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Cancer Research

Esplorazione del metiloma dell'arginina mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare

Published: December 16, 2021 doi: 10.3791/63245
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1
1Gottfried Schatz Research Center for Cell Signaling, Metabolism and Aging, Molecular Biology and Biochemistry, Medical University of Graz, 2Ministry of Education, School of Basic Medical Sciences, Key Laboratory of Gastrointestinal Cancer (Fujian Medical University)
* These authors contributed equally

Summary

Il presente protocollo descrive la preparazione e la misurazione quantitativa di arginina libera e proteina-legata e metil-arginine mediante spettroscopia 1H-NMR.

Abstract

L'arginina legata alle proteine è comunemente metilata in molte proteine e regola la loro funzione alterando le proprietà fisico-chimiche, la loro interazione con altre molecole, comprese altre proteine o acidi nucleici. Questo lavoro presenta un protocollo facilmente implementabile per quantificare l'arginina e i suoi derivati, tra cui la dimetilarginina asimmetrica e simmetrica (ADMA e SDMA, rispettivamente) e la monometilarginina (MMA). Dopo l'isolamento proteico da fluidi corporei biologici, tessuti o lisati cellulari, viene descritto un metodo semplice per l'omogeneizzazione, la precipitazione delle proteine e l'idrolisi proteica. Poiché gli idrolizzati contengono molti altri componenti, come altri amminoacidi, lipidi e acidi nucleici, è essenziale una fase di purificazione mediante estrazione in fase solida (SPE). SPE può essere eseguita manualmente utilizzando centrifughe o un robot di pipettaggio. La sensibilità per ADMA utilizzando il protocollo corrente è di circa 100 nmol/L. Il limite superiore di rilevazione per l'arginina è di 3 mmol / L a causa della saturazione SPE. In sintesi, questo protocollo descrive un metodo robusto, che spazia dalla preparazione del campione biologico al rilevamento basato su NMR, fornendo preziosi suggerimenti e insidie per un lavoro di successo nello studio del metiloma dell'arginina.

Introduction

Negli ultimi due decenni, la metilazione dei residui di arginina è stata riconosciuta come una modificazione post-traduzionale essenziale delle proteine. Colpisce processi biologici fondamentali come la regolazione della trascrizione, la trasduzione del segnale e molti altri1. Le principali proteine coinvolte nella regolazione della metilazione dell'arginina sono le proteine arginina metiltransferasi (PRMT)2. I principali derivati dell'arginina sono la ω-(N G,N G)-dimetilarginina asimmetrica (ADMA), la dimetilarginina ω-(N G,N'G)-simmetrica (SDMA) e la ω-N G-monometilarginina (MMA)2.

I PRMT usano S-adenosil-l-metionina per trasferire i gruppi metilici al gruppo guanidino terminale (con due gruppi amminici equivalenti) dell'arginina1 legata alle proteine. Si possono distinguere due enzimi principali: sia gli enzimi di tipo I che quelli di tipo II catalizzano la prima fase di metilazione per formare MMA (che quindi perde la sua simmetria). Seguendo questa fase, gli enzimi di tipo I (ad esempio, PRMT1, 2, 3, 4, 6, 8) usano MMA come substrato per formare ADMA, mentre gli enzimi di tipo II (principalmente PRMT5 e PRMT9) producono SDMA. PRMT1 è stata la prima proteina arginina metiltransferasi ad essere isolata da cellule di mammifero3. Tuttavia, i PRMT sono stati evolutivamente conservati4 in altri animali come vertebrati non mammiferi, cordati invertebrati, echinodermi, artropodi e nematodi cnidari5, piante6 e protozoi, compresi funghi come il lievito7. In molti casi, il knockout di uno dei PRMT porta alla perdita di vitalità, rivelando il ruolo essenziale delle specie di arginina metilata coinvolte in processi cellulari fondamentali come la trascrizione, la traduzione, la trasduzione del segnale, l'apoptosi e la separazione di fase liquido-liquido (cioè la formazione di organelli senza membrana, ad esempio nucleoli), che coinvolge regolarmente domini ricchi di arginina 8,9,10 . A sua volta, questo influenza la fisiologia e gli stati patologici, tra cui il cancro 11,12,13, il mieloma multiplo 14, le malattie cardiovascolari15, la patogenesi virale, l'atrofia muscolare spinale 16, il diabete mellito 17 e l'invecchiamento1. Si ritiene che l'aumento dei livelli di ADMA nel sangue, ad esempio, derivato dal polmone18 a causa della disgregazione proteica, sia collegato alla disfunzione endoteliale, alla malattia polmonare cronica19 e ad altre sindromi di malattie cardiovascolari20. È stato riscontrato che la sovraespressione dei PRMT accelera la tumorigenesi ed è associata a prognosi infausta21,22. Inoltre, l'ablazione di PRMT6 e PRMT7 innesca un fenotipo di senescenza cellulare23. Una significativa diminuzione di ADMA e PRMT1 è stata riscontrata durante l'invecchiamento dei fibroblasti WI-3824.

