Summary
Denne undersøgelse skitserer en meget reproducerbar og medgørlig metode til at studere parakrine ikke-kanoniske Wnt-signalhændelser in vitro. Denne protokol blev anvendt til at evaluere virkningen af parakrin Wnt5a-signalering i murine neurale kamceller og myoblaster.
Abstract
Ikke-kanonisk Wnt-signalering regulerer intracellulær actinfilamentorganisation og polariseret migration af stamceller under embryogenese. Denne proces kræver komplekse og koordinerede parakrine interaktioner mellem signalafsendende og signalmodtagende celler. I betragtning af at disse interaktioner kan forekomme mellem forskellige typer celler fra forskellige slægter, kan in vivo-evaluering af cellespecifikke defekter være udfordrende. Denne undersøgelse beskriver en meget reproducerbar metode til evaluering af parakrin noncanonical Wnt-signalering in vitro. Denne protokol blev designet med evnen til at (1) udføre funktionelle og molekylære vurderinger af ikke-kanonisk Wnt-signalering mellem to celletyper af interesse; (2) dissekere rollen som signalafsendende versus signalmodtagende molekyler i den ikke-kanoniske Wnt-signalvej; og (3) udføre fænotypiske redningseksperimenter med standard molekylære eller farmakologiske tilgange.
Denne protokol blev brugt til at evaluere neural crest cell (NCC) -medieret noncanonical Wnt-signalering i myoblaster. Tilstedeværelsen af NCC'er er forbundet med et øget antal phalloidin-positive cytoplasmatiske filopodier og lamellipodia i myoblaster og forbedret myoblastmigration i et sårhelende assay. Wnt5a-ROR2-aksen blev identificeret som en afgørende ikke-kanonisk Wnt-signalvej mellem NCC og anden hjertefelt (SHF) cardiomyoblast-forfædre. Afslutningsvis er dette en meget medgørlig protokol til undersøgelse af parakrine ikke-kanoniske Wnt-signalmekanismer in vitro.
Introduction
Ikke-kanonisk Wnt-signalering er en evolutionært bevaret vej, der regulerer cellulær filamentorganisation og retningsbestemt migration. Denne vej har været impliceret i flere biologiske processer, herunder embryonal vævsmorfogenese 1,2,3, lymfatisk og vaskulær angiogenese 4,5,6,7 og kræftvækst og metastase 8,9,10 . På celleniveau udføres ikke-kanonisk Wnt-signalering gennem koordinerede parakrine interaktioner mellem signalafsendende og signalmodtagende celler. Disse interaktioner forekommer ofte mellem celler af forskellige afstamninger eller typer og involverer et forskelligt molekylært netværk, der inkluderer op til 19 ligander og flere receptorer, co-receptorer og downstream signaltransduktionseffektorer11. Yderligere komplicerer denne signalproces tidligere undersøgelser har vist, at ligand-receptorkombinationer kan variere på en kontekst- og vævsafhængig måde 12,13, og at de samme kildeligander, der driver ikke-kanonisk Wnt-signalering i signalmodtagende celler, kan produceres af flere signalafsendende celletyper 14,15 . I betragtning af den cellulære og molekylære kompleksitet, der er forbundet med ikke-kanonisk Wnt-signalering, har evnen til at studere individuelle og klinisk relevante mekanismer in vivo været begrænset.
Der er gjort forsøg på at studere ikke-kanonisk Wnt-signalering ved hjælp af cellekulturteknikker in vitro. For eksempel er sårhelende assays udført i cellulære monolag blevet brugt til funktionelt at vurdere cellulær retningsbestemt migration 4,16,17,18,19. Immunostaining teknikker er blevet brugt til at udføre rumlige analyser af overfladeproteinekspression for at evaluere ikke-kanoniske Wnt-inducerede ændringer i cellulær morfologi 7,10, arkitektur og asymmetrisk polarisering18,19,20. Selvom disse tilgange har givet vigtige værktøjer til karakterisering af Wnt-relaterede fænotyper i signalmodtagende celler, begrænser manglen på signalafsendende komponenter i disse protokoller deres evne til nøjagtigt at modellere parakrine signalmekanismer observeret in vivo. Som følge heraf er der fortsat et kritisk behov for at udvikle in vitro-systemer, der muliggør robust og reproducerbar evaluering af parakrine signalinteraktioner mellem signalafsendende og modtagende celler i den ikke-kanoniske Wnt-vej, især dem af forskellige celletyper.
Til dette formål var det primære formål med denne undersøgelse at etablere en protokol til modellering af parakrine ikke-kanoniske Wnt-signalinteraktioner in vitro. Vi udviklede et ikke-kontakt kokultursystem, der rekapitulerer signalafsendende og signalmodtagende komponenter i disse interaktioner og tillader brug af standard molekylære, genetiske eller farmakologiske tilgange til uafhængigt at studere specifikke ligandreceptormekanismer i den ikke-kanoniske Wnt-vej. Mekanismer for NCC-medieret Wnt-signalering blev undersøgt i myoblaster ved hjælp af etablerede murincellelinjer. Som bevis for princippet blev denne model brugt til at bekræfte fund af tidligere in vivo-undersøgelser på mus, der implicerer Wnt5a-ROR2-aksen som en relevant ikke-kanonisk Wnt-signalvej mellem NCC'er 21 og SHF-kardiomyoblast-forfædre 3,22,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Præeksperimentel ekspansion og passaging af celler
- C2C12 cellekultur:
- Forbered 500 ml C2C12 kulturmedium ved at kombinere Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM) med 10% føtalt bovin serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin.
- Optø et hætteglas med C2C12-celler i 37 °C vandbad. Mens C2C12-cellerne tøer op, tilsættes 5 ml C2C12-medium til et 15 ml konisk rør. Overfør straks de optøede celler til 15 ml røret ved hjælp af en P1000 pipette.
BEMÆRK: C2C12-celler er murinmyoblastceller, der tidligere er blevet brugt og valideret som en primær cellelinje til modellering af cardiomyoblast-forfædre. - Bland forsigtigt C2C12-celler i det koniske rør ved hjælp af en serologisk pipette. Derefter tilsættes hele volumenet af optøede celler i C2C12-medium (6 ml) til en 75 cm2 kolbe.
- Kolben tilsættes 6 ml frisk C2C12-medium for et samlet volumen på 12 ml. Kolben drejes forsigtigt, så celle- og medieopløsningen dækker hele bunden af kolben. Kolben anbringes i en cellekulturinkubator (37 °C, 5 % CO2) for at lade cellerne klæbe fast.
- Lad cellerne udvide sig i inkubatoren, indtil de når ~ 60% sammenløb.
BEMÆRK: Dette kan bestemmes ved periodisk at fjerne cellerne fra inkubatoren og hurtigt kontrollere deres sammenløb under et mikroskop. Sørg for at minimere den tid, hvor celler fjernes fra inkubatoren.
