Summary
Detta protokoll beskriver beredning och kvantitativ mätning av fria och proteinbundna arginin och metylargininer med 1H-NMR-spektroskopi.
Abstract
Proteinbundet arginin är vanligen metylerat i många proteiner och reglerar deras funktion genom att förändra de fysikalisk-kemiska egenskaperna, deras interaktion med andra molekyler, inklusive andra proteiner eller nukleinsyror. Detta arbete presenterar ett lätt implementerat protokoll för kvantifiering av arginin och dess derivat, inklusive asymmetrisk och symmetrisk dimetylarginin (ADMA respektive SDMA) och monometylarginin (MMA). Efter proteinisolering från biologiska kroppsvätskor, vävnader eller celllysat beskrivs en enkel metod för homogenisering, utfällning av proteiner och proteinhydrolys. Eftersom hydrolysaten innehåller många andra komponenter, såsom andra aminosyror, lipider och nukleinsyror, är ett reningssteg med fastfasextraktion (SPE) viktigt. SPE kan antingen utföras manuellt med hjälp av centrifuger eller en pipetteringsrobot. Känsligheten för ADMA med det nuvarande protokollet är cirka 100 nmol/L. Den övre detektionsgränsen för arginin är 3 mmol / L på grund av SPE-mättnad. Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll en robust metod, som sträcker sig från biologisk provberedning till NMR-baserad detektion, vilket ger värdefulla tips och fallgropar för framgångsrikt arbete när man studerar argininmetylomet.
Introduction
Under de senaste två decennierna har metylering av argininrester erkänts som en väsentlig posttranslationell modifiering av proteiner. Det påverkar grundläggande biologiska processer som reglering av transkription, signaltransduktion och många fler1. De viktigaste proteinerna som är involverade i regleringen av argininmetylering är proteinargininmetyltransferaser (PRMT)2. De viktigaste derivaten av arginin är ω-(N G,N G)-asymmetrisk dimetylarginin (ADMA), ω-(N G,N'G)-symmetrisk dimetylarginin (SDMA) och ω-N G-monometylarginin (MMA)2.
PRMT använder S-adenosyl-l-metionin för att överföra metylgrupper till den terminala guanidinogruppen (med två ekvivalenta aminogrupper) av proteinbundet arginin1. Två huvudenzymer kan urskiljas: Både typ I- och typ II-enzymer katalyserar det första metyleringssteget för att bilda MMA (som därmed förlorar sin symmetri). Efter detta steg använder typ I-enzymer (t.ex. PRMT1, 2, 3, 4, 6, 8) MMA som substrat för att bilda ADMA, medan typ II-enzymer (främst PRMT5 och PRMT9) producerar SDMA. PRMT1 var det första proteinet argininmetyltransferas som isolerades från däggdjursceller3. Ändå har PRMT evolutionärt bevarats4 hos andra djur som ryggradsdjur som inte är däggdjur, ryggradslösa ackordat, tagghudingar, leddjur och nematoder cnidarians5, växter6 och protozoer, inklusive svampar som jäst7. I många fall leder knockout av en av PRMT till förlust av livskraft, vilket avslöjar den väsentliga rollen för metylerade argininarter som är involverade i grundläggande cellulära processer som transkription, translation, signaltransduktion, apoptos och vätske-vätskefasseparation (vilket betyder bildandet av membranlösa organeller, t.ex. nukleoler), som regelbundet involverar argininrika domäner 8,9,10 . I sin tur påverkar detta fysiologi och sjukdomstillstånd, inklusive cancer 11,12,13, multipelt myelom14, hjärt-kärlsjukdomar 15, viral patogenes, spinal muskelatrofi 16, diabetes mellitus 17 och åldrande1. Förhöjda ADMA-nivåer i blodet, t.ex. härrörande från lunga18 på grund av proteinnedbrytning, tros vara kopplade till endoteldysfunktion, kronisk lungsjukdom19 och andra syndrom av hjärt-kärlsjukdom20. Överuttryck av PRMT har visat sig påskynda tumörgenes och är förknippat med dålig prognos21,22. Dessutom utlöser ablation av PRMT6 och PRMT7 en cellulär senescensfenotyp23. Signifikant minskad ADMA och PRMT1 har hittats under åldrandet av WI-38 fibroblaster24.
Utmaningen är att förstå hur metylering verkar i (pato)fysiologiska processer för att identifiera och kvantifiera proteinargininmetylering. De flesta av de nuvarande metoderna använder antikroppar för att detektera metylerade argininer. Dessa antikroppar är dock fortfarande kontextspecifika och kan misslyckas med att känna igen olika motiv av argininmetylerade proteiner25,26. I det beskrivna protokollet kan alla argininderivat som nämns ovan kvantifieras på ett tillförlitligt sätt genom kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, dvs ensamt, i kombination eller, som i de flesta fall, inom komplexa biologiska matriser som eukaryota celler (t.ex. från jäst, mus eller mänskligt ursprung) och vävnader27, såväl som serum28. För proteiner och dessa komplexa matriser är proteinhydrolys29 en förutsättning för att generera fria (modifierade) aminosyror, såsom arginin, MMA, SDMA och ADMA. Fastfasextraktion (SPE)30 möjliggör anrikning av föreningarna av intresse. Slutligen möjliggör 1H-NMR-spektroskopi parallell detektion av arginin och alla större metylderivat av arginin. NMR-spektroskopi har fördelen att den är genuint kvantitativ, mycket reproducerbar och en robust teknik31,32. De slutliga NMR-mätningarna kan göras efteråt när många prover har samlats in och förberetts. Slutligen fokuserar detta protokoll huvudsakligen på provberedning eftersom detta inte kräver en egen NMR-spektrometer. Det kan utföras i de flesta biokemiska laboratorier. Ändå ges några tips om vilka NMR-spektroskopimätningar som bör göras i detta arbete.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Jästproteinhydrolysat användes som prover för de representativa resultaten av detta arbete. Hela protokollet sammanfattas i figur 1.