La sfida è capire come agisce la metilazione nei processi (pato)fisiologici identificando e quantificando la metilazione dell'arginina proteica. La maggior parte degli approcci attuali utilizza anticorpi per rilevare arginine metilate. Tuttavia, questi anticorpi sono ancora specifici del contesto e potrebbero non riuscire a riconoscere diversi motivi di proteine metilate dell'arginina25,26. Nel protocollo descritto, tutti i derivati dell'arginina menzionati sopra possono essere quantificati in modo affidabile mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR), cioè da soli, in combinazione o, come nella maggior parte dei casi, all'interno di matrici biologiche complesse come cellule eucariotiche (ad esempio, da lievito, topo o origine umana) e tessuti27, così come siero28. Per le proteine e quelle matrici complesse, l'idrolisi proteica29 è un prerequisito per generare aminoacidi liberi (modificati), come arginina, MMA, SDMA e ADMA. L'estrazione in fase solida (SPE)30 consente l'arricchimento dei composti di interesse. Infine, la spettroscopia 1H-NMR permette la rilevazione parallela dell'arginina e di tutti i principali derivati metilici dell'arginina. La spettroscopia NMR ha il vantaggio di essere veramente quantitativa, altamente riproducibile e una tecnica robusta31,32. Le misurazioni NMR finali possono essere eseguite in seguito, quando sono stati raccolti e preparati molti campioni. Infine, questo protocollo si concentra principalmente sulla preparazione del campione in quanto ciò non richiede un proprio spettrometro NMR. Può essere eseguito nella maggior parte dei laboratori biochimici. Tuttavia, alcuni suggerimenti su quali misure di spettroscopia NMR dovrebbero essere fatte sono forniti in questo lavoro.

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Protocol

Gli idrolizzati proteici di lievito sono stati utilizzati come campioni per i risultati rappresentativi di questo lavoro. L'intero protocollo è riassunto nella Figura 1.

1. Preparazione dei materiali e dei reagenti

  1. Metanolo/acqua: preparare una miscela di due parti di metanolo al 99% (MeOH) e una parte di H 2 O, designata come MeOH/H2 O. Conservare MeOH puro e MeOH/H2Oa -20 °C per ridurre al minimo l'evaporazione dell'alcol e aumentare la stabilità del campione.
  2. Acido cloridrico (HCl): diluire 9 mol/L da HCl concentrato (12,0 mol/L o 37%) e 0,1 mol/L di HCl. La soluzione più concentrata (9 mol/L) viene utilizzata per l'idrolisi proteica, mentre quella concentrata più bassa (0,1 mol/L) viene utilizzata per l'estrazione in fase solida.
    ATTENZIONE: Lavorare all'interno della cappa aspirante.
  3. Preparare una soluzione sostitutiva per SPE contenente il 10% di una soluzione di ammoniaca satura (stock: 30% p/p di ammoniaca), il 50% di metanolo e il 40% di acqua (v/v).
  4. Tampone NMR: sciogliere 5,56 g di idrogeno fosfato disodico (Na 2 HPO 4, 0,08 mol/L), 0,4 g di sale sodico di acido propionico 3-(trimetilsilil)-2,2,3,3-d4 (TSP, 5 mmol/L), 0,04 % (p/v) di azoturo di sodio (NaN3) in 500 mL di biossido di deuterio (D2O)e regolare a pH7,4 (utilizzando HCl o NaOH, rispettivamente) (vedi Tabella dei materiali). Controllare la purezza di ogni nuovo lotto tampone mediante spettroscopia NMR.
    NOTA: La quantità di eventuali contaminanti (ad esempio, etanolo) deve essere la più bassa possibile.
  5. Riempire i tubi di polpa con sfere di ossido di zirconio (tubi da 2 ml e perline da 1,4 mm sono adatti per la maggior parte delle applicazioni, ma sono disponibili diverse varianti) (vedi Tabella dei materiali). Riempi circa 10-20 perline a mano o acquista tubi preriempiti, che sono anche disponibili.
  6. Tenere a portata di mano le pipette e le rispettive punte nell'intervallo 10-1.000 μL.
    NOTA: L'acqua altamente pura, designatacome H 2 O, definita da un'elevata resistenza di ≥18,2 MΩ·cm-1, è stata utilizzata durante tutto il lavoro. Corrisponde all'acqua doppia distillata.

2. Raccolta e conservazione dei campioni

  1. Congelare i campioni liquidi (siero/plasma, coltura cellulare surnatante, ecc.) con azoto liquido e conservarli a -80 °C fino all'uso.
  2. Preparare i materiali solidi come indicato di seguito.
    1. Raccogliere le cellule da colture cellulari (3-5 milioni di cellule) sia raccogliendo cellule aderenti, dopo lavaggio con soluzione salina tamponata fosfato a freddo, raschiatura e centrifugazione, sia centrifugazione diretta di cellule cresciute in sospensione.
    2. Rimuovere i surnatanti cellulari (che potrebbero essere raccolti per ulteriori analisi, mediante misurazione diretta consecutiva, vedi punto 6, o dopo precipitazione di proteine solubili, vedi punto 3.1), quindi congelare i pellet con azoto liquido e conservarli a -80 °C. Per ulteriori elaborazioni, vedere il passaggio 3.2.
    3. Conservare e raccogliere i tessuti secondo lo scopo dello studio. Per tessuti molto omogenei, come il fegato o il muscolo, analizzarne qualsiasi parte. Ad esempio, nel caso di un cervello di topo, determinare la metilazione globale dell'arginina dell'intero cervello o sezioni cerebrali.
      NOTA: Il peso ideale dei tessuti da trattare è 30-60 mg. Si consiglia di congelare e polverizzare l'intero cervello e utilizzare aliquote di esso. In alternativa, possono essere utilizzate parti specifiche del cervello (ad esempio, frontale, cervelletto, regioni occipitali o un emisfero, del peso di ~ 250 mg).

