Summary
Le présent protocole décrit la préparation et la mesure quantitative de l’arginine libre et liée aux protéines et des méthyl-arginines par spectroscopie RMN 1H.
Abstract
L’arginine liée aux protéines est généralement méthylée dans de nombreuses protéines et régule leur fonction en modifiant les propriétés physico-chimiques, leur interaction avec d’autres molécules, y compris d’autres protéines ou acides nucléiques. Ce travail présente un protocole facilement réalisable pour quantifier l’arginine et ses dérivés, y compris la diméthylarginine asymétrique et symétrique (ADMA et SDMA, respectivement) et la monométhylarginine (MMA). Après l’isolement des protéines à partir de fluides corporels biologiques, de tissus ou de lysats cellulaires, une méthode simple d’homogénéisation, de précipitation des protéines et d’hydrolyse des protéines est décrite. Étant donné que les hydrolysats contiennent de nombreux autres composants, tels que d’autres acides aminés, lipides et acides nucléiques, une étape de purification par extraction en phase solide (SPE) est essentielle. L’EPS peut être effectuée manuellement à l’aide de centrifugeuses ou d’un robot de pipetage. La sensibilité pour ADMA utilisant le protocole actuel est d’environ 100 nmol/L. La limite supérieure de détection de l’arginine est de 3 mmol/L en raison de la saturation SPE. En résumé, ce protocole décrit une méthode robuste, qui s’étend de la préparation d’échantillons biologiques à la détection basée sur la RMN, fournissant des conseils précieux et des pièges pour un travail réussi lors de l’étude du méthylome d’arginine.
Introduction
Au cours des deux dernières décennies, la méthylation des résidus d’arginine a été reconnue comme une modification post-traductionnelle essentielle des protéines. Il affecte les processus biologiques fondamentaux tels que la régulation de la transcription, la transduction du signal et bien d’autres1. Les principales protéines impliquées dans la régulation de la méthylation de l’arginine sont les protéines arginine méthyltransférases (PRMT)2. Les principaux dérivés de l’arginine sont la ω-(N G,N G)-diméthylarginine asymétrique (ADMA), la ω-(N G,N’G)-diméthylarginine symétrique (SDMA) et la ω-N G-monométhylarginine (MMA)2.
Les PRMT utilisent la S-adénosyl-l-méthionine pour transférer les groupes méthyle au groupe guanidino terminal (avec deux groupes aminés équivalents) de l’arginine1 liée aux protéines. Deux enzymes principales peuvent être distinguées: les enzymes de type I et de type II catalysent la première étape de méthylation pour former le MMA (qui perd ainsi sa symétrie). Après cette étape, les enzymes de type I (p. ex. PRMT1, 2, 3, 4, 6, 8) utilisent le MMA comme substrat pour former l’ADMA, tandis que les enzymes de type II (principalement PRMT5 et PRMT9) produisent de la SDMA. PRMT1 a été la première protéine arginine méthyltransférase à être isolée à partir de cellules de mammifères3. Pourtant, les PRMT ont été conservés au cours de l’évolution4 chez d’autres animaux comme les vertébrés non mammifères, les chordés d’invertébrés, les échinodermes, les arthropodes et les nématodes cnidaires5, les plantes6 et les protozoaires, y compris les champignons comme la levure7. Dans de nombreux cas, l’élimination de l’un des PRMT entraîne une perte de viabilité, révélant le rôle essentiel des espèces d’arginine méthylée impliquées dans des processus cellulaires fondamentaux tels que la transcription, la traduction, la transduction du signal, l’apoptose et la séparation de phase liquide-liquide (c’est-à-dire la formation d’organites sans membrane, par exemple des nucléoles), qui implique régulièrement des domaines riches en arginine 8,9,10 . À son tour, cela influence la physiologie et les états pathologiques, y compris le cancer 11,12,13, le myélome multiple 14, les maladies cardiovasculaires15, la pathogenèse virale, l’amyotrophie spinale 16, le diabète sucré 17 et le vieillissement1. On pense que l’augmentation des taux d’ADMA dans la circulation sanguine, par exemple dérivée du poumon18 en raison de la dégradation des protéines, est liée à un dysfonctionnement endothélial, à une maladie pulmonaire chronique19 et à d’autres syndromes de maladie cardiovasculaire20. La surexpression des PRMT a été trouvée pour accélérer la tumorigenèse et est associée à un mauvais pronostic21,22. Par ailleurs, l’ablation de PRMT6 et PRMT7 déclenche un phénotype de sénescence cellulaire23. Une diminution significative de l’ADMA et du PRMT1 a été observée au cours du vieillissement des fibroblastes WI-3824.
