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Developmental Biology

मॉडलिंग पैराक्रिन नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग इन विट्रो

Published: December 10, 2021 doi: 10.3791/63247
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3
1Department of Surgery, Keck School of Medicine of USC, 2Department of Pediatrics, Keck School of Medicine of USC, 3Heart Institute, Children’s Hospital Los Angeles

Summary

वर्तमान अध्ययन विट्रो में पैराक्रिन नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग घटनाओं का अध्ययन करने के लिए एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और वापस लेने योग्य विधि को रेखांकित करता है। यह प्रोटोकॉल मुराइन न्यूरल क्रेस्ट कोशिकाओं और मायोब्लास्ट्स में पैराक्रिन डब्ल्यूएनटी 5 ए सिग्नलिंग के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए लागू किया गया था।

Abstract

नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग इंट्रासेल्युलर एक्टिन फिलामेंट संगठन और भ्रूणजनन के दौरान पूर्वज कोशिकाओं के ध्रुवीकृत प्रवास को नियंत्रित करता है। इस प्रक्रिया में सिग्नल-भेजने और सिग्नल-रिसीविंग कोशिकाओं के बीच जटिल और समन्वित पैराक्रिन इंटरैक्शन की आवश्यकता होती है। यह देखते हुए कि ये इंटरैक्शन विभिन्न वंशों से विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच हो सकते हैं, सेल-विशिष्ट दोषों का विवो मूल्यांकन चुनौतीपूर्ण हो सकता है। वर्तमान अध्ययन इन विट्रो में पैराक्रिन नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग का मूल्यांकन करने के लिए एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल को (1) किसी भी दो सेल प्रकार के हित के बीच नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग के कार्यात्मक और आणविक आकलन करने की क्षमता के साथ डिज़ाइन किया गया था; (2) नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग मार्ग में सिग्नल-भेजने बनाम सिग्नल-प्राप्त अणुओं की भूमिका का विश्लेषण; और (3) मानक आणविक या फार्माकोलॉजिकल दृष्टिकोण के साथ फेनोटाइपिक बचाव प्रयोग करें।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग मायोब्लास्ट्स में न्यूरल क्रेस्ट सेल (एनसीसी) -मध्यस्थता नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। एनसीसी की उपस्थिति मायोब्लास्ट्स में फेलोइडिन-पॉजिटिव साइटोप्लाज्मिक फिलोपोडिया और लैमेलिपोडिया की बढ़ती संख्या से जुड़ी हुई है और घाव भरने वाली परख में मायोब्लास्ट माइग्रेशन में सुधार हुआ है। डब्ल्यूएनटी 5 ए-आरओआर 2 अक्ष को एनसीसी और दूसरे हृदय क्षेत्र (एसएचएफ) कार्डियोमायोब्लास्ट पूर्वजों के बीच एक महत्वपूर्ण नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग मार्ग के रूप में पहचाना गया था। अंत में, यह विट्रो में पैराक्रिन नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक अत्यधिक ट्रैक्टेबल प्रोटोकॉल है।

Introduction

नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग एक विकासवादी संरक्षित मार्ग है जो सेलुलर फिलामेंट संगठन और दिशात्मक प्रवास को नियंत्रित करता है। इस मार्ग को कई जैविक प्रक्रियाओं में फंसाया गया है, जिसमें भ्रूण ऊतक मोर्फोजेनेसिस 1,2,3, लसीका और संवहनी एंजियोजेनेसिस 4,5,6,7, और कैंसर की वृद्धि और मेटास्टेसिस 8,9,10 शामिल हैं . सेलुलर स्तर पर, सिग्नल-भेजने और सिग्नल-प्राप्त करने वाली कोशिकाओं के बीच समन्वित पैराक्रिन इंटरैक्शन के माध्यम से नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग की जाती है। ये इंटरैक्शन अक्सर विभिन्न वंशों या प्रकारों की कोशिकाओं के बीच होते हैं और इसमें एक विविध आणविक नेटवर्क शामिल होता है जिसमें 19 लिगेंड और कई रिसेप्टर्स, सह-रिसेप्टर्स और डाउनस्ट्रीम सिग्नल ट्रांसडक्शन प्रभावक11 शामिल होते हैं। इस सिग्नलिंग प्रक्रिया को और जटिल बनाते हुए, पिछले अध्ययनों से पता चला है कि लिगैंड-रिसेप्टर संयोजन एक संदर्भ- और ऊतक-निर्भर तरीकेसे भिन्न हो सकते हैं 12,13, और सिग्नल-प्राप्त करने वाली कोशिकाओं में नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग चलाने वाले एक ही स्रोत लिगेंड को कई सिग्नल-सेंडिंग सेल प्रकार14,15 द्वारा उत्पादित किया जा सकता है। . नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग से जुड़ी सेलुलर और आणविक जटिलता को देखते हुए, विवो में व्यक्तिगत और चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक तंत्र का अध्ययन करने की क्षमता सीमित हो गई है।

विट्रो में सेल कल्चर तकनीकों का उपयोग करके नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग का अध्ययन करने के प्रयास किए गए हैं। उदाहरण के लिए, सेलुलर मोनोलेयर में किए गए घाव-उपचार परख का उपयोग सेलुलर दिशात्मकप्रवासन 4,16,17,18,19 का कार्यात्मक रूप से आकलन करने के लिए किया गया है। इम्यूनोस्टेनिंग तकनीकों का उपयोग सेलुलर आकृति विज्ञान 7,10, वास्तुकला और असममित ध्रुवीकरण 18,19,20 में गैर-कैननिकल डब्ल्यूएनटी-प्रेरित परिवर्तनों का मूल्यांकन करने के लिए सतह प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्थानिक विश्लेषण करने के लिए किया गया है। यद्यपि इन दृष्टिकोणों ने सिग्नल-प्राप्त कोशिकाओं में डब्ल्यूएनटी-संबंधित फेनोटाइप्स को चिह्नित करने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान किए हैं, इन प्रोटोकॉल में सिग्नल भेजने वाले घटकों की कमी विवो में देखे गए पैराक्रिन सिग्नलिंग तंत्र को सटीक रूप से मॉडल करने की उनकी क्षमता को सीमित करती है। नतीजतन, इन विट्रो सिस्टम विकसित करने की एक महत्वपूर्ण आवश्यकता बनी हुई है जो नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी मार्ग के सिग्नल-भेजने और प्राप्त करने वाली कोशिकाओं के बीच पैराक्रिन सिग्नलिंग इंटरैक्शन के मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मूल्यांकन की अनुमति देती है, विशेष रूप से विभिन्न सेल प्रकारों की।

इस अंत तक, इस अध्ययन का प्राथमिक उद्देश्य विट्रो में पैराक्रिन नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग इंटरैक्शन को मॉडल करने के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित करना था। हमने एक गैर-संपर्क सह-संस्कृति प्रणाली विकसित की है जो इन इंटरैक्शन के सिग्नल-सेंडिंग और सिग्नल-रिसीविंग घटकों को पुन: व्यवस्थित करती है और गैर-कैननिकल डब्ल्यूएनटी मार्ग में विशिष्ट लिगैंड-रिसेप्टर तंत्र का स्वतंत्र रूप से अध्ययन करने के लिए मानक आणविक, आनुवंशिक या फार्माकोलॉजिकल दृष्टिकोण के उपयोग की अनुमति देती है। एनसीसी-मध्यस्थता वाले डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग के तंत्र की जांच स्थापित मुराइन सेल लाइनों का उपयोग करके मायोब्लास्ट्स में की गई थी। सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, इस मॉडल का उपयोग चूहों में विवो अध्ययनों में पूर्व के निष्कर्षों की पुष्टि करने के लिए किया गया था जो डब्ल्यूएनटी 5 ए-आरओआर 2 अक्ष को एनसीएस 21 और एसएचएफ कार्डियोमायोब्लास्टपूर्वजों 3,22,23 के बीच एक प्रासंगिक नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग मार्ग के रूप में फंसाते हैं।