3. Preparazione preliminare del campione

NOTA: Eseguire il lavoro sul ghiaccio, mantenendo MeOH freddo. I campioni devono inoltre essere conservati su ghiaccio per evitare la degradazione delle proteine.

  1. Per i campioni liquidi, aggiungere 400 μL di metanolo ghiacciato a 200 μL del campione. Continuare con il passaggio 3.3.
    NOTA: se è disponibile meno campione, regolare i volumi di conseguenza; La sensibilità NMR è solitamente abbastanza elevata per quantità di campione più piccole, ma deve essere testata individualmente.
  2. Nel caso di materiali solidi, preparare provette da 1,5 ml sufficienti per i lisati (utilizzare per la centrifugazione dopo l'omogeneizzazione).
    1. Con attenzione, ma accuratamente, risospendere i pellet cellulari in 600 μL di MeOH/H2O e trasferire l'intera fase liquida nei tubi di spappolatura.
    2. Metti i tessuti in provette di polpa (puoi pesarli direttamente nei tubi) e aggiungi 600 μL di MeOH / H2O (per 30-60 mg; regola se il peso differisce sostanzialmente).
    3. Inserire i tubi nell'omogeneizzatore tissutale (vedere Tabella dei materiali) e omogeneizzare una volta per 20 s con forti agitazioni (per pellet cellulari, tessuti molli) o due volte per 20 s ciascuno (o più a lungo se necessario) con un intervallo di 5 minuti in mezzo (per tessuti rigidi).
    4. Dopo l'omogeneizzazione, rimettere immediatamente i campioni sul ghiaccio e trasferire l'intero lisato in nuove provette da 1,5 ml.
  3. Conservare i campioni per almeno 30 minuti (fino a diversi giorni) a -20 °C prima di un'ulteriore lavorazione.
  4. Centrifugare a 10.000 x g per 30 minuti a 4 °C. Nel frattempo, preparare provette da 1,5 ml sufficienti per raccogliere i surnatanti
    NOTA: Questo surnatante (designato "(1)" nella Figura 1) potrebbe essere scartato, essere liofilizzato ed elaborato direttamente per NMR (fase 6) o analizzato in altro modo.
  5. In questo protocollo, il precipitato di MeOH (= pellet ottenuto dopo la fase 3.1 o 3.2.2, rispettivamente) viene utilizzato per ulteriori analisi contenenti, tra l'altro, componenti quali acidi nucleici e lipidi, proteine arginina-metilate. Continuare con l'idrolisi proteica o conservare i pellet a -20 °C per alcuni giorni.

4. Idrolisi proteica

  1. Aggiungere 500 μL di 9 mol/L di HCl a ciascun campione. Quindi, troncare i tappi di ciascun tubo con le forbici e inserirli nei tubi di coltura di vetro (Figura 2A). Con attenzione, ma strettamente, chiudere i tappi rossi (controllando così la sigillatura).
    NOTA: Prima dell'uso, controllare sempre ogni guarnizione (pellicola di PTFE grigia all'interno dei tappi a vite rossi) per un corretto serraggio e pulirli regolarmente con acqua.
  2. Al termine, posizionare i tubi in un becher parzialmente riempito di sabbia (per un migliore trasferimento di calore) e idrolizzare i campioni per circa 16 ore a 110 °C in una camera di essiccazione.
  3. Dopo l'idrolisi, raffreddare i campioni (~1 h).
  4. Successivamente, liofilizzare durante la notte utilizzando una centrifuga ad alto vuoto (inferiore a 100 Pa).
  5. Sciogliere i pellet - se completamente asciutti (in caso contrario, continuare la liofilizzazione) - in 1 mL di 0,1 mol/L HCl e aggiungere 50 μL di cloroformio (CHCl3) a ciascun tubo; Sciogliere accuratamente il pellet con una pipetta da 1.000 μL, mescolando così i liquidi, quindi trasferire l'intero volume in un nuovo tubo.
    ATTENZIONE: Lavorare sempre con piccole quantità per ridurre al minimo l'evaporazione estesa
  6. Quindi, centrifugare a 8.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.
  7. Raccogliere con cura la fase superiore del liquido bifasico contenente la frazione solubile in acqua (Figura 2B, la frazione con la densità inferiore) con una pipetta e riempirla in nuovi tubi. Utilizzare tubi da 1,5 mL per SPE manuale (punto 5.2) o flaconcini di vetro per SPE robotizzati (punto 5.3 e figura 2D). Evitare di versare su CHCl3 e il suo contenuto (Figura 2C).

