Summary
Het huidige protocol beschrijft de bereiding en kwantitatieve meting van vrije en eiwitgebonden arginine en methyl-arginineen door 1H-NMR spectroscopie.
Abstract
Eiwitgebonden arginine wordt vaak gemethyleerd in veel eiwitten en reguleert hun functie door de fysisch-chemische eigenschappen te veranderen, hun interactie met andere moleculen, waaronder andere eiwitten of nucleïnezuren. Dit werk presenteert een gemakkelijk implementeerbaar protocol voor het kwantificeren van arginine en zijn derivaten, waaronder asymmetrisch en symmetrisch dimethylarginine (respectievelijk ADMA en SDMA) en monomethyl arginine (MMA). Na eiwitisolatie van biologische lichaamsvloeistoffen, weefsels of cellysaten wordt een eenvoudige methode voor homogenisatie, precipitatie van eiwitten en eiwithydrolyse beschreven. Omdat de hydrolysaten veel andere componenten bevatten, zoals andere aminozuren, lipiden en nucleïnezuren, is een zuiveringsstap met behulp van vastefase-extractie (SPE) essentieel. SPE kan handmatig worden uitgevoerd met behulp van centrifuges of een pipetteerrobot. De gevoeligheid voor ADMA met behulp van het huidige protocol is ongeveer 100 nmol / L. De bovengrens van detectie voor arginine is 3 mmol / L als gevolg van SPE-verzadiging. Samenvattend beschrijft dit protocol een robuuste methode, die zich uitstrekt van biologische monstervoorbereiding tot NMR-gebaseerde detectie, en waardevolle hints en valkuilen biedt voor succesvol werk bij het bestuderen van het argininemethyloom.
Introduction
In de afgelopen twee decennia is methylering van arginineresiduen erkend als een essentiële posttranslationele modificatie van eiwitten. Het beïnvloedt fundamentele biologische processen zoals regulatie van transcriptie, signaaltransductie en nog veel meer1. De belangrijkste eiwitten die betrokken zijn bij de regulatie van arginine methylatie zijn eiwit arginine methyltransferasen (PRMTs)2. De belangrijkste derivaten van arginine zijn ω-(NG,N G)-asymmetrisch dimethylarginine (ADMA), ω-(N G,N'G)-symmetrisch dimethylarginine (SDMA) en ω-N G-monomethylarginine (MMA)2.
PRMT's gebruiken S-adenosyl-l-methionine om methylgroepen over te brengen naar de terminale guanidinogroep (met twee equivalente aminogroepen) van eiwitgebonden arginine1. Twee belangrijke enzymen kunnen worden onderscheiden: Zowel type I- als type II-enzymen katalyseren de eerste methylatiestap om MMA te vormen (dat daardoor zijn symmetrie verliest). Na deze stap gebruiken type I-enzymen (bijv. PRMT1, 2, 3, 4, 6, 8) MMA als substraat om ADMA te vormen, terwijl type II-enzymen (voornamelijk PRMT5 en PRMT9) SDMA produceren. PRMT1 was het eerste eiwit arginine methyltransferase dat werd geïsoleerd uit zoogdiercellen3. Toch zijn PRMT's evolutionair geconserveerd4 in andere dieren zoals niet-zoogdier gewervelde dieren, ongewervelde chordaten, stekelhuidigen, geleedpotigen en nematoden cnidarians5, planten6 en protozoa, inclusief schimmels zoals gist7. In veel gevallen leidt knock-out van een van de PRMT's tot verlies van levensvatbaarheid, wat de essentiële rol onthult van gemethyleerde argininesoorten die betrokken zijn bij fundamentele cellulaire processen zoals transcriptie, translatie, signaaltransductie, apoptose en vloeistof-vloeistoffasescheiding (wat de vorming van membraanloze organellen betekent, bijvoorbeeld nucleoli), waarbij regelmatig argininerijke domeinen 8,9,10 betrokken zijn . Dit beïnvloedt op zijn beurt de fysiologie en ziektetoestanden, waaronder kanker 11,12,13, multipel myeloom14, hart- en vaatziekten 15, virale pathogenese, spinale musculaire atrofie16, diabetes mellitus17 en veroudering 1. Verhoogde ADMA-niveaus in de bloedbaan, bijvoorbeeld afgeleid van long18 als gevolg van eiwitafbraak, worden verondersteld verband te houden met endotheeldisfunctie, chronische longziekte19 en andere syndromen van hart- en vaatziekten20. Overexpressie van PRMT's blijkt tumorigenese te versnellen en is geassocieerd met een slechte prognose21,22. Bovendien veroorzaakt ablatie van PRMT6 en PRMT7 een cellulair senescentiefenotype23. Significant verlaagde ADMA en PRMT1 zijn gevonden tijdens de veroudering van WI-38 fibroblasten24.
De uitdaging is om te begrijpen hoe methylatie werkt in (patho)fysiologische processen is het identificeren en kwantificeren van eiwit arginine methylatie. De meeste van de huidige benaderingen gebruiken antilichamen om gemethyleerde arginineen te detecteren. Deze antilichamen zijn echter nog steeds contextspecifiek en herkennen mogelijk geen verschillende motieven van arginine gemethyleerde eiwitten25,26. In het beschreven protocol kunnen alle hierboven genoemde argininederivaten betrouwbaar worden gekwantificeerd door kernspinresonantie (NMR) spectroscopie, d.w.z. alleen, in combinatie, of, zoals in de meeste gevallen, binnen complexe biologische matrices zoals eukaryote cellen (bijv. Van gist, muis of menselijke oorsprong) en weefsels27, evenals serum28. Voor eiwitten en die complexe matrices is eiwithydrolyse29 een voorwaarde om vrije (gemodificeerde) aminozuren te genereren, zoals arginine, MMA, SDMA en ADMA. Vaste-fase extractie (SPE)30 maakt de verrijking van de verbindingen van belang mogelijk. Ten slotte maakt 1H-NMR-spectroscopie de parallelle detectie van arginine en alle belangrijke methylderivaten van arginine mogelijk. NMR-spectroscopie heeft het voordeel dat het echt kwantitatief, zeer reproduceerbaar en een robuuste techniek is31,32. De definitieve NMR-metingen kunnen achteraf worden gedaan wanneer veel monsters zijn verzameld en voorbereid. Tot slot richt dit protocol zich vooral op monstervoorbereiding omdat hiervoor geen eigen NMR-spectrometer nodig is. Het kan worden uitgevoerd in de meeste biochemische laboratoria. Toch worden in dit werk enkele hints gegeven waarop NMR-spectroscopiemetingen moeten worden uitgevoerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Gisteiwithydrolysaten werden gebruikt als monsters voor de representatieve resultaten van dit werk. Het hele protocol is samengevat in figuur 1.