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Protocol

1. कोशिकाओं के पूर्व-प्रयोगात्मक विस्तार और पासिंग

  1. C2C12 सेल संस्कृति:
    1. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ डलबेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) को मिलाकर सी 2 सी 12 संस्कृति माध्यम के 500 एमएल तैयार करें।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सी 2 सी 12 कोशिकाओं की एक शीशी पिघलाएं। जबकि सी 2 सी 12 कोशिकाएं पिघल रही हैं, 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में सी 2 सी 12 माध्यम के 5 एमएल जोड़ें। पी 1000 पिपेट का उपयोग करके पिघली हुई कोशिकाओं को तुरंत 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: सी 2 सी 12 कोशिकाएं म्यूरिन मायोब्लास्ट कोशिकाएं हैं जिन्हें पहले कार्डियोमायोब्लास्ट पूर्वजों के मॉडलिंग के लिए प्राथमिक सेल लाइन के रूप में उपयोग और मान्य किया गया है।
    3. धीरे से सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके शंक्वाकार ट्यूब में सी 2 सी 12 कोशिकाओं को मिलाएं। फिर, सी 2 सी 12 माध्यम (6 एमएल) में पिघली हुई कोशिकाओं की पूरी मात्रा को 75 सेमी2 फ्लास्क में जोड़ें।
    4. 12 एमएल की कुल मात्रा के लिए फ्लास्क में 6 एमएल ताजा सी 2 सी 12 माध्यम जोड़ें। धीरे से फ्लास्क को घुमाएं जैसे कि सेल और मीडिया समाधान फ्लास्क के पूरे तल को कवर करता है। फ्लास्क को सेल कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में रखें ताकि कोशिकाओं को पालन करने की अनुमति मिल सके।
    5. कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में विस्तार करने की अनुमति दें जब तक कि वे ~ 60% कंफ्लुएंसी तक नहीं पहुंच जाते।
      नोट: यह समय-समय पर इनक्यूबेटर से कोशिकाओं को हटाकर और माइक्रोस्कोप के तहत उनकी स्थिरता की जांच करके निर्धारित किया जा सकता है। इनक्यूबेटर से कोशिकाओं को हटाने के समय को कम करना सुनिश्चित करें।
  2. C2C12 कोशिकाओं को पास करना:
    1. सी 2 सी 12 माध्यम, 500 एमएल 1 एक्स पीबीएस, और 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गर्म करें। अभिकर्मकों को गर्म करने के बाद, सभी अभिकर्मकों को सेल कल्चर हुड में स्थानांतरित करें।
    2. सेल कल्चर हुड में सी 2 सी 12 कोशिकाओं वाले फ्लास्क लाएं। धीरे से गर्म 1x PBS के साथ C2C12 कोशिकाओं वाले फ्लास्क को दो बार धोएं।
      1. फ्लास्क को 45° कोण पर झुकाएं और वैक्यूम सक्शन से जुड़े ग्लास पिपेट के साथ C2C12 माध्यम को एस्पिरेट करें। 45 ° कोण बनाए रखते हुए, सावधानीपूर्वक एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके फ्लास्क के कोने में 10 एमएल गर्म 1x पीबीएस जोड़ें। फ्लास्क को सतह पर सपाट रखें और धीरे-धीरे फ्लास्क को गोलाकार गति में स्थानांतरित करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि 1x PBS कोशिकाओं के पूरे मोनोलेयर पर धोता है।
        नोट: सावधान रहें कि माध्यम को उत्तेजित करते समय सी 2 सी 12 मोनोलेयर को बाधित न करें।
    3. दूसरे धोने के बाद 1x PBS को हटा दें। फ्लास्क में 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए का 1 एमएल जोड़ें, ऊपर वर्णित फ्लास्क को धीरे से स्थानांतरित करें ताकि ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान को जितना संभव हो उतना मोनोलेयर में फैलने की अनुमति मिल सके और फ्लास्क को 2 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में रखें।
    4. 2 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, फ्लास्क को इनक्यूबेटर से हटा दें और किसी भी शेष कोशिकाओं को अलग करने के लिए धीरे से टैप करें।
    5. ट्रिप्सिन को बुझाने के लिए सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ फ्लास्क में 9 एमएल सी 2 सी 12 माध्यम जोड़ें। सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, धीरे से कोशिकाओं को माध्यम से कुल्ला करें और ट्रिप्सिनाइज्ड सेल सस्पेंशन के 10 एमएल एकत्र करें। एक ताजा 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में सेल निलंबन के 10 एमएल जोड़ें और 5 मिनट के लिए 100 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    6. शंक्वाकार ट्यूब को सेल कल्चर हुड में वापस करें और वैक्यूम सक्शन से जुड़े ग्लास पिपेट के साथ सुपरनैटेंट को हटा दें। सतह पर तैरने वाले को उत्तेजित करते समय, ध्यान रखें कि शंक्वाकार ट्यूब के तल पर सेल गोली को बाधित न करें। ऐसा करने के लिए, शंक्वाकार ट्यूब में सतह पर तैरने वाले के ~ 0.2 एमएल को छोड़ दें। ताजा C2C12 माध्यम के 10 एमएल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    7. अतिरिक्त पासिंग के लिए, 75 सेमी2 फ्लास्क में पुन: निलंबित कोशिकाओं के 1 एमएल जोड़ें। एक सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ फ्लास्क में 11 एमएल सी 2 सी 12 माध्यम जोड़ें और फ्लास्क को इनक्यूबेटर में रखें।
  3. एसटीओ सेल संस्कृति:
    1. 7% एफबीएस, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 2 एनएम एल-ग्लूटामाइन के साथ 500 एमएल डीएमईएम बनाकर एसटीओ कल्चर माध्यम तैयार करें।
    2. 500 एमएल ऊतक-ग्रेड या ऑटोक्लेव पानी वाली बोतल में 0.5 ग्राम जिलेटिन पाउडर जोड़कर 0.1% जिलेटिन तैयार करें। 75 सेमी2 फ्लास्क में 0.1% जिलेटिन समाधान का 7 एमएल जोड़ें। फ्लास्क को इस तरह घुमाएं कि जिलेटिन समाधान फ्लास्क के पूरे तल को कवर करता है। फ्लास्क को सेल कल्चर हुड में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने दें।
    3. 30 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, वैक्यूम सक्शन से जुड़े पिपेट का उपयोग करके अतिरिक्त जिलेटिन को हटा दें। फ्लास्क को उपयोग करने से पहले 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में रहने दें।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में एसटीओ कोशिकाओं की एक शीशी पिघलाएं। पी 1000 पिपेट का उपयोग करके, पिघली हुई कोशिकाओं को तुरंत 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 5 एमएल ताजा तैयार एसटीओ कल्चर माध्यम हो।
      नोट: एसटीओ कोशिकाएं म्यूरिन भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट हैं जो नियमित रूप से सेल कल्चर प्रोटोकॉल में फीडर कोशिकाओं के रूप में उपयोग की जाती हैं।
    5. धीरे से एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं को मिलाएं। जिलेटिन-लेपित 75 सेमी2 फ्लास्क में कोशिकाओं की पूरी मात्रा (6 एमएल) जोड़ें। फ्लास्क को घुमाएं ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि सेल निलंबन फ्लास्क के तल के साथ अच्छी तरह से वितरित किया गया है।
    6. 12 एमएल की कुल मात्रा के लिए फ्लास्क में 6 एमएल ताजा एसटीओ माध्यम जोड़ें। फ्लास्क को घुमाएं जैसा कि ऊपर वर्णित है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि फ्लास्क के तल के साथ कोशिकाएं और माध्यम अच्छी तरह से वितरित किए जाते हैं। फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें ताकि कोशिकाओं को पालन करने की अनुमति मिल सके। कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में प्रसार करने की अनुमति दें जब तक कि वे ~ 60-70% कंफ्लुएंसी तक नहीं पहुंच जाते।
  4. एसटीओ कोशिकाओं को पास करना:
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गर्म एसटीओ सेल माध्यम, 1xPBS, और 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए।
    2. चरण 1.2.2.1 में वर्णित गर्म 1x PBS के साथ एसटीओ कोशिकाओं वाले फ्लास्क को धीरे से दो बार कुल्ला करें।
    3. पी 1000 पिपेट का उपयोग करके फ्लास्क में 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए का 1 एमएल जोड़ें। फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 5 मिनट के लिए रखें।
    4. 5 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, फ्लास्क को इनक्यूबेटर से हटा दें। किसी भी अनुयायी कोशिकाओं को अलग करने के लिए फ्लास्क को धीरे से टैप करें।
    5. ट्रिप्सिन को बुझाने के लिए फ्लास्क में 9 एमएल एसटीओ माध्यम जोड़ें और ऊपर वर्णित ट्रिप्सिनाइज्ड सेल सस्पेंशन के 10 एमएल एकत्र करें। 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में सेल निलंबन के 10 एमएल जोड़ें और 5 मिनट के लिए 100 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    6. सतह पर तैरने वाले को हटा दें और ऊपर वर्णित एसटीओ माध्यम के 10 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। अतिरिक्त पासिंग के लिए, 75 सेमी2 फ्लास्क में पुन: निलंबित कोशिकाओं के 1 एमएल जोड़ें। एसटीओ माध्यम के 11 एमएल जोड़ें, फ्लास्क के तल के साथ कोशिकाओं और माध्यम के वितरण को सुनिश्चित करने के लिए फ्लास्क को घुमाएं, और फ्लास्क को इनक्यूबेटर में रखें।
  5. निष्क्रिय एसटीओ सेल संस्कृति और ओ 9 -1 सेल बेसल मध्यम तैयारी:
    1. 15% एफबीएस, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 2 एनएम एल-ग्लूटामाइन, 0.1 एमएम न्यूनतम गैर-अमीनो एसिड, 1 एनएम सोडियम पाइरूवेट और 55 एसएम बीटा-मर्काप्टोएथेनॉल के साथ 500 एमएल डीएमईएम मिलाकर ओ 9-1 सेल बेसल कल्चर माध्यम तैयार करें।
    2. 0.5 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता पर 1x PBS में माइटोमाइसिन C समाधान तैयार करें, सीधे एक माइटोमाइसिन सी शीशी में 1x PBS के 4 एमएल जोड़कर। पी 1000 पिपेट के साथ कई बार समाधान करें। 1x PBS में माइटोमाइसिन C को और भंग करने के लिए, शीशी को 45 मिनट से 1 घंटे के लिए भंवर मिक्सर या बेंचटॉप रॉकर पर रखें।
    3. मानक एसटीओ माध्यम में जोड़े गए 0.01 मिलीग्राम / एमएल माइटोमाइसिन सी की अंतिम एकाग्रता के साथ एसटीओ प्लेटों का इलाज करके एसटीओ कोशिकाओं को निष्क्रिय करें। एसटीओ प्लेटों को 2 घंटे के लिए इनक्यूबेटर के अंदर रखें, इनक्यूबेटर के बाहर बिताए गए समय को कम करके माइटोमाइसिन सी युक्त फ्लास्क को प्रकाश से बचाने का ध्यान रखें। माइटोमाइसिन उपचार के बाद, चरण 1.2.2.1 में वर्णित 1x PBS में कोशिकाओं को दो बार धोएं।
      नोट: मिटोमाइसिन सी एसटीओ कोशिकाओं के प्रसार को रोकता है ताकि उनका उपयोग फ्लास्क में अतिप्रवाह बनने के बिना कई दिनों में वातानुकूलित माध्यम उत्पन्न करने के लिए किया जा सके।
    4. 1x PBS को हटाने के बाद, निष्क्रिय एसटीओ सेल संस्कृतियों में O9-1 बेसल कल्चर माध्यम के 12 एमएल जोड़ें और उन्हें 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। वातानुकूलित, निष्क्रिय एसटीओ + ओ 9 -1 बेसल कल्चर माध्यम एकत्र करें और इसे प्रकाश से बचाने के लिए पन्नी में लपेटे गए 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में रखें।
    5. ऊपर वर्णित निष्क्रिय एसटीओ सेल संस्कृतियों में ताजा ओ 9 -1 बेसल संस्कृति माध्यम के 12 एमएल जोड़ें। हर 24 घंटे में निष्क्रिय एसटीओ कोशिकाओं वाले एक ही फ्लैंक में ताजा ओ 9 -1 बेसल कल्चर माध्यम जोड़कर इस चरण को दोहराएं।
      नोट: माइटोमाइसिन सी उपचार के बाद, निष्क्रिय एसटीओ कोशिकाएं प्रसार नहीं कर सकती हैं; इसलिए, निष्क्रिय एसटीओ कोशिकाओं वाले फ्लास्क को वातानुकूलित माध्यम उत्पन्न करने के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है।
    6. पन्नी से लिपटे 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों को वातानुकूलित, निष्क्रिय एसटीओ + ओ 9-1 बेसल कल्चर माध्यम को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि माध्यम का कुल 500 एमएल एकत्र नहीं किया जाता है।
  6. O9-1 सेल संस्कृति:
    1. 500 एमएल वातानुकूलित एसटीओ + ओ 9 -1 बेसल माध्यम का उपयोग करके ओ 9-1 सेल विकास संस्कृति माध्यम तैयार करें, और ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक (एलआईएफ) और 25 एनजी / एमएल बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक (बुनियादी-एफजीएफ) की 103 इकाइयों को जोड़ें।
    2. चरण 1.3.2-1.3.3 में वर्णित 0.1% जिलेटिन-लेपित फ्लास्क तैयार करें।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ओ 9 -1 कोशिकाओं की एक शीशी पिघलाएं। पिघली हुई कोशिकाओं को तुरंत 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 5 एमएल ताजा तैयार ओ 9 -1 विकास माध्यम होता है।
      नोट: ओ 9 -1 सेल लाइन एकमात्र स्थिर, मल्टीपोटेंट न्यूरल क्रेस्ट सेल लाइन है जो माउस से उत्पन्न हुई है। इस सेल लाइन का उपयोग आमतौर पर विट्रो प्रयोगों में तंत्रिका शिखा में किया जाता है।
    4. धीरे से एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके कोशिकाओं को मिलाएं। जिलेटिन-लेपित 75 सेमी2 फ्लास्क में पूरे 6 एमएल कोशिकाओं को जोड़ें।
    5. 12 एमएल की कुल मात्रा के लिए फ्लास्क में 6 एमएल ओ 9-1 विकास माध्यम जोड़ें। फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें ताकि कोशिकाओं को पालन करने की अनुमति मिल सके। कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में प्रसार करने की अनुमति दें जब तक कि वे ~ 60-70% कंफ्लुएंसी तक नहीं पहुंच जाते।
  7. O9-1 कोशिकाओं को पास करना:
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गर्म ओ 9 -1 विकास माध्यम, 1 एक्स पीबीएस, और 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए।
    2. चरण 1.2.2.1 में वर्णित गर्म 1x PBS के साथ O9-1 कोशिकाओं वाली प्लेट को धीरे से धोएं।
    3. फ्लास्क में 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए का 1 एमएल जोड़ें और इसे 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
    4. 5 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, फ्लास्क को इनक्यूबेटर से हटा दें और किसी भी अनुयायी कोशिकाओं को अलग करने के लिए फ्लास्क को धीरे से टैप करें।
    5. ट्रिप्सिन को बुझाने के लिए फ्लास्क में 9 एमएल ओ 9-1 विकास माध्यम जोड़ें। ट्रिप्सिनाइज्ड सेल सस्पेंशन के 10 एमएल एकत्र करें और 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में इस सेल निलंबन के 10 एमएल जोड़ें। ट्यूब को 5 मिनट के लिए 100 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    6. सतह पर तैरने वाले को हटा दें और कोशिकाओं को 10 एमएल ओ 9 -1 विकास माध्यम में फिर से निलंबित करें। अतिरिक्त पासिंग के लिए, 75 सेमी2 फ्लास्क में पुन: निलंबित कोशिकाओं के 1 एमएल जोड़ें। 11 एमएल ओ 9-1 विकास माध्यम जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 12 एमएल माध्यम में कोशिकाओं वाले फ्लास्क को रखें।