1. Beredning av material och reagenser
- Metanol/vatten: Bered en blandning av två delar 99 % metanol (MeOH) och en del H2O, betecknad MeOH /H2O. Förvara renMeOH och MeOH/ H 2O vid -20 ° C för att minimera alkoholavdunstning och öka provstabiliteten.
- Saltsyra (HCl): späd 9 mol / L från koncentrerad HCl (12,0 mol / L eller 37%) samt 0,1 mol / L HCl. Den högre koncentrerade (9 mol / L) lösningen används för proteinhydrolys, medan den lägre koncentrerade (0,1 mol / L) används för fastfasextraktion.
VARNING: Arbeta inuti dragskåpet. - Bered en ersättningslösning för SPE som innehåller 10 % mättad ammoniaklösning (lager:30 % ammoniak per vikt), 50 % metanol och 40 % vatten (v/v).
- NMR-buffert: Lös 5,56 g dinatriumvätefosfat (Na2HPO4, 0,08 mol/l), 0,4 g 3-(trimetylsilyl) propionsyra-2,2,3,3-d4 natriumsalt (TSP, 5 mmol/L), 0,04 % (vikt/volym) natriumazid (NaN3) i 500 ml deuteriumdioxid (D2O) och justera till pH 7,4 (med HCl eller NaOH, respektive) (se Materialförteckning). Kontrollera renheten hos varje ny buffertsats med NMR-spektroskopi.
OBS: Mängden föroreningar (t.ex. etanol) bör vara så låg som möjligt. - Fyll massarör med zirkoniumoxidpärlor (2 ml rör och 1,4 mm pärlor är lämpliga för de flesta applikationer, men olika varianter finns tillgängliga) (se materialförteckning). Fyll ungefär 10-20 pärlor för hand eller köp förfyllda rör, som också finns tillgängliga.
- Håll pipetter och respektive spetsar redo i intervallet 10-1 000 μL.
OBS: Mycket rent vatten, betecknat somH2O, definierat av ett högt motstånd på ≥18,2 MΩ · cm-1, användes under hela arbetet. Det motsvarar dubbeldestillerat vatten.
2. Insamling och lagring av prover
- Snabbfrys vätskeproverna (serum/plasma, cellodlingssupernatant osv.) med flytande kväve och förvara dem vid -80 °C tills de används.
- Förbered de fasta materialen enligt nedan.
- Samla cellerna från cellkulturer (3-5 miljoner celler) antingen genom att samla vidhäftande celler, efter tvättning med kall fosfatbuffrad saltlösning, skrapning och centrifugering, eller direkt centrifugering av celler odlade i suspension.
- Ta bort cellsupernatanterna (som kan samlas in för vidare analys, antingen genom direkt konsekutiv mätning, se steg 6, eller efter utfällning av lösliga proteiner, se steg 3.1) och frys sedan pelletsen med flytande kväve och förvara dem vid -80 °C. För vidare bearbetning, se steg 3.2.
- Förvara och samla vävnaderna enligt syftet med studien. För mycket homogena vävnader, såsom lever eller muskel, analysera någon del av den. Till exempel, när det gäller en mushjärna, bestäm global argininmetylering av hela hjärnan eller hjärnsektionerna.
OBS: Den ideala vikten av vävnader som ska bearbetas är 30-60 mg. Det är lämpligt att frysa och pulverisera hela hjärnan och använda alikvoter därav. Alternativt kan specifika delar av hjärnan (t.ex. frontal, cerebellum, occipitala regioner eller en halvklot, som väger ~ 250 mg) användas.
3. Preliminär provberedning
OBS: Utför arbetet på is och håll MeOH kallt. Proverna måste också förvaras på is för att undvika proteinnedbrytning.
- För vätskeprover, tillsätt 400 μL iskall metanol till 200 μL av provet. Fortsätt med steg 3.3.
OBS: Om mindre prov är tillgängligt, justera volymerna därefter; NMR-känsligheten är vanligtvis tillräckligt hög för mindre provmängder, men måste testas individuellt. - När det gäller fasta material, förbered tillräckligt med 1,5 ml rör för lysaterna (använd för centrifugering efter homogenisering).
- Återsuspendera försiktigt men noggrant cellpelletsen i 600 μL MeOH/H2Ooch överför hela vätskefasen till massarören.
- Placera vävnaderna i massarör (du kan väga dem direkt i rören) och tillsätt 600 μL MeOH/H2O(för 30-60 mg; justera om vikten skiljer sig väsentligt).
- Sätt rören i vävnadshomogenisatorn (se materialtabell) och homogenisera antingen en gång i 20 s med kraftig skakning (för cellpellets, mjuka vävnader) eller två gånger i 20 s vardera (eller längre vid behov) med ett intervall på 5 min däremellan (för styva vävnader).
- Efter homogenisering, lägg omedelbart proverna på isen igen och överför hela lysaterna till nya 1,5 ml rör.
- Förvara proverna i minst 30 minuter (upp till flera dagar) vid -20 °C före vidare bearbetning.