5. Estrazione in fase solida (SPE)

  1. Prima del primo utilizzo, pulire le cartucce SPE due volte con 1 mL della soluzione sostitutiva (fase 1.3) seguita da centrifugazione a 800 x g per 1 minuto a temperatura ambiente (posto in provette da 15 ml). Possono essere utilizzati 10-20 volte ciascuno.
  2. SPE manuale
    1. Precondizionare le cartucce (vedere la tabella dei materiali) in ogni ciclo con 1 mL di metanolo puro e 2 x 1 mL di PBS, seguita ogni volta da centrifugazione a 800 x g per 1 minuto a temperatura ambiente (posta in tubi da 15 ml).
    2. Successivamente, caricare i campioni (dal punto 4.7) sulle cartucce SPE e centrifugarli a 600 x g per 2 minuti a temperatura ambiente.
    3. Quindi, applicare un ciclo di lavaggio come indicato di seguito.
      1. Aggiungere tre volte 1 mL di H2O (ciascuno seguito da centrifugazione per 1 minuto a 800 x g a temperatura ambiente).
      2. Aggiungere cinque volte 1 mL di 0,1 mol/L HCl (ciascuno seguito da centrifugazione per 1 minuto a 800 x g a temperatura ambiente).
      3. Aggiungere due volte 1 mL di MeOH (ciascuno seguito da centrifugazione per 1 minuto a 800 x g a temperatura ambiente).
    4. Quindi, eluire l'arginina e i suoi derivati con 3 x 1 mL di soluzione sostitutiva (seguita da centrifugazione 1 minuto a 800 x g a temperatura ambiente) in un singolo tubo da 15 ml.
      NOTA: La soluzione sostitutiva funge da eluente per l'arginina e derivati e viene utilizzata anche per la pulizia delle cartucce (tutte le sostanze vengono lavate prima dell'eluizione o al valore pH basico della soluzione sostitutiva). Tuttavia, per evitare la contaminazione nel tempo, il riutilizzo dovrebbe essere limitato (vedere il passaggio 5.1).
  3. SPE robotica
    NOTA: Qui, un robot per pipettaggio (la parte principale costituita da un ago per pipettaggio, una stazione di lavaggio per l'ago, una fornitura di reagenti e posizioni per campioni ed eluati, vedi Tabella dei materiali) viene fornito con un portacartucce per le colonne SPE. Per altri strumenti, assicurati di essere completamente equipaggiato con tutte le cose elencate.
    1. Riempire il surnatante (dal punto 4.7) direttamente in flaconcini di vetro con sigillante in PTFE (Figura 2D), preparare un numero sufficiente di reagenti (100 mL di ciascuno, cioè soluzione sostitutiva, 99% di MeOH, PBS, H 2 Oe 0,1 di mol/L HCl), tubi da 5 mL per l'eluizione e soluzione di lavaggio per l'ago del robot (di solito H2O).
    2. Utilizzare un'applicazione o un metodo nel software del robot basato esattamente sui passaggi descritti per SPE manuale (passo 5.2).
      NOTA: I dettagli possono variare molto tra i fornitori di strumenti, quindi fare riferimento al manuale del software del rispettivo robot per la programmazione. Un robot di pipettaggio di solito funziona applicando la pressione dell'aria sulle cartucce invece della centrifugazione, che è la differenza principale. Se il protocollo viene stabilito ed eseguito per la prima volta, includere controlli (ad esempio, L-arginina di concentrazione nota) per verificare un flusso di lavoro ottimale.

