Summary
본 프로토콜은 1H-NMR 분광법에 의한 유리 및 단백질 결합 아르기닌 및 메틸 아르기닌의 제조 및 정량 측정을 설명합니다.
Abstract
단백질 결합 아르기닌은 일반적으로 많은 단백질에서 메틸화되며 물리 화학적 특성, 다른 단백질 또는 핵산을 포함한 다른 분자와의 상호 작용을 변경함으로써 기능을 조절합니다. 이 연구는 비대칭 및 대칭 디메틸아르기닌(각각 ADMA 및 SDMA) 및 모노메틸 아르기닌(MMA)을 포함하여 아르기닌과 그 유도체를 정량화하기 위한 쉽게 구현할 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 생물학적 체액, 조직 또는 세포 용해물로부터 단백질을 분리한 후, 균질화, 단백질의 침전 및 단백질 가수분해를 위한 간단한 방법이 설명된다. 가수분해물에는 다른 아미노산, 지질 및 핵산과 같은 많은 다른 성분이 포함되어 있기 때문에 고체상 추출(SPE)을 사용한 정제 단계가 필수적입니다. SPE는 원심분리기 또는 피펫팅 로봇을 사용하여 수동으로 수행할 수 있습니다. 현재 프로토콜을 사용하는 ADMA의 감도는 약 100nmol/L입니다. 아르기닌의 검출 상한은 SPE 포화로 인해 3mmol/L입니다. 요약하면, 이 프로토콜은 생물학적 샘플 준비에서 NMR 기반 검출에 이르는 강력한 방법을 설명하며, 아르기닌 메틸롬을 연구할 때 성공적인 작업을 위한 귀중한 힌트와 함정을 제공합니다.
Introduction
지난 20 년 동안 아르기닌 잔기의 메틸화는 단백질의 필수적인 번역 후 변형으로 인식되었습니다. 그것은 전사 조절, 신호 전달 등과 같은 기본적인 생물학적 과정에 영향을 미칩니다1. 아르기닌 메틸화 조절에 관여하는 주요 단백질은 단백질 아르기닌 메틸 전이 효소 (PRMT)2. 아르기닌의 주요 유도체는 ω- (NG, NG)- 비대칭 디메틸 아르기닌 (ADMA), ω- (NG, NG)- 대칭 디메틸 아르기닌 (SDMA) 및 ω-NG- 모노 메틸 아르기닌 (MMA)2입니다.
PRMT는 S- 아데노 실 -l- 메티오닌을 사용하여 메틸기를 단백질 결합 아르기닌1의 말단 구아니디노 그룹 (두 개의 동등한 아미노기 포함)으로 전달합니다. 두 가지 주요 효소를 구별 할 수 있습니다 : 유형 I 및 유형 II 효소는 MMA를 형성하기 위해 첫 번째 메틸화 단계를 촉매합니다 (따라서 대칭을 잃습니다). 이 단계에 따라 I형 효소(예: PRMT1, 2, 3, 4, 6, 8)는 MMA를 기질로 사용하여 ADMA를 형성하는 반면, II형 효소(주로 PRMT5 및 PRMT9)는 SDMA를 생성합니다. PRMT1은 포유동물 세포3으로부터 단리된 최초의 단백질 아르기닌 메틸트랜스퍼라제였다. 그럼에도 불구하고 PRMT는 비포유류 척추동물, 무척추동물 척색동물, 극피동물, 절지동물, 선충류자포동물5, 식물6 및 효모7과 같은 균류를 포함한 원생동물과 같은 다른 동물에서 진화적으로 보존되었습니다.4 많은 경우, PRMT 중 하나의 녹아웃은 생존력 상실로 이어져 전사, 번역, 신호 전달, 세포 사멸 및 액체-액체 상 분리 (막이없는 세포 기관의 형성을 의미 함)와 같은 기본적인 세포 과정에 관여하는 메틸화 아르기닌 종의 필수적인 역할을 밝혀냅니다. . 차례로, 이것은 암 11,12,13, 다발성 골수종 14, 심혈관 질환 15, 바이러스 병인, 척수성 근위축증16, 당뇨병 17, 및 노화1을 포함하는 생리학 및 질병 상태에 영향을 미칩니다. 혈류 내의 증가된 ADMA 수준, 예를 들어, 단백질 분해로 인한 폐(18)로부터 유래된 것은 내피 기능장애, 만성 폐 질환(19) 및 심혈관 질환(20)의 다른 증후군과 관련이 있는 것으로 생각된다. PRMT의 과발현은 종양 형성을 가속화하는 것으로 밝혀졌으며 나쁜 예후와 관련이 있습니다21,22. 또한, PRMT6 및 PRMT7의 절제는 세포 노화 표현형23을 유발한다. 현저한 ADMA 및 PRMT1 감소는 WI-38 섬유아세포의 노화 동안 발견되었다24.