Le défi consiste à comprendre comment la méthylation agit dans les processus (physio)physiologiques en identifiant et en quantifiant la méthylation de la protéine arginine. La plupart des approches actuelles utilisent des anticorps pour détecter les arginines méthylées. Cependant, ces anticorps sont toujours spécifiques au contexte et pourraient ne pas reconnaître différents motifs des protéines méthylées de l’arginine25,26. Dans le protocole décrit, tous les dérivés de l’arginine mentionnés ci-dessus peuvent être quantifiés de manière fiable par spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN), c’est-à-dire seuls, en combinaison ou, comme dans la plupart des cas, dans des matrices biologiques complexes comme les cellules eucaryotes (par exemple, de levure, de souris ou d’origine humaine) et les tissus27, ainsi que le sérum28. Pour les protéines et ces matrices complexes, l’hydrolysedes protéines 29 est une condition préalable à la génération d’acides aminés libres (modifiés), tels que l’arginine, le MMA, la SDMA et l’ADMA. L’extraction en phase solide (SPE)30 permet l’enrichissement des composés d’intérêt. Enfin, la spectroscopie 1H-RMN permet la détection parallèle de l’arginine et de tous les principaux dérivés méthyliques de l’arginine. La spectroscopie RMN présente l’avantage d’être véritablement quantitative, hautement reproductible et d’être une technique robuste31,32. Les mesures RMN finales peuvent être effectuées par la suite lorsque de nombreux échantillons ont été prélevés et préparés. Enfin, ce protocole se concentre principalement sur la préparation des échantillons car cela ne nécessite pas de spectromètre RMN propre. Il peut être effectué dans la plupart des laboratoires biochimiques. Néanmoins, quelques indices sur lesquels les mesures de spectroscopie RMN devraient être effectuées sont fournis dans ce travail.
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Protocol
Des hydrolysats de protéines de levure ont été utilisés comme échantillons pour les résultats représentatifs de ces travaux. L’ensemble du protocole est résumé à la figure 1.
1. Préparation des matériaux et des réactifs
- Méthanol/eau : préparer un mélange de deux parties de méthanol à 99 % (MeOH) et d’une partie deH2O, désigné comme MeOH/H 2O. Entreposer le MeOH pur et le MeOH/H2Oà -20°C pour minimiser l’évaporation de l’alcool et augmenter la stabilité de l’échantillon.
- Acide chlorhydrique (HCl) : diluer 9 mol/L de HCl concentré (12,0 mol/L ou 37 %) ainsi que 0,1 mol/L de HCl. La solution concentrée plus élevée (9 mol/L) est utilisée pour l’hydrolyse des protéines, tandis que la solution concentrée plus faible (0,1 mol/L) est utilisée pour l’extraction en phase solide.
ATTENTION : Travaillez à l’intérieur de la hotte. - Préparer une solution de remplacement pour SPE contenant 10 % d’une solution d’ammoniac saturée (stock : 30 % p/p d’ammoniac), 50 % de méthanol et 40 % d’eau (v/v).
- Tampon RMN : Dissoudre 5,56 g d’hydrogénophosphate disodique (Na2 HPO 4, 0,08 mol/L), 0,4 g de sel de sodium de l’acide 3-(triméthylsilyl)propionique-2,2,3,3-d4 (PTS, 5 mmol/L), 0,04 % (p/v) d’azoture de sodium (NaN3) dans 500 mL de dioxyde de deutérium (D2O) et ajuster à pH7,4 (en utilisant HCl ou NaOH, respectivement) (voir le tableau des matières). Vérifier la pureté de chaque nouveau lot tampon par spectroscopie RMN.
REMARQUE : La quantité de contaminants (p. ex. éthanol) doit être aussi faible que possible. - Remplir les tubes de mise en pâte avec des billes d’oxyde de zirconium (les tubes de 2 mL et les billes de 1,4 mm conviennent à la plupart des applications, mais différentes variantes sont disponibles) (voir le tableau des matériaux). Remplissez environ 10 à 20 perles à la main ou achetez des tubes préremplis, qui sont également disponibles.
- Gardez les pipettes et les embouts respectifs prêts dans la plage de 10 à 1 000 μL.
REMARQUE : De l’eau très pure, désignéeH 2 O, définie par une résistance élevée de ≥18,2 MΩ·cm-1, a été utilisée tout au long des travaux. Elle correspond à de l’eau distillée double.
2. Prélèvement et stockage des échantillons
- Congeler rapidement les échantillons liquides (sérum/plasma, surnageant de culture cellulaire, etc.) avec de l’azote liquide et les conserver à -80 °C jusqu’à utilisation.
- Préparez les matériaux solides comme mentionné ci-dessous.
- Recueillir les cellules à partir de cultures cellulaires (3 à 5 millions de cellules) soit en collectant des cellules adhérentes, après lavage avec une solution saline tamponnée au phosphate froid, grattage et centrifugation, soit par centrifugation directe des cellules cultivées en suspension.
- Retirer les surnageants cellulaires (qui peuvent être collectés pour une analyse plus approfondie, soit par mesure directe consécutive, voir étape 6, soit après précipitation des protéines solubles, voir étape 3.1), puis congeler les pastilles avec de l’azote liquide et les conserver à -80 °C. Pour un traitement plus approfondi, voir l’étape 3.2.