6. Preparazione finale per la RMN

  1. Campioni di liofilizzazione durante la notte per completare la secchezza per eliminare l'ammoniaca e H2O.
  2. Sciogliere ciascun campione in 500 μL di tampone NMR (fase 1.4) e trasferirlo in provette NMR. È importante sottolineare che il volume deve essere lo stesso in tutte le provette e i campioni devono essere omogenei (privi di residui e lipidi, che tendono ad aggregarsi).
    NOTA: I dettagli della spettroscopia NMR vanno oltre questa revisione del metodo e sono descritti più dettagliatamente altrove27. Qui, vengono spiegati solo i requisiti e i passaggi principali. La quantificazione dell'arginina e dei suoi metaboliti viene eseguita su uno spettrometro NMR a 600 MHz (vedi Tabella dei materiali). In linea di principio, è possibile utilizzare qualsiasi altra intensità di campo dello spettrometro NMR/NMR, a condizione che i segnali NMR dell'arginina e delle arginine metilate possano essere rilevati con sufficiente sensibilità e senza sovrapposizione di segnali. È possibile utilizzare qualsiasi testa di sonda con gradienti dell'asse z in grado di registrare 1spettro H, a condizione che le sequenze di impulsi siano impostate di conseguenza.
  3. Registrare uno spettro 1D utilizzando la sequenza di impulsi CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill)33,34 (cpmgpr1d, 512 scansioni, dimensione di fid 73728, larghezza spettrale 11904,76 Hz su un NMR a 600 MHz, ritardo di riciclo 4 s) con soppressione del segnale dell'acqua utilizzando la presaturazione.
  4. In questi esperimenti, rimuovere gli accoppiamenti scalari 1H mediante disaccoppiamento virtuale, riducendo la sovrapposizione del segnale. Registrare ulteriori per domande specifiche e/o campioni o matrici complesse, ad esempio 1H-13 C-eteronucleare singolo spettro di coerenza quantistica (HSQC) H-1327.
    NOTA: Per matrici più complesse in cui i segnali NMR1 H di arginine metilate potrebbero essere parzialmente sovrapposti a segnali NMR 1H di altri metaboliti (ad esempio, lisina), sono necessari spettri omo-nucleari J-risolti (JRES)35 H.
  5. Eseguire la quantificazione assoluta integrando le rispettive intensità di picco degli standard di una concentrazione nota, ad esempio 100 μmol / arginina.
    NOTA: Di routine, ADMA, SDMA e MMA (vedere la tabella dei materiali) sono riportati come rapporto relativo all'arginina. Ciò ha un vantaggio significativo che non è necessario eseguire alcuna normalizzazione separata (ad esempio, numero di cellule, massa tissutale, concentrazioni proteiche). In tal caso, l'arginina funge da standard interno e la quantificazione relativa è sufficiente per ottenere informazioni biologicamente rilevanti.
  6. Per differenziare SDMA e MMA, liofilizzare nuovamente i campioni per eliminare D2O (se sono stati risospesi in tampone NMR in precedenza), che viene poi sostituito da dimetilsolfossido deuterato (d 6-DMSO), consentendo la risoluzione delle risonanze metiliche27. Pertanto, aspirare i campioni dalle provette NMR con pipette Pasteur, liofilizzarli e scioglierli in 500 μL di d6-DMSO.

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Representative Results

Di routine, proiezioni 1H 1D di spettri NMR 2D J-risolti (JRES), virtualmente disaccoppiati vengono utilizzate per assegnazioni e quantificazioni di picco nel nostro laboratorio36. La figura 3 mostra spettri JRES rappresentativi di idrolizzati proteici di lievito purificati utilizzando l'attuale protocollo SPE. Sebbene a concentrazioni molto diverse, entrambe le sostanze possono essere separate e quantificate in una matrice cellulare. Sulla base del numero di protoni del gruppo specifico metile (-CH3) o metilene (-CH2-) al rispettivo spostamento chimico, la spettroscopia 1H-NMR consente una quantificazione precisa. Come sottolineato nel protocollo (fase 0), la quantificazione relativa di un derivato metil-arginina rispetto all'arginina è principalmente adeguata per osservare i processi biologici, ad esempio, cambiamenti della metilazione dell'arginina come risposta a modulazioni, come knock-down / sovraespressione di geni, cambiamenti nei nutrienti o trattamento con inibitori.

Come mostrato in precedenza 27, L-arginina e ADMA possono essere ben discriminati dai loro diversi cambiamenti chimici caratteristici rispettivamente a3,25 e 3,02 ppm. I protoni metilici SDMA e MMA rivelano picchi sovrappostiin D 2 O (il tampone NMR descritto nella fase 1.4) con uno spostamento chimico di 2,85 ppm. Se è presente un picco nella rispettiva posizione, si potrebbe separare SDMA e MMA dissolvendo i campioni in d 6-DMSO come descritto al punto6.6 del protocollo. Utilizzando questo approccio, gli spostamenti chimici NMR 1H di SDMA e MMA possono essere separati e quantificati con cambiamenti chimici caratteristici a 2,76 ppm (SDMA) e 2,74 ppm (MMA)27. La figura 3B mostra i dati rappresentativi di SDMA e MMA (entrambi 100 μmol/L) rispettivamente in D2O e d6-DMSO. Dati corrispondenti di SMDA e MMA rilevati in varie cellule e tessuti sono stati riportati di recente27. Come descritto nelle fasi 6.4-6.5 del protocollo, gli standard di riferimento delle concentrazioni note possono essere utilizzati per la quantificazione. Tutte le norme di riferimento menzionate nel testo sono disponibili in commercio.