문제는 (patho) 생리적 과정에서 메틸화가 어떻게 작용하는지 이해하는 것이 단백질 아르기닌 메틸화를 식별하고 정량화하는 것입니다. 현재 접근법의 대부분은 항체를 사용하여 메틸화 된 아르기닌을 검출합니다. 그러나, 이들 항체는 여전히 문맥-특이적이고, 아르기닌 메틸화 단백질25,26의 상이한 모티프를 인식하지 못할 수 있다. 설명된 프로토콜에서, 전술한 모든 아르기닌 유도체는 핵자기 공명(NMR) 분광법, 즉 단독으로, 조합하여, 또는 대부분의 경우에서와 같이, 진핵 세포(예를 들어, 효모, 마우스, 또는 인간 기원으로부터) 및 조직(27) 및 혈청(28)과 같은 복잡한 생물학적 매트릭스 내에서 신뢰성 있게 정량화될 수 있다. 단백질 및 이러한 복합 매트릭스의 경우, 단백질 가수분해29는 아르기닌, MMA, SDMA 및 ADMA와 같은 유리(변형된) 아미노산을 생성하기 위한 전제 조건이다. 고체상 추출(SPE)30은 관심 화합물의 농축을 가능하게 합니다. 마지막으로, 1H-NMR 분광법은 아르기닌과 아르기닌의 모든 주요 메틸 유도체의 병렬 검출을 허용합니다. NMR 분광법은 진정으로 정량적이고 재현성이 높으며 강력한 기술이라는 장점이 있습니다31,32. 최종 NMR 측정은 나중에 많은 샘플이 수집되고 준비되면 수행할 수 있습니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 자체 NMR 분광기가 필요하지 않기 때문에 주로 샘플 준비에 중점을 둡니다. 대부분의 생화학 실험실에서 수행 할 수 있습니다. 그러나 NMR 분광법 측정을 수행해야 하는 몇 가지 힌트가 이 작업에서 제공됩니다.
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Protocol
효모 단백질 가수분해물을 본 연구의 대표적인 결과를 위한 샘플로 사용하였다. 전체 프로토콜은 그림 1에 요약되어 있습니다.
1. 재료 및 시약의 제조
- 메탄올 / 물 : 99 % 메탄올 (MeOH) 2 부분과 MeOH / H2O로 지정된 H 2 O 1 부분의 혼합물을 준비합니다. 알코올 증발을 최소화하고 샘플 안정성을 높이기 위해 -20 ° C에서 순수한 MeOH 및 MeOH / H2O를 보관하십시오.
- 염산 (HCl) : 농축 HCl (12.0 mol / L 또는 37 %)과 0.1 mol / L의 HCl에서 9 mol / L를 희석하십시오. 고농축(9mol/L) 용액은 단백질 가수분해에 사용되는 반면 저농축(0.1mol/L) 용액은 고상 추출에 사용됩니다.
주의 : 흄 후드 내부에서 작업하십시오. - 포화 암모니아 용액 10%(재고: 암모니아 30% w/w), 메탄올 50% 및 물 40%(v/v)를 포함하는 SPE용 교체 용액을 준비합니다.
- NMR 완충액: 5.56g의 인산이나트륨(Na2HPO4, 0.08mol/L), 0.4g의 3-(트리메틸실릴)프로피온산-2,2,3,3-d4 나트륨염(TSP, 5mmol/L), 0.04%(w/v)의 아지드화나트륨(NaN3)을 이산화중수소(D2O) 500mL에 용해시키고 pH 7.4로 조정합니다(HCl 또는 NaOH, 각각)(재료 표 참조). 각각의 새로운 완충액 배치의 순도를 NMR 분광법으로 확인하였다.
알림: 오염 물질 (예 : 에탄올)의 양은 가능한 한 적어야합니다. - 펄프화 튜브를 산화 지르코늄 비드로 채웁니다(2mL 튜브 및 1.4mm 비드는 대부분의 응용 분야에 적합하지만 다양한 변형 가능)( 재료 표 참조). 손으로 약 10-20개의 구슬을 채우거나 미리 채워진 튜브를 구입하십시오.
- 피펫과 각 팁을 10-1,000 μL 범위로 준비하십시오.
참고 : ≥18.2 MΩ · cm-1의 높은 저항으로 정의 된 H2O로 지정된 고순도의 물이 작업 전반에 걸쳐 사용되었습니다. 이중 증류수에 해당합니다.
2. 샘플 수집 및 보관
- 액체 샘플(혈청/혈장, 세포 배양 상청액 등)을 액체 질소로 급속 동결하고 사용 전까지 -80°C에서 보관합니다.
- 아래에 언급 된대로 고체 재료를 준비하십시오.
- 부착 세포를 수집하거나, 차가운 인산염 완충 식염수로 세척하거나, 스크래핑 및 원심 분리하거나, 현탁액에서 성장한 세포를 직접 원심 분리하여 세포 배양 (3-5 백만 세포)에서 세포를 수집합니다.
- 세포 상청액을 제거한 다음(추가 분석을 위해 수집될 수 있음, 연속 직접 측정, 6단계 참조 또는 가용성 단백질 침전 후 단계 3.1 참조) 펠릿을 액체 질소로 급속 동결하고 -80°C에서 저장합니다. 추가 처리는 3.2단계를 참조하십시오.
