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Cancer Research

Explorando o metiloma de arginina por espectroscopia de ressonância magnética nuclear

Published: December 16, 2021 doi: 10.3791/63245
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1
1Gottfried Schatz Research Center for Cell Signaling, Metabolism and Aging, Molecular Biology and Biochemistry, Medical University of Graz, 2Ministry of Education, School of Basic Medical Sciences, Key Laboratory of Gastrointestinal Cancer (Fujian Medical University)
* These authors contributed equally

Summary

O presente protocolo descreve a preparação e a medição quantitativa de arginina e metil-argininas livres e ligadas a proteínas por espectroscopia de 1RMN-H.

Abstract

A arginina ligada a proteínas é comumente metilada em muitas proteínas e regula sua função alterando as propriedades físico-químicas, sua interação com outras moléculas, incluindo outras proteínas ou ácidos nucleicos. Este trabalho apresenta um protocolo de fácil implementação para quantificação da arginina e seus derivados, incluindo dimetilarginina assimétrica e simétrica (ADMA e SDMA, respectivamente) e monometilarginina (MMA). Após o isolamento proteico de fluidos corporais biológicos, tecidos ou lisatos celulares, um método simples para homogeneização, precipitação de proteínas e hidrólise de proteínas é descrito. Como os hidrolisados contêm muitos outros componentes, como outros aminoácidos, lipídios e ácidos nucleicos, uma etapa de purificação usando a extração em fase sólida (SPE) é essencial. O SPE pode ser realizado manualmente usando centrífugas ou um robô de pipetagem. A sensibilidade para ADMA usando o protocolo atual é de cerca de 100 nmol/L. O limite superior de detecção de arginina é de 3 mmol/L devido à saturação de SPE. Em resumo, este protocolo descreve um método robusto, que abrange desde a preparação biológica da amostra até a detecção baseada em RMN, fornecendo dicas e armadilhas valiosas para o trabalho bem-sucedido ao estudar o metiloma da arginina.

Introduction

Durante as últimas duas décadas, a metilação de resíduos de arginina tem sido reconhecida como uma modificação pós-translacional essencial de proteínas. Afeta processos biológicos fundamentais, como regulação da transcrição, transdução de sinal e muitos outros1. As principais proteínas envolvidas na regulação da metilação da arginina são as proteínas argininas metiltransferases (PRMTs)2. Os principais derivados da arginina são ω-(N G,N G)-dimetilarginina assimétrica (ADMA), dimetilarginina simétrica ω-(N G,N'G)-simétrica (SDMA) e ω-N G-monometilarginina (MMA)2.

Os PRMTs usam S-adenosil-l-metionina para transferir grupos metil para o grupo guanidino terminal (com dois grupos amino equivalentes) de arginina ligada a proteínas1. Duas enzimas principais podem ser distinguidas: ambas as enzimas tipo I e tipo II catalisam a primeira etapa de metilação para formar MMA (que, assim, perde sua simetria). Após essa etapa, as enzimas do tipo I (por exemplo, PRMT1, 2, 3, 4, 6, 8) usam o MMA como substrato para formar o ADMA, enquanto as enzimas do tipo II (principalmente PRMT5 e PRMT9) produzem SDMA. A PRMT1 foi a primeira proteína arginina metiltransferase a ser isolada de células de mamíferos3. Ainda assim, os PRMTs foram conservados evolutivamente4 em outros animais, como vertebrados não mamíferos, cordados de invertebrados, equinodermos, artrópodes e nematoides cnidários5, plantas6 e protozoários, incluindo fungos como leveduras7. Em muitos casos, o knockout de um dos PRMTs leva à perda de viabilidade, revelando o papel essencial das espécies de arginina metilada envolvidas em processos celulares fundamentais como transcrição, tradução, transdução de sinal, apoptose e separação de fase líquido-líquido (o que significa a formação de organelas sem membrana, por exemplo, nucléolos), que envolve regularmente domínios ricos em arginina 8,9,10 . Por sua vez, isso influencia a fisiologia e os estados patológicos, incluindo câncer 11,12,13, mieloma múltiplo 14, doenças cardiovasculares 15, patogênese viral, atrofia muscular espinhal 16, diabetes mellitus 17 e envelhecimento1. Acredita-se que o aumento dos níveis de ADMA na corrente sanguínea, por exemplo, derivado do pulmão18 devido à quebra de proteínas, esteja relacionado à disfunção endotelial, doença pulmonar crônica19 e outras síndromes de doença cardiovascular20. Verificou-se que a superexpressão de PRMTs acelera a tumorigênese e está associada a um prognóstico desfavorável21,22. Além disso, a ablação de PRMT6 e PRMT7 desencadeia um fenótipo de senescência celular23. Diminuição significativa da ADMA e PRMT1 foram encontradas durante o envelhecimento dos fibroblastos WI-3824.