- Centrifugera vid 10 000 x g i 30 min vid 4 °C. Under tiden förbereder du tillräckligt med 1,5 ml rör för att samla supernatanterna.
OBS: Denna supernatant (betecknad "(1)" i figur 1) kan kasseras, frystorkas och bearbetas direkt för NMR (steg 6) eller analyseras på annat sätt. - I detta protokoll används MeOH-fällningen (= pellet erhållen efter steg 3.1 respektive 3.2.2) för vidare analys innehållande bland annat komponenter såsom nukleinsyror och lipider, argininmetylerade proteiner. Fortsätt med proteinhydrolys eller förvara pelletsen vid -20 °C i några dagar.
4. Proteinhydrolys
- Tillsätt 500 μl 9 mol/l HCl till varje prov. Trunkera sedan locken på varje rör med sax och placera dem i glasodlingsrören (figur 2A). Stäng försiktigt, men tätt, de röda locken (kontrollera därmed tätningen).
OBS: Före användning, kontrollera alltid varje tätning (grå PTFE-folie inuti de röda skruvlocken) för korrekt åtdragning och rengör dem regelbundet med vatten. - När du är klar, placera rören i en bägare delvis fylld med sand (för bättre värmeöverföring) och hydrolysera proverna i ca 16 timmar vid 110 °C i en torkkammare.
- Efter hydrolys, kyl ner proverna (~ 1 timme).
- Därefter lyofilisera över natten med en centrifug med högt vakuum (under 100 Pa).
- Lös upp pelletsen - om de är helt torra (om inte, fortsätt frystorkningen) - i 1 ml 0,1 mol / L HCl och tillsätt 50 μL kloroform (CHCl3) till varje rör; Lös upp pelleten noggrant med en 1 000 μl pipett, blanda därmed vätskorna och överför sedan hela volymen till ett nytt rör.
VARNING: Arbeta alltid med små mängder för att minimera omfattande avdunstning - Centrifugera sedan vid 8 000 x g i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Samla försiktigt den övre fasen av den bifasiska vätskan som innehåller den vattenlösliga fraktionen (figur 2B, fraktionen med lägre densitet) med en pipett och fyll den i nya rör. Använd 1,5 ml rör för manuell SPE (avsnitt 5.2) eller glasflaskor för robotiserad SPE (avsnitt 5.3 och figur 2D). Undvik att spilla över CHCl3 och dess innehåll (figur 2C).
5. Extraktion av fast fas (SPE)
- Före den första användningen, rengör SPE-patronerna två gånger med 1 ml ersättningslösning (steg 1.3) följt av centrifugering vid 800 x g i 1 min vid rumstemperatur (placerad i 15 ml rör). De kan användas 10-20 gånger vardera.
- Manuell SPE
- Förkonditionera patronerna (se materialtabell) i varje körning med 1 ml ren metanol och 2 x 1 ml PBS, varje gång följt av centrifugering vid 800 x g i 1 min vid rumstemperatur (placerad i 15 ml rör).
- Därefter laddar du proverna (från steg 4.7) på SPE-patronerna och centrifugerar dem vid 600 x g i 2 minuter vid rumstemperatur.
- Applicera sedan en tvättcykel som nämns nedan.
- Tillsätt tre gånger 1 mlH2O(vardera följt av centrifugering i 1 min vid 800 x g vid rumstemperatur).
- Tillsätt fem gånger 1 ml 0,1 mol / L HCl (vardera följt av centrifugering i 1 min vid 800 x g vid rumstemperatur).
- Tillsätt två gånger 1 ml MeOH (vardera följt av centrifugering i 1 min vid 800 x g vid rumstemperatur).
- Eluera sedan arginin och dess derivat med 3 x 1 ml ersättningslösning (följt av centrifugering 1 min vid 800 x g vid rumstemperatur) till ett enda 15 ml rör.
OBS: Ersättningslösningen fungerar som elueringsmedel för arginin och derivat och används också för rengöring av patronerna (alla ämnen tvättas antingen ut före eluering eller vid ersättningslösningens grundläggande pH-värde). För att undvika kontaminering över tid bör återanvändningen dock begränsas (se steg 5.1).
- Robotic SPE
OBS: Här levereras en pipetteringsrobot (huvuddelen består av en pipetteringsnål, en tvättstation för nålen, en reagensförsörjning och positioner för prover och eluater, se Materialförteckning) med en patronhållare för SPE-kolumnerna. För andra instrument, se till att vara fullt utrustad med alla saker som anges.- Fyll supernatanten (från steg 4.7) direkt i injektionsflaskor av glas med PTFE-försegling (figur 2D), förbered tillräckligt med reagens (100 ml av varje, dvs. ersättningslösning, 99% MeOH, PBS,H2Ooch 0,1 mol/L HCl), 5 ml rör för eluering och tvättlösning för robotens nål (vanligtvisH2O).
- Använd en applikation eller metod i robotens programvara baserat exakt på de steg som beskrivs för manuell SPE (steg 5.2).
OBS: Detaljerna kan variera mycket mellan instrumentleverantörer, så se programvaruhandboken för respektive robot för programmering. En pipetteringsrobot fungerar vanligtvis genom att applicera lufttryck på patronerna istället för centrifugering, vilket är den största skillnaden. Om protokollet upprättas och körs för första gången, inkludera kontroller (t.ex. L-arginin med känd koncentration) för att verifiera ett optimalt arbetsflöde.