- Passerende C2C12-celler:
- C2C12-mediet, 500 ml 1x PBS og 0,25% trypsin-EDTA opvarmes i et 37 °C vandbad. Når reagenserne er opvarmet, overføres alle reagenser til cellekulturhætten.
- Kolben indeholdende C2C12-cellerne bringes ind i cellekulturhætten. Kolben med C2C12-cellerne skylles forsigtigt med varm 1x PBS to gange.
- Kolben vippes i en vinkel på 45°, og C2C12-mediet opsuges med en glaspipette, der er forbundet med vakuumsugning. Mens du opretholder en vinkel på 45°, tilsættes forsigtigt 10 ml varm 1x PBS til kolbens hjørne ved hjælp af en serologisk pipette. Kolben lægges fladt på overfladen, og kolben bevæges forsigtigt i cirkulære bevægelser for at sikre, at 1x PBS skyller over hele cellemonolaget.
BEMÆRK: Pas på ikke at forstyrre C2C12-monolaget, mens du opsuger mediet.
- Kolben vippes i en vinkel på 45°, og C2C12-mediet opsuges med en glaspipette, der er forbundet med vakuumsugning. Mens du opretholder en vinkel på 45°, tilsættes forsigtigt 10 ml varm 1x PBS til kolbens hjørne ved hjælp af en serologisk pipette. Kolben lægges fladt på overfladen, og kolben bevæges forsigtigt i cirkulære bevægelser for at sikre, at 1x PBS skyller over hele cellemonolaget.
- Fjern 1x PBS efter anden vask. Tilsæt 1 ml 0,25% trypsin-EDTA til kolben, flyt forsigtigt kolben som beskrevet ovenfor, så trypsin-EDTA-opløsningen kan sprede sig over så meget af monolaget som muligt, og læg kolben i inkubatoren i 2 min.
- Efter 2 minutters inkubation fjernes kolben fra inkubatoren og bankes forsigtigt på den for at løsne eventuelle resterende celler.
- Der tilsættes 9 ml C2C12-medium til kolben med en serologisk pipette for at slukke trypsinen. Brug den serologiske pipette til forsigtigt at skylle cellerne med mediet og opsamle de 10 ml trypsiniseret cellesuspension. Tilsæt 10 ml cellesuspension til et frisk 15 ml konisk rør og centrifuger ved 100 × g i 5 min.
- Sæt det koniske rør tilbage til cellekulturhætten, og fjern supernatanten med en glaspipette, der er forbundet til vakuumsugning. Mens du aspirerer supernatanten, skal du passe på ikke at forstyrre cellepelleten i bunden af det koniske rør. For at gøre dette skal du efterlade ~ 0,2 ml supernatant i det koniske rør. Resuspender cellerne i 10 ml frisk C2C12-medium.
- For yderligere passaging tilsættes 1 ml af de resuspenderede celler i en 75 cm2 kolbe. Der tilsættes 11 ml C2C12-medium til kolben med en serologisk pipette, og kolben anbringes i inkubatoren.
- STO-cellekultur:
- Forbered STO-kulturmedium ved at fremstille 500 ml DMEM med 7% FBS, 1% penicillin / streptomycin og 2 nM L-glutamin.
- Forbered 0,1% gelatine ved at tilsætte 0,5 g gelatinepulver til en flaske indeholdende 500 ml vævskvalitet eller autoklaveret vand. Der tilsættes 7 ml 0,1% gelatineopløsning til en 75 cm2 kolbe. Kolben drejes således, at gelatineopløsningen dækker hele kolbens bund. Lad kolben inkubere i 30 minutter ved stuetemperatur i cellekulturhætten.
- Efter 30 minutters inkubation fjernes overskydende gelatine ved hjælp af en pipette, der er forbundet med vakuumsugning. Lad kolberne forblive i inkubatoren i yderligere 30 minutter før brug.
- Optø et hætteglas med STO-celler i et 37 °C vandbad. Ved hjælp af en P1000-pipette overføres straks de optøede celler til et 15 ml konisk rør indeholdende 5 ml frisklavet STO-kulturmedium.
BEMÆRK: STO-celler er murine embryonale fibroblaster, der rutinemæssigt anvendes som fødeceller i cellekulturprotokoller. - Bland forsigtigt cellerne i det koniske rør ved hjælp af en serologisk pipette. Hele rumfanget (6 ml) celler tilsættes til en gelatinebelagt 75 cm2 kolbe. Kolben drejes for at sikre, at cellesuspensionen fordeles godt langs kolbens bund.
- Kolben tilsættes 6 ml frisk STO-medium til et samlet volumen på 12 ml. Kolben drejes som beskrevet ovenfor for at sikre, at cellerne og mediet fordeles godt langs kolbens bund. Kolben anbringes i rugemaskinen på 37 °C, så cellerne kan klæbe fast. Lad cellerne sprede sig i inkubatoren, indtil de når ~ 60-70% sammenløb.
- Passaging STO-celler:
- Varmt STO-cellemedium, 1xPBS og 0,25% trypsin-EDTA i et 37 °C vandbad.
- Kolben med STO-celler skylles forsigtigt med varm 1x PBS to gange som beskrevet i trin 1.2.2.1.
- Tilsæt 1 ml 0,25% trypsin-EDTA til kolben ved hjælp af en P1000-pipette. Kolben anbringes i 37 °C inkubatoren i 5 min.
- Efter 5 minutters inkubation fjernes kolben fra inkubatoren. Bank forsigtigt på kolben for at løsne eventuelle klæbende celler.
- Tilsæt 9 ml STO-medium til kolben for at slukke trypsinen og opsamling af 10 ml trypsiniseret cellesuspension som beskrevet ovenfor. Tilsæt 10 ml cellesuspension til et 15 ml konisk rør og centrifuger ved 100 × g i 5 min.
- Supernatanten fjernes, og cellerne gensuspenderes i 10 ml STO-medium som beskrevet ovenfor. For yderligere passaging tilsættes 1 ml af de resuspenderede celler i en 75 cm2 kolbe. Der tilsættes 11 ml STO-medium, kolben drejes for at sikre en jævn fordeling af cellerne og mediet langs kolbens bund, og kolben anbringes i inkubatoren.
- Inaktiv STO-cellekultur og O9-1-celle basal mediumpræparat:
- Forbered O9-1 celle basalkulturmedium ved at blande 500 ml DMEM med 15% FBS, 1% penicillin / streptomycin, 2 nM L-glutamin, 0,1 mM minimum ikke-essentielle aminosyrer, 1 nM natriumpyruvat og 55 μM beta-mercaptoethanol.
- Der fremstilles mitomycin C-opløsning i 1x PBS i en koncentration på 0,5 mg/ml ved at tilsætte 4 ml 1x PBS direkte til et mitomycin C-hætteglas. Opløsningen pipetteres flere gange med en P1000-pipette. For yderligere at opløse mitomycin C i 1x PBS skal du placere hætteglasset på en hvirvelblander eller benchtop rocker i 45 minutter til 1 time.