O desafio é entender como a metilação atua nos processos fisiopatológicos é identificar e quantificar a metilação da arginina proteica. A maioria das abordagens atuais usa anticorpos para detectar argininas metiladas. No entanto, esses anticorpos ainda são específicos do contexto e podem não reconhecer diferentes motivos de proteínas metiladas de arginina25,26. No protocolo descrito, todos os derivados de arginina mencionados anteriormente podem ser quantificados de forma confiável por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN), ou seja, isoladamente, em combinação ou, como na maioria dos casos, dentro de matrizes biológicas complexas como células eucarióticas (por exemplo, de levedura, camundongo ou origem humana) e tecidos27, bem como soro28. Para proteínas e matrizes complexas, a hidrólisede proteínas 29 é um pré-requisito para gerar aminoácidos livres (modificados), como arginina, MMA, SDMA e ADMA. A extração em fase sólida (SPE)30 possibilita o enriquecimento dos compostos de interesse. Finalmente, 1espectroscopia de RMN-H permite a detecção paralela de arginina e todos os principais derivados metílicos da arginina. A espectroscopia de RMN traz a vantagem de ser genuinamente quantitativa, altamente reprodutível e uma técnica robusta31,32. As medições finais de RMN podem ser feitas depois, quando muitas amostras tiverem sido coletadas e preparadas. Finalmente, este protocolo se concentra principalmente na preparação da amostra, pois isso não requer um espectrômetro de RMN próprio. Pode ser realizado na maioria dos laboratórios bioquímicos. Ainda assim, algumas dicas sobre quais medições de espectroscopia de RMN devem ser feitas são fornecidas neste trabalho.

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Protocol

Hidrolisados de proteínas de levedura foram utilizados como amostras para os resultados representativos deste trabalho. Todo o protocolo está resumido na Figura 1.

1. Preparação de materiais e reagentes

  1. Metanol/água: preparar uma mistura de duas partes de metanol a 99% (MeOH) e uma parte de H 2 O, designada como MeOH/H 2 O.Armazenar MeOH puro e MeOH/H2O a -20 °C para minimizar a evaporação do álcool e aumentar a estabilidade da amostra.
  2. Ácido clorídrico (HCl): dilui 9 mol/L a partir de HCl concentrado (12,0 mol/L ou 37%), bem como 0,1 mol/L de HCl. A solução mais concentrada (9 mol/L) é usada para hidrólise de proteínas, enquanto a solução mais concentrada (0,1 mol/L) é usada para extração em fase sólida.
    CUIDADO: Trabalhe dentro do exaustor.
  3. Preparar uma solução de substituição para SPE contendo 10% de uma solução saturada de amônia (estoque: 30% p/m de amônia), 50% de metanol e 40% de água (v/v).
  4. Tampão RMN: Dissolver 5,56 g de hidrogenofosfato dissódico (Na 2 HPO 4, 0,08 mol/L), 0,4 g de sal de sódio (TSP, 5 mmol/L) de ácido propiônico 3-(trimetilsilil) 2,2,3,3-d4 (TSP, 5 mmol/L), 0,04 % (p/v) de azida sódica (NaN3) em 500 mL de dióxido de deutério (D2O) e ajustar ao pH7,4 (usando HCl ou NaOH, respectivamente) (ver Tabela de Materiais). Verifique a pureza de cada novo lote tampão por espectroscopia de RMN.
    NOTA: A quantidade de quaisquer contaminantes (por exemplo, etanol) deve ser a mais baixa possível.
  5. Encha os tubos de polpação com esferas de óxido de zircônio (tubos de 2 mL e contas de 1,4 mm são adequados para a maioria das aplicações, mas diferentes variantes estão disponíveis) (consulte Tabela de Materiais). Encha cerca de 10-20 contas à mão ou compre tubos pré-cheios, que também estão disponíveis.
  6. Mantenha as pipetas e as respectivas pontas prontas na faixa de 10-1.000 μL.
    NOTA: Água altamente pura, designada como H 2O, definida por uma alta resistência de ≥18,2 MΩ·cm-1, foi utilizada durante todo o trabalho. Corresponde à água duplamente destilada.