2. एक सहसंस्कृति प्रणाली में कोशिकाओं को चढ़ाना

  1. प्लेटिंग C2C12 सेल कक्ष:
    1. ट्रिप्सिनाइजेशन के बाद (जैसा कि चरण 1.2 में वर्णित है), सी 2 सी 12 माध्यम के 10 एमएल में सी 2 सी 12 सेल गोली को फिर से निलंबित करें। पुन: निलंबित C2C12 कोशिकाओं के 0.5 mL को हटाकर और उन्हें 9.5 mL ताजा C2C12 माध्यम वाले एक नए 15 mL शंक्वाकार ट्यूब में जोड़कर C2C12 माध्यम में 1: 20 अनुपात में कोशिकाओं को पतला करें। धीरे से निलंबन को एक सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ मिलाएं।
    2. पी 1000 पिपेट का उपयोग करके एक नए 4-कक्षित कुएं के प्रत्येक कुएं में 1: 20-पतला सी 2 सी 12 कोशिकाओं का 1 एमएल जोड़ें और इनक्यूबेटर में 4-कक्षित कुएं को रखें।
  2. चढ़ाना O9-1 सेल सम्मिलित करता है:
    1. ट्रिप्सिनाइजेशन के बाद, ओ 9 -1 विकास माध्यम के 10 एमएल में ओ 9 -1 सेल गोली को फिर से निलंबित करें। पुन: निलंबित C2C12 कोशिकाओं के 0.5 mL को हटाकर और उन्हें 9.5 mL ताजा O9-1 विकास माध्यम वाले एक नए 15 mL शंक्वाकार ट्यूब में जोड़कर O9-1 विकास माध्यम में 1: 20 अनुपात में कोशिकाओं को पतला करें। धीरे से निलंबन को एक सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ मिलाएं।
    2. ओ 9-1 विकास माध्यम के 1 एमएल से भरे एक नए 4-कक्षीय कुएं के प्रत्येक कुएं के अंदर एक एकल पारगम्य सम्मिलित ( सामग्री की तालिका देखें) रखें।
      नोट: यह 4-कक्षित कुआं चरण 2.1.3 से सी 2 सी 12 कोशिकाओं से अलग होना चाहिए।
    3. पी 1000 पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक सम्मिलित में पतला ओ 9 -1 सेल निलंबन का 300 μL जोड़ें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक इंसर्ट का निचला भाग 1.3 एमएल ओ 9-1 विकास माध्यम से भरे कुएं के भीतर डूबा हुआ है। कुएं को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
  3. (वैकल्पिक)। O9-1 कोशिकाओं या C2C12 कोशिकाओं में SIRNA वध करें।
    1. ओ 9 -1 सेल इंसर्ट या सी 2 सी 12 सेल चैंबर कुओं को चढ़ाने के बाद 18-24 घंटे तक सीआरएनए द्वारा जीन वध करें।
      1. निर्माताओं की सिफारिशों और प्रयोग के लिए वांछित सांद्रता के अनुसार कम-सीरम माध्यम ( सामग्री की तालिका देखें) में सीआरएनए और अभिकर्मक अभिकर्मक को पतला करें। धीरे से पतला सीआरएनए और अभिकर्मक अभिकर्मक (1: 1) मिलाएं और मिश्रण को 7 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
        नोट: इस प्रोटोकॉल में, 50 एनएम सांद्रता का उपयोग किया गया था क्योंकि इस सीआरएनए एकाग्रता को लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति के पर्याप्त वध के परिणामस्वरूप निर्धारित किया गया था।
      2. प्रयोगात्मक डिजाइन द्वारा निर्धारित ओ 9 -1 सेल इंसर्ट या सी 2 सी 12 सेल चैंबर कुओं में सीआरएनए-लिपिड कॉम्प्लेक्स जोड़ें और ~ 36-48 घंटे के लिए सीआरएनए-लिपिड कॉम्प्लेक्स के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।

3. घाव परख का प्रदर्शन करना और मात्रात्मक रूप से मायोब्लास्ट माइग्रेशन का आकलन करना