6. Slutförberedelse för NMR
- Lyofilisera prover över natten för att slutföra torrhet för att bli av med ammoniak ochH2O.
- Lös upp varje prov i 500 μl NMR-buffert (steg 1.4) och överför till NMR-rör. Viktigt är att volymen måste vara densamma i alla rör, och proverna måste vara homogena (fria från rester och lipider, som tenderar att aggregera).
OBS: Detaljerna i NMR-spektroskopi går utöver denna metodgranskning och beskrivs mer detaljerat på annan plats27. Här förklaras endast de viktigaste kraven och stegen. Kvantifieringen av arginin och dess metaboliter utförs på en 600 MHz NMR-spektrometer (se Materialtabell). I princip kan alla andra NMR-spektrometer/NMR-fältstyrkor användas, förutsatt att NMR-signalerna från arginin och metylerade argininer kan detekteras med tillräcklig känslighet och utan signalöverlappning. Alla sondhuvuden med z-axelgradienter som kan registrera 1H-spektra kan användas, förutsatt att pulssekvenserna är inställda i enlighet därmed. - Spela in ett 1D-spektrum med CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill) pulssekvens33,34 (cpmgpr1d, 512 skanningar, storlek på fid 73728, 11904.76 Hz spektralbredd på en 600 MHz NMR, återvinningsfördröjning 4 s) med vattensignalundertryckning med förmättnad.
- I dessa experiment, ta bort 1H-skalärkopplingarna genom virtuell frikoppling, vilket minskar signalöverlappningen. Registrera ytterligare för specifika frågor och/eller komplexa prover eller matriser, t.ex. 1 H-13C-heteronukleära single quantum coherence (HSQC) spektra27.
OBS: För mer komplexa matriser där 1 H NMR-signaler från metylerade argininer delvis kan överlappas med 1 H NMR-signaler från andra metaboliter (t.ex. lysin) krävs 1H homonukleära J-upplösta spektra (JRES)35. - Utför absolut kvantifiering genom att integrera respektive toppintensitet för standarder för en känd koncentration, t.ex. 100 μmol / arginin.
OBS: Rutinmässigt rapporteras ADMA, SDMA och MMA (se materialtabell) som ett förhållande i förhållande till arginin. Detta har en betydande fördel att ingen separat normalisering (t.ex. cellantal, vävnadsmassa, proteinkoncentrationer) behöver utföras. I så fall fungerar arginin som en intern standard, och relativ kvantifiering är tillräcklig för att få biologiskt relevant information. - För differentiering av SDMA och MMA, frystorka proverna igen för att bli av med D2O (om de har återsuspenderats i NMR-buffert tidigare), som sedan ersätts av deutererad dimetylsulfoxid (d 6-DMSO), vilket möjliggör upplösning av metylresonanser27. Aspirera därför proverna från NMR-rören med Pasteurpipetter, frystorka och lös upp dem i 500 μL d6-DMSO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rutinmässigt används 1H 1D-projektioner av 2D J-upplösta (JRES), virtuellt frikopplade NMR-spektra för toppuppdrag och kvantifieringar i vårt laboratorium36. Figur 3 visar representativa JRES-spektra av hydrolyserade jästproteiner renade med det nuvarande SPE-protokollet. Även vid mycket olika koncentrationer kan båda substanserna separeras och kvantifieras i en cellulär matris. Baserat på antalet protoner i den specifika metyl- (-CH3) eller metylengruppen (-CH2-) vid respektive kemisk förskjutning möjliggör 1H-NMR-spektroskopi exakt kvantifiering. Som påpekats i protokollet (steg 0) är den relativa kvantifieringen av ett metyl-argininderivat jämfört med arginin huvudsakligen adekvat för att observera biologiska processer, t.ex. förändringar av argininmetylering som ett svar på moduleringar, såsom knock-down / överuttryck av gener, förändringar i näringsämnen eller behandling med hämmare.
Som visats tidigare27 kan L-arginin och ADMA väl diskrimineras av deras olika karakteristiska kemiska skift vid 3,25 respektive 3,02 ppm. SDMA- och MMA-metylprotoner avslöjar överlappande toppar iD2O(NMR-bufferten som beskrivs i steg 1.4) vid en kemisk förskjutning på 2,85 ppm. Om en topp finns vid respektive position kan man separera SDMA och MMA genom att lösa upp proverna i d 6-DMSO enligt beskrivningen i steg6.6 i protokollet. Med hjälp av detta tillvägagångssätt kan 1H NMR kemiska skift av SDMA och MMA separeras och kvantifieras med karakteristiska kemiska skift vid 2,76 ppm (SDMA) och 2,74 ppm (MMA)27. Figur 3B visar representativa data för SDMA och MMA (båda 100 μmol/L) i D2O respektive d 6-DMSO. Motsvarande data för SMDA och MMA som upptäckts i olika celler och vävnader har nyligen rapporterats27. Som beskrivs i steg 6.4–6.5 i protokollet kan referensstandarder för kända koncentrationer användas för kvantifiering. Alla referensstandarder som nämns i texten är kommersiellt tillgängliga.