2. Recolha e armazenamento de amostras

  1. Congelar rapidamente as amostras líquidas (soro/plasma, sobrenadante de cultura celular, etc.) com azoto líquido e armazená-las a -80 °C até à sua utilização.
  2. Prepare os materiais sólidos conforme mencionado abaixo.
    1. Coletar as células de culturas celulares (3-5 milhões de células), seja coletando células aderentes, após lavagem com solução salina tamponada com fosfato frio, raspagem e centrifugação, ou centrifugação direta de células cultivadas em suspensão.
    2. Remova os sobrenadantes celulares (que podem ser recolhidos para análise posterior, quer por medição directa consecutiva, ver passo 6, quer após precipitação de proteínas solúveis, ver passo 3.1) e, em seguida, congele rapidamente os pellets com azoto líquido e guarde a -80 °C. Para processamento adicional, consulte a etapa 3.2.
    3. Armazenar e recolher os tecidos de acordo com o objetivo do estudo. Para tecidos muito homogêneos, como o fígado ou o músculo, analise qualquer parte dele. Por exemplo, no caso de um cérebro de rato, determine a metilação global da arginina de todo o cérebro ou secções cerebrais.
      NOTA: O peso ideal dos tecidos a serem processados é de 30-60 mg. É aconselhável congelar e pulverizar todo o cérebro e usar alíquotas do mesmo. Alternativamente, partes específicas do cérebro (por exemplo, frontal, cerebelo, regiões occipitais ou um hemisfério, pesando ~250 mg) podem ser usadas.

3. Preparação preliminar da amostra

NOTA: Realizar o trabalho no gelo, mantendo o MeOH frio. As amostras também devem ser mantidas no gelo para evitar a degradação de proteínas.

  1. Para as amostras líquidas, adicionar 400 μL de metanol gelado a 200 μL da amostra. Continue com a etapa 3.3.
    NOTA: Se houver menos amostra disponível, ajuste os volumes de acordo; A sensibilidade à RMN geralmente é alta o suficiente para quantidades menores de amostra, mas deve ser testada individualmente.
  2. No caso de materiais sólidos, preparar tubos suficientes de 1,5 mL para os lisados (uso para centrifugação após homogeneização).
    1. Cuidadosamente, mas completamente, ressuspenda os pellets celulares em 600 μL de MeOH/H2O e transfira toda a fase líquida para os tubos de polpa.
    2. Coloque os tecidos em tubos de polpação (você pode pesá-los diretamente nos tubos) e adicione 600 μL de MeOH / H2O (para 30-60 mg; ajuste se o peso diferir substancialmente).
    3. Coloque os tubos no homogeneizador de tecido (ver Tabela de Materiais) e homogeneize uma vez por 20 s com agitação pesada (para pellets celulares, tecidos moles) ou duas vezes por 20 s cada (ou mais, se necessário) com um intervalo de 5 minutos entre eles (para tecidos rígidos).
    4. Após a homogeneização, coloque imediatamente as amostras no gelo novamente e transfira todos os lisados para novos tubos de 1,5 mL.
  3. Conservar as amostras durante, pelo menos, 30 minutos (até vários dias) a -20 °C antes de continuar a ser processado.
  4. Centrífuga a 10.000 x g durante 30 min a 4 °C. Enquanto isso, prepare tubos suficientes de 1,5 mL para coletar os sobrenadantes.
    NOTA: Esse sobrenadante (designado "(1)" na Figura 1) pode ser descartado, liofilizado e processado diretamente para RMN (etapa 6) ou analisado de outra forma.
  5. Neste protocolo, o precipitado de MeOH (= pellet obtido após as etapas 3.1 ou 3.2.2, respectivamente) é usado para análises posteriores contendo, entre outras coisas, componentes como ácidos nucleicos e lipídios, proteínas metiladas com arginina. Continue com a hidrólise de proteínas ou armazene os pellets a -20 °C durante alguns dias.

4. Hidrólise de proteínas

  1. Adicionar 500 μL de 9 mol/L de HCl a cada amostra. Em seguida, truncar as tampas de cada tubo com uma tesoura e colocá-las nos tubos de cultura de vidro (Figura 2A). Cuidadosamente, mas com força, feche as tampas vermelhas (verificando assim a vedação).
    NOTA: Antes de usar, sempre verifique cada vedação (folha de PTFE cinza dentro das tampas de rosca vermelhas) para o aperto adequado e limpe-as regularmente com água.
  2. Quando terminar, colocar os tubos num copo parcialmente cheio de areia (para uma melhor transferência de calor) e hidrolisar as amostras durante cerca de 16 h a 110 °C numa câmara de secagem.
  3. Após a hidrólise, arrefecer as amostras (~1 h).
  4. Depois disso, liofilize durante a noite usando uma centrífuga com alto vácuo (abaixo de 100 Pa).
  5. Dissolva os pellets - se completamente secos (se não, continue a liofilização) - em 1 mL de HCl 0,1 mol/L e adicione 50 μL de clorofórmio (CHCl3) a cada tubo; dissolver completamente o pellet com uma pipeta de 1.000 μL, misturando assim os líquidos e, em seguida, transferir o volume completo para um novo tubo.
    CUIDADO: Sempre trabalhe com pequenas quantidades para minimizar a evaporação extensiva
  6. Em seguida, centrifugar a 8.000 x g por 10 min à temperatura ambiente.
  7. Recolher cuidadosamente a fase superior do líquido bifásico que contém a fracção solúvel em água (Figura 2B, a fracção com a densidade inferior) com uma pipeta e enchê-la em novos tubos. Utilizar tubos de 1,5 ml para SPE manual (secção 5.2) ou frascos para injetáveis de vidro para SPE robótico (secção 5.3 e Figura 2D). Evitar transbordar sobre CHCl3 e seu conteúdo (Figura 2C).