- Stocker et collecter les tissus conformément à l’objectif de l’étude. Pour les tissus très homogènes, tels que le foie ou le muscle, analysez n’importe quelle partie de celui-ci. Par exemple, dans le cas d’un cerveau de souris, déterminer la méthylation globale de l’arginine de l’ensemble du cerveau ou des sections du cerveau.
REMARQUE: Le poids idéal des tissus à traiter est de 30 à 60 mg. Il est conseillé de congeler et de pulvériser tout le cerveau et d’utiliser des aliquotes de celui-ci. Alternativement, des parties spécifiques du cerveau (par exemple, frontal, cervelet, régions occipitales ou un hémisphère, pesant ~ 250 mg) peuvent être utilisés.
3. Préparation préliminaire de l’échantillon
REMARQUE: Effectuez le travail sur la glace, en gardant MeOH froid. Les échantillons doivent également être conservés sur de la glace pour éviter la dégradation des protéines.
- Pour les échantillons liquides, ajouter 400 μL de méthanol glacé à 200 μL de l’échantillon. Passez à l’étape 3.3.
REMARQUE: Si moins d’échantillon est disponible, ajustez les volumes en conséquence; La sensibilité RMN est généralement suffisamment élevée pour des échantillons plus petits, mais doit être testée individuellement. - Dans le cas des matériaux solides, préparer suffisamment de tubes de 1,5 mL pour les lysats (utiliser pour la centrifugation après homogénéisation).
- Soigneusement, mais soigneusement, remettre en suspension les pastilles cellulaires dans 600 μL de MeOH/H2O et transférer toute la phase liquide dans les tubes de réduction en pâte.
- Placez les mouchoirs dans des tubes de réduction en pâte (vous pouvez les peser directement dans les tubes) et ajoutez 600 μL de MeOH/H2O (pour 30-60 mg; ajuster si le poids diffère considérablement).
- Mettez les tubes dans l’homogénéisateur tissulaire (voir le tableau des matériaux) et homogénéisez une fois pendant 20 s avec agitation importante (pour les granulés cellulaires, les tissus mous) ou deux fois pendant 20 s chacun (ou plus si nécessaire) avec un intervalle de 5 minutes entre les deux (pour les tissus rigides).
- Après homogénéisation, remettre immédiatement les échantillons sur la glace et transférer les lysats entiers dans de nouveaux tubes de 1,5 mL.
- Conserver les échantillons pendant au moins 30 minutes (jusqu’à plusieurs jours) à -20 °C avant de poursuivre le traitement.
- Centrifuger à 10 000 x g pendant 30 min à 4 °C. En attendant, préparez suffisamment de tubes de 1,5 mL pour recueillir les surnageants.
REMARQUE : Ce surnageant (désigné « (1) » dans la figure 1) peut être jeté, lyophilisé et directement traité pour la RMN (étape 6) ou analysé autrement. - Dans ce protocole, le précipité de MeOH (= pastille obtenue après l’étape 3.1 ou 3.2.2, respectivement) est utilisé pour des analyses ultérieures contenant, entre autres, des composants tels que des acides nucléiques et des lipides, des protéines méthylées à l’arginine. Poursuivre l’hydrolyse des protéines ou conserver les granulés à -20 °C pendant quelques jours.
4. Hydrolyse des protéines
- Ajouter 500 μL de 9 mol/L de HCl à chaque échantillon. Ensuite, tronquez les bouchons de chaque tube avec des ciseaux et placez-les dans les tubes de culture en verre (figure 2A). Fermez soigneusement mais fermement les bouchons rouges (vérifiant ainsi l’étanchéité).
REMARQUE: Avant utilisation, vérifiez toujours chaque étanchéité (feuille PTFE grise à l’intérieur des bouchons à vis rouges) pour un serrage approprié et nettoyez-les régulièrement avec de l’eau. - Une fois terminé, placez les tubes dans un bécher partiellement rempli de sable (pour un meilleur transfert de chaleur) et hydrolysez les échantillons pendant environ 16 h à 110 °C dans une chambre de séchage.
- Après hydrolyse, refroidir les échantillons (~1 h).
- Après cela, lyophiliser pendant la nuit à l’aide d’une centrifugeuse à vide poussé (inférieur à 100 Pa).
- Dissoudre les pastilles - si elles sont complètement sèches (sinon, poursuivre la lyophilisation) - dans 1 mL de 0,1 mol/L de HCl et ajouter 50 μL de chloroforme (CHCl3) dans chaque tube; Dissoudre soigneusement la pastille avec une pipette de 1 000 μL, mélangeant ainsi les liquides, puis transférer le volume complet dans un nouveau tube.
ATTENTION: Toujours travailler avec de petites quantités pour minimiser l’évaporation importante - Ensuite, centrifuger à 8 000 x g pendant 10 min à température ambiante.
- Recueillir soigneusement la phase supérieure du liquide biphasique contenant la fraction soluble dans l’eau (Figure 2B, la fraction de densité inférieure) à l’aide d’une pipette et la remplir dans de nouveaux tubes. Utiliser des tubes de 1,5 mL pour l’EPS manuelle (section 5.2) ou des flacons en verre pour l’EPS robotisée (section 5.3 et figure 2D). Éviter de renverser la CHCl3 et son contenu (figure 2C).