Figur 1: Översikt över provberedningen. Schema som avslöjar de viktiga stegen från provtagning till NMR-mätning. De svarta rutorna hänvisar till numreringen i protokollavsnitten. Dessutom visas det ungefärliga antalet dagar (varierande beroende på antalet prover). Inhomogena vätskeprover kan centrifugeras innan MeOH tillsätts (steg 3.1) för att avlägsna resterna (visas inte). Supernatanten efter initial centrifugering (1) som innehåller t.ex. intracellulära metaboliter eller icke-proteinbundna argininmetaboliter kan förvaras vid -20 °C för vidare analys. Rutinmässigt analyseras MeOH-pellets (2) ytterligare. Förkortningar: CHCl3, kloroform; HCl, saltsyra; MeOH, metanol; NMR, kärnmagnetisk resonans; o/n, över natten; SN, supernatant; SPE, fastfasextraktion. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Hantering av hydrolyserade proteiner och beredning för fastfasextraktion. (A) Bägare fylld med sand, glasrör, skruvkorkar med grå tätningsfolie av polytetrafluoreten (PTFE) och prover i 1,5 ml rör efter avskärning av locken. b) Röret efter centrifugering (steg 4.6) och (C) efter avlägsnande av den vattenhaltiga supernatanten (steg 4.7): en del restvatten (~50 μl) kan finnas kvar. Den svarta återstoden innehåller olösliga, kolade organiska rester. Ändå kan vissa prover innehålla färgade ämnen (D), som inte stör L-argininmätningen. Detta beror delvis på fastfasextraktion (SPE) efteråt, antingen med hjälp av på varandra följande centrifugeringssteg (E) eller en pipetteringsrobot (F). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Typiska NMR-spektra för L-arginin och dess metylderivat. 1 H 1D-projicerade J-upplösta NMR-spektra kunde lätt skilja δ-(CH2)-protonerna av L-arginin (3,25 ppm) och ω-N-CH3-protonerna av asymmetrisk dimetylarginin (ADMA, vid 3,02 ppm). Prover från jästpellets (A) som avslöjar varierande mängder ADMA kan kvantifieras genom att integrera signalintensiteter även i närvaro av stora mängder arginin (observera att hela arginintoppen inte visas). (B) Eftersom ω-(N G,N'G)-symmetrisk dimetylarginin (SDMA) och ω-N G-monometylarginin (MMA) knappast kan urskiljas i deuteriumoxidbuffert (D 2 O), måste proverna lösas i deutererad dimetylsulfoxid (d6-DMSO), där topparna (i detta fall 100 μmol/L av varje ämne) lätt kan skiljas från varandra (toppar vid 2,75 och2,76ppm, respektive) och kvantifieras. Alla spektrogram exporterades direkt från NMR-spektrometerns styrprogramvara. Programvaran avslöjar de primära resultaten, som måste kontrolleras innan en mer detaljerad analys, inklusive statistik över många prover, görs. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I följande avsnitt ligger det primära fokuset på själva metoden; de biologiska konsekvenserna av argininmetylering beskrivs i introduktionsavsnittet.
För det första kan vävnader med olika styvhet behöva justeras vid provlysering: celler från cellodling (inklusive bakterier, jäst etc.) och vävnader som hjärna, ung lever, glatt muskulatur etc. kan snabbt homogeniseras. För vävnader med hög styvhet (inklusive lever från äldre personer, artärer, ben etc.) måste homogeniseringen göras två gånger (se steg 3.2.3). Ändå bör denna process inte fortsättas oftare, även om vissa olösliga rester lämnas. Istället bör proverna centrifugeras i 10 minuter vid 10 000 x g och supernatanterna samlas in för vidare analys (för att minimera provnedbrytningen).
Vid varje steg där prover fryses (initialt, efter tillsats av MeOH, steg 3.3, 3.4 respektive 3.5) eller efter frystorkning (steg 4.4 och 6.1), kan prover lagras i några dagar före vidare bearbetning. Dessutom kan supernatanten från steg 3.4 (efter homogenisering; betecknas som "(1)" i figur 1) också lagras för vidare analys, t.ex. för mätning av andra metaboliter än metylargininer36,37,38.
Å ena sidan involverar kritiska steg provlagring, eftersom nedbrytning av proteiner kan förändra resultatet. Om proteinnedbrytning sker före MeOH-utfällning kan arginin och dess metylderivat underskattas. Därför är det viktigt att lagra prover, t.ex. före och efter cell- eller vävnadslys vid -20 °C eller, när så är möjligt, vid -80 °C. Före eller efter homogeniseringen (steg 3.2) skall proverna läggas på is.
Å andra sidan förändrar metanolförbehandling av prover för att fälla ut proteiner inte metyleringsmönstret för arginin. Detta testades med lysozym- och Escherichia coli-proteinextrakt (som inte innehåller metylerat arginin)27. Tidigare rapporter har dock visat att MeOH kan metylera de terminala karboxylgrupperna glutamat och aspartat39.
För proteinhydrolys, se till att tätningarna på skruvkapsylerna är intakta (steg 4.1). Om inte, kan avdunstning av HCl påverka torkkammaren. Koncentrationen av analyterna kan dock inte förändras kritiskt, eftersom de inte avdunstar, och kvarvarande HCl avdunstas senare genom lyofilisering. Lägre koncentrationer av HCl, t.ex. 6 mol / L, kan användas men kan kräva en längre hydrolystid. Efter hydrolys kan proverna behandlas vid rumstemperatur. Korrekt avlägsnande av lipider är dock viktigt. Lipider kan bilda bifasiska blandningar i vatten (respektiveD2O) senare under NMR-mätning. Dessa inhomogeniteter leder till att NMR-toppbreddningen breddas och potentiellt påverkar NMR-experimentens kvalitet och känslighet.
