 både in vitro og in vivo, kræver yderligere udforskning1. At studere kinetikken af methylering (som vores gruppe for nylig har vist)27 er afgørende for at få indsigt i argininmodifikation og proteinnedbrydningsmekanismer. Globale argininmethyleringsmålinger og kinetiske eksperimenter (prøver kan fryses når som helst), der spænder fra enkeltproteiner til prøver fra hele organismer, kan udføres ligetil ved hjælp af denne protokol. Det giver derfor en robust metode, som let kan tilpasses til fremtidig forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Arbejdet blev støttet af Austrian Science Fund (FWF) tilskud P28854, I3792, doc.funds BioMolStruct DOC 130, DK-MCD W1226 BioTechMed-Graz (flagskibsprojekt DYNIMO), Austrian Research Promotion Agency (FFG) tilskud 864690 og 870454, Integrative Metabolism Research Center Graz; Østrigsk infrastrukturprogram 2016/2017, Steiermarks regering (Zukunftsfonds) og opstartsfond for talenter på højt niveau ved Fujian Medical University (XRCZX2021020). Vi takker Center for Medicinsk Forskning for adgang til cellekulturfaciliteter. F.Z. blev uddannet inden for rammerne af ph.d.-uddannelsen Molekylær Medicin, Medical University of Graz. Q.Z. blev uddannet inden for rammerne af ph.d.-uddannelsen Metaboliske og hjerte-kar-sygdomme, Medical University of Graz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | Greiner Bio One | 188271 | |
| 3-(trimethylsilyl) propionic acid-2,2,3,3-d4 sodium salt (TSP) | Alfa Aesar | A1448 | |
| 5 mL tubes, round bottom | Greiner Bio One | 115101 | |
| Ammonia Solution 32% | Roth | A990.1 | |
| Bruker 600 MHz NMR spectrometer, equipped with a TXI probe head | Bruker | - | |
| Centrifuge, refrigerated, e.g. 5430 R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chloroform ≥99% p.a. | Roth | 3313.1 | |
| Cryocool | Thermo Scientific | SCC1 | heat transfer fluid for SpeedVac System |
| Deuterium Oxide (D2O) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-10-PK | |
| Dimethyl sulfoxide-d6 (d6-DMSO) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-6-1000 | |
| Drying Chamber | Binder | 9090-0018 | |
| DURAN culture tubes, 13 x 100mm, GL 14, 9 mL | VWR International | 212-0375 | |
| Edwards Deep vacuum oil pump RV5 | Thermo Scientific | 16234611 | part of the SpeedVac System |
| Eppendorf 1.5 mL tubes | Greiner Bio One | 616201 | |
| Gilson pipetting robot GX-241 Aspec | Gilson Inc. | 26150008 | |
| L-arginine | AppliChem | A3675 | |
| Methanol ≥99% | Roth | 8388.4 | |
| Milli-Q water aparatus | Millipore | ZIQ7000T0 | |
| Oasis MCX 1cc/30 mg, 1 mL cartridges | Waters | 186000252 | https://www.waters.com/waters/en_US/Waters-Oasis-Sample-Extraction-SPE-Products/ |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | LONBE17-512F | |
| Precellys 24 tissue homogenizer | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | https://www.bertin-instruments.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys24-tissue-homogenizer/ |
| Precellys tubes (pulping tubes) | VWR International | 432-0351 | |
| Precellyse 1.4 mm zirconium oxide beads | VWR International | 432-0356 | |
| Reacti-Therm/ReactiVap Heating, Stirring, and Evaporation Modules | Thermo Scientific | TS-18820 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/TS-18820 |
| Rotor for 1.5 mL tubes, FA-45-30-11 | Eppendorf | 5427753001 | |
| Savant Refrigerated Cooling Trap | Thermo Scientific | 15996161 | part of the SpeedVac System |
| Savant SpeedVac vacuum concentrator SPD210 | Thermo Scientific | 15906181 | part of the SpeedVac System; equipped with rotor for 1.5 ml tubes |
| Screw caps for glas vials with PTFE sealing, DN9 | Dr. R. Forche Chromatographie | CT11B3011 | |
| Seasand | Roth | 8441.3 | |
| Short thread glas vials 1.5 mL, ND9 | Dr. R. Forche Chromatographie | VT1100309 | |
| Sodium azide (NaN3) | Roth | K305.1 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | VWR | BDH7363-4 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | VWR | 80731-078 | |
| TopSpin 4.0 (Software) | Bruker | - | https://www.bruker.com |
| ω-NG-asymmetric dimethylarginine (ADMA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-208093 | |
| ω-NG-monomethylarginine (MMA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-200739A | |
| ω-NG-NG'-symmetric dimethylarginine (SDMA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-202235A |
References
- Guccione, E., Richard, S. The regulation, functions and clinical relevance of arginine methylation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).
- Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
- Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase. Journal of Biological Chemistry. 271 (25), 15034-15044 (1996).
- Bachand, F. Protein arginine methyltransferases: from unicellular eukaryotes to humans. Eukaryotic Cell. 6 (6), 889-898 (2007).
- Wang, Y. C., Li, C. Evolutionarily conserved protein arginine methyltransferases in non-mammalian animal systems. FEBS Journal. 279 (6), 932-945 (2012).
- Ahmad, A., Cao, X. Plant PRMTs broaden the scope of arginine methylation. Journal of Genetics and Genomics. 39 (5), 195-208 (2012).
- Fisk, J. C., Read, L. K. Protein arginine methylation in parasitic protozoa. Eukaryotic Cell. 10 (8), 1013-1022 (2011).
- Hofweber, M., et al. Phase Separation of FUS Is Suppressed by Its Nuclear Import Receptor and Arginine Methylation. Cell. 173 (3), 706-719 (2018).
- Chong, P. A., Vernon, R. M., Forman-Kay, J. D. RGG/RG Motif Regions in RNA Binding and Phase Separation. Journal of Molecular Biology. 430 (23), 4650-4665 (2018).
- Nott, T. J., et al. Phase transition of a disordered nuage protein generates environmentally responsive membraneless organelles. Molecular Cell. 57 (5), 936-947 (2015).
- Fong, J. Y., et al. Therapeutic targeting of RNA splicing catalysis through inhibition of protein arginine methylation. Cancer Cell. 36 (2), 194-209 (2019).
- Yang, Y., Bedford, M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer. Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).
- Wang, S. M., Dowhan, D. H., Muscat, G. E. O. Epigenetic arginine methylation in breast cancer: emerging therapeutic strategies. Journal of Molecular Endocrinology. 62 (3), 223-237 (2019).
- Gulla, A., et al. Protein arginine methyltransferase 5 has prognostic relevance and is a druggable target in multiple myeloma. Leukemia. 32 (4), 996-1002 (2018).
- Wang, Z., Tang, W. H., Cho, L., Brennan, D. M., Hazen, S. L. Targeted metabolomic evaluation of arginine methylation and cardiovascular risks: potential mechanisms beyond nitric oxide synthase inhibition. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (9), 1383-1391 (2009).
- Friesen, W. J., Massenet, S., Paushkin, S., Wyce, A., Dreyfuss, G. SMN, the product of the spinal muscular atrophy gene, binds preferentially to dimethylarginine-containing protein targets. Molecular Cell. 7 (5), 1111-1117 (2001).
- Lee, J. H., Park, G. H., Lee, Y. K., Park, J. H. Changes in the arginine methylation of organ proteins during the development of diabetes mellitus. Diabetes Research and Clinical Practice. 94 (1), 111-118 (2011).
- Bulau, P., et al. Analysis of methylarginine metabolism in the cardiovascular system identifies the lung as a major source of ADMA. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 292 (1), 18-24 (2007).
- Zakrzewicz, D., Eickelberg, O. From arginine methylation to ADMA: a novel mechanism with therapeutic potential in chronic lung diseases. BMC Pulmonary Medicine. 9, 5 (2009).
- Fulton, M. D., Brown, T., Zheng, Y. G. The biological axis of protein arginine methylation and asymmetric dimethylarginine. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), (2019).
- Aliferis, K. A., Chrysayi-Tokousbalides, M. Metabolomics in pesticide research and development: review and future perspectives. Metabolomics. 7 (1), 35-53 (2011).