- 연구 목적에 따라 조직을 저장하고 수집하십시오. 간이나 근육과 같은 매우 균질 한 조직의 경우 그 일부를 분석하십시오. 예를 들어, 마우스 뇌의 경우, 전체 뇌 또는 뇌 절편의 글로벌 아르기닌 메틸화를 결정한다.
알림: 처리 할 조직의 이상적인 무게는 30-60mg입니다. 뇌 전체를 동결시키고 분쇄하여 분취량을 사용하는 것이 좋습니다. 대안적으로, 특정 뇌 부분(예를 들어, 전두엽, 소뇌, 후두 부위 또는 ~250mg의 한 반구)이 사용될 수 있다.
3. 예비 샘플 준비
알림: MeOH를 차갑게 유지하면서 얼음 위에서 작업을 수행하십시오. 또한 단백질 분해를 방지하기 위해 샘플을 얼음 위에 보관해야 합니다.
- 액체 샘플의 경우 샘플 200μL에 얼음처럼 차가운 메탄올 400μL를 추가합니다. 3.3단계를 계속하십시오.
알림: 사용 가능한 샘플이 적으면 그에 따라 볼륨을 조정하십시오. NMR 감도는 일반적으로 더 적은 양의 샘플에 대해 충분히 높지만 개별적으로 테스트해야 합니다. - 고체 물질의 경우 용해물을 위한 충분한 1.5mL 튜브를 준비합니다(균질화 후 원심분리에 사용).
- 조심스럽게, 그러나 철저하게, 600 μL의 MeOH / H2O에 세포 펠릿을 재현탁시키고 전체 액상을 펄프 화 튜브로 옮깁니다.
- 조직을 펄프화 튜브에 넣고(튜브에 직접 무게를 잴 수 있음) 600μL의 MeOH/H2O를 추가합니다(30-60mg의 경우, 무게가 크게 다른 경우 조정).
- 튜브를 조직 균질화기( 재료 표 참조)에 넣고 심하게 흔들어 20초 동안 한 번(세포 펠릿, 연조직의 경우) 또는 그 사이에 5분 간격으로 각각 20초 동안 두 번(또는 필요한 경우 더 길게) 균질화합니다(뻣뻣한 조직의 경우).
- 균질화 후 즉시 샘플을 얼음에 다시 넣고 전체 용해물을 새로운 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
- 추가 처리 전에 -20 ° C에서 최소 30 분 (최대 며칠) 동안 샘플을 보관하십시오.
- 10,000 x g 에서 4 °C에서 30 분 동안 원심 분리합니다. 그 동안 상청액을 수집하기에 충분한 1.5mL 튜브를 준비하십시오.
참고: 이 상청액(그림 1에서 "( 1)"로 지정됨)은 폐기, 동결건조 및 NMR을 위해 직접 처리되거나(6단계) 달리 분석될 수 있습니다. - 이 프로토콜에서 MeOH 침전물 (= 각각 3.1 단계 또는 3.2.2 단계 이후에 얻은 펠릿)은 핵산 및 지질, 아르기닌 메틸화 단백질과 같은 성분을 포함하는 추가 분석에 사용됩니다. 단백질 가수 분해를 계속하거나 펠릿을 -20 ° C에서 며칠 동안 보관하십시오.
4. 단백질 가수 분해
- 각 샘플에 9 mol/L의 HCl 500 μL를 추가합니다. 그런 다음 가위로 각 튜브의 캡을 자르고 유리 배양 튜브에 넣습니다(그림 2A). 조심스럽게, 그러나 단단히 빨간 뚜껑을 닫으십시오 (따라서 밀봉을 점검하십시오).
알림: 사용하기 전에 항상 각 씰링(빨간색 나사 캡 내부의 회색 PTFE 호일)이 제대로 조여졌는지 확인하고 정기적으로 물로 청소하십시오. - 완료되면 튜브를 모래로 부분적으로 채워진 비커에 넣고 (더 나은 열 전달을 위해) 건조실에서 110 ° C에서 약 16 시간 동안 샘플을 가수 분해합니다.
- 가수 분해 후 샘플을 냉각시킵니다 (~ 1 시간).
- 그 후, 고진공 (100Pa 이하)의 원심 분리기를 사용하여 밤새 동결 건조한다.
- 펠릿을 완전히 건조되면 (그렇지 않은 경우 동결 건조 계속) 1mL의 0.1 mol / L HCl에 녹이고 각 튜브에 50 μL의 클로로포름 (CHCl3)을 첨가합니다. 펠릿을 1,000 μL 피펫으로 완전히 용해시켜 액체를 혼합 한 다음 전체 부피를 새 튜브로 옮깁니다.
주의 : 광범위한 증발을 최소화하기 위해 항상 소량으로 작업하십시오. - 그런 다음 실온에서 10분 동안 8,000 x g 에서 원심분리합니다.
- 수용성 분획 (그림 2B, 밀도가 낮은 분획)을 포함하는 이상성 액체의 상부 단계를 피펫으로 조심스럽게 수집하고 새 튜브에 채 웁니다. 수동 SPE(섹션 5.2)의 경우 1.5mL 튜브를 사용하거나 로봇 SPE의 경우 유리 바이알(섹션 5.3 및 그림 2D)을 사용하십시오. CHCl3 및 그 내용물에 유출되지 않도록 합니다(그림 2C).