Om ingen pipetteringsrobot finns tillgänglig för SPE är det värt investeringen (den kan också användas för andra ändamål). Proverna på SPE-pipetteringsroboten bearbetas sekventiellt, och i den nuvarande installationen tar ett prov ~ 40 minuter för en fullständig körning. På grund av begränsningar av reagenskapaciteten (dvs. 100 ml) kan endast 19 prover bearbetas på en gång (med ~ 13 timmar totalt). Ändå är den praktiska tiden mycket mindre än för den manuella SPE-proceduren och kräver mindre material. Under denna period kan prover lagras i roboten vid rumstemperatur fram till frystorkning. Likvärdiga produkter kan ersätta de använda SPE-matriserna och patronerna. Det rekommenderas dock att utvärdera SPE-protokollet och justera det vid behov.
Detektionsgränsen för ADMA är ~100 nmol/L som tidigare utvärderats genom serieutspädning och med användning av rapporterade NMR-mättider. Å andra sidan kan höga argininkoncentrationer också överskatta förhållandet mellan ADMA och arginin (som vanligtvis ligger i intervallet 5% -15%). Detta beror på att över 3 mmol / L arginin; SPE-kolonnens bindningskapacitet kan nå mättnad27. För att kontrollera känslighet och specificitet för hela arbetsflödet i händelse av oväntade resultat (t.ex. inga toppar eller överlappande toppar i 1H-NMR-spektra vid de rapporterade kemiska skiften) finns standarder för ADMA, SDMA och MMA tillgängliga från kommersiella leverantörer (se materialförteckning). Om något laboratorium inte har någon NMR-spektrometer kan alla steg, inklusive slutlig frystorkning (steg 6.1), utföras i respektive laboratorium och prover kan skickas till en NMR-anläggning för analys.
Jämfört med andra metoder, såsom masspektrometri, behövs ingen märkning av analyterna, och det kan utföras utan interna standarder för kvantifiering. Å andra sidan är känsligheten hos NMR något lägre, vilket i de flesta biologiska fall dock inte spelar någon roll, eftersom arginin och dess metylderivat lätt kan detekteras i alla typer av eukaryota celler eller vävnader. Som tidigare nämnts räcker 3 miljoner celler för att kvantifiera proteinbunden ADMA - flera celler som lätt kan uppnås med de flesta cellinjer. När det gäller långsamt växande, omodifierade primära celler från mänskligt ursprung som vuxna stamceller40, kan celler odlas under en längre period eller slås samman från separata experiment. Detsamma gäller för vävnadsprover. ~ 30 mg vävnad, motsvarande många organ, t.ex. möss (delvis eller alla, t.ex. små muskler) eller biopsiprov, är tillräckligt för att förbereda tillräckligt med lysat och proteinhydrolysat för NMR-mätning27. Andra metoder för att mäta proteinargininmetylering inkluderar användning av enzymkopplade luminiscensanalyser41 eller 3H-märkta S-adenosylmetionin (SAM)42. Känsligheten är hög och kan ökas genom att använda 14C-märkt SAM men på bekostnad av ökade kostnader. Dessutom orsakar användningen av radioaktiva ämnen (inklusive vätskor för scintillationsräkning) särskild avfallshantering, vilket inte är nödvändigt med det nuvarande protokollet.
En kompletterande metod till detta protokoll, som använder 2D heteronukleär NMR-spektroskopi, kan avslöja platsspecifika metyleringsmönster inom isolerade proteiner. Den har nyligen publicerats, inklusive en detaljerad beskrivning av detektion av metylargininer med NMR-spektroskopi i allmänhet43. Det nuvarande protokollet ger inte information om platsspecifik argininmetylering inom proteiner. Ändå förändras global metylering på cellulär och fysiologisk nivå, inklusive celltillväxt och differentiering, åldrande, cancer 1,2,12, kardiovaskulär20 och neurodegenerativa sjukdomar 8,44. Detaljerna om de exakta mekanismerna som är inblandade är fortfarande inte helt förstådda, och möjliga läkemedelskandidater som stör protein-argininmetylering11 både in vitro och in vivo behöver ytterligare undersökning1. Att studera kinetiken för metylering (som vår grupp nyligen har visat)27 är viktigt för att få insikt i argininmodifiering och proteinnedbrytningsmekanismer. Globala argininmetyleringsmätningar och kinetiska experiment (prover kan frysas när som helst) som sträcker sig från enskilda proteiner till prover från hela organismer kan åstadkommas enkelt med hjälp av detta protokoll. Det ger därför en robust metod, som lätt kan anpassas för framtida forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inte några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Arbetet stöddes av österrikiska vetenskapsfondens (FWF) bidrag P28854, I3792, doc.funds BioMolStruct DOC 130, DK-MCD W1226 BioTechMed-Graz (flaggskeppsprojekt DYNIMO), österrikiska forskningsfrämjande byrån (FFG) bidrag 864690 och 870454, Integrative Metabolism Research Center Graz; Österrikes infrastrukturprogram 2016/2017, Steiermarks regering (Zukunftsfonds) och startfond för talanger på hög nivå vid Fujian Medical University (XRCZX2021020). Vi tackar Center of Medical Research för tillgång till cellodlingsanläggningar. F.Z. utbildades inom ramen för doktorandprogrammet Molecular Medicine, Medical University of Graz. Q.Z. utbildades inom ramen för doktorandprogrammet Metabola och kardiovaskulära sjukdomar, Medical University of Graz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | Greiner Bio One | 188271 | |