- Chiang, K., et al. PRMT5 Is a Critical Regulator of Breast Cancer Stem Cell Function via Histone Methylation and FOXP1 Expression. Cell Reports. 21 (12), 3498-3513 (2017).
- Blanc, R. S., Vogel, G., Chen, T., Crist, C., Richard, S. PRMT7 preserves satellite cell regenerative capacity. Cell Reports. 14 (6), 1528-1539 (2016).
- Lim, Y., Lee, E., Lee, J., Oh, S., Kim, S. Down-regulation of asymmetric arginine methylation during replicative and H2O2-induced premature senescence in WI-38 human diploid fibroblasts. Journal of Biochemistry. 144 (4), 523-529 (2008).
- Bhatter, N., et al. Arginine methylation augments Sbp1 function in translation repression and decapping. FEBS Journal. 286 (23), 4693-4708 (2019).
- Lee, Y. H., Stallcup, M. R. Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation. Molecular Endocrinology. 23 (4), 425-433 (2009).
- Zhang, F., et al. Global analysis of protein arginine methylation. Cell Reports Methods. 1 (2), (2021).
- Zinellu, A., Sotgia, S., Scanu, B., Deiana, L., Carru, C. Determination of protein-incorporated methylated arginine reference values in healthy subjects whole blood and evaluation of factors affecting protein methylation. Clinical Biochemistry. 41 (14-15), 1218-1223 (2008).
- Weiss, M., Manneberg, M., Juranville, J. F., Lahm, H. W., Fountoulakis, M. Effect of the hydrolysis method on the determination of the amino acid composition of proteins. Journal of Chromatography A. 795 (2), 263-275 (1998).
- Davids, M., et al. Simultaneous determination of asymmetric and symmetric dimethylarginine, L-monomethylarginine, L-arginine, and L-homoarginine in biological samples using stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 900, 38-47 (2012).
- Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation. Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).
- Vignoli, A., et al. High-throughput metabolomics by 1D NMR. Angewandte Chemie International Edition. 58 (4), 968-994 (2019).
- Carr, H. Y., Purcell, E. M. Effects of diffusion on free precession in nuclear magnetic resonance experiments. Physical Review. 94 (3), 630-638 (1954).
- Meiboom, S., Gill, D. Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation times. Review of Scientific Instruments. 29 (8), 688-691 (1958).
- Nagayama, K., Wuthrich, K., Bachmann, P., Ernst, R. R. Two-dimensional J-resolved 1H n.m.r. spectroscopy for studies of biological macromolecules. Biochemical and Biophysical Research Communications. 78 (1), 99-105 (1977).
- Stryeck, S., et al. Serum concentrations of Citrate, Tyrosine, 2- and 3- Hydroxybutyrate are associated with increased 3-month mortality in acute heart failure patients. Scientific Reports. 9 (1), 6743 (2019).
- Zhang, F., et al. Tissue-specific landscape of metabolic dysregulation during ageing. Biomolecules. 11 (2), (2021).
- Zhang, F., et al. Growing human hepatocellular tumors undergo a global metabolic reprogramming. Cancers. 13 (8), (2021).
- Pahlich, S., Zakaryan, R. P., Gehring, H. Protein arginine methylation: Cellular functions and methods of analysis. Biochimica et Biophysica Acta. 1764 (12), 1890-1903 (2006).
- Habisch, H. J., et al. Neuroectodermally converted human mesenchymal stromal cells provide cytoprotective effects on neural stem cells and inhibit their glial differentiation. Cytotherapy. 12 (4), 491-504 (2010).
- Ibanez, G., McBean, J. L., Astudillo, Y. M., Luo, M. An enzyme-coupled ultrasensitive luminescence assay for protein methyltransferases. Analytical Biochemistry. 401 (2), 203-210 (2010).
- Hevel, J. M., Price, O. M. Rapid and direct measurement of methyltransferase activity in about 30min. Methods. 175, 3-9 (2020).
- Altincekic, N., et al. Site-specific detection of arginine methylation in highly repetitive protein motifs of low sequence complexity by NMR. Journal of the American Chemical Society. 142 (16), 7647-7654 (2020).
- Kaneb, H. M., Dion, P. A., Rouleau, G. A. The FUS about arginine methylation in ALS and FTLD. The EMBO Journal. 31 (22), 4249-4251 (2012).