5. Extração em fase sólida (SPE)

  1. Antes da primeira utilização, limpar os cartuchos SPE duas vezes com 1 ml da solução de substituição (passo 1.3) seguido de centrifugação a 800 x g durante 1 min à temperatura ambiente (colocados em tubos de 15 ml). Eles podem ser usados 10-20 vezes cada.
  2. Manual SPE
    1. Pré-condicione os cartuchos (ver Tabela de Materiais) em cada corrida com 1 mL de metanol puro e 2 x 1 mL de PBS, cada vez seguida de centrifugação a 800 x g por 1 min à temperatura ambiente (colocados em tubos de 15 mL).
    2. Depois disso, carregar as amostras (a partir da etapa 4.7) nos cartuchos SPE e centrifugar-as a 600 x g durante 2 min à temperatura ambiente.
    3. Em seguida, aplique um ciclo de lavagem como mencionado abaixo.
      1. Adicionar três vezes 1 mL de H2O (cada um seguido de centrifugação por 1 min a 800 x g à temperatura ambiente).
      2. Adicionar cinco vezes 1 mL de HCl 0,1 mol/L (cada um seguido de centrifugação por 1 min a 800 x g à temperatura ambiente).
      3. Adicionar duas vezes 1 mL de MeOH (cada uma seguida de centrifugação por 1 min a 800 x g à temperatura ambiente).
    4. Em seguida, eluir arginina e seus derivados com 3 x 1 mL de solução de reposição (seguida de centrifugação 1 min a 800 x g à temperatura ambiente) em um único tubo de 15 mL.
      NOTA: A solução de substituição serve como eluente para a arginina e derivados e também é utilizada para limpar os cartuchos (todas as substâncias são lavadas antes da eluição ou no valor de pH básico da solução de substituição). Ainda assim, para evitar a contaminação ao longo do tempo, a reutilização deve ser limitada (ver passo 5.1).
  3. SPE robótico
    NOTA: Aqui, um robô de pipetagem (a parte principal consiste em uma agulha de pipetagem, uma estação de lavagem para a agulha, um suprimento de reagente e posições para amostras e eluatos, consulte Tabela de Materiais) é fornecido com um suporte de cartucho para as colunas SPE. Para outros instrumentos, certifique-se de estar totalmente equipado com todas as coisas listadas.
    1. Encher o sobrenadante (a partir da etapa 4.7) diretamente em frascos de vidro com vedação de PTFE (Figura 2D), preparar reagentes suficientes (100 mL de cada, ou seja, solução de reposição, 99% de MeOH, PBS, H 2 O e 0,1 de mol/L HCl), tubos de 5 mL para eluição e solução de lavagem para a agulha do robô (geralmente H2O).
    2. Use um aplicativo ou método no software do robô com base precisamente nas etapas descritas para o SPE manual (etapa 5.2).
      NOTA: Os detalhes podem variar muito entre os fornecedores de instrumentos, por isso consulte o manual de software do respectivo robô para programação. Um robô de pipetagem geralmente funciona aplicando pressão de ar sobre os cartuchos em vez de centrifugação, que é a principal diferença. Se o protocolo for estabelecido e executado pela primeira vez, inclua controles (por exemplo, L-arginina de concentração conhecida) para verificar um fluxo de trabalho ideal.