5. 고체상 추출 (SPE)
- 처음 사용하기 전에 1mL의 교체 용액으로 SPE 카트리지를 두 번 청소한 다음(1.3단계) 실온에서 800 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다(15mL 튜브에 넣음). 그들은 각각 10-20 번 사용할 수 있습니다.
- 수동 SPE
- 매번 1mL의 순수 메탄올과 2 x 1mL의 PBS로 카트리지( 재료 표 참조)를 사전 조정한 다음 실온에서 1분 동안 800 x g 에서 원심분리합니다(15mL 튜브에 넣음).
- 그런 다음 샘플(4.7단계)을 SPE 카트리지에 로드하고 실온에서 600 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다.
- 그런 다음 아래에 언급된 대로 세탁 주기를 적용하십시오.
- 1 mL의H2O를 3회 첨가한다(각각 실온에서 800 x g 에서 1분 동안 원심분리).
- 0.1 mol / L HCl 1 mL를 5 회 첨가 (각각 실온에서 800 x g 에서 1 분 동안 원심 분리).
- 1mL의 MeOH를 2회 첨가한다(각각 실온에서 800 x g 에서 1분 동안 원심분리).
- 그런 다음 아르기닌과 그 유도체를 3 x 1mL의 대체 용액으로 용출합니다(이어서 실온에서 800 x g 에서 1분 원심분리).
알림: 교체 용액은 아르기닌 및 유도체의 용리액 역할을 하며 카트리지 세척에도 사용됩니다(모든 물질은 용출 전 또는 교체 용액의 기본 pH 값에서 세척됨). 그러나 시간이 지남에 따라 오염을 방지하려면 재사용을 제한해야합니다 (5.1 단계 참조).
- 로봇 SPE
참고: 여기에서 피펫팅 로봇(피펫팅 바늘, 바늘용 세척 스테이션, 시약 공급, 샘플 및 용리액 위치로 구성된 주요 부품, 재료 표 참조)에는 SPE 컬럼용 카트리지 홀더가 제공됩니다. 다른 악기의 경우 나열된 모든 것을 완벽하게 갖추고 있는지 확인하십시오.- PTFE 밀봉 (그림 2D)을 사용하여 상청액 (4.7 단계)을 유리 바이알에 직접 채우고 충분한 시약 (각각 100mL, 즉 대체 용액, 99 %의 MeOH, PBS, H 2 O 및 0.1 mol / L HCl), 용출을위한 5mL 튜브 및 로봇 바늘 용 세척 용액 (일반적으로 H2O).
- 수동 SPE에 대해 설명된 단계를 정확하게 기반으로 로봇의 소프트웨어에서 응용 프로그램 또는 방법을 사용합니다(단계 5.2).
알림: 세부 사항은 기기 공급업체마다 크게 다를 수 있으므로 프로그래밍은 해당 로봇의 소프트웨어 설명서를 참조하십시오. 피펫팅 로봇은 일반적으로 원심분리 대신 카트리지에 공기 압력을 가하여 작동하며, 이것이 주요 차이점입니다. 프로토콜이 설정되고 처음으로 실행되는 경우 최적의 작업 흐름을 확인하기 위해 대조군(예: 알려진 농도의 L-아르기닌)을 포함합니다.
6. NMR의 최종 준비
- 암모니아와 H2O를 제거하기 위해 건조를 완료하기 위해 밤새 샘플을 동결 건조시킵니다.
- 각 샘플을 500μL의 NMR 완충액에 용해시키고(단계 1.4) NMR 튜브로 옮깁니다. 중요한 것은 부피가 모든 튜브에서 동일해야 하며 샘플이 균질해야 한다는 것입니다(응집되는 경향이 있는 잔류물과 지질이 없음).
참고 : NMR 분광법의 세부 사항은이 방법 검토를 넘어서서 다른 곳에서 더 자세히 설명됩니다27. 여기에서는 주요 요구 사항과 단계 만 설명합니다. 아르기닌과 그 대사 산물의 정량화는 600MHz NMR 분광계에서 수행됩니다 ( 재료 표 참조). 원칙적으로 아르기닌과 메틸화 아르기닌의 NMR 신호가 신호 중첩 없이 충분한 감도로 검출될 수 있는 경우 다른 NMR 분광계/NMR 전계 강도를 사용할 수 있습니다. 펄스 시퀀스가 그에 따라 설정되는 경우 1H-스펙트럼을 기록할 수 있는 z축 그래디언트를 가진 모든 프로브 헤드를 사용할 수 있습니다. - CPMG(카-퍼셀-메이붐-길) 펄스 시퀀스33,34(cpmgpr1d, 512 스캔, 600MHz NMR에서 fid 73728, 11904.76Hz 스펙트럼 폭의 크기, 재활용 지연 4초)를 사용하여 물 신호 억제를 사용하여 1D 스펙트럼을 기록합니다.
