Summary
Den aktuella studien beskriver en mycket reproducerbar och lätthanterlig metod för att studera parakrina icke-kanoniska Wnt-signaleringshändelser in vitro. Detta protokoll tillämpades för att utvärdera effekten av parakrin Wnt5a-signalering i murina neurala vapenceller och myoblaster.
Abstract
Icke-kanonisk Wnt-signalering reglerar intracellulär aktinfilamentorganisation och polariserad migration av stamceller under embryogenesen. Denna process kräver komplexa och samordnade parakrina interaktioner mellan signalsändande och signalmottagande celler. Med tanke på att dessa interaktioner kan uppstå mellan olika typer av celler från olika släktlinjer kan in vivo-utvärdering av cellspecifika defekter vara utmanande. Denna studie beskriver en mycket reproducerbar metod för att utvärdera parakrin icke-kanonisk Wnt-signalering in vitro. Detta protokoll utformades med förmågan att (1) genomföra funktionella och molekylära bedömningar av icke-kanonisk Wnt-signalering mellan två celltyper av intresse; (2) dissekera rollen av signalsändande kontra signalmottagande molekyler i den icke-kanoniska Wnt-signalvägen; och (3) utföra fenotypiska räddningsexperiment med vanliga molekylära eller farmakologiska metoder.
Detta protokoll användes för att utvärdera neurala crest cell (NCC) -medierade icke-kanoniska Wnt-signalering i myoblaster. Närvaron av NCC är associerad med ett ökat antal falloidinpositiva cytoplasmatiska filopodier och lamellipodier i myoblaster och förbättrad myoblastmigration i en sårläkningsanalys. Wnt5a-ROR2-axeln identifierades som en avgörande icke-kanonisk Wnt-signalväg mellan NCC och andra hjärtfält (SHF) kardiomyoblastförfäder. Sammanfattningsvis är detta ett mycket lätthanterligt protokoll för att studera parakrina icke-kanoniska Wnt-signalmekanismer in vitro.
Introduction
Icke-kanonisk Wnt-signalering är en evolutionärt bevarad väg som reglerar cellulär filamentorganisation och riktningsmigration. Denna väg har varit inblandad i flera biologiska processer, inklusive embryonal vävnadsmorfogenes 1,2,3, lymfatisk och vaskulär angiogenes 4,5,6,7 och cancertillväxt och metastasering 8,9,10 . På cellnivå utförs icke-kanonisk Wnt-signalering genom samordnade parakrina interaktioner mellan signalsändande och signalmottagande celler. Dessa interaktioner förekommer ofta mellan celler av olika härstamning eller typ och involverar ett varierat molekylärt nätverk som inkluderar upp till 19 ligander och flera receptorer, samreceptorer och nedströms signaltransduktionseffektorer11. För att ytterligare komplicera denna signalprocess har tidigare studier visat att ligand-receptorkombinationer kan variera på ett kontext- och vävnadsberoende sätt 12,13, och att samma källligander som driver icke-kanonisk Wnt-signalering i signalmottagande celler kan produceras av flera signalsändande celltyper 14,15 . Med tanke på den cellulära och molekylära komplexiteten associerad med icke-kanonisk Wnt-signalering har förmågan att studera individuella och kliniskt relevanta mekanismer in vivo varit begränsad.
Försök har gjorts att studera icke-kanonisk Wnt-signalering med hjälp av cellodlingstekniker in vitro. Till exempel har sårläkningsanalyser utförda i cellulära monolager använts för att funktionellt bedöma cellulär riktningsmigration 4,16,17,18,19. Immunfärgningstekniker har använts för att utföra rumsliga analyser av ytproteinuttryck för att utvärdera icke-kanoniska Wnt-inducerade förändringar i cellulär morfologi 7,10, arkitektur och asymmetrisk polarisation18,19,20. Även om dessa tillvägagångssätt har gett viktiga verktyg för att karakterisera Wnt-relaterade fenotyper i signalmottagande celler, begränsar bristen på signalsändande komponenter i dessa protokoll deras förmåga att exakt modellera parakrina signalmekanismer som observerats in vivo. Som ett resultat kvarstår ett kritiskt behov av att utveckla in vitro-system som möjliggör robust och reproducerbar utvärdering av parakrina signalinteraktioner mellan signalsändande och mottagande celler i den icke-kanoniska Wnt-vägen, särskilt de av olika celltyper.
För detta ändamål var det primära målet med denna studie att upprätta ett protokoll för att modellera parakrina icke-kanoniska Wnt-signalinteraktioner in vitro. Vi utvecklade ett kontaktfritt kokultursystem som rekapitulerar signalsändande och signalmottagande komponenter i dessa interaktioner och tillåter användning av standard molekylära, genetiska eller farmakologiska metoder för att självständigt studera specifika ligandreceptormekanismer i den icke-kanoniska Wnt-vägen. Mekanismer för NCC-medierad Wnt-signalering undersöktes i myoblaster med hjälp av etablerade murina cellinjer. Som bevis på princip användes denna modell för att bekräfta fynd av tidigare in vivo-studier på möss som implicerar Wnt5a-ROR2-axeln som en relevant icke-kanonisk Wnt-signalväg mellan NCC 21 och SHF kardiomyoblast stamfäder 3,22,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preexperimentell expansion och passering av celler
- C2C12 cellodling:
- Förbered 500 ml C2C12-odlingsmedium genom att kombinera Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM) med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1 % penicillin / streptomycin.