1. Bereiding van materialen en reagentia
- Methanol/water: bereid een mengsel van twee delen 99% methanol (MeOH) en een deel van H2O, aangeduid als MeOH/H2O. Bewaar pure MeOH en MeOH/H2O bij -20 °C om de alcoholverdamping tot een minimum te beperken en de stabiliteit van het monster te verhogen.
- Zoutzuur (HCl): verdun 9 mol/L uit geconcentreerd HCl (12,0 mol/L of 37%) en 0,1 mol/L HCl. De hoger geconcentreerde (9 mol/L) oplossing wordt gebruikt voor eiwithydrolyse, terwijl de lager geconcentreerde (0,1 mol/L) oplossing wordt gebruikt voor vaste-fase extractie.
LET OP: Werk in de zuurkast. - Bereid een vervangingsoplossing voor SPE die 10% van een verzadigde ammoniakoplossing (voorraad: 30% m/m ammoniak), 50% methanol en 40% water (v/v) bevat.
- NMR-buffer: Los 5,56 g dinatriumwaterstoffosfaat (Na2HPO4, 0,08 mol/L), 0,4 g 3-(trimethylsilyl)propionzuur-2,2,3,3-d4 natriumzout (TSP, 5 mmol/l), 0,04 % (m/v) natriumazide (NaN3) op in 500 ml deuteriumdioxide (D2O) en stel aan tot pH 7,4 (met HCl of NaOH, respectievelijk) (zie materiaaltabel). Controleer de zuiverheid van elke nieuwe bufferbatch met NMR-spectroscopie.
OPMERKING: De hoeveelheid verontreinigingen (bijv. ethanol) moet zo laag mogelijk zijn. - Vul pulpbuizen met zirkoniumoxidekorrels (buizen van 2 ml en kralen van 1,4 mm zijn geschikt voor de meeste toepassingen, maar er zijn verschillende varianten beschikbaar) (zie materiaaltabel). Vul ongeveer 10-20 kralen met de hand of koop voorgevulde buizen, die ook beschikbaar zijn.
- Houd pipetten en de respectievelijke uiteinden klaar in het bereik van 10-1.000 μL.
OPMERKING: Zeer zuiver water, aangeduid als H2O, gedefinieerd door een hoge weerstand van ≥18,2 MΩ·cm-1, werd tijdens het hele werk gebruikt. Het komt overeen met dubbel gedestilleerd water.
2. Monsterverzameling en -opslag
- Flash bevries de vloeibare monsters (serum/plasma, celkweek supernatant, enz.) met vloeibare stikstof en bewaar ze bij -80 °C tot gebruik.
- Bereid de vaste materialen zoals hieronder vermeld.
- Verzamel de cellen uit celculturen (3-5 miljoen cellen) door het verzamelen van aanhangende cellen, na het wassen met koude fosfaat-gebufferde zoutoplossing, schrapen en centrifugatie, of directe centrifugatie van cellen gekweekt in suspensie.
- Verwijder de celsupernatanten (die kunnen worden verzameld voor verdere analyse, hetzij door opeenvolgende directe metingen, zie stap 6, of na precipitatie van oplosbare eiwitten, zie stap 3.1), en vries de pellets vervolgens in met vloeibare stikstof en bewaar ze bij -80 °C. Zie voor verdere verwerking stap 3.2.
- Bewaar en verzamel de weefsels volgens het doel van het onderzoek. Voor zeer homogene weefsels, zoals de lever of spier, analyseert u elk deel ervan. Bepaal bijvoorbeeld in het geval van een muizenbrein de globale argininemethylatie van de hele hersenen of hersensecties.
OPMERKING: Het ideale gewicht van de te verwerken weefsels is 30-60 mg. Het is raadzaam om de hele hersenen in te vriezen en te verpulveren en daarvan aliquots te gebruiken. Als alternatief kunnen specifieke hersendelen (bijv. Frontale, cerebellum, occipitale regio's of één hemisfeer, met een gewicht van ~ 250 mg) worden gebruikt.
3. Voorlopige monstervoorbereiding
OPMERKING: Voer het werk uit op ijs en houd MeOH koud. De monsters moeten ook op ijs worden bewaard om eiwitafbraak te voorkomen.
- Voeg voor vloeibare monsters 400 μL ijskoude methanol toe aan 200 μL van het monster. Ga verder met stap 3.3.
OPMERKING: Als er minder monster beschikbaar is, pas dan de volumes dienovereenkomstig aan; De NMR-gevoeligheid is meestal hoog genoeg voor kleinere monsterhoeveelheden, maar moet individueel worden getest. - Bereid in het geval van vaste materialen voldoende buizen van 1,5 ml voor de lysaten (gebruik voor centrifugatie na homogenisatie).
- Resuspenseer de celpellets voorzichtig, maar grondig, in 600 μL MeOH/H2O en breng de gehele vloeibare fase over in de pulpbuizen.
- Plaats weefsels in pulpbuizen (u kunt ze direct in de buizen wegen) en voeg 600 μL MeOH / H2O toe (voor 30-60 mg; pas aan als het gewicht aanzienlijk verschilt).
- Plaats de buisjes in de weefselhomogenisator (zie Materiaaltabel) en homogeniseer één keer gedurende 20 s met zwaar schudden (voor celpellets, zachte weefsels) of twee keer gedurende 20 s elk (of langer indien nodig) met een interval van 5 minuten ertussen (voor stijve weefsels).