- 이 실험에서는 가상 디커플링으로 1H스칼라 커플링을 제거하여 신호 중첩을 줄입니다. 특정 질문 및/또는 복잡한 샘플 또는 매트릭스(예: 1H-13C-헤테로핵 단일 양자 일관성(HSQC) 스펙트럼27)에 대해 추가로 기록합니다.
참고: 메틸화 아르기닌의 1H NMR 신호가 다른 대사체(예: 라이신)의 1H NMR 신호와 부분적으로 겹칠 수 있는 보다 복잡한 매트릭스의 경우 1H호모 핵 J-분해 스펙트럼(JRES)35이 필요합니다. - 알려진 농도(예: 100μmol/아르기닌)의 표준물질의 각 피크 강도를 통합하여 절대 정량화를 수행합니다.
참고: 일반적으로 ADMA, SDMA 및 MMA( 재료 표 참조)는 아르기닌에 대한 비율로 보고됩니다. 이는 별도의 정규화(예를 들어, 세포 수, 조직 질량, 단백질 농도)가 수행될 필요가 없다는 상당한 이점을 갖는다. 이 경우 아르기닌은 내부 표준으로 사용되며 상대적 정량화는 생물학적으로 관련된 정보를 얻기에 충분합니다. - SDMA 및 MMA의 분화를 위해, 샘플을 다시 동결건조하여D2O(이전에 NMR 완충액에 재현탁된 경우)를 제거한 다음, 중수소화 디메틸설폭사이드(d6-DMSO)로 대체하여 메틸 공명27의 분해능을 가능하게 합니다. 따라서 파스퇴르 피펫으로 NMR 튜브에서 샘플을 흡입하고 동결 건조하여 500μL의 d 6-DMSO에 용해시킵니다.
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Representative Results
일상적으로, 2D J-분해능(JRES), 사실상 분리된 NMR 스펙트럼의 1H 1D투영이 당사 실험실(36)에서 피크 할당 및 정량화를 위해 사용된다. 도 3은 본 SPE 프로토콜을 사용하여 정제된 효모 단백질 가수분해물의 대표적인 JRES 스펙트럼을 나타낸다. 농도는 매우 다르지만 두 물질은 세포 매트릭스에서 분리되고 정량화 될 수 있습니다. 각각의 화학적 이동에서 특정 메틸 (-CH3) 또는 메틸렌 (-CH2-) 그룹의 양성자 수를 기준으로 1H-NMR 분광법은 정확한 정량화를 허용합니다. 프로토콜(단계 0)에서 지적한 바와 같이, 아르기닌과 비교한 메틸-아르기닌 유도체의 상대적 정량화는 주로 생물학적 과정, 예를 들어 유전자의 녹다운/과발현, 영양소의 변화 또는 억제제 처리와 같은 조절에 대한 반응으로서 아르기닌 메틸화의 변화를 관찰하는 데 적합합니다.
앞서도 27에 나타낸 바와 같이, L-아르기닌 및 ADMA는 각각 3.25 및 3.02 ppm에서 이들의 상이한 특징적인 화학적 이동에 의해 잘 구별될 수 있다. SDMA 및 MMA 메틸 양성자는 2.85ppm의 화학적 이동에서D2O(1.4단계에서 설명한 NMR 버퍼)에서 중첩 피크를 나타냅니다. 각각의 위치에 피크가 존재하는 경우, 프로토콜의 6.6단계에서 설명한 대로 샘플을 d 6-DMSO에 용해시켜 SDMA와 MMA를 분리할 수 있습니다. 이 접근법을 사용하면 SDMA와 MMA의 1HNMR 화학적 이동을 분리하고 2.76ppm(SDMA) 및 2.74ppm(MMA)27의 특징적인 화학적 이동으로 정량화할 수 있습니다. 그림 3B는 각각D2O 및 d6-DMSO에서 SDMA 및 MMA(둘 다 100μmol/L)의 대표 데이터를 보여줍니다. 다양한 세포 및 조직에서 검출된 SMDA 및 MMA의 상응하는 데이터가 최근보고되었다 27. 프로토콜의 단계 6.4 내지 6.5에 기재된 바와 같이, 알려진 농도의 참조 표준이 정량화를 위해 사용될 수 있다. 본문에 언급된 모든 참조 표준은 상업적으로 이용 가능합니다.