6. Preparação final para a RMN

  1. Liofilizar amostras durante a noite para completar a secura para se livrar de amônia e H2O.
  2. Dissolver cada amostra em 500 μL de tampão RMN (passo 1.4) e transferir para tubos de RMN. É importante ressaltar que o volume deve ser o mesmo em todos os tubos, e as amostras devem ser homogêneas (livres de resíduos e lipídios, que tendem a se agregar).
    NOTA: Os detalhes da espectroscopia de RMN vão além desta revisão do método e são descritos em mais detalhes em outro lugar27. Aqui, apenas os principais requisitos e etapas são explicados. A quantificação da arginina e dos seus metabolitos é realizada num espectrómetro de RMN de 600 MHz (ver Tabela de Materiais). Em princípio, qualquer outro espectrômetro de RMN/intensidades de campo de RMN pode ser usado, desde que os sinais de RMN de arginina e argininas metiladas possam ser detectados com sensibilidade suficiente e sem sobreposição de sinal. Qualquer cabeça de sonda com gradientes de eixo z capaz de registrar 1espectros H pode ser usada, desde que as sequências de pulso sejam configuradas de acordo.
  3. Grave um espectro 1D usando a sequência de pulsos CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill)33,34 (cpmgpr1d, 512 varreduras, tamanho do fid 73728, largura espectral de 11904,76 Hz em uma RMN de 600 MHz, atraso de reciclagem 4 s) com supressão do sinal de água usando pré-saturação.
  4. Nesses experimentos, remova os acoplamentos escalares de 1H por desacoplamento virtual, reduzindo a sobreposição de sinal. Registre adicional para questões específicas e/ou amostras ou matrizes complexas, por exemplo, 1espectro H-13C-heteronuclear de coerência quântica única (HSQC)27.
    NOTA: Para matrizes mais complexas nas quais sinais de RMN 1 H de argininas metiladas podem ser parcialmente sobrepostos com sinais de RMN 1H de outros metabólitos (por exemplo, lisina), são necessários espectros J-resolved homonucleares 1H (JRES)35.
  5. Realizar quantificação absoluta integrando as respectivas intensidades de pico de padrões de uma concentração conhecida, por exemplo, 100 μmol/arginina.
    NOTA: Rotineiramente, ADMA, SDMA e MMA (ver Tabela de Materiais) são relatados como uma proporção relativa à arginina. Isso tem uma vantagem significativa de que nenhuma normalização separada (por exemplo, número de células, massa tecidual, concentrações de proteínas) precisa ser realizada. Nesse caso, a arginina serve como um padrão interno, e a quantificação relativa é suficiente para obter informações biologicamente relevantes.
  6. Para diferenciação de SDMA e MMA, liofilizar as amostras novamente para se livrar de D2O (se já tiverem sido ressuspensas em tampão RMN antes), que é então substituído por dimetilsulfóxido deuterado (d 6-DMSO), possibilitando a resolução das ressonâncias metílicas27. Portanto, aspirar as amostras dos tubos de RMN com pipetas de Pasteur, liofilizar e dissolvê-las em 500 μL de d6-DMSO.

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Representative Results

Rotineiramente, projeções 1H 1D de espectros de RMN 2D J-resolvidos (JRES), virtualmente desacoplados, são usadas para atribuições e quantificações de pico em nosso laboratório36. A Figura 3 mostra espectros JRES representativos de hidrolisados de proteínas de levedura purificados usando o presente protocolo SPE. Embora em concentrações muito diferentes, ambas as substâncias podem ser separadas e quantificadas em uma matriz celular. Com base no número de prótons do grupo específico metil (-CH3) ou metileno (-CH2-) no respectivo deslocamento químico, a espectroscopia 1H-NMR permite uma quantificação precisa. Como apontado no protocolo (etapa 0), a quantificação relativa de um derivado de metil-arginina em comparação com a arginina é principalmente adequada para observar processos biológicos, por exemplo, alterações da metilação da arginina como resposta a modulações, como derrubada/superexpressão de genes, alterações em nutrientes ou tratamento com inibidores.

Como mostrado anteriormente27, a L-arginina e a ADMA podem ser bem discriminadas por seus diferentes deslocamentos químicos característicos em 3,25 e 3,02 ppm, respectivamente. Os prótons metílicos SDMA e MMA revelam picos sobrepostosem D 2 O (o tampão NMR descrito na etapa 1.4) a um deslocamento químico de 2,85 ppm. Se um pico estiver presente na respectiva posição, pode-se separar SDMA e MMA dissolvendo as amostras em d 6-DMSO, conforme descrito na etapa6.6 do protocolo. Usando essa abordagem, os deslocamentos químicos de RMN de 1H de SDMA e MMA podem ser separados e quantificados com deslocamentos químicos característicos a 2,76 ppm (SDMA) e 2,74 ppm (MMA)27. A Figura 3B mostra dados representativos de SDMA e MMA (ambos 100 μmol/L) em D2O e d6-DMSO, respectivamente. Dados correspondentes de SMDA e MMA detectados em várias células e tecidos foram relatados recentemente27. Conforme descrito nas etapas 6.4-6.5 do protocolo, padrões de referência de concentrações conhecidas podem ser usados para quantificação. Todas as normas de referência mencionadas no texto estão comercialmente disponíveis.