Figure 1
Figura 1: Panoramica della preparazione del campione. Schema che rivela i passaggi significativi dalla raccolta del campione alla misurazione NMR. Le caselle nere si riferiscono alla numerazione nelle sezioni del protocollo. Inoltre, viene mostrato il numero approssimativo di giorni (che varia in base al numero di campioni). Campioni liquidi disomogenei potrebbero essere centrifugati prima di aggiungere MeOH (fase 3.1) per rimuovere i residui (non mostrato). Il surnatante dopo centrifugazione iniziale (1) contenente, ad esempio, metaboliti intracellulari o metaboliti argininici non legati alle proteine può essere conservato a -20 °C per ulteriori analisi. Di routine, i pellet MeOH (2) vengono ulteriormente analizzati. Abbreviazioni: CHCl3, cloroformio; HCl, acido cloridrico; MeOH, metanolo; NMR, risonanza magnetica nucleare; o/n, pernottamento; SN, surnatante; SPE, estrazione in fase solida. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Manipolazione degli idrolizzati proteici e preparazione per l'estrazione in fase solida. (A) Becher riempito con sabbia, tubi di vetro, tappi a vite con pellicola sigillante in politetrafluoroetilene grigio (PTFE) e campioni in provette da 1,5 mL dopo aver tagliato i tappi. (B) Tubo dopo centrifugazione (fase 4.6) e (C) dopo la rimozione del surnatante acquoso (fase 4.7): può rimanere dell'acqua residua (~50 μL). Il residuo nero contiene resti organici insolubili e carbonizzati. Tuttavia, alcuni campioni possono contenere sostanze colorate (D), che non interferiscono con la misurazione di L-arginina. Ciò è in parte dovuto all'estrazione in fase solida (SPE) in seguito, utilizzando fasi di centrifugazione consecutive (E) o un robot di pipettaggio (F). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Spettri NMR tipici della L-arginina e dei suoi derivati metilici. 1 Gli spettri NMR J-risolti proiettati H 1D potrebbero facilmente distinguere i protoni δ-(CH2) di L-arginina (3,25 ppm) e i 3-protoni ω-N-CH della dimetilarginina asimmetrica (ADMA, a 3,02 ppm). I campioni di pellet di lievito (A) che rivelano quantità variabili di ADMA possono essere quantificati integrando intensità di segnale anche in presenza di elevate quantità di arginina (si noti che il picco completo di arginina non è mostrato). (B) Poiché la dimetilarginina (SDMA) ω-(N G,N'G)-simmetrica (SDMA) e la ω-N G-monometil arginina (MMA) difficilmente possono essere discriminate nel tampone di ossido di deuterio (D 2 O), i campioni devono essere disciolti in dimetilsolfossido deuterato (d6-DMSO), dove i picchi (in questo caso 100 μmol/L di ciascuna sostanza) possono essere facilmente distinti l'uno dall'altro (picchi a 2,75 e2,76ppm, rispettivamente) ed essere quantificati. Tutti gli spettrogrammi sono stati esportati direttamente dal software di controllo dello spettrometro NMR. Il software rivela i risultati primari, che devono essere controllati prima di eseguire un'analisi più dettagliata, comprese le statistiche di molti campioni. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

Nella sezione seguente, l'attenzione principale si trova sul metodo stesso; le implicazioni biologiche della metilazione dell'arginina sono descritte nella sezione Introduzione.

In primo luogo, i tessuti di diversa rigidità potrebbero richiedere un aggiustamento della lisi del campione: le cellule provenienti da colture cellulari (inclusi batteri, lieviti, ecc.) e tessuti come cervello, fegato giovane, muscolatura liscia, ecc., Possono essere rapidamente omogeneizzati. Per i tessuti ad alta rigidità (compresi il fegato di soggetti anziani, arterie, ossa, ecc.), l'omogeneizzazione deve essere eseguita due volte (vedere il punto 3.2.3). Tuttavia, questo processo non dovrebbe essere continuato più spesso, anche se rimangono alcuni resti insolubili. Invece, i campioni devono essere centrifugati per 10 minuti a 10.000 x g e i surnatanti raccolti per ulteriori analisi (per ridurre al minimo la degradazione del campione).

In ogni fase in cui i campioni vengono congelati (inizialmente, dopo l'aggiunta di MeOH, fasi 3.3, 3.4 o 3.5, rispettivamente) o dopo la liofilizzazione (fasi 4.4 e 6.1), i campioni possono essere conservati per alcuni giorni prima di ulteriori elaborazioni. Inoltre, il surnatante della fase 3.4 (dopo omogeneizzazione; designato come "(1)" nella Figura 1) può anche essere conservato per ulteriori analisi, ad esempio per la misurazione di metaboliti diversi dalle metil-arginine36,37,38.

Da un lato, i passaggi critici riguardano la conservazione dei campioni, poiché la degradazione delle proteine può alterare il risultato. Se la degradazione proteica si verifica prima della precipitazione di MeOH, l'arginina e i suoi derivati metilici possono essere sottostimati. Pertanto, la conservazione dei campioni è essenziale, ad esempio, prima e dopo la lisi cellulare o tissutale a -20 °C o, quando possibile, a -80 °C. Prima o dopo l'omogeneizzazione (fase 3.2), i campioni devono essere conservati su ghiaccio.

D'altra parte, il pretrattamento con metanolo dei campioni per precipitare le proteine non altera il modello di metilazione dell'arginina. Questo è stato testato con estratti proteici di lisozima ed Escherichia coli (che non contengono arginina metilata)27. Tuttavia, rapporti precedenti hanno dimostrato che MeOH può metilare i gruppi carbossilici terminali di glutammato e aspartato39.