  1. घाव परख:
    1. प्रोटोकॉल के इस हिस्से के साथ आगे बढ़ने से पहले ओ 9 -1 सेल इंसर्ट और सी 2 सी 12 सेल चैंबर कुओं को इनक्यूबेटर में पालन और प्रसार करने की अनुमति दें जब तक कि दोनों कोशिकाएं ~ 70-80% कंफ्लुएंसी पर न हों। यदि कोशिकाएं >90% कंफ्लुएंट बढ़ती हैं, तो स्क्रैच परख के साथ आगे न बढ़ें, क्योंकि कोशिकाएं केवल कुएं से अलग हो जाएंगी।
    2. 1x PBS और C2C12 माध्यम को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखकर गर्म करें।
    3. सी 2 सी 12 कक्ष से सुपरनैटेंट माध्यम को अच्छी तरह से हटा दें और कोशिकाओं को 1x PBS के साथ एक बार धो लें। 1x PBS को हटा दें और तुरंत एक बाँझ P10 पिपेट टिप के साथ कोशिकाओं को खरोंचें।
      1. सेल मोनोलेयर की पूरी लंबाई या चौड़ाई (जैसे, दाएं से बाएं, ऊपर से नीचे) को फैलाने के लिए बाँझ पी 10 पिपेट टिप को एक ही दिशा में मजबूती से पास करें। प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त कोशिकाओं को केवल एक बार खरोंचना सुनिश्चित करें।
        नोट: स्क्रैचिंग परिणामों को अनुकूलित करने के लिए, विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों के कुओं को समान स्तर पर खरोंच करें। ऐसा करने के लिए, सुनिश्चित करें कि प्रत्येक 4-कक्षीय कुएं में प्रत्येक आवश्यक प्रयोगात्मक स्थिति के लिए कोशिकाएं हैं (उदाहरण के लिए, अच्छी तरह से # 1 नकारात्मक नियंत्रण, अच्छी तरह से # 2 सकारात्मक नियंत्रण)। इसके अलावा, प्रत्येक खरोंच के लिए एक नए बाँझ पी 10 पिपेट का उपयोग करें और हर बार पिपेट पर समान मात्रा में बल लागू करें। प्रत्येक कुएं में एक से अधिक खरोंच बनाने का प्रयास न करें।
      2. खरोंच के बाद, जल्दी से पी 1000 पिपेट टिप का उपयोग करके कुएं में 1 एमएल 1 एक्स पीबीएस जोड़ें। खरोंच वाले प्रत्येक कुएं के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
        नोट: प्रत्येक खरोंच से जुड़ी परिवर्तनशीलता को देखते हुए, यह अनुशंसा की जाती है कि प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति में घाव निर्माण के लिए कई कुओं (एन = 3) का उपयोग किया जाता है। तेजी से काम करें क्योंकि इन चरणों के दौरान कोशिकाओं के बिना 1x PBS की अवधि को कम करना महत्वपूर्ण है। प्रत्येक कुएं से 1x PBS को हटाने के बाद, प्रत्येक कुएं में घाव उत्पन्न करने के लिए 5 सेकंड से अधिक नहीं लेना चाहिए।
    4. घाव उत्पन्न करने और प्रत्येक कुएं में 1x PBS वापस जोड़ने के बाद, एक उज्ज्वल क्षेत्र उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके खरोंच को चित्रित करें और इस छवि को बेसलाइन घाव के आकार (समय 0) के रूप में उपयोग करें। छवियों को लेने के लिए, निम्न चरणों का पालन करें:
      1. पावर बटन दबाकर कंप्यूटर और माइक्रोस्कोप चालू करें ( सामग्री की तालिका देखें)। मंच पर कक्ष स्लाइड रखें और उद्देश्य डायल को 5x आवर्धन में घुमाएं।
      2. कंप्यूटर डेस्कटॉप पर सॉफ़्टवेयर आइकन को डबल-क्लिक करके इमेजिंग सॉफ़्टवेयर खोलें (सामग्री तालिका देखें)। सॉफ़्टवेयर होम स्क्रीन पर कैमरा टैब क्लिक करें। AxioCam IC टैब पर कक्षों की कल्पना करने के लिए लाइव बटन क्लिक करें।
      3. सुनिश्चित करें कि प्रकाश फ़िल्टर को कैमरे और कंप्यूटर स्क्रीन पर पारित करने की अनुमति देने के लिए सभी तरह से खींचा गया है। एक्सिओकैम आईसी टैब पर लाइव छवि के केंद्र में घाव क्षेत्र को स्थिति में रखने के लिए कक्ष स्लाइड को मैन्युअल रूप से स्थानांतरित करें और / या घुमाएं।
      4. छवियां लेने के लिए, AxioCam IC टैब के बगल में एक नया टैब खोलने के लिए स्नैप क्लिक करें जिसमें छवि है।
      5. इस स्टिल छवि को सहेजने के लिए, सॉफ़्टवेयर होम पेज के शीर्ष बाईं ओर फ़ाइल क्लिक करें | फ़ाइल नाम बॉक्स में फ़ाइल नाम दर्ज | के रूप में सहेजें। आकृति को कार्ल ज़ीस छवि (*.czi) स्वरूप (डिफ़ॉल्ट सेटिंग) में सहेजें, और फ़ाइल को .czi फ़ाइल के रूप में डेस्कटॉप पर सहेजने के लिए बाईं ओर पट्टी पर डेस्कटॉप का चयन करें, जिसे केवल Zen lite 2012 सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम में खोला जा सकता है.
      6. चित्र को .tiff के रूप में सहेजने के लिए, फ़ाइल नाम बॉक्स में फ़ाइल नाम दर्ज | के रूप में सहेजने के | फ़ाइल क्लिक करें. सेव को टाइप बटन पर क्लिक करके और ड्रॉपडाउन मेनू से *.tiff का चयन करके आकृति को टैग की गई छवि फ़ाइल (* .tiff) के रूप में सहेजें।
        नोट: .tiff प्रारूप किसी भी छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर में खोला जा सकता है।
      7. उसी कुएं में घाव के अन्य बिंदुओं पर 2-3 और छवियां लेने के लिए कक्ष स्लाइड को मैन्युअल रूप से पुनर्स्थापित करें।
        नोट: कुल मिलाकर, इसके परिणामस्वरूप प्रत्येक कुएं में घाव की 3-4 गैर-अतिव्यापी, उच्च-आवर्धन छवियां होंगी।
    5. प्रत्येक कुएं से 1x PBS निकालें और C2C12 माध्यम के 1 mL जोड़ें।
      नोट: घाव पैदा होने के बाद कक्ष को अच्छी तरह से हटाने या जोड़ने के दौरान बहुत आक्रामक रूप से पिपेट न करें, क्योंकि इससे कोशिकाएं कक्ष से अच्छी तरह से अलग हो सकती हैं। इसके अलावा, कक्ष को अच्छी तरह से झुकाएं ताकि सेल मोनोलेयर व्यवधान को कम करने के लिए प्रत्येक कुएं के कोनों पर समाधानों की आकांक्षा और पुन: परिचय किया जा सके।
    6. कक्ष के प्रत्येक कुएं में ओ 9 -1 कोशिकाओं वाले इंसर्ट को मैन्युअल रूप से रखकर अच्छी तरह से सम्मिलित कोकल्चर सिस्टम को इकट्ठा करें। धीरे से इंसर्ट को कुएं में नीचे धकेलें ताकि इंसर्ट का निचला हिस्सा अंतर्निहित सी 2 सी 12 कोशिकाओं के ठीक ऊपर बैठे। इनक्यूबेटर को अच्छी तरह से सम्मिलित संरचनाओं को वापस करें।
      नोट: सम्मिलित के निचले भाग को शारीरिक रूप से स्पर्श करने और यांत्रिक रूप से अंतर्निहित C2C12 कोशिकाओं को बाधित करने की अनुमति न दें।
    7. कोशिकाओं को कुल 9-12 घंटे के लिए माइग्रेट करने दें। इष्टतम माइग्रेशन समय निर्धारित करने के लिए, घाव निर्माण के बाद 6 घंटे पर कोशिकाओं की जांच करें, फिर उसके बाद हर 2-3 घंटे। प्रयोग को समाप्त करें जब नियंत्रण या सकारात्मक नियंत्रण स्थितियों में कोशिकाएं घाव को पूरी तरह से कवर करना शुरू कर देती हैं।
      नोट: निर्माण की गैर-संपर्क प्रकृति को देखते हुए, अंतराल माइग्रेशन प्रगति की जांच करते समय कुओं से ओवरलाइंग इंसर्ट को हटाने की आवश्यकता नहीं होती है। इस परख में उपयोग किए जाने वाले सेल प्रकारों, घाव उत्पादन के समय सेलुलर घनत्व, बनाए गए घाव की चौड़ाई, और हेरफेर कोशिकाओं की प्रयोगात्मक स्थितियों (जैसे, जीन वध, पुनः संयोजक प्रोटीन जोड़) जैसे कारकों के आधार पर प्रवासी परिवर्तनशीलता देखी जाएगी। इन अभिकर्मकों की सांद्रता निर्माता सिफारिशों से मार्गदर्शन के साथ प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित की जानी चाहिए।

4. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होना और माइग्रेटिंग मायोब्लास्ट्स की इमेजिंग