- Inaktiver STO-cellerne ved at behandle STO-pladerne med en slutkoncentration på 0,01 mg/ml mitomycin C tilsat til standard STO-mediet. Placer STO-pladerne inde i inkubatoren i 2 timer, og sørg for at beskytte kolben indeholdende mitomycin C mod lys ved at minimere den tid, der bruges uden for inkubatoren. Efter behandling med mitomycin vaskes cellerne i 1x PBS to gange som beskrevet i trin 1.2.2.1.
BEMÆRK: Mitomycin C hæmmer spredningen af STO-celler, så de kan bruges til at generere konditioneret medium over flere dage uden at blive overkonfluent i kolben. - Efter fjernelse af 1x PBS tilsættes 12 ml O9-1 basalkulturmedium til de inaktiverede SO-cellekulturer og inkuberes dem i 24 timer. Saml det konditionerede, inaktiverede STO + O9-1 basalkulturmedium, og læg det i 50 ml koniske rør indpakket i folie for at beskytte det mod lys.
- Tilsæt 12 ml frisk O9-1 basalkulturmedium til de inaktiverede SO-cellekulturer som beskrevet ovenfor. Gentag dette trin ved at tilføje frisk O9-1 basalkulturmedium til de samme flanker, der indeholder de inaktiverede STO-celler hver 24. time.
BEMÆRK: Efter mitomycin C-behandling kan de inaktiverede SO-celler ikke proliferere; derfor kan kolberne, der indeholder de inaktiverede STO-celler, genbruges til at generere konditioneret medium. - De folieindpakkede 50 ml koniske rør indeholdende konditioneret, inaktiveret STO + O9-1 basalkulturmedium opbevares ved 4 °C, indtil der er opsamlet i alt 500 ml af mediet.
- O9-1 cellekultur:
- Forbered O9-1 cellevækstkulturmedium ved hjælp af 500 ml konditioneret STO + O9-1 basalmedium, og tilsæt 103 enheder leukæmihæmmende faktor (LIF) og 25 ng / ml basisk fibroblastvækstfaktor (basic-FGF).
- Der fremstilles 0,1 % gelatinebelagte kolber som beskrevet i trin 1.3.2-1.3.3.
- Optø et hætteglas med O9-1-celler i et 37 °C vandbad. Overfør straks de optøede celler til et 15 ml konisk rør indeholdende 5 ml frisklavet O9-1 vækstmedium.
BEMÆRK: O9-1-cellelinjen er den eneste stabile, multipotente neurale kamcellelinje, der er genereret fra musen. Denne cellelinje er almindeligt anvendt i neurale crest in vitro eksperimenter. - Bland forsigtigt cellerne ved hjælp af en serologisk pipette. Tilsæt hele 6 ml celler til en gelatinebelagt 75 cm2 kolbe.
- Kolben tilsættes 6 ml O9-1 vækstmedium for et samlet volumen på 12 ml. Kolben anbringes i rugemaskinen på 37 °C, så cellerne kan klæbe fast. Lad cellerne sprede sig i inkubatoren, indtil de når ~ 60-70% sammenløb.
- Passerende O9-1 celler:
- Varmt O9-1 vækstmedium, 1x PBS og 0,25% trypsin-EDTA i et 37 °C vandbad.
- Pladen med O9-1-celler skylles forsigtigt med varm 1x PBS to gange som beskrevet i trin 1.2.2.1.
- Der tilsættes 1 ml trypsin-EDTA til kolben og anbringes i 37 °C inkubatoren i 5 min.
- Efter 5 minutters inkubation fjernes kolben fra inkubatoren, og kolben tappes forsigtigt for at løsne eventuelle klæbende celler.
- Tilsæt 9 ml O9-1 vækstmedium til kolben for at slukke trypsinen. Saml 10 ml af den trypsiniserede cellesuspension og tilsæt 10 ml af denne cellesuspension til et 15 ml konisk rør. Centrifuger røret ved 100 × g i 5 min.
- Supernatanten fjernes, og cellerne gensuspenderes i 10 ml O9-1 vækstmedium. For yderligere passaging tilsættes 1 ml af de resuspenderede celler til en 75 cm2 kolbe. Der tilsættes 11 ml O9-1-vækstmedium, og kolben indeholdende cellerne anbringes i 12 ml medium i kuvøsen 37 °C.
2. Plating af celler i et kokultursystem
- Belægning af C2C12 cellekamre:
- Efter trypsinisering (som beskrevet i trin 1.2) resuspenderes C2C12-cellepellet i 10 ml C2C12-medium. Fortynd cellerne i forholdet 1:20 i C2C12-medium ved at fjerne 0,5 ml af de resuspenderede C2C12-celler og tilføje dem til et nyt 15 ml konisk rør indeholdende 9,5 ml frisk C2C12-medium. Bland forsigtigt suspensionen med en serologisk pipette.
- Tilsæt 1 ml af de 1:20-fortyndede C2C12-celler til hver brønd i en ny 4-kammerbrønd ved hjælp af en P1000-pipette og læg den 4-kammerede brønd i inkubatoren.
- Plating O9-1 celleindsatser:
- Efter trypsinisering resuspenderes O9-1-cellepellet i 10 ml O9-1-vækstmedium. Fortynd cellerne i forholdet 1:20 i O9-1 vækstmedium ved at fjerne 0,5 ml af de resuspenderede C2C12-celler og tilføje dem til et nyt 15 ml konisk rør indeholdende 9,5 ml frisk O9-1 vækstmedium. Bland forsigtigt suspensionen med en serologisk pipette.
- Placer en enkelt permeabel indsats (se materialetabellen) inde i hver brønd i en ny 4-kammerbrønd fyldt med 1 ml O9-1 vækstmedium.
BEMÆRK: Denne 4-kammerbrønd skal være forskellig fra den, der indeholder C2C12-cellerne fra trin 2.1.3. - Der tilsættes 300 μL fortyndet O9-1-cellesuspension til hver indsats ved hjælp af en P1000-pipette. Sørg for, at bunden af hver indsats er nedsænket i brønden fyldt med 1,3 ml O9-1 vækstmedium. Brønden anbringes i rugemaskinen på 37 °C.
- (Valgfrit). Udfør siRNA-knockdown i O9-1-cellerne eller C2C12-cellerne.
- Udfør gennedslag med siRNA 18-24 timer efter plettering af enten O9-1 celleindsatser eller C2C12 cellekammerbrønde.
- Fortynd siRNA og transfektionsreagens i reduceret serummedium (se materialetabellen) i henhold til producentens anbefalinger og de ønskede koncentrationer for eksperimentet. Bland forsigtigt det fortyndede siRNA og transfektionsreagens (1:1) og inkuber blandingen ved stuetemperatur i 7 min.