Per l'idrolisi delle proteine, assicurarsi che le guarnizioni dei tappi a vite siano intatte (punto 4.1). In caso contrario, l'evaporazione di HCl potrebbe influire sulla camera di essiccazione. La concentrazione degli analiti potrebbe non essere modificata in modo critico, tuttavia, perché non evaporano e l'HCl residuo viene evaporato in seguito dalla liofilizzazione. Concentrazioni più basse di HCl, ad esempio 6 mol / L, possono essere utilizzate, ma potrebbero richiedere un tempo di idrolisi più lungo. Dopo l'idrolisi, i campioni possono essere trattati a temperatura ambiente. La corretta rimozione dei lipidi è essenziale, però. I lipidi possono formare miscele bifasiche in acqua (o D2O, rispettivamente) più tardi durante la misurazione NMR. Queste disomogeneità portano all'ampliamento del picco NMR e potenzialmente influenzano la qualità e la sensibilità degli esperimenti NMR.

Se non è disponibile alcun robot per pipettaggio per SPE, vale la pena investire (può essere utilizzato anche per altri scopi). I campioni sul robot di pipettaggio SPE vengono elaborati in sequenza e, nella configurazione attuale, un campione richiede ~ 40 minuti per un'esecuzione completa. A causa delle limitazioni delle capacità dei reagenti (cioè 100 ml), solo 19 campioni possono essere elaborati in una volta sola (prendendo ~ 13 ore complessive). Tuttavia, il tempo di intervento è molto inferiore rispetto alla procedura manuale SPE e richiede meno materiale. Durante questo periodo, i campioni possono essere conservati all'interno del robot a temperatura ambiente fino alla liofilizzazione. Prodotti equivalenti potrebbero sostituire le matrici e le cartucce SPE usate. Tuttavia, si raccomanda di valutare il protocollo SPE e di modificarlo se necessario.

Il limite di rilevazione per ADMA è ~100 nmol/L come valutato in precedenza mediante diluizioni seriali e utilizzando i tempi di misurazione NMR riportati. D'altra parte, alte concentrazioni di arginina possono anche sovrastimare il rapporto tra ADMA e arginina (che di solito è nell'intervallo del 5% -15%). Questo perché sopra 3 mmol / L di arginina; la capacità di legame della colonna SPE può raggiungere la saturazione27. Per verificare la sensibilità e la specificità dell'intero flusso di lavoro in caso di risultati imprevisti (ad esempio, nessun picco o picco sovrapposto negli spettri 1H-NMR agli spostamenti chimici riportati), gli standard di ADMA, SDMA e MMA sono disponibili presso i fornitori commerciali (vedere Tabella dei materiali). Se un laboratorio non dispone di spettrometro NMR, tutte le fasi, compresa la liofilizzazione finale (fase 6.1), potrebbero essere eseguite nel rispettivo laboratorio e i campioni potrebbero essere spediti a una struttura NMR per l'analisi.

Rispetto ad altri metodi, come la spettrometria di massa, non è necessaria alcuna etichettatura degli analiti e può essere eseguita senza standard interni per la quantificazione. D'altra parte, la sensibilità della NMR è leggermente inferiore, che nella maggior parte dei casi biologici non ha alcun ruolo, come l'arginina e i suoi derivati metilici possono essere facilmente rilevati in tutti i tipi di cellule o tessuti eucarioti. Come accennato in precedenza, 3 milioni di cellule sono sufficienti per quantificare l'ADMA legata alle proteine - diverse cellule che possono essere facilmente ottenute con la maggior parte delle linee cellulari. Nel caso di cellule primarie a crescita lenta, non modificate di origine umana come le cellule staminali adulte40, le cellule potrebbero essere coltivate per un periodo più lungo o raggruppate da esperimenti separati. Lo stesso vale per i campioni di tessuto. ~ 30 mg di tessuto, corrispondenti a molti organi, ad esempio di topi (in parte o tutti, ad esempio, piccoli muscoli) o campione bioptico, è sufficiente per preparare abbastanza lisato e idrolizzato proteico per la misurazione NMR27. Altri metodi per misurare la metilazione dell'arginina proteica includono l'uso di saggi di luminescenza accoppiati ad enzimi41 o 3S-adenosil-metionina (SAM) marcati con H 42. La sensibilità è elevata e potrebbe essere aumentata utilizzando 14SAM marcati C, ma a scapito di un aumento dei costi. Inoltre, l'uso di sostanze radioattive (compresi i fluidi per il conteggio a scintillazione) provoca una gestione speciale dei rifiuti, che non è necessaria utilizzando il protocollo attuale.

Un metodo complementare al presente protocollo, che utilizza la spettroscopia NMR eteronucleare 2D, può rivelare modelli di metilazione sito-specifici all'interno di proteine isolate. È stato recentemente pubblicato, compresa una descrizione dettagliata della rilevazione di metil-arginine mediante spettroscopia NMR in generale43. L'attuale protocollo non fornisce informazioni sulla metilazione dell'arginina sito-specifica all'interno delle proteine. Tuttavia, la metilazione globale è cambiata a livello cellulare e fisiologico, compresa la crescita e la differenziazione cellulare, l'invecchiamento, il cancro 1,2,12, cardiovascolare20 e le malattie neurodegenerative 8,44. I dettagli sui meccanismi esatti coinvolti non sono ancora completamente compresi, e possibili farmaci candidati che interferiscono con la metilazione proteina-arginina11 sia in vitro che in vivo necessitano di ulteriori esplorazioni1. Studiare la cinetica della metilazione (che il nostro gruppo ha recentemente dimostrato)27 è essenziale per ottenere informazioni sulla modificazione dell'arginina e sui meccanismi di degradazione delle proteine. Le misurazioni globali della metilazione dell'arginina e gli esperimenti cinetici (i campioni possono essere congelati in qualsiasi momento) che vanno da singole proteine a campioni di organismi interi possono essere eseguiti direttamente utilizzando questo protocollo. Pertanto, fornisce un metodo robusto, che può essere facilmente adattato per la ricerca futura.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Acknowledgments