Figure 1
Figura 1: Visão geral da preparação da amostra. Esquema que revela as etapas significativas desde a coleta da amostra até a medição da RMN. As caixas pretas referem-se à numeração nas seções de protocolo. Além disso, a quantidade aproximada de dias (variando de acordo com o número de amostras) é mostrada. Amostras líquidas não homogéneas podem ser centrifugadas antes da adição de MeOH (passo 3.1) para remover os resíduos (não indicados). O sobrenadante após centrifugação inicial (1) contendo, por exemplo, metabólitos intracelulares ou metabólitos de arginina não ligados a proteínas pode ser armazenado a -20 °C para análise posterior. Rotineiramente, os pellets de MeOH (2) são mais bem analisados. Abreviaturas: CHCl3, clorofórmio; HCl, ácido clorídrico; MeOH, metanol; RMN, ressonância magnética nuclear; o/n, durante a noite; SN, sobrenadante; SPE, extração em fase sólida. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Manuseio de hidrolisados proteicos e preparação para extração em fase sólida. (A) Copo cheio de areia, tubos de vidro, tampas de rosca com folha de vedação de politetrafluoroetileno cinza (PTFE) e amostras em tubos de 1,5 mL após o corte das tampas. (B) Tubo após centrifugação (etapa 4.6) e (C) após remoção do sobrenadante aquoso (etapa 4.7): alguma água residual (~50 μL) pode permanecer. O resíduo preto contém restos orgânicos insolúveis e carbonizados. Ainda assim, algumas amostras podem conter substâncias coloridas (D), que não interferem na medição da L-arginina. Isto é em parte devido à extração em fase sólida (SPE) depois, usando etapas de centrifugação consecutivas (E) ou um robô de pipetagem (F). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Espectros típicos de RMN da L-arginina e seus derivados metílicos. 1 Os espectros de RMN J-resolvidos projetados por H 1D poderiam facilmente distinguir os prótons δ-(CH2)-da L-arginina (3,25 ppm) e os 3-prótons ω-N-CH da dimetilarginina assimétrica (ADMA, a3,02 ppm). Amostras de pellets de levedura (A) revelando quantidades variáveis de ADMA podem ser quantificadas integrando intensidades de sinal, mesmo na presença de grandes quantidades de arginina (note que o pico completo de arginina não é mostrado). (B) Uma vez que ω-(N G,N'G)-simétrico dimetilarginina (SDMA) e ω-N G-monometil arginina (MMA) dificilmente podem ser discriminados em tampão de óxido de deutério (D 2 O), as amostras devem ser dissolvidas em dimetilsulfóxido deuterado (d6-DMSO), onde os picos (neste caso 100 μmol/L de cada substância) podem ser facilmente distinguidos uns dos outros (picos de 2,75 e2,76ppm, respectivamente) e ser quantificado. Todos os espectrogramas foram exportados diretamente do software de controle do espectrômetro de RMN. O software revela os resultados primários, que precisam ser verificados antes que uma análise mais detalhada, incluindo estatísticas de muitas amostras, seja feita. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Na seção a seguir, o foco principal está no próprio método; as implicações biológicas da metilação da arginina são descritas na seção Introdução.

Em primeiro lugar, tecidos de rigidez diferente podem precisar de ajuste da lise da amostra: células da cultura de células (incluindo bactérias, leveduras, etc.) e tecidos como cérebro, fígado jovem, músculo liso, etc., podem ser rapidamente homogeneizados. Para tecidos de alta rigidez (incluindo fígado de idosos, artérias, ossos, etc.), a homogeneização precisa ser feita duas vezes (ver etapa 3.2.3). No entanto, esse processo não deve ser continuado com mais frequência, mesmo que alguns remanescentes insolúveis sejam deixados. Em vez disso, as amostras devem ser centrifugadas por 10 min a 10.000 x g e os sobrenadantes coletados para análise adicional (para minimizar a degradação da amostra).

Em cada etapa em que as amostras são congeladas (inicialmente, após a adição de MeOH, etapas 3.3, 3.4 ou 3.5, respectivamente) ou após a liofilização (etapas 4.4 e 6.1), as amostras podem ser armazenadas por alguns dias antes do processamento adicional. Além disso, o sobrenadante da etapa 3.4 (após homogeneização; designado como "(1)" na Figura 1) também pode ser armazenado para análise posterior, por exemplo, para medição de metabólitos diferentes das metil-argininas36,37,38.

Por um lado, etapas críticas envolvem o armazenamento da amostra, pois a degradação das proteínas pode alterar o resultado. Se a degradação proteica ocorrer antes da precipitação de MeOH, a arginina e seus derivados metílicos podem estar subestimados. Portanto, o armazenamento de amostras é essencial, por exemplo, antes e depois da lise celular ou tecidual a -20 °C ou, sempre que possível, a -80 °C. Antes ou após a homogeneização (etapa 3.2), as amostras devem ser mantidas no gelo.

Por outro lado, o pré-tratamento com metanol de amostras para precipitar proteínas não altera o padrão de metilação da arginina. Este foi testado com extratos proteicos de lisozima e Escherichia coli (que não contêm arginina metilada)27. No entanto, relatos anteriores mostraram que o MeOH pode metilar os grupos carboxila terminais do glutamato e do aspartato39.