BEMÆRK: I denne protokol blev 50 nM-koncentrationer anvendt, da denne siRNA-koncentration blev bestemt til at resultere i tilstrækkelig knockdown af målgenekspression. - Tilsæt siRNA-lipidkomplekserne til enten O9-1-celleindsatserne eller C2C12-cellekammerbrøndene som bestemt af det eksperimentelle design og inkuber cellerne med siRNA-lipidkomplekserne i ~ 36-48 timer.
- Fortynd siRNA og transfektionsreagens i reduceret serummedium (se materialetabellen) i henhold til producentens anbefalinger og de ønskede koncentrationer for eksperimentet. Bland forsigtigt det fortyndede siRNA og transfektionsreagens (1:1) og inkuber blandingen ved stuetemperatur i 7 min.
- Udfør gennedslag med siRNA 18-24 timer efter plettering af enten O9-1 celleindsatser eller C2C12 cellekammerbrønde.
3. Udførelse af sårassay og kvantitativ vurdering af myoblastmigration
- Såranalyse:
- Lad O9-1-celleindsatserne og C2C12-cellekammerbrøndene klæbe og proliferere i inkubatoren, indtil begge celler er ved ~ 70-80% sammenløb, før du fortsætter med denne del af protokollen. Hvis celler vokser >90% sammenflydende, skal du ikke fortsætte med ridseanalysen, da celler blot løsner sig fra brønden.
- Varm 1x PBS og C2C12 medium ved at placere dem i et 37 ° C vandbad.
- Fjern supernatantmedium fra C2C12-kammeret godt, og vask cellerne en gang med 1x PBS. Fjern 1x PBS, og ridse straks cellerne med en steril P10-pipettespids.
- Før den sterile P10-pipettespids godt i en enkelt retning for at spænde over hele længden eller bredden af cellemonolaget (f.eks. højre mod venstre, top til bund). Sørg for kun at ridse hver brønd, der indeholder celler én gang.
BEMÆRK: For at optimere ridseresultater skal du ridse brønde med forskellige eksperimentelle forhold på et lignende niveau af sammenløb. For at gøre dette skal du sikre dig, at hver 4-kammerbrønd har celler til hver krævet eksperimentel tilstand (f.eks. Godt # 1 negativ kontrol, godt # 2 positiv kontrol). Derudover skal du bruge en ny steril P10-pipette til hver ridse og anvende en lignende mængde kraft på pipetten hver gang. Forsøg ikke at skabe mere end en ridse i hver brønd. - Efter ridser skal du hurtigt tilføje 1 ml 1x PBS tilbage i brønden ved hjælp af en P1000 pipettespids. Gentag denne proces for hver brønd, der vil blive ridset.
BEMÆRK: I betragtning af variabiliteten forbundet med hver ridse anbefales det, at flere brønde (n = 3) anvendes til sårdannelse i hver eksperimentel tilstand. Arbejd hurtigt, da det er afgørende at minimere den varighed, hvor cellerne er uden 1x PBS under disse trin. Efter fjernelse af 1x PBS fra hver brønd bør man ikke tage mere end 5 s for at generere et sår i hver brønd.
- Før den sterile P10-pipettespids godt i en enkelt retning for at spænde over hele længden eller bredden af cellemonolaget (f.eks. højre mod venstre, top til bund). Sørg for kun at ridse hver brønd, der indeholder celler én gang.
- Når du har genereret et sår og tilføjet 1x PBS tilbage i hver brønd, skal du afbilde ridsen ved hjælp af et brightfield omvendt mikroskop og bruge dette billede som basissårstørrelse (tid 0). Udfør følgende trin for at tage billeder:
- Tænd computeren og mikroskopet (se materialetabellen) ved at trykke på tænd / sluk-knappen. Placer kammerrutsjebanen på scenen, og drej målskiven til 5x forstørrelse.
- Åbn billedbehandlingssoftwaren (se materialetabellen) ved at dobbeltklikke på softwareikonet på computerens skrivebord. Klik på fanen Kamera på softwarens startskærm. Klik på knappen Live for at visualisere cellerne på fanen AxioCam IC .
- Sørg for, at lysfilteret trækkes helt ud, så lyset kan passere til kameraet og computerskærmen. Flyt og/eller drej kammersliden manuelt for at placere sårområdet i midten af det levende billede på fanen AxioCam IC .
- Hvis du vil tage billeder, skal du klikke på fastgør for at åbne en ny fane ved siden af fanen AxioCam IC , der indeholder billedet.
- For at gemme dette stillbillede skal du klikke på filen øverst til venstre på softwarens startside | gemme som | indtaste filnavnet i filnavnsfeltet. Gem figuren i Carl Zeiss-billedformat (*.czi)-format (standardindstillingen), og vælg skrivebord på linjen til venstre for at gemme filen på skrivebordet som en .czi-fil, som kun kan åbnes i Zen lite 2012-softwareprogrammet.
- Hvis du vil gemme billedet som en .tiff, skal du klikke på filen | gemme som | indtaste filnavnet i feltet Filnavn. Gem figuren som tagget billedfil (*.tiff) ved at klikke på knappen Gem som type og vælge *.tiff i rullemenuen.
BEMÆRK: Det .tiff format kan åbnes i enhver billedbehandlingssoftware. - Flyt kammerrutsjebanen manuelt for at tage 2-3 billeder mere på andre punkter af såret i samme brønd.
BEMÆRK: I alt vil dette resultere i 3-4 ikke-overlappende, højforstørrelsesbilleder af såret i hver brønd.
- Fjern 1x PBS fra hver brønd, og tilføj 1 ml C2C12-medium.
BEMÆRK: Vær forsigtig med ikke at pipettere for aggressivt, når du fjerner eller tilføjer opløsninger til kammerbrønden efter sårgenerering, da dette kan få celler til at løsne sig fra kammeret godt. Derudover skal du vippe kammeret godt, så aspiration og genindførelse af løsninger kan udføres i hjørnerne af hver brønd for at minimere cellemonolagsforstyrrelse. - Saml brøndindsatsens kokultursystem ved manuelt at placere indsatserne indeholdende O9-1-cellerne i hver brønd i kammerbrønden. Skub forsigtigt indsatserne ned i brønden, så bunden af indsatsen sidder lige over de underliggende C2C12-celler. Returner brøndindsatskonstruktionerne til inkubatoren.
BEMÆRK: Lad ikke bunden af indsatsen fysisk røre ved og mekanisk forstyrre de underliggende C2C12-celler. - Lad cellerne migrere i alt 9-12 timer. For at bestemme den optimale migrationstid skal du kontrollere cellerne kl. 6 efter sårdannelse og derefter hver 2-3 timer. Afslut eksperimentet, når cellerne i kontrol eller positive kontrolforhold begynder at dække såret helt.
BEMÆRK: I betragtning af konstruktionens berøringsfri karakter behøver den overliggende indsats ikke at blive fjernet fra brøndene, når man kontrollerer intervalmigrationsprogression. Migrationsvariation vil blive observeret afhængigt af faktorer som de celletyper, der anvendes i dette assay, cellulær tæthed på tidspunktet for sårgenerering, bredden af det skabte sår og eksperimentelle betingelser for manipulerede celler (f.eks. gennedslagning, rekombinant proteintilsætning). Koncentrationerne af disse reagenser bør bestemmes eksperimentelt med vejledning fra fabrikantens anbefalinger.