  1. माइग्रेशन परख को समाप्त करना और अच्छी तरह से सम्मिलित प्रणाली का पुनर्निर्माण करना:
    1. 9-12 घंटे माइग्रेशन अवधि (या प्रयोगात्मक स्थितियों द्वारा निर्दिष्ट वैकल्पिक समय) के बाद ओ 9-1 सेल इंसर्ट को हटा दें। पी 1000 पिपेट का उपयोग करके सी 2 सी 12 माध्यम को सावधानीपूर्वक तैयार करें। कक्ष कुओं में 1x PBS का 0.5 mL जोड़ें, और माइग्रेशन के बाद कोशिकाओं की अंतिम छवियां लें।
    2. माध्यम के साथ मिश्रित 1x PBS के सभी 0.5 एमएल को सावधानीपूर्वक तैयार करें और किट निर्देशों का उपयोग करके कक्ष कुओं से प्लास्टिक कक्षों को हटा दें, जिससे अंतर्निहित स्लाइड में C2C12 कोशिकाएं हों।
      नोट: कक्ष कुओं को हटाते समय स्लाइड के अनुरूप सी 2 सी 12 कोशिकाओं को बाधित न करने के लिए सावधान रहें।
  2. इम्यूनोस्टेनिंग प्रदर्शन:
    1. स्लाइड को तुरंत 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) युक्त स्लाइड होल्डर में रखें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 4% पीएफए डालें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए स्लाइड को धोने के लिए स्लाइड धारक में 0.1% ट्राइटन एक्स -100 युक्त 1एक्स पीबीएस (1एक्स पीबीएसटी) जोड़ें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए स्लाइड को धोने के लिए स्लाइड धारक में 1x PBST डालें और स्लाइड होल्डर में 1x PBS जोड़ें। कुल दो 1x PBS वॉश के लिए इस चरण को एक बार फिर दोहराएं।
    2. स्लाइड धारक से स्लाइड निकालें. स्लाइड से समाधान को फैलने से रोकने के लिए स्लाइड के चारों ओर एक हाइड्रोफोबिक सीमा बनाने के लिए हाइड्रोफोबिक पेन के साथ स्लाइड के बाहरी किनारों का पता लगाएं। ध्यान रखें कि अनुयायी कोशिकाओं को बाधित न करें।
    3. स्लाइड में 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) ब्लॉकिंग समाधान (1x PBS में पतला) जोड़ें (~ 0.5 mL प्रति स्लाइड)। सुनिश्चित करें कि समाधान चरण 4.2.4 में बनाई गई हाइड्रोफोबिक सीमा के भीतर निहित है। एक ह्यूमिडिफाइड स्लाइड कक्ष में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए स्लाइड को इनक्यूबेट करें।
      नोट: हालांकि फैलोइडिन इम्यूनोस्टेनिंग के लिए बीएसए ब्लॉकिंग की आवश्यकता नहीं है, प्रोटोकॉल में यह कदम फ्लोरेसेंस एंटीबॉडी धुंधला होने के साथ युग्मन की अनुमति देता है।
    4. 1 घंटे के लिए अवरुद्ध करने के बाद, स्लाइड से ब्लॉकिंग समाधान डालें, स्लाइड में फैलोइडिन एंटीबॉडी (1% बीएसए ब्लॉकिंग समाधान में 1:200 तक पतला) जोड़ें और 995 μL बीएसए समाधान में एंटीबॉडी के 5 μL को जोड़कर) जोड़ें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। फिर, सुनिश्चित करें कि समाधान चरण 4.2.4 में बनाई गई हाइड्रोफोबिक सीमा के भीतर निहित है। यह देखते हुए कि फेलोइडिन एंटीबॉडी एलेक्सा फ्लोर -488 डाई से संयुग्मित है, स्लाइड में जोड़ने से पहले और बाद में एंटीबॉडी अभिकर्मक के प्रकाश जोखिम को कम करें।
    5. अगले दिन, स्लाइड को प्रकाश जोखिम से सुरक्षित स्लाइड धारक में रखें (उदाहरण के लिए, स्लाइड धारक को पन्नी में लपेटें या गैर-पारदर्शी स्लाइड धारक का उपयोग करें)। स्लाइड धारक में कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 1x PBS के साथ धोएं। कुल तीन 10 मिनट के धोने के लिए धोने को दोहराएं।
    6. 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल (DAPI) युक्त माउंटिंग माध्यम जोड़ें और ग्लास कवरलिप्स के साथ स्लाइड्स को माउंट करें। एक मानक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके स्थानांतरित होने वाली कोशिकाओं की छवि।

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Representative Results

म्यूरिन मायोब्लास्ट्स की प्रवासी क्षमता पर एनसी का प्रभाव
इस परख को पहली बार मायोब्लास्ट्स की प्रवासी क्षमता पर एनसीसी के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए लागू किया गया था। चित्रा 1 परख के योजनाबद्ध मॉडल को रेखांकित करता है। इस प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, स्क्रैच परख मायोब्लास्ट्स के साथ किए गए थे जो इंसर्ट की उपस्थिति में उगाए गए लोगों की तुलना में अलगाव (एनसीसी इंसर्ट के बिना) में उगाए गए थे। एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, 500 एनजी / एमएल पुनः संयोजक डब्ल्यूएनटी 5 ए (आरडब्ल्यूएनटी 5 ए) को एनसीसी इंसर्ट के साथ चैंबर कुओं में जोड़ा गया था। RWnt5a की यह एकाग्रता C2C12 कोशिकाओं (पूरक चित्रा S1) में किए गए खुराक-प्रतिक्रिया विश्लेषण द्वारा निर्धारित की गई थी। एनसीसी इंसर्ट की प्रतिनिधि छवियों को पूरक चित्रा एस 2 में दिखाया गया है, यह दर्शाता है कि इस समय एनसीसी स्वस्थ हैं। इम्यूनोफ्लोरेसेंस 50 एनएम डब्ल्यूएनटी 5 ए सीआरएनए (पूरक चित्रा एस 3) के साथ इनक्यूबेशन के बाद प्रोटीन स्तर पर डब्ल्यूएनटी 5 ए के मजबूत वध को दर्शाता है। 9 घंटे की प्रवासन अवधि के बाद, यह पाया गया कि एनसीसी की अनुपस्थिति में जांच किए गए मायोब्लास्ट्स की तुलना में एनसीसी की उपस्थिति में मायोब्लास्ट्स की प्रवासी क्षमता में काफी वृद्धि हुई (72.6% घाव-पुन: आबादी क्षेत्र बनाम 59.1% घाव-पुन: आबादी क्षेत्र, पी = 0.033)। कोकल्चर कुओं में आरडब्ल्यूएनटी 5 ए के अलावा मायोब्लास्ट माइग्रेशन में तेजी आई, कुछ घाव क्षेत्रों ने 9 घंटे के समय बिंदु तक पूरी तरह से वसूली का प्रदर्शन किया, जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है। जैसा कि अपेक्षित था, सभी तीन स्थितियों में प्रवासी मायोब्लास्ट्स ने सामान्य प्रवासी सेलुलर आकृति विज्ञान का प्रदर्शन किया, जिसमें अच्छी तरह से गठित और उभरी हुई फिलोपोडिया और लैमेलोपोडिया और एक्टिन साइटोस्केलेटल अनुमानों का असममित ध्रुवीकरण शामिल है (चित्रा 2 सी)।

मायोब्लास्ट्स के ध्रुवीकृत प्रवास के लिए एनसीसी-व्युत्पन्न डब्ल्यूएनटी 5 ए का महत्व
मायोब्लास्ट माइग्रेशन पर एनसीसी-व्युत्पन्न डब्ल्यूएनटी 5 ए के पैराक्रिन प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, एनसीसी में डब्ल्यूएनटी 5 ए के सीआरएनए-मध्यस्थता वध के बाद मायोब्लास्ट्स में घाव भरने वाले परीक्षण किए गए थे। सबसे पहले, वास्तविक समय-मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन द्वारा एनसीसी में डब्ल्यूएनटी 5 ए वध दक्षता को मान्य किया गया था। Wnt5a के खिलाफ 50 nM siRNA के साथ उपचार नकारात्मक नियंत्रण (स्क्रैम्बल्ड) SIRNA (चित्रा 3A) की तुलना में Wnt5a जीन अभिव्यक्ति को 64% तक कम करने के लिए पाया गया था। इस एकाग्रता का उपयोग करते हुए, ओ 9 -1 सेल इंसर्ट को कोकल्चर को इकट्ठा करने से 48 घंटे पहले या तो नियंत्रण सीआरएनए या डब्ल्यूएनटी 5 ए सीआरएनए के साथ स्थानांतरित किया गया था। C2C12 कोशिकाओं को सामान्य परिस्थितियों में उगाया गया था, और घावों को उचित संयोजन पर बनाया गया था। घाव पैदा होने के तुरंत बाद, नकारात्मक नियंत्रण या डब्ल्यूएनटी 5 ए वध एनसीसी इंसर्ट को प्रत्येक कुएं में जोड़ा गया था। 10 घंटे की प्रवासन अवधि के बाद, यह पाया गया कि एनसीसी में डब्ल्यूएनटी 5 ए के वध ने नियंत्रण एनसीसी (39.1% घाव-पुनरावर्तित क्षेत्र बनाम 74.8% घाव-पुनरावर्तित क्षेत्र, पी < 0.001) के साथ जांच की गई मायोब्लास्ट्स की तुलना में अंतर्निहित मायोब्लास्ट प्रवासी क्षमता को काफी कम कर दिया। इसके अलावा, डब्ल्यूएनटी 5 ए के वध के साथ एनसीसी की उपस्थिति में जांच किए गए मायोब्लास्ट्स ने इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा असामान्य साइटोलॉजिकल आकृति विज्ञान प्रदर्शित किया, जिसमें साइटोप्लाज्मिक क्षेत्रों में कमी और कम एक्टिन साइटोस्केलेटल अनुमान (चित्रा 3 डी) शामिल हैं। मायोब्लास्ट माइग्रेशन को बचाने के लिए, 500 एनजी / एमएल आरडब्ल्यूएनटी 5 ए के बहिर्जात पूरक को कोकल्चर कुओं में जोड़ा गया था जिसमें डब्ल्यूएनटी 5 ए वध सम्मिलित था। बहिर्जात आरडब्ल्यूएनटी 5 ए के अलावा इन मायोब्लास्ट्स (चित्रा 3 सी, डी) में देखे गए प्रवासी और आकृति संबंधी दोषों को पूरी तरह से बचाने के लिए पाया गया था।