| 3-(trimethylsilyl) propionic acid-2,2,3,3-d4 sodium salt (TSP) | Alfa Aesar | A1448 | |
| 5 mL tubes, round bottom | Greiner Bio One | 115101 | |
| Ammonia Solution 32% | Roth | A990.1 | |
| Bruker 600 MHz NMR spectrometer, equipped with a TXI probe head | Bruker | - | |
| Centrifuge, refrigerated, e.g. 5430 R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chloroform ≥99% p.a. | Roth | 3313.1 | |
| Cryocool | Thermo Scientific | SCC1 | heat transfer fluid for SpeedVac System |
| Deuterium Oxide (D2O) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-10-PK | |
| Dimethyl sulfoxide-d6 (d6-DMSO) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-6-1000 | |
| Drying Chamber | Binder | 9090-0018 | |
| DURAN culture tubes, 13 x 100mm, GL 14, 9 mL | VWR International | 212-0375 | |
| Edwards Deep vacuum oil pump RV5 | Thermo Scientific | 16234611 | part of the SpeedVac System |
| Eppendorf 1.5 mL tubes | Greiner Bio One | 616201 | |
| Gilson pipetting robot GX-241 Aspec | Gilson Inc. | 26150008 | |
| L-arginine | AppliChem | A3675 | |
| Methanol ≥99% | Roth | 8388.4 | |
| Milli-Q water aparatus | Millipore | ZIQ7000T0 | |
| Oasis MCX 1cc/30 mg, 1 mL cartridges | Waters | 186000252 | https://www.waters.com/waters/en_US/Waters-Oasis-Sample-Extraction-SPE-Products/ |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | LONBE17-512F | |
| Precellys 24 tissue homogenizer | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | https://www.bertin-instruments.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys24-tissue-homogenizer/ |
| Precellys tubes (pulping tubes) | VWR International | 432-0351 | |
| Precellyse 1.4 mm zirconium oxide beads | VWR International | 432-0356 | |
| Reacti-Therm/ReactiVap Heating, Stirring, and Evaporation Modules | Thermo Scientific | TS-18820 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/TS-18820 |
| Rotor for 1.5 mL tubes, FA-45-30-11 | Eppendorf | 5427753001 | |
| Savant Refrigerated Cooling Trap | Thermo Scientific | 15996161 | part of the SpeedVac System |
| Savant SpeedVac vacuum concentrator SPD210 | Thermo Scientific | 15906181 | part of the SpeedVac System; equipped with rotor for 1.5 ml tubes |
| Screw caps for glas vials with PTFE sealing, DN9 | Dr. R. Forche Chromatographie | CT11B3011 | |
| Seasand | Roth | 8441.3 | |
| Short thread glas vials 1.5 mL, ND9 | Dr. R. Forche Chromatographie | VT1100309 | |
| Sodium azide (NaN3) | Roth | K305.1 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | VWR | BDH7363-4 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | VWR | 80731-078 | |
| TopSpin 4.0 (Software) | Bruker | - | https://www.bruker.com |
| ω-NG-asymmetric dimethylarginine (ADMA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-208093 | |
| ω-NG-monomethylarginine (MMA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-200739A | |
| ω-NG-NG'-symmetric dimethylarginine (SDMA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-202235A |
References
- Guccione, E., Richard, S. The regulation, functions and clinical relevance of arginine methylation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).
- Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
- Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase. Journal of Biological Chemistry. 271 (25), 15034-15044 (1996).
- Bachand, F. Protein arginine methyltransferases: from unicellular eukaryotes to humans. Eukaryotic Cell. 6 (6), 889-898 (2007).
- Wang, Y. C., Li, C. Evolutionarily conserved protein arginine methyltransferases in non-mammalian animal systems. FEBS Journal. 279 (6), 932-945 (2012).
- Ahmad, A., Cao, X. Plant PRMTs broaden the scope of arginine methylation. Journal of Genetics and Genomics. 39 (5), 195-208 (2012).
- Fisk, J. C., Read, L. K. Protein arginine methylation in parasitic protozoa. Eukaryotic Cell. 10 (8), 1013-1022 (2011).
- Hofweber, M., et al. Phase Separation of FUS Is Suppressed by Its Nuclear Import Receptor and Arginine Methylation. Cell. 173 (3), 706-719 (2018).
- Chong, P. A., Vernon, R. M., Forman-Kay, J. D. RGG/RG Motif Regions in RNA Binding and Phase Separation. Journal of Molecular Biology. 430 (23), 4650-4665 (2018).
- Nott, T. J., et al. Phase transition of a disordered nuage protein generates environmentally responsive membraneless organelles. Molecular Cell. 57 (5), 936-947 (2015).
- Fong, J. Y., et al. Therapeutic targeting of RNA splicing catalysis through inhibition of protein arginine methylation. Cancer Cell. 36 (2), 194-209 (2019).
- Yang, Y., Bedford, M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer. Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).
- Wang, S. M., Dowhan, D. H., Muscat, G. E. O. Epigenetic arginine methylation in breast cancer: emerging therapeutic strategies. Journal of Molecular Endocrinology. 62 (3), 223-237 (2019).
- Gulla, A., et al. Protein arginine methyltransferase 5 has prognostic relevance and is a druggable target in multiple myeloma. Leukemia. 32 (4), 996-1002 (2018).
- Wang, Z., Tang, W. H., Cho, L., Brennan, D. M., Hazen, S. L. Targeted metabolomic evaluation of arginine methylation and cardiovascular risks: potential mechanisms beyond nitric oxide synthase inhibition. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (9), 1383-1391 (2009).