4. Immunofluorescensfarvning og billeddannelse af migrerende myoblaster
- Afslutning af migrationsanalysen og dekonstruktion af brøndindsatssystemet:
- Fjern O9-1-celleindsatserne efter en 9-12 timers migrationsperiode (eller alternativ tid udpeget af eksperimentelle betingelser). Opsug forsigtigt C2C12-mediet ved hjælp af en P1000-pipette. Tilføj 0,5 ml 1x PBS til kammerbrøndene, og tag de endelige billeder af celler efter migration.
- Opsug forsigtigt alle 0,5 ml 1x PBS blandet med medium, og fjern plastkamrene fra kammerbrøndene ved hjælp af kitinstruktioner, så det underliggende dias indeholdende C2C12-cellerne efterlades.
BEMÆRK: Pas på ikke at forstyrre C2C12-cellerne, der klæber til diaset, når du fjerner kammerbrøndene.
- Udførelse af immunostaining:
- Anbring straks diaset i en diasholder, der indeholder 4% paraformaldehyd (PFA), og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur. Hæld 4% PFA ud og tilsæt 0,1% Triton X-100-indeholdende 1x PBS (1x PBST) til glideholderen for at vaske diaset i 15 minutter ved stuetemperatur. Hæld 1x PBST ud, og tilsæt 1x PBS til glideholderen for at vaske rutsjebanen i 10 minutter ved stuetemperatur. Gentag dette trin endnu en gang for i alt to 1x PBS-vaske.
- Fjern sliden fra slideholderen. Spor de ydre kanter af diaset med en hydrofob pen for at skabe en hydrofob grænse omkring diaset for at forhindre opløsninger i at spilde fra diaset. Pas på ikke at forstyrre de vedhæftede celler.
- Der tilsættes 1% bovin serumalbumin (BSA) blokerende opløsning (fortyndet i 1x PBS) til diaset (~ 0,5 ml pr. Dias). Sørg for, at opløsningen er indeholdt i den hydrofobe grænse, der blev oprettet i trin 4.2.4. Inkuber glideren i 1 time ved stuetemperatur i et befugtet glidekammer.
BEMÆRK: Selvom BSA-blokering ikke er påkrævet for phalloidin-immunostaining, giver dette trin i protokollen mulighed for kobling med fluorescensantistoffarvning. - Efter blokering i 1 time hældes blokeringsopløsningen ud af diaset, phalloidinantistoffet tilsættes (fortyndet til 1:200 i 1% BSA-blokerende opløsning ved at tilsætte 5 μL antistof til 995 μL BSA-opløsning) til diaset og inkuberes ved 4 °C natten over. Igen skal det sikres, at opløsningen er indeholdt i den hydrofobe grænse, der blev oprettet i trin 4.2.4. I betragtning af at phalloidin-antistoffet er konjugeret til Alexa Fluor-488-farvestof, minimeres lyseksponeringen af antistofreagenset før og efter tilsætning til diaset.
- Den følgende dag skal du placere rutsjebanen i en glideholder, der er beskyttet mod lyseksponering (f.eks. pakke glideholderen ind i folie eller bruge en uigennemsigtig glideholder). Cellerne i lysbilledholderen vaskes med 1x PBS i 10 minutter ved stuetemperatur. Gentag vasken i alt tre 10 minutters vask.
- Tilsæt 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI)-indeholdende monteringsmedium og monter diasene med glasdæksler. Forestil dig de celler, der er migreret ved hjælp af et standard fluorescensmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Virkningerne af NCC'er på migrationskapaciteten af murine myoblaster
Dette assay blev først anvendt til at evaluere virkningen af NCC'er på myoblasternes migrationskapacitet. Figur 1 skitserer den skematiske model af analysen. For at teste denne påvirkning blev ridseanalyser udført med myoblaster, der blev dyrket isoleret (uden NCC-indsatser) sammenlignet med dem, der blev dyrket i nærværelse af indsatser. Som en positiv kontrol blev 500 ng/ml rekombinant Wnt5a (rWnt5a) tilsat til kammerbrønde med NCC-indsatser. Denne koncentration af rWnt5a blev bestemt ved en dosis-respons-analyse udført i C2C12-celler (supplerende figur S1). Repræsentative billeder af NCC-indsatser er vist i supplerende figur S2, der viser, at NCC'erne er sunde på dette tidspunkt. Immunofluorescens viser robust knockdown af Wnt5a på proteinniveau efter inkubation med 50 nM Wnt5a siRNA (supplerende figur S3). Efter en migrationsperiode på 9 timer blev det konstateret, at tilstedeværelsen af NCC'er signifikant øgede myoblasternes migrationskapacitet sammenlignet med myoblaster analyseret i fravær af NCC-indsatser (72,6% sårgenbefolket område mod 59,1% sårgenbefolket område, p = 0,033). Tilføjelsen af rWnt5a til kokulturbrønde fremskyndede myoblastmigrationen, hvor nogle sårområder viste fuldstændig bedring ved 9 timers tidspunktet, som vist i figur 2. Som forventet udviste migrerende myoblaster under alle tre tilstande normal migrerende cellulær morfologi, herunder velformet og fremspringende filopodia og lamellopodi og asymmetrisk polarisering af actin cytoskeletale fremskrivninger (figur 2C).
Betydningen af NCC-afledt Wnt5a for polariseret migration af myoblaster
For at evaluere den parakrine effekt af NCC-afledt Wnt5a på myoblast-migration blev sårhelingsassays udført i myoblaster efter den siRNA-medierede knockdown af Wnt5a i NCC'er. For det første blev Wnt5a knockdown-effektiviteten valideret i NCC'er ved realtidskvantitativ polymerasekædereaktion. Behandling med 50 nM siRNA mod Wnt5a viste sig at reducere Wnt5a-genekspression med 64% sammenlignet med negativ kontrol (krypteret) siRNA (figur 3A). Ved hjælp af denne koncentration blev O9-1-celleindsatser transficeret med enten kontrolsiRNA eller Wnt5a siRNA 48 timer før samling af kokulturen. C2C12-celler blev dyrket under normale forhold, og der blev skabt sår ved det passende sammenløb. Umiddelbart efter sårgenerering blev negativ kontrol eller Wnt5a knockdown NCC-indsatser tilføjet til hver brønd. Efter en migrationsperiode på 10 timer blev det konstateret, at knockdown af Wnt5a i NCC'er signifikant reducerede den underliggende myoblast-migrationskapacitet sammenlignet med myoblaster analyseret med kontrol NCC'er (39,1% sårgenbefolket område vs 74,8% sår-genbefolket område, p < 0,001). Desuden viste myoblaster analyseret i nærværelse af NCC'er med knockdown af Wnt5a unormal cytologisk morfologi ved immunostaining, herunder reducerede cytoplasmatiske områder og færre actin cytoskeletale fremskrivninger (figur 3D). For at redde myoblastmigrationen blev eksogent tilskud af 500 ng/ml rWnt5a tilsat til cokulturbrønde indeholdende Wnt5a knockdown-indsatser. Tilsætningen af eksogen rWnt5a viste sig fuldstændigt at redde vandrende og morfologiske defekter observeret i disse myoblaster (figur 3C, D).