ध्रुवीकृत प्रवासन के चालक के रूप में मायोब्लास्ट्स में आरओआर 2 के माध्यम से डब्ल्यूएनटी 5 ए सिग्नलिंग
इस पैराक्रिन मॉडल में सिग्नल-रिसीविंग सेल तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए, मायोब्लास्ट्स में आरओआर 2 रिसेप्टर के वध के बाद परख को दोहराया गया था। इस प्रयोग में, घाव पैदा होने से पहले मायोब्लास्ट्स को आरओआर 2 सीआरएनए ~ 40 घंटे के 50 एनएम के साथ स्थानांतरित किया गया था, जिसे आरओआर 2 जीन अभिव्यक्ति को 54% तक कम करने के लिए पर्याप्त दिखाया गया था (चित्रा 4 ए)। इस समय के दौरान, एनसीसी इंसर्ट सामान्य परिस्थितियों में समानांतर में उगाए गए थे। मायोब्लास्ट्स के उचित संयोजन तक पहुंचने के बाद, खरोंच परख का प्रदर्शन किया गया, और कोकल्चर वेल इंसर्ट को इकट्ठा किया गया। एनसीसी इंसर्ट की उपस्थिति में 10 घंटे की प्रवास अवधि के बाद, आरओआर 2 वध मायोब्लास्ट्स ने नकारात्मक नियंत्रण सीआरएनए (48.1% घाव-पुन: आबादी वाले क्षेत्र बनाम 75.7% घाव-पुन: आबादी वाले क्षेत्र, पी = 0.019) के साथ इलाज किए गए मायोब्लास्ट्स की तुलना में कम प्रवासी क्षमता का प्रदर्शन किया (चित्रा 4 बी, सी)। 500 एनजी / एमएल आरडब्ल्यूएनटी 5 ए का अतिरिक्त आरओआर 2 वध के बाद मायोब्लास्ट प्रवासी क्षमता को बचाने में विफल रहा, यह सुझाव देते हुए कि आरओआर 2 की कमी डब्ल्यूएनटी 5 ए सिग्नल प्राप्त करने के लिए मायोब्लास्ट्स की क्षमता को बाधित करती है (चित्रा 4 बी, सी)। फेलोइडिन के लिए इम्यूनोस्टेनिंग ने प्रवासी डेटा की पुष्टि की और दिखाया कि आरओआर 2 में फैलोइडिन-पॉजिटिव लैमेलोपोडिया और फिलोपोडिया में कमी ने मायोब्लास्ट्स को पूरक आरडब्ल्यूएनटी 5 ए (चित्रा 4 डी) द्वारा बहाल नहीं किया था।

Figure 1
चित्रा 1: परख का योजनाबद्ध मॉडल। चरण 1 में एसटीओ फीडर कोशिकाओं का उपयोग करके सी 2 सी 12 मायोब्लास्ट्स और एनसीसी का इन विट्रो विस्तार शामिल है। चरण 2 में कोकल्चर सिस्टम में एनसीएस और सी 2 सी 12 कोशिकाओं की चढ़ाना शामिल है। चरण 3 में सेलुलर प्रवासी क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए अंतर्निहित सी 2 सी 12 कोशिकाओं में किए गए घाव परख शामिल हैं। चरण 4 में माइग्रेटेड कोशिकाओं के साइटोलॉजिकल आर्किटेक्चर और आकृति विज्ञान का मूल्यांकन करने के लिए फेलोइडिन के लिए इम्यूनोस्टेनिंग शामिल है। संक्षेप: NCCs = तंत्रिका शिखा कोशिकाएं; एबी = एंटीबॉडी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: तंत्रिका शिखा कोशिकाओं की उपस्थिति मायोब्लास्ट प्रवासी क्षमता को बढ़ाती है। (A) घाव उत्पादन के समय तंत्रिका शिखा कोशिका (NCC) सम्मिलित होने से मायोब्लास्ट प्रवास में सुधार होता है। एनसीसी-सी 2 सी 12 सहसंस्कृति में बहिर्जात पुनः संयोजक डब्ल्यूएनटी 5 ए (आरडब्ल्यूएनटी 5 ए) को जोड़ने से मायोब्लास्ट माइग्रेशन पर सबसे मजबूत सकारात्मक प्रभाव पड़ता है। (बी) घाव उत्पादन के बाद 9 घंटे में औसत मायोब्लास्ट पुन: आबादी वाले क्षेत्र का परिमाणीकरण (त्रुटि पट्टियां मानक विचलन दिखाती हैं)। (सी) घाव उत्पन्न होने के 9 घंटे बाद घाव सीमा पर मायोब्लास्ट्स का फैलोइडिन धुंधला होना। डैश्ड आयताकार प्रवासी मोर्चे पर फैलोइडिन-सना हुआ मायोब्लास्ट दिखाते हैं। बी में परिमाणित प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के लिए कुल एन = 3 नमूने का उपयोग किया गया था। स्केल सलाखों = 200 μm ( A और C के लिए)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: मायोब्लास्ट माइग्रेशन के लिए न्यूरल क्रेस्ट सेल-व्युत्पन्न WNT5a आवश्यक है। (A) NCCs में SIRNA-मध्यस्थता वाले वध को मान्य करने के लिए WNT5a की सापेक्ष mRNA अभिव्यक्ति। (B) NCCs में Wnt5a वध के बाद C2C12 मायोब्लास्ट्स का प्रवासन काफी कम हो गया है। मायोब्लास्ट्स में इस प्रवासी घाटे को बचाने के लिए बहिर्जात rWnt5a को जोड़ना पर्याप्त है। (सी) घाव उत्पन्न होने के बाद 10 घंटे पर औसत मायोब्लास्ट-पुन: आबादी वाले क्षेत्र का परिमाणीकरण (त्रुटि पट्टियां मानक विचलन दिखाती हैं)। (डी) घाव उत्पन्न होने के 10 घंटे बाद घाव की सीमा पर मायोब्लास्ट्स का फैलोइडिन धुंधला होना। डैश्ड आयताकार प्रवासी मोर्चे पर फैलोइडिन-सना हुआ मायोब्लास्ट दिखाते हैं। सी में परिमाणित प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के लिए कुल एन = 3 नमूने का उपयोग किया गया था। स्केल सलाखों = 200 μm ( B और D के लिए)। संक्षेप: NCCs = तंत्रिका शिखा कोशिकाएं; सीआरएनए = छोटा हस्तक्षेप करने वाला आरएनए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: Wnt5a माइग्रेशन को चलाने के लिए मायोब्लास्ट्स में ROR2 रिसेप्टर्स के माध्यम से संकेत देता है। (A) C2C12 कोशिकाओं में SIRNA-मध्यस्थता वध को मान्य करने के लिए ROR2 की सापेक्ष एमआरएनए अभिव्यक्ति। (B) मायोब्लास्ट्स में ROR2 का वध NCCs की उपस्थिति के बावजूद उनकी प्रवासी क्षमता को कम कर देता है। (सी) घाव उत्पन्न होने के बाद 10 घंटे पर औसत मायोब्लास्ट-पुन: आबादी वाले क्षेत्र का परिमाणीकरण (त्रुटि पट्टियां मानक विचलन दिखाती हैं)। (डी) घाव उत्पन्न होने के 10 घंटे बाद घाव की सीमा पर मायोब्लास्ट्स का फैलोइडिन धुंधला होना। डैश्ड आयताकार प्रवासी मोर्चे पर फैलोइडिन-सना हुआ मायोब्लास्ट दिखाते हैं। सी में परिमाणित प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के लिए कुल एन = 3 नमूने का उपयोग किया गया था। स्केल सलाखों = 200 μm. संक्षेप: NCCs = तंत्रिका शिखा कोशिकाएं; सीआरएनए = छोटा हस्तक्षेप करने वाला आरएनए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा एस 1: पुनः संयोजक डब्ल्यूएनटी 5 ए पूरकता के लिए खुराक-निर्भर विश्लेषण। पुनः संयोजक Wnt5a पूरक परीक्षण 0 ng/mL, 100 ng/mL, और 500 ng/mL के लिए खुराक-निर्भर विश्लेषण में पाया गया कि बहिर्जात rWnt5a के 500 ng/mL को विट्रो में 12 घंटे की प्रवासी अवधि के दौरान मायोब्लास्ट माइग्रेशन और फेलोइडिन साइटोआर्किटेक्चरल परिवर्तनों को चलाने के लिए इष्टतम एकाग्रता माना जाता है। स्केल पट्टियाँ = 200 μm. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 2: अच्छी तरह से सम्मिलित की प्रतिनिधि छवियां। (ए) 50 एनएम नकारात्मक नियंत्रण सीआरएनए और (बी) 50 एनएम डब्ल्यूएनटी 5 ए सीआरएनए के साथ इलाज किए गए ओ 9 -1 तंत्रिका शिखा कोशिकाओं वाले अच्छी तरह से सम्मिलित की ब्राइटफील्ड छवियां। स्केल सलाखों = 200 μm. संक्षिप्त नाम: सीआरएनए = छोटा हस्तक्षेप करने वाला आरएनए। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 3: सीआरएनए-मध्यस्थता डब्ल्यूएनटी 5 ए वध के बाद ओ 9 -1 कोशिकाओं में डब्ल्यूएनटी 5 ए प्रोटीन अभिव्यक्ति की प्रतिनिधि छवियां। कोशिका संस्कृति कुओं में डब्ल्यूएनटी 5 ए प्रोटीन का इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधलापन जिसमें ओ 9 -1 तंत्रिका शिखा कोशिकाएं होती हैं, (ए) 50 एनएम नकारात्मक नियंत्रण सीआरएनए और (बी) 50 एनएम डब्ल्यूएनटी 5 ए सीआरएनए के साथ इलाज किया जाता है। स्केल बार = 20 μM. संक्षिप्तीकरण: SIRNA = छोटे हस्तक्षेप करने वाले आरएनए; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