Il lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni dell'Austrian Science Fund (FWF) P28854, I3792, doc.funds BioMolStruct DOC 130, DK-MCD W1226 BioTechMed-Graz (progetto faro DYNIMO), sovvenzioni dell'Agenzia austriaca per la promozione della ricerca (FFG) 864690 e 870454, dal Centro di ricerca sul metabolismo integrativo di Graz; Programma infrastrutturale austriaco 2016/2017, il governo della Stiria (Zukunftsfonds) e il Fondo di avvio per talenti di alto livello dell'Università di medicina del Fujian (XRCZX2021020). Ringraziamo il Centro di Ricerca Medica per l'accesso alle strutture di coltura cellulare. F.Z. è stato formato nell'ambito del programma di dottorato in medicina molecolare, Università di medicina di Graz. Q.Z. è stato addestrato nell'ambito del programma di dottorato in Malattie metaboliche e cardiovascolari, Università di Medicina di Graz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL tubes Greiner Bio One 188271
3-(trimethylsilyl) propionic acid-2,2,3,3-d4 sodium salt (TSP) Alfa Aesar A1448
5 mL tubes, round bottom Greiner Bio One 115101
Ammonia Solution 32% Roth A990.1
Bruker 600 MHz NMR spectrometer, equipped with a TXI probe head Bruker -
Centrifuge, refrigerated, e.g. 5430 R Eppendorf 5428000010
Chloroform ≥99% p.a. Roth 3313.1
Cryocool Thermo Scientific SCC1 heat transfer fluid for SpeedVac System
Deuterium Oxide (D2O) Cambridge Isotope Laboratories DLM-10-PK
Dimethyl sulfoxide-d6 (d6-DMSO) Cambridge Isotope Laboratories DLM-6-1000
Drying Chamber Binder 9090-0018
DURAN culture tubes, 13 x 100mm, GL 14, 9 mL VWR International 212-0375
Edwards Deep vacuum oil pump RV5 Thermo Scientific 16234611 part of the SpeedVac System
Eppendorf 1.5 mL tubes Greiner Bio One 616201
Gilson pipetting robot GX-241 Aspec Gilson Inc. 26150008
L-arginine AppliChem A3675
Methanol ≥99% Roth 8388.4
Milli-Q water aparatus Millipore ZIQ7000T0
Oasis MCX 1cc/30 mg, 1 mL cartridges Waters 186000252 https://www.waters.com/waters/en_US/Waters-Oasis-Sample-Extraction-SPE-Products/
Phosphate Buffered Saline (PBS) Lonza LONBE17-512F
Precellys 24 tissue homogenizer Bertin Instruments P000669-PR240-A https://www.bertin-instruments.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys24-tissue-homogenizer/
Precellys tubes (pulping tubes) VWR International 432-0351
Precellyse 1.4 mm zirconium oxide beads VWR International 432-0356
Reacti-Therm/ReactiVap Heating, Stirring, and Evaporation Modules Thermo Scientific TS-18820 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/TS-18820
Rotor for 1.5 mL tubes, FA-45-30-11 Eppendorf 5427753001
Savant Refrigerated Cooling Trap Thermo Scientific 15996161 part of the SpeedVac System
Savant SpeedVac vacuum concentrator SPD210 Thermo Scientific 15906181 part of the SpeedVac System; equipped with rotor for 1.5 ml tubes
Screw caps for glas vials with PTFE sealing, DN9 Dr. R. Forche Chromatographie CT11B3011
Seasand Roth 8441.3
Short thread glas vials 1.5 mL, ND9 Dr. R. Forche Chromatographie VT1100309
Sodium azide (NaN3) Roth K305.1
Sodium hydroxide (NaOH) VWR BDH7363-4
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) VWR 80731-078
TopSpin 4.0 (Software) Bruker - https://www.bruker.com
ω-NG-asymmetric dimethylarginine (ADMA) Santa Cruz Biotechnology sc-208093
ω-NG-monomethylarginine (MMA) Santa Cruz Biotechnology sc-200739A
ω-NG-NG'-symmetric dimethylarginine (SDMA) Santa Cruz Biotechnology sc-202235A

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Ricerca sul cancro numero 178
Esplorazione del metiloma dell'arginina mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare
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Habisch, H., Zhang, F., Zhou, Q.,… More

Habisch, H., Zhang, F., Zhou, Q., Madl, T. Exploring the Arginine Methylome by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. J. Vis. Exp. (178), e63245, doi:10.3791/63245 (2021).

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