- Na homogenisatie, onmiddellijk monsters op het ijs opnieuw en breng de hele lysaten over in nieuwe 1,5 ml buizen.
- Bewaar monsters gedurende ten minste 30 minuten (tot enkele dagen) bij -20 °C voor verdere verwerking.
- Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C. Bereid in de tussentijd voldoende buizen van 1,5 ml om de supernatanten te verzamelen.
OPMERKING: Dit supernatant (aangeduid als "(1)" in figuur 1) kan worden weggegooid, gelyofiliseerd en direct worden verwerkt voor NMR (stap 6) of anderszins worden geanalyseerd. - In dit protocol wordt het MeOH-neerslag (= pellet verkregen na respectievelijk stap 3.1 of 3.2.2) gebruikt voor verdere analyse met onder andere componenten zoals nucleïnezuren en lipiden, arginine-gemethyleerde eiwitten. Ga verder met eiwithydrolyse of bewaar de pellets enkele dagen bij -20 °C.
4. Eiwithydrolyse
- Voeg 500 μL 9 mol/L HCl toe aan elk monster. Knip vervolgens de doppen van elke buis af met een schaar en plaats ze in de glazen kweekbuizen (figuur 2A). Sluit voorzichtig, maar goed, de rode doppen (controleer daarbij de afdichting).
OPMERKING: Controleer voor gebruik altijd elke afdichting (grijze PTFE-folie in de rode schroefdoppen) op een goede aanscherping en reinig ze regelmatig met water. - Als u klaar bent, plaatst u de buizen in een bekerglas dat gedeeltelijk is gevuld met zand (voor een betere warmteoverdracht) en hydrolyseer u monsters gedurende ongeveer 16 uur bij 110 °C in een droogkamer.
- Koel na hydrolyse de monsters af (~ 1 uur).
- Daarna 's nachts lyofieliseren met behulp van een centrifuge met een hoog vacuüm (minder dan 100 Pa).
- Los de pellets op - indien volledig droog (zo niet, ga door met lyofiliëren) - in 1 ml 0,1 mol / L HCl en voeg 50 μL chloroform (CHCl3) toe aan elke buis; los de pellet grondig op met een pipet van 1.000 μL, meng daarbij de vloeistoffen en breng vervolgens het volledige volume over in een nieuwe buis.
LET OP: Werk altijd met kleine hoeveelheden om uitgebreide verdamping te minimaliseren - Centrifugeer vervolgens op 8.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Verzamel de bovenste fase van de bifasische vloeistof die de in water oplosbare fractie bevat (figuur 2B, de fractie met de onderste dichtheid) zorgvuldig met een pipet en vul deze in nieuwe buizen. Gebruik buizen van 1,5 ml voor handmatige SPE (punt 5.2) of glazen injectieflacons voor robotische SPE (punt 5.3 en figuur 2D). Vermijd morsen over CHCl3 en de inhoud ervan (figuur 2C).
5. Vaste-fase extractie (SPE)
- Reinig de SPE-cartridges vóór het eerste gebruik twee keer met 1 ml van de vervangende oplossing (stap 1.3), gevolgd door centrifugatie bij 800 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur (geplaatst in buizen van 15 ml). Ze kunnen elk 10-20 keer worden gebruikt.
- Handleiding SPE
- Conditioneer de cartridges (zie materiaaltabel) in elke run met 1 ml zuivere methanol en 2 x 1 ml PBS, telkens gevolgd door centrifugatie bij 800 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur (geplaatst in buizen van 15 ml).
- Laad daarna de monsters (uit stap 4.7) op de SPE-patronen en centrifugeer ze bij 600 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Breng vervolgens een wascyclus aan zoals hieronder vermeld.
- Voeg driemaal 1 ml H2O toe (elk gevolgd door centrifugeren gedurende 1 minuut bij 800 x g bij kamertemperatuur).
- Voeg vijf maal 1 ml 0,1 mol/l HCl toe (elk gevolgd door centrifugatie gedurende 1 minuut bij 800 x g bij kamertemperatuur).
- Voeg twee keer 1 ml MeOH toe (elk gevolgd door centrifugatie gedurende 1 minuut bij 800 x g bij kamertemperatuur).
- Eluate vervolgens arginine en zijn derivaten met 3 x 1 ml vervangende oplossing (gevolgd door centrifugatie 1 min bij 800 x g bij kamertemperatuur) in een enkele buis van 15 ml.
OPMERKING: De vervangende oplossing dient als eluent voor arginine en derivaten en wordt ook gebruikt voor het reinigen van de patronen (alle stoffen worden ofwel vóór elutie uitgewassen of bij de basis pH-waarde van de vervangende oplossing). Om besmetting in de loop van de tijd te voorkomen, moet het hergebruik echter worden beperkt (zie stap 5.1).
- RobotISCHE SPE
OPMERKING: Hier wordt een pipetteerrobot (het grootste deel bestaande uit een pipetteernaald, een wasstation voor de naald, een reagenstoevoer en posities voor monsters en eluaten, zie Materiaaltabel) geleverd met een patroonhouder voor de SPE-kolommen. Voor andere instrumenten, zorg ervoor dat u volledig uitgerust bent met alle genoemde dingen.- Vul het supernatant (vanaf stap 4.7) rechtstreeks in glazen injectieflacons met PTFE-afdichting (figuur 2D), bereid voldoende reagentia (100 ml van elk, d.w.z. vervangende oplossing, 99% van MeOH, PBS, H2O en 0,1 van mol / L HCl), 5 ml buizen voor elutie en wasoplossing voor de naald van de robot (meestal H2O).
- Gebruik een applicatie of methode in de software van de robot op basis van de stappen die zijn beschreven voor handmatige SPE (stap 5.2).