5. Extraction en phase solide (SPE)
- Avant la première utilisation, nettoyer les cartouches SPE deux fois avec 1 mL de la solution de remplacement (étape 1.3) suivie d’une centrifugation à 800 x g pendant 1 min à température ambiante (placées dans des tubes de 15 mL). Ils peuvent être utilisés 10 à 20 fois chacun.
- SPE manuelle
- Préconditionner les cartouches (voir le tableau des matériaux) à chaque passage avec 1 mL de méthanol pur et 2 x 1 mL de PBS, suivi à chaque fois d’une centrifugation à 800 x g pendant 1 min à température ambiante (placées dans des tubes de 15 mL).
- Ensuite, chargez les échantillons (à partir de l’étape 4.7) sur les cartouches SPE et centrifugez-les à 600 x g pendant 2 min à température ambiante.
- Ensuite, appliquez un cycle de lavage comme mentionné ci-dessous.
- Ajouter trois fois 1 mL deH2O(chacun suivi d’une centrifugation pendant 1 min à 800 x g à température ambiante).
- Ajouter cinq fois 1 mL de 0,1 mol/L de HCl (chacun suivi d’une centrifugation pendant 1 min à 800 x g à température ambiante).
- Ajouter deux fois 1 mL de MeOH (suivi d’une centrifugation pendant 1 min à 800 x g à température ambiante).
- Ensuite, éluer l’arginine et ses dérivés avec 3 x 1 mL de solution de remplacement (suivie d’une centrifugation 1 min à 800 x g à température ambiante) dans un seul tube de 15 mL.
NOTE: La solution de remplacement sert d’éluant pour l’arginine et ses dérivés et est également utilisée pour nettoyer les cartouches (toutes les substances sont soit éliminées avant élution, soit à la valeur de pH de base de la solution de remplacement). Néanmoins, pour éviter la contamination au fil du temps, la réutilisation doit être limitée (voir étape 5.1).
- SPE robotique
NOTE: Ici, un robot de pipetage (la partie principale consistant en une aiguille de pipetage, une station de lavage pour l’aiguille, une alimentation en réactif et des positions pour les échantillons et les éluats, voir Tableau des matériaux) est fourni avec un porte-cartouche pour les colonnes SPE. Pour les autres instruments, assurez-vous d’être entièrement équipé avec tout ce qui est énuméré.- Remplir le surnageant (à partir de l’étape 4.7) directement dans des flacons en verre avec un scellage en PTFE (Figure 2D), préparer suffisamment de réactifs (100 mL de chaque, c’est-à-dire une solution de remplacement, 99 % de MeOH, PBS, H 2 O et 0,1 de HCl mol/L), des tubes de 5 mL pour l’élution et une solution delavage pour l’aiguille du robot (habituellement H2O).
- Utiliser une application ou une méthode dans le logiciel du robot en se basant précisément sur les étapes décrites pour l’EPS manuelle (étape 5.2).
REMARQUE: Les détails peuvent varier considérablement d’un fournisseur d’instruments à l’autre, reportez-vous donc au manuel du logiciel du robot respectif pour la programmation. Un robot de pipetage fonctionne généralement en appliquant une pression d’air sur les cartouches au lieu de la centrifugation, ce qui est la principale différence. Si le protocole est établi et exécuté pour la première fois, inclure des contrôles (par exemple, L-arginine de concentration connue) pour vérifier un flux de travail optimal.
6. Préparation finale pour la RMN
- Lyophiliser les échantillons pendant la nuit pour compléter la sécheresse afin de se débarrasser de l’ammoniac et deH2O.
- Dissoudre chaque échantillon dans 500 μL de tampon RMN (étape 1.4) et transférer dans des tubes RMN. Il est important de noter que le volume doit être le même dans tous les tubes et que les échantillons doivent être homogènes (exempts de résidus et de lipides, qui ont tendance à s’agréger).
NOTE: Les détails de la spectroscopie RMN vont au-delà de cet examen de la méthode et sont décrits plus en détail ailleurs27. Ici, seules les principales exigences et étapes sont expliquées. La quantification de l’arginine et de ses métabolites est effectuée sur un spectromètre RMN de 600 MHz (voir le tableau des matériaux). En principe, tout autre spectromètre RMN/intensité de champ RMN peut être utilisé, à condition que les signaux RMN de l’arginine et des arginines méthylées puissent être détectés avec une sensibilité suffisante et sans chevauchement de signaux. Toute tête de sonde avec des gradients d’axe z capables d’enregistrer 1spectre H peut être utilisée, à condition que les séquences d’impulsions soient configurées en conséquence. - Enregistrer un spectre 1D en utilisant la séquence d’impulsions CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill)33,34 (cpmgpr1d, 512 balayages, taille de fid 73728, largeur spectrale 11904,76 Hz sur une RMN de 600 MHz, délai de recyclage 4 s) avec suppression du signal d’eau par présaturation.