- Tina en injektionsflaska med C2C12-celler i 37 °C vattenbad. Medan C2C12-cellerna tinar, tillsätt 5 ml C2C12-medium till ett 15 ml koniskt rör. Överför omedelbart de tinade cellerna till 15 ml röret med en P1000-pipett.
OBS: C2C12-celler är murina myoblastceller som tidigare har använts och validerats som en primär cellinje för modellering av kardiomyoblast-stamfäder. - Blanda försiktigt C2C12-celler i det koniska röret med en serologisk pipett. Tillsätt sedan hela volymen tinade celler i C2C12-medium (6 ml) till en 75 cm2 kolv.
- Tillsätt 6 ml färskt C2C12-medium till kolven med en total volym på 12 ml. Rotera kolven försiktigt så att cell- och medielösningen täcker hela kolvens botten. Placera kolven i en cellodlingsinkubator (37 °C, 5 %CO2) så att cellerna kan fästa.
- Låt cellerna expandera i inkubatorn tills de når ~ 60% sammanflöde.
OBS: Detta kan bestämmas genom att regelbundet avlägsna cellerna från inkubatorn och snabbt kontrollera deras sammanflöde under ett mikroskop. Var noga med att minimera tiden som celler tas bort från inkubatorn.
- Passaging C2C12 celler:
- Värm C2C12-mediet, 500 ml 1x PBS och 0,25% trypsin-EDTA i ett 37 °C vattenbad. Efter att reagenserna har värmts överför du alla reagenser till cellodlingshuven.
- För in kolven som innehåller C2C12-cellerna i cellodlingshuven. Skölj försiktigt kolven som innehåller C2C12-cellerna med varm 1x PBS två gånger.
- Luta kolven i 45° vinkel och aspirera C2C12-mediet med en glaspipett ansluten till vakuumsugning. Med en vinkel på 45°, tillsätt försiktigt 10 ml varm 1x PBS i hörnet av kolven med en serologisk pipett. Lägg kolven platt på ytan och flytta försiktigt kolven i cirkulära rörelser för att säkerställa att 1x PBS tvättas över hela monolagret av celler.
OBS: Var försiktig så att du inte stör C2C12-monolagret när du aspirerar mediet.
- Luta kolven i 45° vinkel och aspirera C2C12-mediet med en glaspipett ansluten till vakuumsugning. Med en vinkel på 45°, tillsätt försiktigt 10 ml varm 1x PBS i hörnet av kolven med en serologisk pipett. Lägg kolven platt på ytan och flytta försiktigt kolven i cirkulära rörelser för att säkerställa att 1x PBS tvättas över hela monolagret av celler.
- Ta bort 1x PBS efter den andra tvätten. Tillsätt 1 ml 0,25 % trypsin-EDTA till kolven, flytta försiktigt kolven enligt beskrivningen ovan så att trypsin-EDTA-lösningen kan spridas över så mycket som möjligt av monolagret och placera kolven i inkubatorn i 2 minuter.
- Efter 2 minuters inkubation, ta bort kolven från inkubatorn och knacka försiktigt på den för att lossa eventuella återstående celler.
- Tillsätt 9 ml C2C12-medium till kolven med en serologisk pipett för att släcka trypsinet. Använd den serologiska pipetten, skölj försiktigt cellerna med mediet och samla 10 ml trypsiniserad cellsuspension. Tillsätt 10 ml av cellsuspensionen till ett nytt 15 ml koniskt rör och centrifugera med 100 × g i 5 minuter.
- Sätt tillbaka det koniska röret till cellodlingshuven och ta bort supernatanten med en glaspipett ansluten till vakuumsugning. När du aspirerar supernatanten, var försiktig så att du inte stör cellpelleten i botten av det koniska röret. För att göra detta, lämna ~ 0,2 ml av supernatanten i det koniska röret. Återsuspendera cellerna i 10 ml färskt C2C12-medium.
- För ytterligare passering, tillsätt 1 ml av de återsuspenderade cellerna i en 75 cm2 kolv. Tillsätt 11 ml C2C12-medium till kolven med en serologisk pipett och placera kolven i inkubatorn.
- STO-cellodling:
- Förbered STO-odlingsmedium genom att göra 500 ml DMEM med 7% FBS, 1% penicillin / streptomycin och 2 nM L-glutamin.