OPMERKING: De details kunnen sterk variëren tussen instrumentleveranciers, dus raadpleeg de softwarehandleiding van de betreffende robot voor het programmeren. Een pipetteerrobot werkt meestal door luchtdruk op de cartridges uit te oefenen in plaats van centrifugatie, wat het belangrijkste verschil is. Als het protocol wordt vastgesteld en voor de eerste keer wordt uitgevoerd, neem dan controles op (bijv. L-arginine van bekende concentratie) om een optimale workflow te verifiëren.
6. Laatste voorbereiding op NMR
- Lyofiliseer monsters 's nachts om de droogheid te voltooien om ammoniak en H2O te verwijderen.
- Los elk monster op in 500 μL NMR-buffer (stap 1.4) en breng over in NMR-buizen. Belangrijk is dat het volume in alle buizen hetzelfde moet zijn en dat monsters homogeen moeten zijn (vrij van residuen en lipiden, die de neiging hebben om te aggregeren).
OPMERKING: De details van NMR-spectroscopie gaan verder dan deze methodebeoordeling en worden elders in meer detail beschreven27. Hier worden alleen de belangrijkste vereisten en stappen uitgelegd. De kwantificering van arginine en zijn metabolieten worden uitgevoerd op een 600 MHz NMR-spectrometer (zie Materiaaltabel). In principe kunnen alle andere NMR-spectrometer/NMR-veldsterkten worden gebruikt, op voorwaarde dat de NMR-signalen van arginine en gemethyleerde arginineen met voldoende gevoeligheid en zonder signaaloverlapping kunnen worden gedetecteerd. Elke sondekop met z-asgradiënten die 1H-spectra kunnen registreren, kan worden gebruikt, op voorwaarde dat de pulssequenties dienovereenkomstig worden ingesteld. - Neem een 1D-spectrum op met behulp van de CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill) pulssequentie 33,34 (cpmgpr1d, 512 scans, grootte van fid 73728, 11904,76 Hz spectrale breedte op een 600 MHz NMR, recyclevertraging 4 s) met watersignaalonderdrukking met behulp van voorverzadiging.
- Verwijder in deze experimenten de 1H scalaire koppelingen door virtuele ontkoppeling, waardoor de signaaloverlapping wordt verminderd. Noteer aanvullend voor specifieke vragen en/of complexe monsters of matrices, bijvoorbeeld 1 H-13C-heteronucleaire single quantum coherence (HSQC) spectra27.
OPMERKING: Voor complexere matrices waarin 1H NMR-signalen van gemethyleerde arginineen gedeeltelijk kunnen worden overlapt met 1H NMR-signalen van andere metabolieten (bijv. lysine), zijn 1H homo-nucleaire J-opgeloste spectra (JRES)35 vereist. - Voer absolute kwantificering uit door de respectieve piekintensiteiten van normen van een bekende concentratie te integreren, bijvoorbeeld 100 μmol / arginine.
OPMERKING: Routinematig worden ADMA, SDMA en MMA (zie Tabel van materialen) gerapporteerd als een verhouding ten opzichte van arginine. Dit heeft een belangrijk voordeel dat er geen afzonderlijke normalisatie (bijv. Celnummer, weefselmassa, eiwitconcentraties) hoeft te worden uitgevoerd. In dat geval dient arginine als een interne standaard en is relatieve kwantificering voldoende om biologisch relevante informatie te verkrijgen. - Voor differentiatie van SDMA en MMA, lyofiliseer de monsters opnieuw om D2O te verwijderen (als ze eerder in NMR-buffer zijn geresuspendeerd), dat vervolgens wordt vervangen door gedeutereerd dimethylsulfoxide (d6-DMSO), waardoor de resolutie van methylresonanties mogelijk wordt27. Zuig daarom de monsters uit de NMR-buizen op met Pasteur-pipetten, lyofieliseer en los ze op in 500 μL d 6-DMSO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Routinematig worden 1H 1D-projecties van 2D J-opgeloste (JRES), vrijwel ontkoppelde NMR-spectra gebruikt voor piektoewijzingen en kwantificeringen in ons laboratorium36. Figuur 3 toont representatieve JRES-spectra van gisteiwithydrolysaten gezuiverd met behulp van het huidige SPE-protocol. Hoewel in zeer verschillende concentraties, kunnen beide stoffen worden gescheiden en gekwantificeerd in een cellulaire matrix. Op basis van het aantal protonen van de specifieke methyl (-CH3) of methyleen (-CH2-) groep bij de respectieve chemische verschuiving, maakt 1H-NMR-spectroscopie nauwkeurige kwantificering mogelijk. Zoals aangegeven in het protocol (stap 0), is de relatieve kwantificering van een methyl-argininederivaat in vergelijking met arginine voornamelijk voldoende om biologische processen te observeren, bijvoorbeeld veranderingen van argininemethylatie als reactie op modulaties, zoals knock-down / overexpressie van genen, veranderingen in voedingsstoffen of behandeling met remmers.
Zoals eerder getoond27, L-arginine en ADMA kunnen goed worden onderscheiden door hun verschillende karakteristieke chemische verschuivingen op respectievelijk 3,25 en 3,02 ppm. SDMA- en MMA-methylprotonen onthullen overlappende pieken in D2O (de NMR-buffer beschreven in stap 1.4) bij een chemische verschuiving van 2,85 ppm. Als er een piek aanwezig is op de betreffende positie, kan men SDMA en MMA scheiden door de monsters in d6-DMSO op te lossen zoals beschreven in stap 6.6 van het protocol. Met behulp van deze aanpak kunnen de 1H NMR chemische verschuivingen van SDMA en MMA worden gescheiden en gekwantificeerd met karakteristieke chemische verschuivingen bij 2,76 ppm (SDMA) en 2,74 ppm (MMA)27. Figuur 3B toont representatieve gegevens van SDMA en MMA (beide 100 μmol/L) in respectievelijk D2O en d 6-DMSO. Overeenkomstige gegevens van SMDA en MMA gedetecteerd in verschillende cellen en weefsels zijn onlangs gemeld27. Zoals beschreven in stap 6.4-6.5 van het protocol, kunnen referentienormen voor bekende concentraties worden gebruikt voor kwantificering. Alle referentienormen die in de tekst worden genoemd, zijn in de handel verkrijgbaar.