- Dans ces expériences, supprimez les couplages scalaires de 1H par découplage virtuel, réduisant ainsi le chevauchement du signal. Enregistrer des questions spécifiques et/ou des échantillons ou matrices complexes, p. ex., 1 H-13C-hétéronucléaire spectre de cohérence quantique unique (HSQC)27.
NOTA : Pour les matrices plus complexes dans lesquelles les signaux RMN de 1 H d’arginines méthylées pourraient être partiellement chevauchés avec des signaux RMN de 1 H d’autres métabolites (p. ex. lysine), des spectres homonucléaires résolus en J (JRES)35 de 1H sont requis. - Effectuer une quantification absolue en intégrant les intensités de crête respectives des étalons d’une concentration connue, par exemple, 100 μmol/arginine.
REMARQUE : Habituellement, l’ADMA, la SDMA et le MMA (voir le tableau des matières) sont déclarés comme un rapport par rapport à l’arginine. Cela présente un avantage significatif qu’aucune normalisation distincte (p. ex. nombre de cellules, masse tissulaire, concentrations de protéines) ne doit être effectuée. Dans ce cas, l’arginine sert d’étalon interne, et la quantification relative est suffisante pour obtenir des informations biologiquement pertinentes. - Pour la différenciation de la SDMA et du MMA, lyophiliser à nouveau les échantillons pour se débarrasser deD2O(s’ils ont été remis en suspension dans un tampon RMN auparavant), qui est ensuite remplacé par du diméthylsulfoxyde deutéré (d6-DMSO), permettant la résolution des résonances méthyliques27. Par conséquent, aspirez les échantillons des tubes RMN avec des pipettes Pasteur, lyophilisez-les et dissolvez-les dans 500 μL de d6-DMSO.
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Representative Results
Régulièrement, des projections 1H 1D de spectres RMN 2D résolus en J (JRES), virtuellement découplés, sont utilisées pour les assignations de pics et les quantifications dans notre laboratoire36. La figure 3 montre des spectres JRES représentatifs d’hydrolysats de protéines de levure purifiés à l’aide du protocole SPE actuel. Bien qu’à des concentrations très différentes, les deux substances peuvent être séparées et quantifiées dans une matrice cellulaire. Sur la base du nombre de protons du groupe spécifique méthyle (-CH3) ou méthylène (-CH2-) au décalage chimique respectif, la spectroscopie 1H-RMN permet une quantification précise. Comme indiqué dans le protocole (étape 0), la quantification relative d’un dérivé de méthyl-arginine par rapport à l’arginine est principalement adéquate pour observer des processus biologiques, par exemple des changements de méthylation de l’arginine en réponse à des modulations, telles que l’élimination / surexpression de gènes, des changements dans les nutriments ou un traitement avec des inhibiteurs.
Comme indiqué précédemment27, la L-arginine et l’ADMA peuvent être bien discriminées par leurs différents décalages chimiques caractéristiques à 3,25 et 3,02 ppm, respectivement. Les protons méthyliques de SDMA et de MMA révèlent des pics de chevauchement dansD2O(le tampon RMN décrit à l’étape 1.4) à un déplacement chimique de 2,85 ppm. Si un pic est présent à la position respective, on peut séparer la SDMA et le MMA en dissolvant les échantillons dans d 6-DMSO comme décrit à l’étape6.6 du protocole. En utilisant cette approche, les décalages chimiques RMN de 1H de la SDMA et du MMA peuvent être séparés et quantifiés avec des décalages chimiques caractéristiques à 2,76 ppm (SDMA) et 2,74 ppm (MMA)27. La figure 3B présente des données représentatives de la SDMA et du MMA (100 μmol/L dans les deux cas dans les régions D2O et d6-DMSO, respectivement. Des données correspondantes de SMDA et de MMA détectées dans diverses cellules et tissus ont été rapportées récemment27. Comme décrit aux étapes 6.4 à 6.5 du protocole, les étalons de référence des concentrations connues peuvent être utilisés pour la quantification. Toutes les normes de référence mentionnées dans le texte sont disponibles dans le commerce.