Wnt5a signalerer gennem ROR2 i myoblaster som en drivkraft for polariseret migration
For bedre at forstå de signalmodtagende cellemekanismer i denne parakrine model blev analysen gentaget efter knockdown af ROR2-receptoren i myoblaster. I dette eksperiment blev myoblaster transficeret med 50 nM ROR2 siRNA ~ 40 timer før sårgenerering, hvilket viste sig at være tilstrækkeligt til at slå ROR2-genekspression ned med 54% (figur 4A). I løbet af denne tid blev NCC-indsatser dyrket parallelt under normale forhold. Efter at myoblaster nåede passende sammenløb, blev der udført ridseassays, og cokulturbrøndindsatser blev samlet. Efter en 10 timers migrationsperiode i nærværelse af NCC-indsatser viste ROR2 knockdown myoblaster reduceret migrationskapacitet sammenlignet med myoblaster behandlet med negativ kontrol siRNA (48,1% sår-genbefolket område vs 75,7% sår-genbefolket område, p = 0,019) (figur 4B,C). Tilføjelsen af 500 ng/ml rWnt5a kunne ikke redde myoblast-migrationskapaciteten efter ROR2-knockdown, hvilket tyder på, at ROR2-udtømning forstyrrer myoblasternes evne til at modtage Wnt5a-signaler (figur 4B,C). Immunostaining for phalloidin bekræftede migrationsdataene og viste, at en reduktion i phalloidin-positiv lamellopodi og filopodia i ROR2 knockdown myoblaster ikke blev genoprettet ved supplerende rWnt5a (figur 4D).
Figur 1: Skematisk model af analysen. Trin 1 omfatter in vitro-ekspansion af C2C12 myoblaster og NCC'er ved hjælp af STO-feederceller. Trin 2 involverer plettering af NCC'er og C2C12-celler i kokultursystemet. Trin 3 inkluderer sårassayet udført i underliggende C2C12-celler for at evaluere cellulær migrationskapacitet. Trin 4 involverer immunostaining for phalloidin for at evaluere cytologisk arkitektur og morfologi af migrerede celler. Forkortelser: NCC'er = neurale kamceller; Ab = antistof. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Tilstedeværelsen af neurale kamceller øger myoblast-migrationskapaciteten. (A) Tilstedeværelsen af neurale kamcelleindsatser (NCC) på tidspunktet for sårgenerering fører til forbedret myoblastmigration. Tilsætningen af eksogene rekombinante Wnt5a (rWnt5a) til NCC-C2C12 cokulturer har den stærkeste positive effekt på myoblastmigration. (B) Kvantificering af gennemsnitligt myoblast genbefolket område ved 9 timer efter sårgenerering (fejlbjælker viser standardafvigelse). (C) Phalloidinfarvning af myoblaster ved sårgrænsen 9 timer efter sårdannelse. Stiplede rektangler viser phalloidinfarvede myoblaster ved migrationsfronten. Der blev anvendt i alt n = 3 prøver for hver forsøgstilstand kvantificeret i B. Skalabjælker = 200 μm (for A og C). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Neural crest celle-afledt Wnt5a er nødvendig for myoblast migration. (A) Relativ mRNA-ekspression af Wnt5a for at validere siRNA-medieret knockdown i NCC'er. (B) Migration af C2C12 myoblaster reduceres signifikant efter Wnt5a knockdown i NCC'er. (C) Kvantificering af det gennemsnitlige myoblast-genbefolkede område ved 10 timer efter sårdannelse (fejllinjer viser standardafvigelse). (D) Phalloidinfarvning af myoblaster ved sårgrænsen 10 timer efter sårdannelse. Stiplede rektangler viser phalloidinfarvede myoblaster ved migrationsfronten. Der blev anvendt i alt n = 3 prøver for hver forsøgstilstand kvantificeret i C. Skalabjælker = 200 μm (for B og D). Forkortelser: NCC'er = neurale kamceller; siRNA = lille interfererende RNA. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Wnt5a signalerer gennem ROR2-receptorer i myoblaster for at drive migration. (A) Relativ mRNA-ekspression af ROR2 for at validere siRNA-medieret knockdown i C2C12-celler. (B) Knockdown af ROR2 i myoblaster reducerer deres migrationskapacitet på trods af tilstedeværelsen af NCC'er. (C) Kvantificering af det gennemsnitlige myoblast-genbefolkede område ved 10 timer efter sårdannelse (fejllinjer viser standardafvigelse). (D) Phalloidinfarvning af myoblaster ved sårgrænsen 10 timer efter sårdannelse. Stiplede rektangler viser phalloidinfarvede myoblaster ved migrationsfronten. Der blev anvendt i alt n = 3 prøver for hver forsøgstilstand kvantificeret i C. Skala søjler = 200 μm. Forkortelser: NCC'er = neurale kamceller; siRNA = lille interfererende RNA. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur S1: Dosisafhængig analyse for rekombinant Wnt5a-tilskud. Dosisafhængig analyse for rekombinant Wnt5a-tilskudstest 0 ng / ml, 100 ng / ml og 500 ng / ml fandt 500 ng / ml eksogen rWnt5a at være den optimale koncentration til at drive myoblastmigration og phalloidin cytoarkitektoniske ændringer i løbet af en 12 timers migrationsperiode in vitro. Skalabjælker = 200 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S2: Repræsentative billeder af brøndindsatser. Brightfield-billeder af brøndindsatser indeholdende O9-1 neurale kamceller behandlet med (A) 50 nM negativ kontrol siRNA og (B) 50 nM Wnt5a siRNA. Skala søjler = 200 μm. Forkortelse: siRNA = lille interfererende RNA. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S3: Repræsentative billeder af Wnt5a-proteinekspression i O9-1-celler efter siRNA-medieret Wnt5a-knockdown. Immunofluorescensfarvning af Wnt5a-protein i cellekulturbrønde indeholdende O9-1 neurale kamceller behandlet med (A) 50 nM negativ kontrol siRNA og (B) 50 nM Wnt5a siRNA. Skalabjælker = 20 μM. Forkortelser: siRNA = lille interfererende RNA; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den noncanonical Wnt / planar cell polarity (PCP) signalvej er en kritisk vigtig cellulær signalvej, der har været impliceret i flere udviklingsmæssige 24,25 og sygdomsprocesser 24,26. Under embryonal udvikling involverer ikke-kanonisk Wnt-signalering et ekspansivt netværk af molekylære signaler fra signalsendende celler, der i sidste ende inducerer ændringer i morfologi, asymmetrisk organisation og retningsbestemt migration i signalmodtagende celler11. Tidligere undersøgelser har vist, at de specifikke ligandreceptorveje, der driver denne signalering, er forskellige, kontekstafhængige og ofte varierer mellem celletyper12,13,14,15. På grund af denne molekylære kompleksitet har evnen til at vurdere parakrine nonkanoniske Wnt-signalinteraktioner ved hjælp af konventionelle genetiske rekombinationsmetoder in vivo været begrænset. Mens in vitro-systemer i stigende grad er blevet brugt som en alternativ tilgang til at studere ikke-kanoniske Wnt-cellulære fænotyper, fokuserer tilgængelige protokoller udelukkende på nedstrøms signalmodtagende aspekter af vejen og undlader i tilstrækkelig grad at modellere den intercellulære og parakrine karakter af disse signalhændelser. Derfor var formålet med denne undersøgelse at udvikle en protokol for et ikke-kontakt kokultursystem, der rekapitulerer parakrine Wnt-interaktioner in vitro. Fokus for denne protokol var at modellere to karakteristiske aspekter af funktionel noncanonisk Wnt-signalering in vitro, herunder organisering af intracellulære filamentproteiner og polariseret migrationskapacitet.