Para a hidrólise de proteínas, certifique-se de que as vedações das tampas de rosca estão intactas (etapa 4.1). Caso contrário, a evaporação do HCl pode afetar a câmara de secagem. A concentração dos analitos pode não ser criticamente alterada, no entanto, porque eles não evaporam, e HCl residual é evaporado mais tarde por liofilização. Concentrações mais baixas de HCl, por exemplo, 6 mol/L, podem ser usadas, mas podem exigir um tempo de hidrólise mais longo. Após a hidrólise, as amostras podem ser tratadas à temperatura ambiente. A remoção adequada de lipídios é essencial, no entanto. Os lipídios podem formar misturas bifásicas em água (ou D2O, respectivamente) mais tarde durante a medição da RMN. Essas não homogeneidades levam ao aumento do pico de RMN e potencialmente afetam a qualidade e a sensibilidade dos experimentos de RMN.

Se nenhum robô de pipetagem estiver disponível para SPE, vale a pena o investimento (também pode ser usado para outros fins). As amostras no robô de pipetagem SPE são processadas sequencialmente e, na configuração atual, uma amostra leva ~ 40 minutos para uma execução completa. Devido às limitações das capacidades de reagentes (ou seja, 100 mL), apenas 19 amostras podem ser processadas de uma só vez (tomando ~13 h no geral). Ainda assim, o tempo prático é muito menor do que para o procedimento SPE manual e requer menos material. Durante este período, as amostras podem ser armazenadas dentro do robô à temperatura ambiente até a liofilização. Produtos equivalentes podem substituir as matrizes e cartuchos SPE usados. No entanto, recomenda-se avaliar o protocolo SPE e ajustá-lo, se necessário.

O limite de detecção para ADMA é de ~100 nmol/L, conforme avaliado anteriormente por diluições seriadas e usando os tempos de medição de RMN relatados. Por outro lado, altas concentrações de arginina também podem superestimar a proporção de ADMA para arginina (que geralmente está na faixa de 5% a 15%). Isso ocorre porque acima de 3 mmol / L de arginina; a capacidade de ligação da coluna SPE pode atingir a saturação27. Para verificar a sensibilidade e a especificidade de todo o fluxo de trabalho em caso de resultados inesperados (por exemplo, sem picos ou picos sobrepostos nos espectros de 1RMN-H nos turnos químicos relatados), os padrões de ADMA, SDMA e MMA estão disponíveis em fornecedores comerciais (consulte Tabela de Materiais). Se algum laboratório não tiver espectrômetro de RMN, todas as etapas, incluindo a liofilização final (etapa 6.1), podem ser realizadas no respectivo laboratório e as amostras podem ser enviadas para uma instalação de RMN para análise.

Em comparação com outros métodos, como a espectrometria de massa, não é necessária a marcação dos analitos, podendo ser realizada sem padrões internos de quantificação. Por outro lado, a sensibilidade da RMN é ligeiramente menor, que na maioria dos casos biológicos, embora não desempenhe nenhum papel, como a arginina e seus derivados metílicos podem ser facilmente detectados em todos os tipos de células ou tecidos eucarióticos. Como mencionado anteriormente, 3 milhões de células são suficientes para quantificar o ADMA ligado a proteínas - várias células que podem ser facilmente alcançadas com a maioria das linhagens celulares. No caso de células primárias de origem humana de crescimento lento e não modificadas, como as células-tronco adultas40, as células podem ser cultivadas por um período mais prolongado ou agrupadas a partir de experimentos separados. O mesmo é verdade para amostras de tecido. ~30 mg de tecido, correspondendo a muitos órgãos, por exemplo, de camundongos (em parte ou todos, por exemplo, pequenos músculos) ou espécime de biópsia, é suficiente para preparar lisado e hidrolisado de proteína suficientes para a medição de RMN27. Outros métodos para medir a metilação da proteína arginina incluem o uso de ensaios de luminescência acoplados à enzima41 ou 3S-adenosil-metionina (SAM) marcados com H42. A sensibilidade é alta e pode ser aumentada usando SAM com 14rótulos C, mas às custas de custos aumentados. Além disso, o uso de substâncias radioativas (incluindo os fluidos para contagem de cintilação) causa gerenciamento especial de resíduos, o que não é necessário usando o protocolo atual.

Um método complementar ao presente protocolo, utilizando espectroscopia de RMN heteronuclear 2D, pode revelar padrões de metilação sítio-específicos dentro de proteínas isoladas. Foi publicado recentemente, incluindo uma descrição detalhada da detecção de metil-argininas por espectroscopia de RMN em geral43. O protocolo atual não fornece informações sobre a metilação da arginina específica do local dentro das proteínas. Ainda assim, a metilação global é alterada no nível celular e fisiológico, incluindo crescimento e diferenciação celular, envelhecimento, câncer 1,2,12, cardiovascular20 e doenças neurodegenerativas 8,44. Os detalhes sobre os mecanismos exatos envolvidos ainda não são totalmente compreendidos, e possíveis candidatos a fármacos que interferem na metilação proteína-arginina11 tanto in vitro quanto in vivo precisam de maior exploração1. Estudar a cinética da metilação (que nosso grupo mostrou recentemente)27 é essencial para obter insights sobre a modificação da arginina e os mecanismos de quebra de proteínas. Medições globais de metilação da arginina e experimentos cinéticos (amostras podem ser congeladas a qualquer momento) variando de proteínas únicas a amostras de organismos inteiros podem ser realizadas diretamente usando este protocolo. Portanto, fornece um método robusto, que pode ser facilmente adaptado para pesquisas futuras.