Figure 1 : Vue d’ensemble de la préparation des échantillons. Schéma révélant les étapes significatives de la collecte de l’échantillon à la mesure RMN. Les cases noires renvoient à la numérotation dans les sections du protocole. De plus, le nombre approximatif de jours (variant selon le nombre d’échantillons) est indiqué. Les échantillons liquides non homogènes peuvent être centrifugés avant d’ajouter du MeOH (étape 3.1) pour éliminer les résidus (non illustré). Le surnageant après centrifugation initiale (1) contenant, par exemple, des métabolites intracellulaires ou des métabolites d’arginine non liés aux protéines peut être conservé à -20 °C pour une analyse plus approfondie. Régulièrement, les granulés de MeOH (2) sont analysés plus avant. Abréviations : CHCl3, chloroforme; HCl, acide chlorhydrique; MeOH, méthanol; RMN, résonance magnétique nucléaire; o/n, du jour au lendemain; SN, surnageant; SPE, extraction en phase solide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Manipulation des hydrolysats de protéines et préparation pour l’extraction en phase solide. (A) Bécher rempli de sable, tubes de verre, bouchons à vis avec feuille d’étanchéité en polytétrafluoroéthylène gris (PTFE) et échantillons dans des tubes de 1,5 mL après avoir coupé les bouchons. (B) Tube après centrifugation (étape 4.6) et (C) après élimination du surnageant aqueux (étape 4.7) : il peut rester de l’eau résiduelle (~50 μL). Le résidu noir contient des restes organiques insolubles au charbon de bois. Pourtant, certains échantillons peuvent contenir des substances colorées (D), qui n’interfèrent pas avec la mesure de la L-arginine. Cela est dû en partie à l’extraction en phase solide (SPE) par la suite, soit à l’aide d’étapes de centrifugation consécutives (E), soit d’un robot de pipetage (F). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Spectres RMN typiques de la L-Arginine et de ses dérivés méthyliques. 1 Les spectres RMN J résolus projetés H 1D pouvaient facilement distinguer les δ-(CH2)-protons de la L-arginine (3,25 ppm) et les 3-protons ω-N-CH de la diméthylarginine asymétrique (ADMA, à3,02 ppm). Les échantillons de granulés de levure (A) révélant des quantités variables d’ADMA peuvent être quantifiés en intégrant les intensités du signal même en présence de grandes quantités d’arginine (notez que le pic complet d’arginine n’est pas indiqué). (B) Étant donné que la diméthylarginine ω-(N G,N’G)-symétrique (SDMA) et la ω-N G-monométhyl arginine (MMA) peuvent difficilement être discriminées dans le tampon d’oxyde de deutérium (D 2 O), les échantillons doivent être dissous dans du diméthylsulfoxyde deutéré (d6-DMSO), où les pics (dans ce cas 100 μmol/L de chaque substance) peuvent être facilement distingués les uns des autres (pics à 2,75 et2,76ppm, respectivement) et être quantifiées. Tous les spectrogrammes ont été directement exportés à partir du logiciel de contrôle du spectromètre RMN. Le logiciel révèle les résultats primaires, qui doivent être vérifiés avant qu’une analyse plus détaillée, y compris des statistiques de nombreux échantillons, ne soit effectuée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Dans la section suivante, l’accent est mis sur la méthode elle-même; les implications biologiques de la méthylation de l’arginine sont décrites dans la section Introduction.
Tout d’abord, les tissus de rigidité différente peuvent nécessiter un ajustement de la lyse de l’échantillon: les cellules de culture cellulaire (y compris les bactéries, les levures, etc.) et les tissus comme le cerveau, le foie jeune, les muscles lisses, etc., peuvent rapidement être homogénéisés. Pour les tissus de forte rigidité (y compris le foie des sujets âgés, les artères, les os, etc.), l’homogénéisation doit être effectuée deux fois (voir étape 3.2.3). Néanmoins, ce processus ne devrait pas être poursuivi plus souvent, même s’il reste des restes insolubles. Au lieu de cela, les échantillons doivent être centrifugés pendant 10 minutes à 10 000 x g et les surnageants prélevés pour une analyse plus approfondie (afin de minimiser la dégradation de l’échantillon).
À chaque étape où les échantillons sont congelés (initialement, après ajout de MeOH, étapes 3.3, 3.4 ou 3.5, respectivement) ou après lyophilisation (étapes 4.4 et 6.1), les échantillons peuvent être conservés pendant quelques jours avant un traitement ultérieur. De plus, le surnageant de l’étape 3.4 (après homogénéisation; désigné comme « (1) » sur la figure 1) peut également être stocké pour une analyse plus approfondie, par exemple pour la mesure de métabolites autres que les méthyl-arginines36,37,38.
D’une part, les étapes critiques impliquent le stockage des échantillons, car la dégradation des protéines peut modifier le résultat. Si la dégradation des protéines se produit avant la précipitation de MeOH, l’arginine et ses dérivés méthyliques peuvent être sous-estimés. Par conséquent, il est essentiel de conserver les échantillons, par exemple avant et après la lyse cellulaire ou tissulaire à -20 °C ou, si possible, à -80 °C. Avant ou après l’homogénéisation (étape 3.2), les échantillons doivent être conservés sur de la glace.
D’autre part, le prétraitement au méthanol des échantillons pour précipiter les protéines ne modifie pas le schéma de méthylation de l’arginine. Cela a été testé avec des extraits de protéines de lysozyme et d’Escherichia coli (qui ne contiennent pas d’arginine méthylée)27. Cependant, des rapports antérieurs ont montré que le MeOH peut méthyler les groupes carboxyle terminaux du glutamate et de l’aspartate39.