प्लानर सेल पोलैरिटी (पीसीपी) सिग्नलिंग मार्ग एक गंभीर रूप से महत्वपूर्ण सेलुलर सिग्नलिंग मार्ग है जिसे कई विकासात्मक24,25 और रोग प्रक्रियाओं 24,26 में फंसाया गया है। भ्रूण के विकास के दौरान, नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग में सिग्नल भेजने वाली कोशिकाओं से आणविक संकेतों का एक विशाल नेटवर्क शामिल होता है जो अंततः सिग्नल-प्राप्तकोशिकाओं में आकृति विज्ञान, असममित संगठन और दिशात्मक प्रवास में परिवर्तन को प्रेरित करता है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि इस सिग्नलिंग को चलाने वाले विशिष्ट लिगैंड-रिसेप्टर मार्ग विविध, संदर्भ-निर्भर हैं, और अक्सर सेल प्रकार 12,13,14,15 के बीच भिन्न होते हैं। इस आणविक जटिलता के कारण, विवो में पारंपरिक आनुवंशिक पुनर्संयोजन विधियों का उपयोग करके पैराक्रिन नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग इंटरैक्शन का आकलन करने की क्षमता सीमित हो गई है। जबकि इन विट्रो सिस्टम को नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सेलुलर फेनोटाइप्स का अध्ययन करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में तेजी से उपयोग किया गया है, उपलब्ध प्रोटोकॉल विशेष रूप से मार्ग के डाउनस्ट्रीम सिग्नल-रिसीविंग पहलुओं पर ध्यान केंद्रित करते हैं और इन सिग्नलिंग घटनाओं की अंतरकोशिकीय और पैराक्रिन प्रकृति को पर्याप्त रूप से मॉडल करने में विफल रहते हैं। इसलिए, वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य एक गैर-संपर्क सह-संस्कृति प्रणाली के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित करना था जो विट्रो में पैराक्रिन डब्ल्यूएनटी इंटरैक्शन को पुन: उत्पन्न करता है। इस प्रोटोकॉल का फोकस विट्रो में कार्यात्मक नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग के दो विशिष्ट पहलुओं को मॉडल करना था, जिसमें इंट्रासेल्युलर फिलामेंट प्रोटीन और ध्रुवीकृत प्रवासी क्षमता का संगठन शामिल था।

अवधारणा के प्रमाण के रूप में, इस प्रोटोकॉल को हृदय के विकास के संदर्भ में पैराक्रिन तंत्र का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया था। कार्डियोजेनेसिस के दौरान, कार्डियक एनसीसी और एसएचएफ पूर्वज कोशिकाओं के बीच पारस्परिक सिग्नलिंग घटनाएं कार्डियक बहिर्वाह पथ (ओएफटी) 27,28,29 की उचित परिपक्वता के लिए महत्वपूर्ण हैं। पिछले काम से पता चला है कि माउस कार्डियक विकास के दौरान, ग्रसनी एसएचएफ कोशिकाओं में एनसीसी-मध्यस्थता डब्ल्यूएनटी / पीसीपी सिग्नलिंग को विकासशील ओएफटी में एसएचएफ पूर्वज सेल निगमन और सामान्य ओएफटी संरेखण21 के लिए आवश्यक है। श्लेफ़र्थ एट अल और अन्य ने दिखाया है कि डब्ल्यूएनटी / पीसीपी लिगैंड, डब्ल्यूएनटी 5 को एन्कोडिंग करने वाले जीन के आनुवंशिक नॉकआउट को एसएचएफ पूर्वज कोशिका संगठन और प्रवासी क्षमता को बाधित करने के लिए दिखाया गया है, जिसके परिणामस्वरूप एक पूर्वाभासित और गलत कार्डिएक ओएफटी 22,23,30 है। स्थापित मुराइन एनसीसी (ओ 9-1)31 और मायोब्लास्ट (सी 2 सी 12) सेल लाइनों के साथ, यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि एनसीसी के साथ सहसंस्कृति फैलोइडिन-पॉजिटिव साइटोप्लाज्मिक फिलोपोडिया और लैमेलिपोडिया में वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है और घाव भरने वाली परख में मायोब्लास्ट प्रवासी क्षमता में सुधार करता है। इन विट्रो में ये आणविक और कार्यात्मक समापन बिंदु एनसीसी हेरफेर31 के लिए पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल पर निर्माण करते हैं और डब्ल्यूएनटी 5 ए वैश्विक नॉकआउट चूहों में वर्णित विवो फेनोटाइपिक परिवर्तनों को बारीकी से मॉडल करते हैं, इस मॉडल की उपयोगिता को मान्य करते हैं।

NCCs और मायोब्लास्ट्स के बीच नॉनकैनोनिकल WNT सिग्नलिंग को चलाने वाले विशिष्ट आणविक मार्ग को निर्धारित करने के लिए, NCCs में उम्मीदवार लिगैंड, WNT5a और मायोब्लास्ट्स में इसके संबंधित रिसेप्टर, ROR2 को एन्कोडिंग करने वाले जीन के लिए समानांतर सेल-विशिष्ट वध प्रयोग किए गए थे। जैसा कि अपेक्षित था, सिग्नल-सेंडिंग (NCCs में Wnt5a) और सिग्नल-रिसीविंग (मायोब्लास्ट्स में ROR2) दोनों कोशिकाओं में अणुओं के वध ने स्वतंत्र रूप से WNT / PCP से संबंधित एक्टिन साइटोआर्किटेक्चरल परिवर्तनों को बाधित किया और मायोब्लास्ट माइग्रेशन को रोक दिया। महत्वपूर्ण रूप से, पुनः संयोजक Wnt5a के साथ फेनोटाइपिक बचाव केवल NCC-WNT5a वध स्थिति में देखा गया था, जो एक तंत्र का समर्थन करता है जिससे NCC-व्युत्पन्न WNT5a ROR2 रिसेप्टर्स के माध्यम से मायोब्लास्ट्स में PCP सिग्नलिंग को सक्रिय करता है। ये परिणाम माउस आनुवंशिक अध्ययनों के आंकड़ों के अनुरूप हैं जो भ्रूण के हृदय विकास के दौरान एनसीसी और एसएचएफ कोशिकाओं के बीच एक महत्वपूर्ण डब्ल्यूएनटी / पीसीपी सिग्नलिंग अक्षके रूप में डब्ल्यूएनटी 5 ए-आरओआर 2 अक्ष की पहचान करते हैं। हालांकि इस प्रोटोकॉल में प्रयोगात्मक रूप से परीक्षण नहीं किया गया है, यह स्पष्ट नहीं है कि क्या एसएचएफ-व्युत्पन्न डब्ल्यूएनटी 5 ए आरओआर 2 रिसेप्टर्स के माध्यम से तंत्रिका शिखा को पारस्परिक पैराक्रिन संकेत प्रदान करता है। इस परिकल्पना का परीक्षण इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके शीर्ष पर C2C12 कोशिकाओं और कुएं के निचले भाग पर O9-1 कोशिकाओं के साथ प्रयोगों को दोहराकर किया जा सकता है। यदि एसएचएफ-व्युत्पन्न डब्ल्यूएनटी 5 ए एनसीसी-आरओआर 2 के माध्यम से पारस्परिक पैराक्रिन सिग्नल प्रदान करता है, तो सी 2 सी 12 कोशिकाओं में डब्ल्यूएनटी 5 ए के वध से प्रवासी क्षमता और अंतर्निहित ओ 9 -1 कोशिकाओं के एक्टिन पोलीमराइजेशन को रोकने की उम्मीद होगी।

इस प्रोटोकॉल की कई अनूठी ताकतें हैं। सबसे पहले, यह एक गैर-संपर्क अच्छी तरह से सम्मिलित प्रणाली है जो सिग्नल-प्राप्त कोशिकाओं की एक ही आबादी में कार्यात्मक और आणविक डब्ल्यूएनटी / पीसीपी विशेषताओं का मूल्यांकन करने के लिए घाव-उपचार परख और इम्यूनोस्टेनिंग तकनीकों के अनुक्रमिक उपयोग को शामिल करती है। यह न केवल नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी-प्रेरित इंट्रासेल्युलर फिलामेंट संगठन और विट्रो में ध्रुवीकृत प्रवासी परिवर्तनों के फेनोटाइपिंग के लिए एक मजबूत दृष्टिकोण प्रदान करता है, बल्कि सिग्नल ट्रांसडक्शन तंत्र के अधिक दानेदार आकलन की भी अनुमति देता है। जबकि यह प्रोटोकॉल Wnt5a-ROR2 अणुओं के बारे में सिद्धांत का प्रमाण प्रदान करता है, मॉडल आसानी से नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग मार्ग में अन्य लिगेंड और रिसेप्टर्स के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए खुद को उधार देता है। कोई भी कई संभावित डाउनस्ट्रीम प्रभावक प्रोटीन (जैसे, RhoA, p-JNK, Daam1, Rac1) की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए इम्यूनोस्टेनिंग प्रोटोकॉल को अनुकूलित कर सकता है, जिन्हें विवो में नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी संकेतों को ट्रांसड्यूस करने के लिए दिखाया गया है। इसके अलावा, इन विभिन्न प्रभावकारक अणुओं के प्रोटीन स्तर को प्रवासी या एक्टिन साइटोआर्किटेक्चर फेनोटाइप के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है। दूसरा, कोकल्चर सिस्टम की गैर-संपर्क प्रकृति डब्ल्यूएनटी / पीसीपी मार्ग में विशिष्ट सिग्नल-भेजने बनाम सिग्नल-प्राप्त अणुओं के स्वतंत्र हेरफेर की अनुमति देती है। इन प्रतिनिधि परिणामों में, इसे सेल-विशिष्ट सीआरएनए वध करने के लिए चुना गया था। हालांकि, यह प्रोटोकॉल नैदानिक अनुप्रयोग के लिए उम्मीदवार लिगैंड-रिसेप्टर मार्गों का मूल्यांकन करने के लिए फार्माकोलॉजिकल इनहिबिटर या आनुवंशिक रूप से संशोधित सेल लाइनों के उपयोग के लिए भी उत्तरदायी है। इसी तरह, कोई कोकल्चर माध्यम में आणविक या फार्माकोलॉजिकल यौगिकों को जोड़कर फेनोटाइपिक बचाव प्रयोग कर सकता है, जैसा कि पुनः संयोजक डब्ल्यूएनटी 5 ए के साथ दिखाया गया था। इन यौगिकों को चुनिंदा रूप से सिग्नल-भेजने बनाम सिग्नल-रिसीविंग डिरेंजमेंट को बचाने के लिए लक्षित करना पैराक्रिन यांत्रिक मार्गों को उन तरीकों से मान्य करता है जिन्हें विवो मॉडल सिस्टम में वर्तमान का उपयोग करने की अनुमति नहीं है।