그림 1: 샘플 준비 개요. 샘플 수집에서 NMR 측정까지의 중요한 단계를 나타내는 계획. 블랙 박스는 프로토콜 섹션의 번호 매기기를 나타냅니다. 또한 대략적인 일 수(샘플 수에 따라 다름)가 표시됩니다. 잔류물을 제거하기 위해 MeOH를 첨가하기 전에 불균일한 액체 샘플을 원심분리하여(단계 3.1) 수 있습니다(도시되지 않음). 초기 원심분리 후 상청액(1), 예를 들어 세포내 대사산물 또는 비-단백질 결합된 아르기닌 대사산물을 함유하는 상청액은 추가 분석을 위해 -20°C에서 저장될 수 있다. 일상적으로, MeOH 펠릿 (2)이 추가로 분석된다. 약어 : CHCl3, 클로로포름; HCl, 염산; 메오, 메탄올; NMR, 핵 자기 공명; O/N, 하룻밤; SN, 상청액; SPE, 고체상 추출. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 단백질 가수분해물의 취급 및 고체상 추출을 위한 준비. (A) 모래로 채워진 비커, 유리관, 회색 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 밀봉 호일이있는 스크류 캡 및 캡을 절단 한 후 1.5mL 튜브에 샘플을 넣습니다. (B) 원심분리 후 튜브 (단계 4.6) 및 (C) 수성 상청액 제거 후 (단계 4.7) : 일부 잔류 물 (~ 50 μL)이 남아있을 수 있습니다. 검은 잔류 물에는 불용성 숯으로 된 유기 잔류 물이 포함되어 있습니다. 그러나 일부 샘플에는 L- 아르기닌 측정을 방해하지 않는 착색 물질 (D)이 포함될 수 있습니다. 이는 부분적으로 연속 원심분리 단계(E) 또는 피펫팅 로봇(F)을 사용한 고체상 추출(SPE) 때문입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: L-아르기닌 및 그 메틸 유도체의 일반적인 NMR 스펙트럼. 1 H 1D 투영 J- 분해 NMR 스펙트럼은 L- 아르기닌 (3.25 ppm)의 δ- (CH2) - 양성자와 비대칭 디메틸 아르기닌 (ADMA, 3.02 ppm)의 ω-N-CH3- 양성자를 쉽게 구별 할 수 있었다. 다양한 양의 ADMA를 나타내는 효모 펠릿 (A)의 샘플은 다량의 아르기닌이있는 경우에도 신호 강도를 통합하여 정량화 할 수 있습니다 (전체 아르기닌 피크는 표시되지 않음). (b) ω-(NG,N'G)-대칭 디메틸아르기닌(SDMA)과 ω-NG-모노메틸아르기닌(MMA)은 산화중수소 완충액(D2O)에서 거의 구별할 수 없기 때문에 샘플은 중수소화 디메틸설폭사이드(d6-DMSO)에 용해되어야 하며, 여기서 피크(이 경우 각 물질의 100μmol/L)는 서로 쉽게 구별할 수 있습니다(피크 2.75 및 2.76ppm, 각각) 및 정량화될 수 있다. 모든 스펙트로그램은 NMR 분광기의 제어 소프트웨어에서 직접 내보냈습니다. 소프트웨어는 많은 샘플의 통계를 포함하여보다 자세한 분석이 수행되기 전에 확인해야하는 기본 결과를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
다음 섹션에서는 메서드 자체에 중점을 둡니다. 아르기닌 메틸화의 생물학적 의미는 소개 섹션에 설명되어 있습니다.
첫째, 다른 강성의 조직은 샘플 용해의 조정이 필요할 수 있습니다 : 세포 배양 (박테리아, 효모 등 포함)의 세포와 뇌, 젊은 간, 평활근 등과 같은 조직은 신속하게 균질화 될 수 있습니다. 높은 강성 조직 (노인 피험자의 간, 동맥, 뼈 등 포함)의 경우 균질화를 두 번 수행해야합니다 (3.2.3 단계 참조). 그럼에도 불구하고,이 과정은 일부 불용성 잔류 물이 남아 있더라도 더 자주 계속되어서는 안됩니다. 대신, 샘플을 10,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 추가 분석을 위해 상청액을 수집해야 합니다(샘플 분해를 최소화하기 위해).
샘플이 동결되는 각 단계(초기에는 MeOH를 첨가한 후, 각각 3.3, 3.4 또는 3.5단계) 또는 동결건조 후(단계 4.4 및 6.1), 샘플은 추가 처리 전에 며칠 동안 저장될 수 있다. 추가적으로, 단계 3.4로부터의 상청액(균질화 후; 도 1에서 "(1)"로 지정됨)은 또한 추가 분석을 위해, 예를 들어 메틸-아르기닌36,37,38 이외의 대사산물의 측정을 위해 저장될 수 있다.
한편으로, 중요한 단계에는 단백질의 분해가 결과를 바꿀 수 있기 때문에 샘플 보관이 포함됩니다. MeOH 침전 전에 단백질 분해가 발생하면 아르기닌과 그 메틸 유도체가 과소 평가 될 수 있습니다. 따라서, 샘플을 저장하는 것은 필수적이며, 예를 들어, -20°C에서 세포 또는 조직 용해 전후, 또는 가능할 때마다 -80°C에서 저장된다. 균질화 전후에 (3.2 단계), 샘플은 얼음 위에 보관해야합니다.
반면에, 단백질을 침전시키기 위한 샘플의 메탄올 전처리는 아르기닌의 메틸화 패턴을 변화시키지 않는다. 이것은 리소자임 및 대장균 단백질 추출물(메틸화 아르기닌을 포함하지 않음)27로 테스트되었습니다. 그러나 이전 보고서에 따르면 MeOH는 글루타메이트와 아스 파르 테이트39의 말단 카르복실기를 메틸화 할 수 있습니다.