Pour l’hydrolyse des protéines, s’assurer que les joints des bouchons à vis sont intacts (étape 4.1). Sinon, l’évaporation du HCl pourrait affecter la chambre de séchage. La concentration des analytes pourrait ne pas être modifiée de manière critique, cependant, car ils ne s’évaporent pas et le HCl résiduel est évaporé plus tard par lyophilisation. Des concentrations plus faibles de HCl, p. ex. 6 mol/L, peuvent être utilisées, mais peuvent nécessiter un temps d’hydrolyse plus long. Après hydrolyse, les échantillons peuvent être traités à température ambiante. Une bonne élimination des lipides est essentielle, cependant. Les lipides peuvent former des mélanges biphasiques dans l’eau (ou D2O, respectivement) plus tard pendant la mesure RMN. Ces inhomogénéités conduisent à l’élargissement du pic de RMN et affectent potentiellement la qualité et la sensibilité des expériences de RMN.
Si aucun robot de pipetage n’est disponible pour SPE, cela vaut l’investissement (il peut également être utilisé à d’autres fins). Les échantillons sur le robot de pipetage SPE sont traités séquentiellement, et dans la configuration actuelle, un échantillon prend ~40 min pour un essai complet. En raison des capacités limitées des réactifs (c.-à-d. 100 mL), seulement 19 échantillons peuvent être traités en une seule fois (en prenant ~13 h au total). Pourtant, le temps de prise en main est beaucoup moins long que pour la procédure SPE manuelle et nécessite moins de matériel. Pendant cette période, les échantillons peuvent être stockés dans le robot à température ambiante jusqu’à lyophilisation. Des produits équivalents peuvent remplacer les matrices et cartouches SPE usagées. Néanmoins, il est recommandé d’évaluer le protocole SPE et de l’ajuster si nécessaire.
La limite de détection pour ADMA est de ~100 nmol/L telle qu’évaluée précédemment par dilutions en série et en utilisant les temps de mesure RMN rapportés. D’autre part, des concentrations élevées d’arginine peuvent également surestimer le rapport ADMA / arginine (qui se situe généralement entre 5% et 15%). C’est parce que plus de 3 mmol / L d’arginine; la capacité de liaison de colonne SPE peut atteindre la saturation27. Pour vérifier la sensibilité et la spécificité de l’ensemble du flux de travail en cas de résultats inattendus (p. ex., pas de pics ou de pics qui se chevauchent dans les spectres RMN 1H aux décalages chimiques signalés), les normes ADMA, SDMA et MMA sont disponibles auprès des fournisseurs commerciaux (voir le tableau des matériaux). Si un laboratoire n’a pas de spectromètre RMN, toutes les étapes, y compris la lyophilisation finale (étape 6.1), pourraient être effectuées dans le laboratoire respectif, et les échantillons pourraient être expédiés à une installation de RMN pour analyse.
Par rapport à d’autres méthodes, telles que la spectrométrie de masse, aucun marquage des analytes n’est nécessaire, et il peut être effectué sans normes internes de quantification. D’autre part, la sensibilité de la RMN est légèrement inférieure, ce qui, dans la plupart des cas biologiques, ne joue aucun rôle, comme l’arginine et ses dérivés méthyliques, peut facilement être détecté dans toutes sortes de cellules ou de tissus eucaryotes. Comme mentionné précédemment, 3 millions de cellules suffisent pour quantifier l’ADMA liée aux protéines - plusieurs cellules qui peuvent facilement être obtenues avec la plupart des lignées cellulaires. Dans le cas de cellules primaires d’origine humaine à croissance lente, non modifiées, comme les cellules souches adultes40, les cellules peuvent être cultivées pendant une période plus longue ou mises en commun à partir d’expériences distinctes. Il en va de même pour les échantillons de tissus. ~ 30 mg de tissu, correspondant à de nombreux organes, par exemple de souris (en partie ou en totalité, par exemple de petits muscles) ou d’échantillon de biopsie, est suffisant pour préparer suffisamment de lysat et d’hydrolysat de protéines pour la mesure RMN27. D’autres méthodes de mesure de la méthylation des protéines arginine comprennent l’utilisation de tests de luminescence couplés à des enzymes41 ou 3H-marquée S-adénosyl-méthionine (SAM)42. La sensibilité est élevée et peut être augmentée en utilisant 14SAM marqués C, mais au prix de coûts accrus. De plus, l’utilisation de substances radioactives (y compris les fluides pour le comptage par scintillation) entraîne une gestion spéciale des déchets, ce qui n’est pas nécessaire avec le protocole actuel.