Som et bevis på konceptet blev denne protokol anvendt til at studere parakrine mekanismer i forbindelse med hjerteudvikling. Under kardiogenese er gensidige signalhændelser mellem hjerte-NCC'er og SHF-stamceller afgørende for en passende modning af hjerteudstrømningskanalen (OFT)27,28,29. Tidligere arbejde har vist, at NCC-medieret Wnt/PCP-signalering i svælg-SHF-celler under musehjerte er påkrævet for SHF-stamcelleinkorporering i den udviklende OFT og for normal OFT-justering21. Schleiffarth et al. og andre har vist, at genetisk knockout af genet, der koder for Wnt / PCP-liganden, Wnt5, har vist sig at forstyrre SHF-stamfadercelleorganisation og migrationskapacitet, hvilket resulterer i en forkortet og forkert justeret hjerte OFT22,23,30. Med etablerede murine NCC (O9-1)31 og myoblast (C2C12) cellelinjer viser denne protokol, at samkultur med NCC'er er forbundet med øget phalloidin-positiv cytoplasmatisk filopodia og lamellipodi og forbedrer myoblast-migrationskapaciteten i et sårhelende assay. Disse molekylære og funktionelle endepunkter in vitro bygger på tidligere offentliggjorte protokoller for NCC-manipulation31 og modellerer nøje de in vivo fænotypiske ændringer beskrevet i Wnt5a globale knockoutmus, hvilket validerer nytten af denne model.
For at bestemme den specifikke molekylære vej, der driver ikke-kanonisk Wnt-signalering mellem NCC'er og myoblaster, blev der udført parallelle cellespecifikke knockdown-eksperimenter for generne, der koder for kandidatliganden, Wnt5a, i NCC'er og dens tilsvarende receptor, ROR2, i myoblaster. Som forventet forstyrrede knockdown af molekyler i både signalafsendende (Wnt5a i NCC'er) og signalmodtagende (ROR2 i myoblaster) celler uafhængigt Wnt / PCP-relaterede actincytoarkitektoniske ændringer og hæmmede myoblastmigration. Det er vigtigt, at fænotypisk redning med rekombinant Wnt5a kun blev observeret i NCC-Wnt5a knockdown-tilstanden, som understøtter en mekanisme, hvorved NCC-afledt Wnt5a aktiverer PCP-signalering i myoblaster gennem ROR2-receptorer. Disse resultater er i overensstemmelse med data fra musegenetiske undersøgelser, der identificerer Wnt5a-ROR2-aksen som en afgørende Wnt / PCP-signalakse mellem NCC'er og SHF-celler under embryonal hjerteudvikling 3,21. Selvom det ikke er eksperimentelt testet i denne protokol, er det stadig uklart, om SHF-afledt Wnt5a giver gensidige parakrine signaler til neurale kam gennem ROR2-receptorer. Denne hypotese kunne testes ved hjælp af denne protokol ved at gentage eksperimenterne med C2C12-celler øverst og O9-1-celler på bunden af brøndindsatskonstruktionen. Hvis SHF-afledt Wnt5a giver et gensidigt parakrinsignal gennem NCC-ROR2, ville man forvente, at knockdown af Wnt5a i C2C12-celler hæmmer migrationskapacitet og actinpolymerisation af de underliggende O9-1-celler.
Der er flere unikke styrker ved denne protokol. For det første er det et berøringsfrit brøndindsatssystem, der inkorporerer sekventiel brug af sårhelende assays og immunostaining-teknikker til evaluering af funktionelle og molekylære Wnt / PCP-egenskaber i den samme population af signalmodtagende celler. Dette giver ikke kun en robust tilgang til fænotypning af ikke-kanonisk Wnt-induceret intracellulær filamentorganisation og polariserede migrationsændringer in vitro , men tillader også mere granulære vurderinger af signaltransduktionsmekanismer. Mens denne protokol giver bevis for princippet om Wnt5a-ROR2-molekyler, egner modellen sig også let til at evaluere virkningerne af andre ligander og receptorer i den ikke-kanoniske Wnt-signalvej. Man kan yderligere tilpasse immunostaining-protokollen for at evaluere ekspressionen af flere potentielle downstream-effektorproteiner (f.eks. RhoA, p-JNK, Daam1, Rac1), der har vist sig at transducere ikke-kanoniske Wnt-signaler in vivo. Derudover kan proteinniveauer af disse forskellige effektormolekyler korreleres med enten migrerende eller actincytoarkitekturfænotyper. For det andet giver kokultursystemets ikke-kontaktkarakter mulighed for uafhængig manipulation af specifikke signalafsendende versus signalmodtagende molekyler i Wnt/PCP-vejen. I disse repræsentative resultater blev det valgt at udføre cellespecifik siRNA-knockdown. Denne protokol er imidlertid også egnet til anvendelse af farmakologiske hæmmere eller genetisk modificerede cellelinjer til evaluering af kandidatligandreceptorveje til klinisk anvendelse. På samme måde kan man udføre fænotypiske redningseksperimenter ved at tilføje molekylære eller farmakologiske forbindelser til kokulturmediet, som det blev vist med rekombinant Wnt5a. Målretning af disse forbindelser for selektivt at redde signalafsendelse versus signalmodtagende forstyrrelser validerer yderligere parakrine mekanistiske veje på måder, der ikke er tilladt ved hjælp af nuværende in vivo-modelsystemer .