단백질 가수 분해의 경우 스크류 캡의 밀봉이 손상되지 않았는지 확인하십시오 (4.1 단계). 그렇지 않은 경우 HCl을 증발시켜 건조실에 영향을 줄 수 있습니다. 그러나 분석물의 농도는 증발하지 않고 잔류 HCl이 나중에 동결건조에 의해 증발되기 때문에 결정적으로 변하지 않을 수 있습니다. 더 낮은 농도의 HCl(예: 6mol/L)을 사용할 수 있지만 더 긴 가수분해 시간이 필요할 수 있습니다. 가수 분해 후 샘플을 실온에서 처리 할 수 있습니다. 그러나 지질의 적절한 제거는 필수적입니다. 지질은 나중에 NMR 측정 동안 물 (또는 각각D2O)에서 이상성 혼합물을 형성할 수 있다. 이러한 비균질성은 NMR 피크 확장으로 이어지고 잠재적으로 NMR 실험의 품질과 감도에 영향을 미칩니다.
SPE에 사용할 수 있는 피펫팅 로봇이 없는 경우 투자할 가치가 있습니다(다른 용도로도 사용할 수 있음). SPE 피펫팅 로봇의 샘플은 순차적으로 처리되며, 현재 설정에서는 하나의 샘플이 완전한 실행을 위해 ~40분이 걸립니다. 시약 용량(즉, 100mL)의 한계로 인해 한 번에 19개의 샘플만 처리할 수 있습니다(전체적으로 ~13시간 소요). 그러나 수동 SPE 절차보다 실습 시간이 훨씬 짧고 재료가 덜 필요합니다. 이 기간 동안 샘플은 동결 건조될 때까지 실온에서 로봇 내에 저장될 수 있습니다. 동등한 제품이 사용된 SPE 매트릭스 및 카트리지를 대체할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 SPE 프로토콜을 평가하고 필요한 경우 조정하는 것이 좋습니다.
ADMA의 검출 한계는 이전에 연속 희석 및보고 된 NMR 측정 시간을 사용하여 평가 한 ~ 100 nmol / L입니다. 반면에 높은 아르기닌 농도는 ADMA와 아르기닌의 비율을 과대 평가할 수도 있습니다 (일반적으로 5 % -15 % 범위). 이것은 3 mmol / L 이상의 아르기닌 때문입니다. SPE 컬럼 결합 용량은 포화27에 도달할 수 있습니다. 예상치 못한 결과(예: 보고된 화학적 이동에서 1H-NMR 스펙트럼에서 피크 또는 중첩 피크가 없음)가 발생할 경우 전체 워크플로우의 민감도 및 특이성을 확인하기 위해 ADMA, SDMA 및 MMA 표준을 상용 공급업체에서 구할 수 있습니다(재료 표 참조). 실험실에 NMR 분광계가 없는 경우 최종 동결건조(6.1단계)를 포함한 모든 단계를 해당 실험실에서 수행할 수 있으며 샘플을 분석을 위해 NMR 시설로 배송할 수 있습니다.
질량 분석법과 같은 다른 방법과 비교하여 분석물의 라벨링이 필요하지 않으며 정량화를 위한 내부 표준 없이 수행할 수 있습니다. 반면에 NMR의 민감도는 약간 낮으며, 대부분의 생물학적 경우 아르기닌 및 그 메틸 유도체와 같은 역할은 없지만 모든 종류의 진핵 세포 또는 조직에서 쉽게 검출 할 수 있습니다. 앞서 언급했듯이 300만 개의 세포는 대부분의 세포주에서 쉽게 달성할 수 있는 여러 세포인 단백질 결합 ADMA를 정량화하기에 충분합니다. 성체 줄기 세포(40)와 같이 인간 기원으로부터 천천히 성장하고, 변형되지 않은 일차 세포의 경우, 세포는 더 연장된 기간 동안 성장하거나 별도의 실험으로부터 풀링될 수 있다. 조직 샘플도 마찬가지입니다. 많은 장기, 예를 들어 마우스(예를 들어, 작은 근육과 같은 일부 또는 전체) 또는 생검 표본에 해당하는 ~30mg의 조직은 NMR 측정을 위한 충분한 용해물 및 단백질 가수분해물을 준비하기에 충분합니다27. 단백질 아르기닌 메틸화를 측정하는 다른 방법은 효소 결합 발광 분석41 또는 3H- 표지 된 S- 아데노 실 - 메티오닌 (SAM) 42를 사용하는 것을 포함한다. 감도가 높고 14C표지 SAM을 사용하면 증가할 수 있지만 비용이 증가합니다. 또한 방사성 물질 (섬광 계수를위한 유체 포함)을 사용하면 특수 폐기물 관리가 발생하며 이는 현재 프로토콜을 사용하여 필요하지 않습니다.