Figuur 1: Overzicht van de monstervoorbereiding. Schema dat de significante stappen van monsterverzameling tot NMR-meting onthult. De zwarte vakken verwijzen naar de nummering in de protocolsecties. Bovendien wordt het geschatte aantal dagen (variërend afhankelijk van het aantal monsters) weergegeven. Inhomogene vloeibare monsters kunnen worden gecentrifugeerd voordat MeOH wordt toegevoegd (stap 3.1) om de residuen te verwijderen (niet aangegeven). Het supernatant na initiële centrifugatie (1) dat bijvoorbeeld intracellulaire metabolieten of niet-eiwitgebonden argininemetabolieten bevat, kan voor verdere analyse bij -20 °C worden bewaard. Routinematig worden de MeOH-pellets (2) verder geanalyseerd. Afkortingen: CHCl3, chloroform; HCl, zoutzuur; MeOH, methanol; NMR, nucleaire magnetische resonantie; o/n, overnachting; SN, supernatant; SPE, vaste-fase extractie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Behandeling van eiwithydrolysaten en voorbereiding voor vastefase-extractie. (A) Bekerglas gevuld met zand, glazen buizen, schroefdoppen met grijze polytetrafluorethyleen (PTFE) afdichtingsfolie en monsters in buizen van 1,5 ml na het afsnijden van de doppen. (B) Buis na centrifugatie (stap 4.6) en (C) na verwijdering van het waterige supernatant (stap 4.7): er kan wat restwater (~ 50 μL) overblijven. Het zwarte residu bevat onoplosbare, houtskoolde organische resten. Toch kunnen sommige monsters gekleurde stoffen (D) bevatten, die de L-arginine-meting niet verstoren. Dit is deels te wijten aan vastefase-extractie (SPE) daarna, hetzij met behulp van opeenvolgende centrifugatiestappen (E) of een pipetteerrobot (F). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Typische NMR-spectra van L-Arginine en zijn methylderivaten. 1 H 1D geprojecteerde J-opgeloste NMR-spectra konden gemakkelijk de δ-(CH2)-protonen van L-arginine (3,25 ppm) en de ω-N-CH3-protonen van asymmetrisch dimethylarginine (ADMA, bij 3,02 ppm) onderscheiden. Monsters van gistpellets (A) die verschillende hoeveelheden ADMA onthullen, kunnen worden gekwantificeerd door signaalintensiteiten te integreren, zelfs in de aanwezigheid van grote hoeveelheden arginine (merk op dat de volledige argininepiek niet wordt weergegeven). B) Aangezien ω-(N G,N'G)-symmetrisch dimethylarginine (SDMA) en ω-N G-monomethyl arginine (MMA) nauwelijks kunnen worden onderscheiden in deuteriumoxidebuffer (D2O), moeten monsters worden opgelost in gedeutereerd dimethylsulfoxide (d6-DMSO), waarbij de pieken (in dit geval 100 μmol/l van elke stof) gemakkelijk van elkaar kunnen worden onderscheiden (pieken bij 2,75 en 2,76 ppm; respectievelijk) en gekwantificeerd worden. Alle spectrogrammen werden rechtstreeks geëxporteerd vanuit de besturingssoftware van de NMR-spectrometer. De software onthult de primaire resultaten, die moeten worden gecontroleerd voordat een meer gedetailleerde analyse, inclusief statistieken van veel monsters, wordt uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de volgende sectie ligt de primaire focus op de methode zelf; de biologische implicaties van arginine methylatie worden beschreven in de inleiding sectie.
Ten eerste kunnen weefsels van verschillende stijfheid aanpassing van de monsterlyse nodig hebben: cellen uit celkweek (inclusief bacteriën, gist, enz.) en weefsels zoals hersenen, jonge lever, gladde spieren, enz., Kunnen snel worden gehomogeniseerd. Voor weefsels met een hoge stijfheid (inclusief lever van oudere proefpersonen, slagaders, botten, enz.), Moet de homogenisatie tweemaal worden uitgevoerd (zie stap 3.2.3). Toch moet dit proces niet vaker worden voortgezet, zelfs als er enkele onoplosbare overblijfselen overblijven. In plaats daarvan moeten de monsters gedurende 10 minuten worden gecentrifugeerd bij 10.000 x g en moeten de supernatanten worden verzameld voor verdere analyse (om de afbraak van het monster te minimaliseren).
Bij elke stap waarbij monsters worden ingevroren (in eerste instantie, na toevoeging van MeOH, respectievelijk stap 3.3, 3.4 of 3.5) of na lyofilisatie (stappen 4.4 en 6.1), kunnen monsters enkele dagen worden bewaard voor verdere verwerking. Bovendien kan het supernatant uit stap 3.4 (na homogenisatie; aangeduid als "(1)" in figuur 1) ook worden opgeslagen voor verdere analyse, bijvoorbeeld voor het meten van andere metabolieten dan methyl-arginineen 36,37,38.
Aan de ene kant omvatten kritieke stappen monsteropslag, omdat de afbraak van eiwitten de uitkomst kan veranderen. Als eiwitafbraak optreedt vóór MeOH-precipitatie, kunnen arginine en zijn methylderivaten worden onderschat. Daarom is het essentieel om monsters op te slaan, bijvoorbeeld voor en na cel- of weefsellysis bij -20 °C of, indien mogelijk, bij -80 °C. Voor of na homogenisatie (stap 3.2) moeten monsters op ijs worden bewaard.
Aan de andere kant verandert methanolvoorbehandeling van monsters om eiwitten neer te slaan het methylatiepatroon van arginine niet. Dit werd getest met lysozym en Escherichia coli eiwitextracten (die geen gemethyleerde arginine bevatten)27. Eerdere rapporten hebben echter aangetoond dat MeOH de terminale carboxylgroepen van glutamaat en aspartaat39 kan methyleren.