Une méthode complémentaire au présent protocole, utilisant la spectroscopie RMN hétéronucléaire 2D, peut révéler des schémas de méthylation spécifiques au site dans des protéines isolées. Il a récemment été publié, y compris une description détaillée de la détection des méthyl-arginines par spectroscopie RMN en général43. Le protocole actuel ne fournit pas d’informations sur la méthylation de l’arginine spécifique au site dans les protéines. Pourtant, la méthylation globale est modifiée au niveau cellulaire et physiologique, y compris la croissance et la différenciation cellulaires, le vieillissement, le cancer 1,2,12, cardiovasculaire20 et les maladies neurodégénératives 8,44. Les détails sur les mécanismes exacts impliqués ne sont pas encore entièrement compris, et les candidats médicaments possibles interférant avec la méthylation protéine-arginine11 à la fois in vitro et in vivo nécessitent une exploration plus approfondie1. L’étude de la cinétique de méthylation (que notre groupe a récemment démontrée)27 est essentielle pour mieux comprendre la modification de l’arginine et les mécanismes de dégradation des protéines. Les mesures globales de méthylation de l’arginine et les expériences cinétiques (les échantillons peuvent être congelés à tout moment) allant de protéines simples à des échantillons d’organismes entiers peuvent être effectuées directement à l’aide de ce protocole. Il fournit donc une méthode robuste, qui peut facilement être adaptée pour de futures recherches.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Acknowledgments
Le travail a été soutenu par les subventions P28854, I3792 du Fonds autrichien pour la science (FWF), doc.funds BioMolStruct DOC 130, DK-MCD W1226 BioTechMed-Graz (projet phare DYNIMO), les subventions 864690 de l’Agence autrichienne de promotion de la recherche (FFG) et 870454, le Centre de recherche sur le métabolisme intégratif de Graz; Programme d’infrastructure autrichien 2016/2017, gouvernement styrien (Zukunftsfonds) et Fonds de démarrage pour les talents de haut niveau de l’Université médicale du Fujian (XRCZX2021020). Nous remercions le Centre de recherche médicale pour l’accès aux installations de culture cellulaire. F.Z. a été formé dans le cadre du programme de doctorat en médecine moléculaire de l’Université médicale de Graz. Q.Z. a été formé dans le cadre du programme de doctorat sur les maladies métaboliques et cardiovasculaires de l’Université médicale de Graz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | Greiner Bio One | 188271 | |
| 3-(trimethylsilyl) propionic acid-2,2,3,3-d4 sodium salt (TSP) | Alfa Aesar | A1448 | |
| 5 mL tubes, round bottom | Greiner Bio One | 115101 | |
| Ammonia Solution 32% | Roth | A990.1 | |
| Bruker 600 MHz NMR spectrometer, equipped with a TXI probe head | Bruker | - | |
| Centrifuge, refrigerated, e.g. 5430 R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chloroform ≥99% p.a. | Roth | 3313.1 | |
| Cryocool | Thermo Scientific | SCC1 | heat transfer fluid for SpeedVac System |
| Deuterium Oxide (D2O) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-10-PK | |
| Dimethyl sulfoxide-d6 (d6-DMSO) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-6-1000 | |
| Drying Chamber | Binder | 9090-0018 | |
| DURAN culture tubes, 13 x 100mm, GL 14, 9 mL | VWR International | 212-0375 | |
| Edwards Deep vacuum oil pump RV5 | Thermo Scientific | 16234611 | part of the SpeedVac System |
| Eppendorf 1.5 mL tubes | Greiner Bio One | 616201 | |
| Gilson pipetting robot GX-241 Aspec | Gilson Inc. | 26150008 | |
| L-arginine | AppliChem | A3675 | |
| Methanol ≥99% | Roth | 8388.4 | |
| Milli-Q water aparatus | Millipore | ZIQ7000T0 | |
| Oasis MCX 1cc/30 mg, 1 mL cartridges | Waters | 186000252 | https://www.waters.com/waters/en_US/Waters-Oasis-Sample-Extraction-SPE-Products/ |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | LONBE17-512F | |
| Precellys 24 tissue homogenizer | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | https://www.bertin-instruments.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys24-tissue-homogenizer/ |
| Precellys tubes (pulping tubes) | VWR International | 432-0351 | |
| Precellyse 1.4 mm zirconium oxide beads | VWR International | 432-0356 | |
| Reacti-Therm/ReactiVap Heating, Stirring, and Evaporation Modules | Thermo Scientific | TS-18820 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/TS-18820 |
| Rotor for 1.5 mL tubes, FA-45-30-11 | Eppendorf | 5427753001 | |
| Savant Refrigerated Cooling Trap | Thermo Scientific | 15996161 | part of the SpeedVac System |
| Savant SpeedVac vacuum concentrator SPD210 | Thermo Scientific | 15906181 | part of the SpeedVac System; equipped with rotor for 1.5 ml tubes |
| Screw caps for glas vials with PTFE sealing, DN9 | Dr. R. Forche Chromatographie | CT11B3011 | |
| Seasand | Roth | 8441.3 | |
| Short thread glas vials 1.5 mL, ND9 | Dr. R. Forche Chromatographie | VT1100309 | |
| Sodium azide (NaN3) | Roth | K305.1 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | VWR | BDH7363-4 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | VWR | 80731-078 | |
| TopSpin 4.0 (Software) | Bruker | - | https://www.bruker.com |
| ω-NG-asymmetric dimethylarginine (ADMA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-208093 | |
| ω-NG-monomethylarginine (MMA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-200739A | |
| ω-NG-NG'-symmetric dimethylarginine (SDMA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-202235A |
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