Der er mange kritiske trin i denne protokol. For det første er det vigtigt at sikre, at primære celler udvides og vedligeholdes ved det passende sammenløb i hele protokollen. Hvis C2C12 myoblaster får lov til at sprede sig til 100% sammenløb, vil de begynde at smelte sammen og differentiere sig fra myoblaster til myotubes. Derfor skal disse celler passeres med den passende tæthed som beskrevet. For det andet, i betragtning af at STO-feederceller er nødvendige for at generere konditioneret medium til dyrkning af O9-1-celler, er det bydende nødvendigt, at man korrekt inaktiverer STO-celler med mitomycin C og gør tilstrækkeligt (mindst 500 ml) O9-1-vækstmedium ved hjælp af inaktiverede SO-celler inden optøning og plettering af O9-1-celler. Måske er det mest kritiske trin i denne protokol dannelsen af passende ridser med ensartet geometri og bredde i myoblast monolaget32,33. Trin 3.1.4 beskriver flere tip til optimering af denne del af protokollen. På trods af disse anbefalinger bør det erkendes, at variabiliteten forbundet med standard 2D-ridseanalyser fortsat er en teknisk udfordring og en begrænsning af denne protokol. Derfor er det nødvendigt at have flere tekniske replikater af hver eksperimentel tilstand.
Endelig, selvom de resultater, der præsenteres her, blev genereret ved hjælp af murine NCC'er og myoblaster, kan denne protokol i princippet tilpasses til at omfatte enhver signalafsendende og signalmodtagende celle af interesse. Som et resultat har dette system ikke kun applikationer til at fremme grundlæggende mekanismer for parakrin ikke-kanonisk Wnt-signalering i en række udviklingsmæssige sammenhænge, men det kan også bruges til at teste terapeutiske mekanismer til Wnt / PCP-relaterede sygdomsprocesser. Eksempler omfatter farmakologisk screening for lægemidler, der hæmmer Wnt/PCP-induceret migrationskapacitet hos maligne celler eller genopretter retningsbestemt migration af patientafledte terminalcelletyper med defekt PCP-signalkapacitet ved baseline. Ud over den ikke-kanoniske Wnt-signalvej kan denne protokol også tilpasses til at studere andre parakrine signalmekanismer og veje mellem to celletyper. For eksempel kan siRNA-medieret knockdown af kendte sekretoriske molekyler i andre veje (f.eks. Notch, Bmp / Tgf-β, Fgf) i O9-1-celler kombineres med immunostaining af proliferative, differentiering eller apoptotiske markører i underliggende myoblaster.
Afslutningsvis etablerer denne protokol en ny og meget medgørlig eksperimentel protokol til undersøgelse af mekanismer for ikke-kanonisk Wnt-relateret intracellulær filamentorganisation og polariseret migration in vitro. De metoder, der er beskrevet her, forbedrer eksisterende teknikker ved at opretholde den intercellulære og parakrine karakter af Wnt-interaktioner og giver mulighed for uafhængig vurdering af signalafsendende versus signalmodtagende komponenter i denne vej. Denne protokol kan anvendes bredt til at undersøge grundlæggende parakrine Wnt / PCP-signalmekanismer mellem to celletyper og screening for nye terapeutiske forbindelser rettet mod Wnt / PCP-relaterede sygdomsprocesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at forskningen blev udført i mangel af kommercielle eller økonomiske forhold, der kunne opfattes som en potentiel interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af NIH-priser F30HL154324 til O.T. og K08HL121191 og R03HL154301 til S.R.K. Forfatterne vil gerne anerkende, at skemaet i figur 1 i dette manuskript blev oprettet med biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M-7522 | |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | Stored at 4 °C |
| Bovine serum albumin | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323 | Stored at 4 °C |
| C2C12 murine myoblast cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Cell culture flasks, 75 cm2 | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| Chamber Slide System, 4-well | ThermoFisher Scientific | 154526 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM) | Corning | 10-017-CV | Stored at 4 °C |
| Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membrane | Corning | 353095 | |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | W3381E | Stored in 50 mL aliquots at -20 °C |
| Gelatin solution, 0.1% | ATCC | PCS-999-027 | Stored at 4 °C |
| Graduated and sterile pipette tips, 10 µL | USA Scientific | 1111-3810 | |
| Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Corning | 10-022-CV | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm | Springside Scientific | HRTCG2455 | |
| O9-1 neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| Opti-MEM I, 1x | Gibco | 31985-070 | |
| Paraformaldehyde solution in PBS, 4% | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Stored at 4 °C |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin) | Fisher Scientific | W3470H | Stored in 10 mL aliquots at -20 °C |
| Phalloidin-iFluor 488 | Abcam | ab176753 | Stored at -20 °C, Keep out of light |
| Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CV | Stored at 4 °C |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Recombinant human/mouse Wnt5a protein | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Gibco | 11360-070 | |
| Square Petri dish with grid | Thomas Scientific | 1219C98 | |
| STO murine fibroblast feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Fisher Scientific | W3513C | Stored at 4 °C |
| Zeiss Apotome.2 fluoresence microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zen lite 2012 microscopy software | Carl Zeiss AG | imaging software |
References
- Ho, H. Y. H., et al. Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).
- Čapek, D., et al. Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration. Elife. (8), 42093 (2019).
- Li, D., et al. Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation. Development. 146 (20), 181719 (2019).
- Lutze, G., et al. Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling. Scientific Reports. 9 (1), 4739 (2019).
- Buttler, K., et al.
- Betterman, K. L., et al. Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow. Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).
- Descamps, B., et al. Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling. Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).
- Weeraratna, A. T., et al. Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma. Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).
- Henry, C., et al. Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).
- Anastas, J. N., et al. A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression. Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).
- Niehrs, C. The complex world of WNT receptor signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).
- Dong, B., et al. Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles. Development. 145 (19), (2018).
- Bernascone, I., et al. Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels. Nature Communications. 10 (1), 2481 (2019).
- Hendrickx, G., et al. WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts. Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).
- Avgustinova, A., et al. Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness. Nature Communications. (7), 10305 (2016).
- Tseng, J. C., et al. CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling. Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).
- Wang, Q., et al. A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer. PLoS One. 5 (5), 10456 (2010).
- Gibbs, B. C., et al. Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects. Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).
- Cui, C., et al. a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton. PLoS Biology. 11 (11), 1001720 (2013).
- Gombos, R., et al. The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).
- Toubat, O., et al. Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells. Circulation. 142, Suppl_3 12540 (2020).
- Li, D., et al. Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment. Developmental Biology. 412 (1), 18-31 (2016).
- Sinha, T., et al. Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome. Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).
- Humphries, A. C., et al. From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer. Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).
- Shi, D. L. Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370 (2020).
- Butler, M. T., et al. Planar cell polarity in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).
- Bradshaw, L., et al. Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H. Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).
- Kodo, K., et al. Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development. Scientific Reports. 7 (1), 6771 (2017).
- Waldo, K. L., et al. Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field. Developmental Biology. 281 (1), 66-77 (2005).
- Schleiffarth, J. R., et al. Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice. Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).
- Nguyen, B. H., et al. Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).
- Martinotti, S., et al.