Zorg er voor eiwithydrolyse voor dat de afdichtingen van de schroefdoppen intact zijn (stap 4.1). Zo niet, dan kan het verdampen van HCl de droogkamer beïnvloeden. De concentratie van de analyten kan echter niet kritisch worden veranderd, omdat ze niet verdampen en resterende HCl later wordt verdampt door lyofilisatie. Lagere concentraties HCl, bijvoorbeeld 6 mol/L, kunnen worden gebruikt, maar kunnen een langere hydrolysetijd vereisen. Na hydrolyse kunnen monsters bij kamertemperatuur worden behandeld. Een goede verwijdering van lipiden is echter essentieel. Lipiden kunnen later tijdens de NMR-meting bifasische mengsels vormen in water (respectievelijk D2O). Die inhomogeniteiten leiden tot NMR-piekverbreding en beïnvloeden mogelijk de kwaliteit en gevoeligheid van NMR-experimenten.
Als er geen pipetteerrobot beschikbaar is voor SPE, is deze de investering waard (hij kan ook voor andere doeleinden worden gebruikt). De monsters op de SPE pipetteerrobot worden sequentieel verwerkt en in de huidige opstelling duurt één monster ~ 40 minuten voor een volledige run. Vanwege beperkingen van de reagenscapaciteit (d.w.z. 100 ml), kunnen slechts 19 monsters in één keer worden verwerkt (in totaal ~ 13 uur). Toch is de hands-on tijd veel minder dan voor de handmatige SPE-procedure en vereist minder materiaal. Tijdens deze periode kunnen monsters bij kamertemperatuur in de robot worden opgeslagen tot lyofilisatie. Gelijkwaardige producten kunnen de gebruikte SPE-matrices en -cartridges vervangen. Toch is het aan te raden om het SPE-protocol te evalueren en zo nodig aan te passen.
De detectielimiet voor ADMA is ~100 nmol/L zoals eerder geëvalueerd door seriële verdunningen en met behulp van de gerapporteerde NMR-meettijden. Aan de andere kant kunnen hoge arginineconcentraties ook de verhouding tussen ADMA en arginine overschatten (die meestal in het bereik van 5% -15 ligt). Dit komt omdat boven 3 mmol / L arginine; de bindingscapaciteit van de SPE-kolom kan verzadiging27 bereiken. Voor het controleren van de gevoeligheid en specificiteit van de gehele workflow in geval van onverwachte resultaten (bijv. geen pieken of overlappende pieken in de 1H-NMR spectra bij de gerapporteerde chemische verschuivingen), zijn normen van ADMA, SDMA en MMA beschikbaar bij commerciële leveranciers (zie Materiaaltabel). Als een laboratorium geen NMR-spectrometer heeft, kunnen alle stappen, inclusief de uiteindelijke lyofilisatie (stap 6.1), in het betreffende laboratorium worden uitgevoerd en kunnen monsters voor analyse naar een NMR-faciliteit worden verzonden.
In vergelijking met andere methoden, zoals massaspectrometrie, is geen etikettering van de analyten nodig en kan deze worden uitgevoerd zonder interne normen voor kwantificering. Aan de andere kant is de gevoeligheid van NMR iets lager, wat in de meeste biologische gevallen echter geen rol speelt, zoals arginine en zijn methylderivaten gemakkelijk kunnen worden gedetecteerd in allerlei eukaryote cellen of weefsels. Zoals eerder vermeld, zijn 3 miljoen cellen voldoende om eiwitgebonden ADMA te kwantificeren - verschillende cellen die gemakkelijk kunnen worden bereikt met de meeste cellijnen. In het geval van langzaam groeiende, ongewijzigde primaire cellen van menselijke oorsprong, zoals volwassen stamcellen40, kunnen cellen voor een langere periode worden gekweekt of worden samengevoegd uit afzonderlijke experimenten. Hetzelfde geldt voor weefselmonsters. ~ 30 mg weefsel, overeenkomend met veel organen, bijvoorbeeld van muizen (gedeeltelijk of alle, bijvoorbeeld kleine spieren) of biopsiemonster, is voldoende om voldoende lysaat en eiwithydrolysaat te bereiden voor NMR-meting27. Andere methoden voor het meten van eiwit arginine methylatie omvatten het gebruik van enzym-gekoppelde luminescentie assays41 of 3H-gelabeld S-adenosyl-methionine (SAM)42. De gevoeligheid is hoog en kan worden verhoogd door 14C-gelabelde SAM te gebruiken, maar ten koste van hogere kosten. Bovendien veroorzaakt het gebruik van radioactieve stoffen (inclusief de vloeistoffen voor het tellen van scintillaties) speciaal afvalbeheer, wat niet nodig is met behulp van het huidige protocol.