इस प्रोटोकॉल के कई महत्वपूर्ण कदम हैं। सबसे पहले, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि प्राथमिक कोशिकाओं को पूरे प्रोटोकॉल में उचित संयोजन पर विस्तारित और बनाए रखा जाता है। यदि C2C12 मायोब्लास्ट्स को 100% कंफ्लुएंसी तक बढ़ने की अनुमति दी जाती है, तो वे मायोब्लास्ट्स से मायोट्यूब्स में फ्यूज और अंतर करना शुरू कर देंगे। इसलिए, इन कोशिकाओं को वर्णित के रूप में उपयुक्त घनत्व पर पारित किया जाना चाहिए। दूसरा, यह देखते हुए कि ओ 9 -1 कोशिकाओं को विकसित करने के लिए वातानुकूलित माध्यम उत्पन्न करने के लिए एसटीओ फीडर कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, यह जरूरी है कि कोई उचित रूप से माइटोमाइसिन सी के साथ एसटीओ कोशिकाओं को निष्क्रिय करे और ओ 9 -1 कोशिकाओं को पिघलाने और चढ़ाने से पहले निष्क्रिय एसटीओ कोशिकाओं का उपयोग करके पर्याप्त (कम से कम 500 एमएल) ओ 9 -1 विकास माध्यम बनाए। शायद इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम मायोब्लास्ट मोनोलेयर32,33 में समान ज्यामिति और चौड़ाई के साथ उचित खरोंच की पीढ़ी है। चरण 3.1.4 प्रोटोकॉल के इस हिस्से को अनुकूलित करने के लिए कई युक्तियों का विवरण देता है। इन सिफारिशों के बावजूद, यह स्वीकार किया जाना चाहिए कि मानक 2 डी स्क्रैच परख से जुड़ी परिवर्तनशीलता एक तकनीकी चुनौती और इस प्रोटोकॉल की सीमा बनी हुई है। इसलिए, प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के कई तकनीकी प्रतिकृतियां होना आवश्यक है।

अंत में, हालांकि यहां प्रस्तुत परिणाम मुराइन एनसी और मायोब्लास्ट्स का उपयोग करके उत्पन्न किए गए थे, इस प्रोटोकॉल को सिद्धांत रूप में, किसी भी सिग्नल-भेजने और सिग्नल-रिसीविंग सेल को शामिल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। नतीजतन, इस प्रणाली में न केवल विभिन्न विकास संदर्भों में पैराक्राइन नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग के बुनियादी तंत्र को आगे बढ़ाने के लिए अनुप्रयोग हैं, बल्कि इसका उपयोग डब्ल्यूएनटी / पीसीपी से संबंधित रोग प्रक्रियाओं के लिए चिकित्सीय तंत्र का परीक्षण करने के लिए भी किया जा सकता है। उदाहरणों में उन दवाओं के लिए फार्माकोलॉजिकल स्क्रीनिंग शामिल है जो घातक कोशिकाओं की डब्ल्यूएनटी / पीसीपी-प्रेरित प्रवासी क्षमता को रोकते हैं या बेसलाइन पर दोषपूर्ण पीसीपी सिग्नलिंग क्षमता के साथ रोगी-व्युत्पन्न टर्मिनल सेल प्रकारों के दिशात्मक प्रवास को बहाल करते हैं। नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग मार्ग से परे, इस प्रोटोकॉल को दो सेल प्रकारों के बीच अन्य पैराक्रिन सिग्नलिंग तंत्र और मार्गों का अध्ययन करने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, ओ 9 -1 कोशिकाओं में अन्य मार्गों (जैसे, नॉच, बीएमपी / टीजीएफ -β, एफजीएफ) में ज्ञात स्रावी अणुओं के सीआरएनए-मध्यस्थता वध को अंतर्निहित मायोब्लास्ट्स में प्रोलिफेरेटिव, भेदभाव या एपोप्टोटिक मार्करों के इम्यूनोस्टेनिंग के साथ जोड़ा जा सकता है।

अंत में, यह प्रोटोकॉल नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी से संबंधित इंट्रासेल्युलर फिलामेंट संगठन और विट्रो में ध्रुवीकृत प्रवासन के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक नया और अत्यधिक वापस लेने योग्य प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल स्थापित करता है। यहां वर्णित विधियां डब्ल्यूएनटी इंटरैक्शन की अंतरकोशिकीय और पैराक्रिन प्रकृति को बनाए रखते हुए मौजूदा तकनीकों में सुधार करती हैं और इस मार्ग के सिग्नल-सेंडिंग बनाम सिग्नल-रिसीविंग घटकों के स्वतंत्र मूल्यांकन की अनुमति देती हैं। इस प्रोटोकॉल को मोटे तौर पर दो सेल प्रकारों के बीच बुनियादी पैराक्रिन डब्ल्यूएनटी / पीसीपी सिग्नलिंग तंत्र की जांच करने और डब्ल्यूएनटी / पीसीपी से संबंधित रोग प्रक्रियाओं को लक्षित करने वाले नए चिकित्सीय यौगिकों के लिए स्क्रीन करने के लिए लागू किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि शोध किसी भी वाणिज्यिक या वित्तीय संबंधों की अनुपस्थिति में आयोजित किया गया था जिसे हितों के संभावित टकराव के रूप में माना जा सकता है।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच पुरस्कार एफ 30एचएल 154324 द्वारा ओटी और के08एचएल 121191 और एसआरके को आर03एचएल 154301 द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक यह स्वीकार करना चाहते हैं कि इस पांडुलिपि में चित्रा 1 में योजनाबद्ध biorender.com के साथ बनाया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M-7522
Antifade mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200-10 Stored at 4 °C
Bovine serum albumin Santa Cruz Biotechnology sc-2323 Stored at 4 °C
C2C12 murine myoblast cell line ATCC CRL-1772
Cell culture flasks, 75 cm2 ThermoFisher Scientific 156499
Chamber Slide System, 4-well ThermoFisher Scientific 154526
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM) Corning 10-017-CV Stored at 4 °C
Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL Fisher Scientific 14-959-53A
Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membrane Corning 353095
Fetal bovine serum Fisher Scientific W3381E Stored in 50 mL aliquots at -20 °C
Gelatin solution, 0.1% ATCC PCS-999-027 Stored at 4 °C
Graduated and sterile pipette tips, 10 µL USA Scientific 1111-3810
Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL Millipore Sigma ESG1106
L-glutamine 200 mM (100x) Gibco 25030-081
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778-075
MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x Gibco 11140-050
Minimum essential medium (MEM) Corning 10-022-CV
Mitomycin C Roche 10107409001
Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm Springside Scientific HRTCG2455
O9-1 neural crest cell line Millipore Sigma SCC049
Opti-MEM I, 1x Gibco 31985-070
Paraformaldehyde solution in PBS, 4% Santa Cruz Biotechnology sc-281692 Stored at 4 °C
Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin) Fisher Scientific W3470H Stored in 10 mL aliquots at -20 °C
Phalloidin-iFluor 488 Abcam ab176753 Stored at -20 °C, Keep out of light
Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4 Corning 21-040-CV Stored at 4 °C
Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) R&D Systems 233-FB-025
Recombinant human/mouse Wnt5a protein R&D Systems 645-WN-010
Sodium pyruvate, 100 mM Gibco 11360-070
Square Petri dish with grid Thomas Scientific 1219C98
STO murine fibroblast feeder cells ATCC CRL-1503
Triton X-100 solution Sigma Aldrich X100-100ML
Trypsin-EDTA, 0.25% Fisher Scientific W3513C Stored at 4 °C
Zeiss Apotome.2 fluoresence microscope Carl Zeiss AG
Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope Carl Zeiss AG
Zen lite 2012 microscopy software Carl Zeiss AG imaging software

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References

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 178
मॉडलिंग पैराक्रिन नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग <em>इन विट्रो</em>
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Toubat, O., Choi, J., Kumar, S. R.… More

Toubat, O., Choi, J., Kumar, S. R. Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro. J. Vis. Exp. (178), e63247, doi:10.3791/63247 (2021).

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