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Disclosures

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Acknowledgments

O trabalho foi apoiado pelas subvenções P28854, I3792, doc.funds BioMolStruct DOC 130, DK-MCD W1226 BioTechMed-Graz (Flagship project DYNIMO), Austrian Research Promotion Agency (FFG) grants 864690 e 870454, o Integrative Metabolism Research Center Graz; Programa Austríaco de Infraestrutura 2016/2017, o Governo da Estíria (Zukunftsfonds) e o Fundo de Inicialização para Talentos de Alto Nível da Fujian Medical University (XRCZX2021020). Agradecemos ao Centro de Pesquisa Médica pelo acesso às instalações de cultura de células. F.Z. foi treinado no âmbito do programa de doutorado em Medicina Molecular da Universidade Médica de Graz. Q.Z. foi treinado no âmbito do programa de doutorado Doenças Metabólicas e Cardiovasculares da Universidade Médica de Graz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL tubes Greiner Bio One 188271
3-(trimethylsilyl) propionic acid-2,2,3,3-d4 sodium salt (TSP) Alfa Aesar A1448
5 mL tubes, round bottom Greiner Bio One 115101
Ammonia Solution 32% Roth A990.1
Bruker 600 MHz NMR spectrometer, equipped with a TXI probe head Bruker -
Centrifuge, refrigerated, e.g. 5430 R Eppendorf 5428000010
Chloroform ≥99% p.a. Roth 3313.1
Cryocool Thermo Scientific SCC1 heat transfer fluid for SpeedVac System
Deuterium Oxide (D2O) Cambridge Isotope Laboratories DLM-10-PK
Dimethyl sulfoxide-d6 (d6-DMSO) Cambridge Isotope Laboratories DLM-6-1000
Drying Chamber Binder 9090-0018
DURAN culture tubes, 13 x 100mm, GL 14, 9 mL VWR International 212-0375
Edwards Deep vacuum oil pump RV5 Thermo Scientific 16234611 part of the SpeedVac System
Eppendorf 1.5 mL tubes Greiner Bio One 616201
Gilson pipetting robot GX-241 Aspec Gilson Inc. 26150008
L-arginine AppliChem A3675
Methanol ≥99% Roth 8388.4
Milli-Q water aparatus Millipore ZIQ7000T0
Oasis MCX 1cc/30 mg, 1 mL cartridges Waters 186000252 https://www.waters.com/waters/en_US/Waters-Oasis-Sample-Extraction-SPE-Products/
Phosphate Buffered Saline (PBS) Lonza LONBE17-512F
Precellys 24 tissue homogenizer Bertin Instruments P000669-PR240-A https://www.bertin-instruments.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys24-tissue-homogenizer/
Precellys tubes (pulping tubes) VWR International 432-0351
Precellyse 1.4 mm zirconium oxide beads VWR International 432-0356
Reacti-Therm/ReactiVap Heating, Stirring, and Evaporation Modules Thermo Scientific TS-18820 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/TS-18820
Rotor for 1.5 mL tubes, FA-45-30-11 Eppendorf 5427753001
Savant Refrigerated Cooling Trap Thermo Scientific 15996161 part of the SpeedVac System
Savant SpeedVac vacuum concentrator SPD210 Thermo Scientific 15906181 part of the SpeedVac System; equipped with rotor for 1.5 ml tubes
Screw caps for glas vials with PTFE sealing, DN9 Dr. R. Forche Chromatographie CT11B3011
Seasand Roth 8441.3
Short thread glas vials 1.5 mL, ND9 Dr. R. Forche Chromatographie VT1100309
Sodium azide (NaN3) Roth K305.1
Sodium hydroxide (NaOH) VWR BDH7363-4
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) VWR 80731-078
TopSpin 4.0 (Software) Bruker - https://www.bruker.com
ω-NG-asymmetric dimethylarginine (ADMA) Santa Cruz Biotechnology sc-208093
ω-NG-monomethylarginine (MMA) Santa Cruz Biotechnology sc-200739A
ω-NG-NG'-symmetric dimethylarginine (SDMA) Santa Cruz Biotechnology sc-202235A

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Cancer Research Edição 178
Explorando o metiloma de arginina por espectroscopia de ressonância magnética nuclear
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Habisch, H., Zhang, F., Zhou, Q.,… More

Habisch, H., Zhang, F., Zhou, Q., Madl, T. Exploring the Arginine Methylome by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. J. Vis. Exp. (178), e63245, doi:10.3791/63245 (2021).

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