Een aanvullende methode op het huidige protocol, met behulp van 2D heteronucleaire NMR-spectroscopie, kan plaatsspecifieke methylatiepatronen binnen geïsoleerde eiwitten onthullen. Het is onlangs gepubliceerd, inclusief een gedetailleerde beschrijving van de detectie van methyl-arginineen door NMR-spectroscopie in het algemeen43. Het huidige protocol geeft geen informatie over site-specifieke arginine methylatie in eiwitten. Toch is de wereldwijde methylatie veranderd op cellulair en fysiologisch niveau, inclusief celgroei en differentiatie, veroudering, kanker 1,2,12, cardiovasculaire20 en neurodegeneratieve ziekten 8,44. De details over de exacte betrokken mechanismen zijn nog steeds niet volledig begrepen en mogelijke kandidaat-geneesmiddelen die interfereren met eiwit-arginine methylatie11, zowel in vitro als in vivo, moeten verder worden onderzocht1. Het bestuderen van de kinetiek van methylatie (wat onze groep onlangs heeft aangetoond)27 is essentieel voor het verkrijgen van inzichten in argininemodificatie en eiwitafbraakmechanismen. Wereldwijde arginine methylatiemetingen en kinetische experimenten (monsters kunnen op elk moment worden ingevroren), variërend van enkele eiwitten tot monsters van hele organismen, kunnen eenvoudig worden uitgevoerd met behulp van dit protocol. Het biedt daarom een robuuste methode, die gemakkelijk kan worden aangepast voor toekomstig onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
Het werk werd ondersteund door de subsidies van het Austrian Science Fund (FWF) P28854, I3792, doc.funds BioMolStruct DOC 130, DK-MCD W1226 BioTechMed-Graz (vlaggenschipproject DYNIMO), austrian research promotion agency (FFG) subsidies 864690 en 870454, het Integrative Metabolism Research Center Graz; Oostenrijks infrastructuurprogramma 2016/2017, de regering van Stiermarken (Zukunftsfonds) en het startupfonds voor talenten op hoog niveau van de Fujian Medical University (XRCZX2021020). We danken het Center of Medical Research voor de toegang tot celkweekfaciliteiten. F.Z. is opgeleid in het kader van het PhD-programma Molecular Medicine, Medical University of Graz. Q.Z. is opgeleid in het kader van het PhD-programma Metabolic and Cardiovascular Diseases, Medical University of Graz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | Greiner Bio One | 188271 | |
| 3-(trimethylsilyl) propionic acid-2,2,3,3-d4 sodium salt (TSP) | Alfa Aesar | A1448 | |
| 5 mL tubes, round bottom | Greiner Bio One | 115101 | |
| Ammonia Solution 32% | Roth | A990.1 | |
| Bruker 600 MHz NMR spectrometer, equipped with a TXI probe head | Bruker | - | |
| Centrifuge, refrigerated, e.g. 5430 R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chloroform ≥99% p.a. | Roth | 3313.1 | |
| Cryocool | Thermo Scientific | SCC1 | heat transfer fluid for SpeedVac System |
| Deuterium Oxide (D2O) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-10-PK | |
| Dimethyl sulfoxide-d6 (d6-DMSO) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-6-1000 | |
| Drying Chamber | Binder | 9090-0018 | |
| DURAN culture tubes, 13 x 100mm, GL 14, 9 mL | VWR International | 212-0375 | |
| Edwards Deep vacuum oil pump RV5 | Thermo Scientific | 16234611 | part of the SpeedVac System |
| Eppendorf 1.5 mL tubes | Greiner Bio One | 616201 | |
| Gilson pipetting robot GX-241 Aspec | Gilson Inc. | 26150008 | |
| L-arginine | AppliChem | A3675 | |
| Methanol ≥99% | Roth | 8388.4 | |
| Milli-Q water aparatus | Millipore | ZIQ7000T0 | |
| Oasis MCX 1cc/30 mg, 1 mL cartridges | Waters | 186000252 | https://www.waters.com/waters/en_US/Waters-Oasis-Sample-Extraction-SPE-Products/ |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | LONBE17-512F | |
| Precellys 24 tissue homogenizer | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | https://www.bertin-instruments.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys24-tissue-homogenizer/ |
| Precellys tubes (pulping tubes) | VWR International | 432-0351 | |
| Precellyse 1.4 mm zirconium oxide beads | VWR International | 432-0356 | |
| Reacti-Therm/ReactiVap Heating, Stirring, and Evaporation Modules | Thermo Scientific | TS-18820 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/TS-18820 |
| Rotor for 1.5 mL tubes, FA-45-30-11 | Eppendorf | 5427753001 | |
| Savant Refrigerated Cooling Trap | Thermo Scientific | 15996161 | part of the SpeedVac System |
| Savant SpeedVac vacuum concentrator SPD210 | Thermo Scientific | 15906181 | part of the SpeedVac System; equipped with rotor for 1.5 ml tubes |
| Screw caps for glas vials with PTFE sealing, DN9 | Dr. R. Forche Chromatographie | CT11B3011 | |
| Seasand | Roth | 8441.3 | |
| Short thread glas vials 1.5 mL, ND9 | Dr. R. Forche Chromatographie | VT1100309 | |
| Sodium azide (NaN3) | Roth | K305.1 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | VWR | BDH7363-4 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | VWR | 80731-078 | |
| TopSpin 4.0 (Software) | Bruker | - | https://www.bruker.com |
| ω-NG-asymmetric dimethylarginine (ADMA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-208093 | |
| ω-NG-monomethylarginine (MMA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-200739A | |
| ω-NG-NG'-symmetric dimethylarginine (SDMA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-202235A |
References
- Guccione, E., Richard, S. The regulation, functions and clinical relevance of arginine methylation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).
- Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
- Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase. Journal of Biological Chemistry. 271 (25), 15034-15044 (1996).
- Bachand, F. Protein arginine methyltransferases: from unicellular eukaryotes to humans. Eukaryotic Cell. 6 (6), 889-898 (2007).
- Wang, Y. C., Li, C. Evolutionarily conserved protein arginine methyltransferases in non-mammalian animal systems. FEBS Journal. 279 (6), 932-945 (2012).
- Ahmad, A., Cao, X. Plant PRMTs broaden the scope of arginine methylation. Journal of Genetics and Genomics. 39 (5), 195-208 (2012).
- Fisk, J. C., Read, L. K. Protein arginine methylation in parasitic protozoa. Eukaryotic Cell. 10 (8), 1013-1022 (2011).
- Hofweber, M., et al. Phase Separation of FUS Is Suppressed by Its Nuclear Import Receptor and Arginine Methylation. Cell. 173 (3), 706-719 (2018).
- Chong, P. A., Vernon, R. M., Forman-Kay, J. D. RGG/RG Motif Regions in RNA Binding and Phase Separation. Journal of Molecular Biology. 430 (23), 4650-4665 (2018).
- Nott, T. J., et al. Phase transition of a disordered nuage protein generates environmentally responsive membraneless organelles. Molecular Cell. 57 (5), 936-947 (2015).
- Fong, J. Y., et al. Therapeutic targeting of RNA splicing catalysis through inhibition of protein arginine methylation. Cancer Cell. 36 (2), 194-209 (2019).
- Yang, Y., Bedford, M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer. Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).
- Wang, S. M., Dowhan, D. H., Muscat, G. E. O. Epigenetic arginine methylation in breast cancer: emerging therapeutic strategies. Journal of Molecular Endocrinology. 62 (3), 223-237 (2019).