2D 이종핵 NMR 분광법을 사용하는 본 프로토콜에 대한 보완적인 방법은 분리된 단백질 내에서 부위 특이적 메틸화 패턴을 나타낼 수 있습니다. 일반적으로 NMR 분광법에 의한 메틸 아르기닌의 검출에 대한 상세한 설명을 포함하여 최근43에 발표되었다. 현재 프로토콜은 단백질 내 부위 특이적 아르기닌 메틸화에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 그럼에도 불구하고 세포 성장 및 분화, 노화, 암 1,2,12, 심혈관20 및 신경 퇴행성 질환 8,44를 포함한 세포 및 생리 학적 수준에서 글로벌 메틸화가 변화합니다. 관련된 정확한 메커니즘에 대한 세부 사항은 아직 완전히 이해되지 않았으며 시험관 내 및 생체 내 모두에서 단백질-아르기닌 메틸화11을 방해하는 가능한 약물 후보는 추가 탐색이필요합니다1. 메틸화의 동역학(우리 그룹이 최근에 보여준)27을 연구하는 것은 아르기닌 변형 및 단백질 분해 메커니즘에 대한 통찰력을 얻는 데 필수적입니다. 단일 단백질에서 전체 유기체의 샘플에 이르는 글로벌 아르기닌 메틸화 측정 및 동역학 실험(샘플은 언제든지 동결 가능)을 이 프로토콜을 사용하여 간단하게 수행할 수 있습니다. 따라서 향후 연구에 쉽게 적용 할 수있는 강력한 방법을 제공합니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 오스트리아 과학 기금 (FWF) 보조금 P28854, I3792, doc.funds BioMolStruct DOC 130, DK-MCD W1226 BioTechMed-Graz (주력 프로젝트 DYNIMO), 오스트리아 연구 진흥 기관 (FFG) 보조금 864690 및 870454, 통합 대사 연구 센터 그라츠; 오스트리아 인프라 프로그램 2016/2017, 스티 리아 정부 (Zukunftsfonds) 및 복건 의과 대학의 고급 인재를위한 스타트 업 펀드 (XRCZX2021020). 세포 배양 시설에 대한 접근을 위해 의료 연구 센터에 감사드립니다. F.Z.는 그라츠 의과 대학의 분자 의학 박사 프로그램 프레임 내에서 교육을 받았습니다. Q.Z.는 그라츠 의과 대학의 대사 및 심혈관 질환 박사 프로그램의 틀 내에서 교육을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | Greiner Bio One | 188271 | |
| 3-(trimethylsilyl) propionic acid-2,2,3,3-d4 sodium salt (TSP) | Alfa Aesar | A1448 | |
| 5 mL tubes, round bottom | Greiner Bio One | 115101 | |
| Ammonia Solution 32% | Roth | A990.1 | |
| Bruker 600 MHz NMR spectrometer, equipped with a TXI probe head | Bruker | - | |
| Centrifuge, refrigerated, e.g. 5430 R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chloroform ≥99% p.a. | Roth | 3313.1 | |
| Cryocool | Thermo Scientific | SCC1 | heat transfer fluid for SpeedVac System |
| Deuterium Oxide (D2O) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-10-PK | |
| Dimethyl sulfoxide-d6 (d6-DMSO) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-6-1000 | |
| Drying Chamber | Binder | 9090-0018 | |
| DURAN culture tubes, 13 x 100mm, GL 14, 9 mL | VWR International | 212-0375 | |
| Edwards Deep vacuum oil pump RV5 | Thermo Scientific | 16234611 | part of the SpeedVac System |
| Eppendorf 1.5 mL tubes | Greiner Bio One | 616201 | |
| Gilson pipetting robot GX-241 Aspec | Gilson Inc. | 26150008 | |
| L-arginine | AppliChem | A3675 | |
| Methanol ≥99% | Roth | 8388.4 | |
| Milli-Q water aparatus | Millipore | ZIQ7000T0 | |
| Oasis MCX 1cc/30 mg, 1 mL cartridges | Waters | 186000252 | https://www.waters.com/waters/en_US/Waters-Oasis-Sample-Extraction-SPE-Products/ |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | LONBE17-512F | |
| Precellys 24 tissue homogenizer | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | https://www.bertin-instruments.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys24-tissue-homogenizer/ |
| Precellys tubes (pulping tubes) | VWR International | 432-0351 | |
| Precellyse 1.4 mm zirconium oxide beads | VWR International | 432-0356 | |
| Reacti-Therm/ReactiVap Heating, Stirring, and Evaporation Modules | Thermo Scientific | TS-18820 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/TS-18820 |
| Rotor for 1.5 mL tubes, FA-45-30-11 | Eppendorf | 5427753001 | |
| Savant Refrigerated Cooling Trap | Thermo Scientific | 15996161 | part of the SpeedVac System |
| Savant SpeedVac vacuum concentrator SPD210 | Thermo Scientific | 15906181 | part of the SpeedVac System; equipped with rotor for 1.5 ml tubes |
| Screw caps for glas vials with PTFE sealing, DN9 | Dr. R. Forche Chromatographie | CT11B3011 | |
| Seasand | Roth | 8441.3 | |
| Short thread glas vials 1.5 mL, ND9 | Dr. R. Forche Chromatographie | VT1100309 | |
| Sodium azide (NaN3) | Roth | K305.1 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | VWR | BDH7363-4 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | VWR | 80731-078 | |
| TopSpin 4.0 (Software) | Bruker | - | https://www.bruker.com |
| ω-NG-asymmetric dimethylarginine (ADMA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-208093 | |
| ω-NG-monomethylarginine (MMA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-200739A | |
| ω-NG-NG'-symmetric dimethylarginine (SDMA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-202235A |
References
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