- Friesen, W. J., Massenet, S., Paushkin, S., Wyce, A., Dreyfuss, G. SMN, the product of the spinal muscular atrophy gene, binds preferentially to dimethylarginine-containing protein targets. Molecular Cell. 7 (5), 1111-1117 (2001).
- Lee, J. H., Park, G. H., Lee, Y. K., Park, J. H. Changes in the arginine methylation of organ proteins during the development of diabetes mellitus. Diabetes Research and Clinical Practice. 94 (1), 111-118 (2011).
- Bulau, P., et al. Analysis of methylarginine metabolism in the cardiovascular system identifies the lung as a major source of ADMA. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 292 (1), 18-24 (2007).
- Zakrzewicz, D., Eickelberg, O. From arginine methylation to ADMA: a novel mechanism with therapeutic potential in chronic lung diseases. BMC Pulmonary Medicine. 9, 5 (2009).
- Fulton, M. D., Brown, T., Zheng, Y. G. The biological axis of protein arginine methylation and asymmetric dimethylarginine. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), (2019).
- Aliferis, K. A., Chrysayi-Tokousbalides, M. Metabolomics in pesticide research and development: review and future perspectives. Metabolomics. 7 (1), 35-53 (2011).
- Chiang, K., et al. PRMT5 Is a Critical Regulator of Breast Cancer Stem Cell Function via Histone Methylation and FOXP1 Expression. Cell Reports. 21 (12), 3498-3513 (2017).
- Blanc, R. S., Vogel, G., Chen, T., Crist, C., Richard, S. PRMT7 preserves satellite cell regenerative capacity. Cell Reports. 14 (6), 1528-1539 (2016).
- Lim, Y., Lee, E., Lee, J., Oh, S., Kim, S. Down-regulation of asymmetric arginine methylation during replicative and H2O2-induced premature senescence in WI-38 human diploid fibroblasts. Journal of Biochemistry. 144 (4), 523-529 (2008).
- Bhatter, N., et al. Arginine methylation augments Sbp1 function in translation repression and decapping. FEBS Journal. 286 (23), 4693-4708 (2019).
- Lee, Y. H., Stallcup, M. R. Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation. Molecular Endocrinology. 23 (4), 425-433 (2009).
- Zhang, F., et al. Global analysis of protein arginine methylation. Cell Reports Methods. 1 (2), (2021).
- Zinellu, A., Sotgia, S., Scanu, B., Deiana, L., Carru, C. Determination of protein-incorporated methylated arginine reference values in healthy subjects whole blood and evaluation of factors affecting protein methylation. Clinical Biochemistry. 41 (14-15), 1218-1223 (2008).
- Weiss, M., Manneberg, M., Juranville, J. F., Lahm, H. W., Fountoulakis, M. Effect of the hydrolysis method on the determination of the amino acid composition of proteins. Journal of Chromatography A. 795 (2), 263-275 (1998).
- Davids, M., et al. Simultaneous determination of asymmetric and symmetric dimethylarginine, L-monomethylarginine, L-arginine, and L-homoarginine in biological samples using stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 900, 38-47 (2012).
- Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation. Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).
- Vignoli, A., et al. High-throughput metabolomics by 1D NMR. Angewandte Chemie International Edition. 58 (4), 968-994 (2019).
- Carr, H. Y., Purcell, E. M. Effects of diffusion on free precession in nuclear magnetic resonance experiments. Physical Review. 94 (3), 630-638 (1954).
- Meiboom, S., Gill, D. Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation times. Review of Scientific Instruments. 29 (8), 688-691 (1958).
- Nagayama, K., Wuthrich, K., Bachmann, P., Ernst, R. R. Two-dimensional J-resolved 1H n.m.r. spectroscopy for studies of biological macromolecules. Biochemical and Biophysical Research Communications. 78 (1), 99-105 (1977).
- Stryeck, S., et al. Serum concentrations of Citrate, Tyrosine, 2- and 3- Hydroxybutyrate are associated with increased 3-month mortality in acute heart failure patients. Scientific Reports. 9 (1), 6743 (2019).
- Zhang, F., et al. Tissue-specific landscape of metabolic dysregulation during ageing. Biomolecules. 11 (2), (2021).
- Zhang, F., et al. Growing human hepatocellular tumors undergo a global metabolic reprogramming. Cancers. 13 (8), (2021).
- Pahlich, S., Zakaryan, R. P., Gehring, H. Protein arginine methylation: Cellular functions and methods of analysis. Biochimica et Biophysica Acta. 1764 (12), 1890-1903 (2006).
- Habisch, H. J., et al. Neuroectodermally converted human mesenchymal stromal cells provide cytoprotective effects on neural stem cells and inhibit their glial differentiation. Cytotherapy. 12 (4), 491-504 (2010).
- Ibanez, G., McBean, J. L., Astudillo, Y. M., Luo, M. An enzyme-coupled ultrasensitive luminescence assay for protein methyltransferases. Analytical Biochemistry. 401 (2), 203-210 (2010).
- Hevel, J. M., Price, O. M. Rapid and direct measurement of methyltransferase activity in about 30min. Methods. 175, 3-9 (2020).
- Altincekic, N., et al. Site-specific detection of arginine methylation in highly repetitive protein motifs of low sequence complexity by NMR. Journal of the American Chemical Society. 142 (16), 7647-7654 (2020).
- Kaneb, H. M., Dion, P. A., Rouleau, G. A. The FUS about arginine methylation in ALS and FTLD. The EMBO Journal. 31 (22), 4249-4251 (2012).