- Gulla, A., et al. Protein arginine methyltransferase 5 has prognostic relevance and is a druggable target in multiple myeloma. Leukemia. 32 (4), 996-1002 (2018).
- Wang, Z., Tang, W. H., Cho, L., Brennan, D. M., Hazen, S. L. Targeted metabolomic evaluation of arginine methylation and cardiovascular risks: potential mechanisms beyond nitric oxide synthase inhibition. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (9), 1383-1391 (2009).
- Friesen, W. J., Massenet, S., Paushkin, S., Wyce, A., Dreyfuss, G. SMN, the product of the spinal muscular atrophy gene, binds preferentially to dimethylarginine-containing protein targets. Molecular Cell. 7 (5), 1111-1117 (2001).
- Lee, J. H., Park, G. H., Lee, Y. K., Park, J. H. Changes in the arginine methylation of organ proteins during the development of diabetes mellitus. Diabetes Research and Clinical Practice. 94 (1), 111-118 (2011).
- Bulau, P., et al. Analysis of methylarginine metabolism in the cardiovascular system identifies the lung as a major source of ADMA. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 292 (1), 18-24 (2007).
- Zakrzewicz, D., Eickelberg, O. From arginine methylation to ADMA: a novel mechanism with therapeutic potential in chronic lung diseases. BMC Pulmonary Medicine. 9, 5 (2009).
- Fulton, M. D., Brown, T., Zheng, Y. G. The biological axis of protein arginine methylation and asymmetric dimethylarginine. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), (2019).
- Aliferis, K. A., Chrysayi-Tokousbalides, M. Metabolomics in pesticide research and development: review and future perspectives. Metabolomics. 7 (1), 35-53 (2011).
- Chiang, K., et al. PRMT5 Is a Critical Regulator of Breast Cancer Stem Cell Function via Histone Methylation and FOXP1 Expression. Cell Reports. 21 (12), 3498-3513 (2017).
- Blanc, R. S., Vogel, G., Chen, T., Crist, C., Richard, S. PRMT7 preserves satellite cell regenerative capacity. Cell Reports. 14 (6), 1528-1539 (2016).
- Lim, Y., Lee, E., Lee, J., Oh, S., Kim, S. Down-regulation of asymmetric arginine methylation during replicative and H2O2-induced premature senescence in WI-38 human diploid fibroblasts. Journal of Biochemistry. 144 (4), 523-529 (2008).
- Bhatter, N., et al. Arginine methylation augments Sbp1 function in translation repression and decapping. FEBS Journal. 286 (23), 4693-4708 (2019).
- Lee, Y. H., Stallcup, M. R. Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation. Molecular Endocrinology. 23 (4), 425-433 (2009).
- Zhang, F., et al. Global analysis of protein arginine methylation. Cell Reports Methods. 1 (2), (2021).
- Zinellu, A., Sotgia, S., Scanu, B., Deiana, L., Carru, C. Determination of protein-incorporated methylated arginine reference values in healthy subjects whole blood and evaluation of factors affecting protein methylation. Clinical Biochemistry. 41 (14-15), 1218-1223 (2008).
- Weiss, M., Manneberg, M., Juranville, J. F., Lahm, H. W., Fountoulakis, M. Effect of the hydrolysis method on the determination of the amino acid composition of proteins. Journal of Chromatography A. 795 (2), 263-275 (1998).
- Davids, M., et al. Simultaneous determination of asymmetric and symmetric dimethylarginine, L-monomethylarginine, L-arginine, and L-homoarginine in biological samples using stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 900, 38-47 (2012).
- Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation. Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).
- Vignoli, A., et al. High-throughput metabolomics by 1D NMR. Angewandte Chemie International Edition. 58 (4), 968-994 (2019).
- Carr, H. Y., Purcell, E. M. Effects of diffusion on free precession in nuclear magnetic resonance experiments. Physical Review. 94 (3), 630-638 (1954).
- Meiboom, S., Gill, D. Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation times. Review of Scientific Instruments. 29 (8), 688-691 (1958).
- Nagayama, K., Wuthrich, K., Bachmann, P., Ernst, R. R. Two-dimensional J-resolved 1H n.m.r. spectroscopy for studies of biological macromolecules. Biochemical and Biophysical Research Communications. 78 (1), 99-105 (1977).
- Stryeck, S., et al. Serum concentrations of Citrate, Tyrosine, 2- and 3- Hydroxybutyrate are associated with increased 3-month mortality in acute heart failure patients. Scientific Reports. 9 (1), 6743 (2019).
- Zhang, F., et al. Tissue-specific landscape of metabolic dysregulation during ageing. Biomolecules. 11 (2), (2021).
- Zhang, F., et al. Growing human hepatocellular tumors undergo a global metabolic reprogramming. Cancers. 13 (8), (2021).
- Pahlich, S., Zakaryan, R. P., Gehring, H. Protein arginine methylation: Cellular functions and methods of analysis. Biochimica et Biophysica Acta. 1764 (12), 1890-1903 (2006).
- Habisch, H. J., et al. Neuroectodermally converted human mesenchymal stromal cells provide cytoprotective effects on neural stem cells and inhibit their glial differentiation. Cytotherapy. 12 (4), 491-504 (2010).
- Ibanez, G., McBean, J. L., Astudillo, Y. M., Luo, M. An enzyme-coupled ultrasensitive luminescence assay for protein methyltransferases. Analytical Biochemistry. 401 (2), 203-210 (2010).
- Hevel, J. M., Price, O. M. Rapid and direct measurement of methyltransferase activity in about 30min. Methods. 175, 3-9 (2020).
- Altincekic, N., et al. Site-specific detection of arginine methylation in highly repetitive protein motifs of low sequence complexity by NMR. Journal of the American Chemical Society. 142 (16), 7647-7654 (2020).
- Kaneb, H. M., Dion, P. A., Rouleau, G. A. The FUS about arginine methylation in ALS and FTLD. The EMBO Journal. 31 (22), 4249-4251 (2012).