- Förbered 0,1% gelatin genom att tillsätta 0,5 g gelatinpulver till en flaska innehållande 500 ml vävnadskvalitet eller autoklaverat vatten. Tillsätt 7 ml 0,1% gelatinlösning till en 75 cm2 kolv. Vrid kolven så att gelatinlösningen täcker hela kolvens botten. Låt kolven inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur i cellodlingshuven.
- Efter 30 minuters inkubation, avlägsna överskottet av gelatin med en pipett ansluten till vakuumsugning. Låt kolvarna ligga kvar i kuvösen i ytterligare 30 minuter före användning.
- Tina en injektionsflaska med STO-celler i ett 37 °C vattenbad. Använd en P1000-pipett och överför omedelbart de tinade cellerna till ett 15 ml koniskt rör innehållande 5 ml nyberedt STO-odlingsmedium.
OBS: STO-celler är murina embryonala fibroblaster som rutinmässigt används som matarceller i cellodlingsprotokoll. - Blanda försiktigt cellerna i det koniska röret med en serologisk pipett. Tillsätt hela volymen (6 ml) celler till en gelatinbelagd 75 cm2 kolv. Vrid kolven så att cellsuspensionen är väl fördelad längs kolvens botten.
- Tillsätt 6 ml färskt STO-medium till kolven för en total volym på 12 ml. Vrid kolven enligt beskrivningen ovan för att säkerställa att cellerna och mediet är väl fördelade längs kolvens botten. Placera kolven i 37 °C-inkubatorn så att cellerna kan fästa. Låt cellerna sprida sig i inkubatorn tills de når ~ 60-70% sammanflöde.
- Passerande STO-celler:
- Varmt STO-cellmedium, 1xPBS och 0,25% trypsin-EDTA i ett 37 °C vattenbad.
- Skölj försiktigt kolven som innehåller STO-celler med varm 1x PBS två gånger enligt beskrivningen i steg 1.2.2.1.
- Tillsätt 1 ml 0,25 % trypsin-EDTA till kolven med en P1000-pipett. Placera kolven i 37 °C i 5 minuter.
- Efter 5 minuters inkubation, ta bort kolven från inkubatorn. Tryck försiktigt på kolven för att lossa eventuella vidhäftande celler.
- Tillsätt 9 ml STO-medium till kolven för att släcka trypsin och samla upp 10 ml trypsiniserad cellsuspension enligt beskrivningen ovan. Tillsätt 10 ml av cellsuspensionen till ett 15 ml e-rörs och centrifugera med 100 × g i 5 minuter.
- Ta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 10 ml STO-medium enligt beskrivningen ovan. För ytterligare passering, tillsätt 1 ml av de återsuspenderade cellerna i en 75 cm2 kolv. Tillsätt 11 ml STO-medium, rotera kolven för att säkerställa jämn fördelning av cellerna och mediet längs kolvens botten och placera kolven i inkubatorn.
- Inaktiv STO-cellodling och O9-1-cellbasalmediumberedning:
- Förbered O9-1-cellbasalodlingsmediet genom att blanda 500 ml DMEM med 15% FBS, 1% penicillin / streptomycin, 2 nM L-glutamin, 0,1 mM minsta icke-väsentliga aminosyror, 1 nM natriumpyruvat och 55 μM beta-merkaptoetanol.
- Bered mitomycin C-lösning i 1x PBS i en koncentration av 0,5 mg / ml genom att tillsätta 4 ml 1x PBS direkt till en mitomycin C-injektionsflaska. Pipettera lösningen flera gånger med en P1000-pipett. För att ytterligare lösa upp mitomycin C i 1x PBS, placera injektionsflaskan på en virvelblandare eller bänkvippa i 45 min till 1 timme.
- Inaktivera STO-cellerna genom att behandla STO-plattorna med en slutlig koncentration på 0,01 mg/ml mitomycin C tillsatt till standardmediet STO. Placera STO-plattorna inuti inkubatorn i 2 timmar, var noga med att skydda kolven som innehåller mitomycin C från ljus genom att minimera tiden utanför inkubatorn. Efter behandling med mitomycin, tvätta cellerna i 1x PBS två gånger enligt beskrivningen i steg 1.2.2.1.
OBS: Mitomycin C hämmar proliferationen av STO-celler så att de kan användas för att generera konditionerat medium under flera dagar utan att bli översammanflytande i kolven. - Efter att ha tagit bort 1x PBS, tillsätt 12 ml O9-1 basalodlingsmedium till de inaktiverade STO-cellkulturerna och inkubera dem i 24 timmar. Samla det konditionerade, inaktiverade STO + O9-1 basala odlingsmediet och placera det i 50 ml koniska rör inslagna i folie för att skydda det från ljus.
- Tillsätt 12 ml färskt O9-1-basalodlingsmedium till de inaktiverade STO-cellkulturerna enligt beskrivningen ovan. Upprepa detta steg genom att tillsätta färskt O9-1 basalodlingsmedium till samma flanker som innehåller de inaktiverade STO-cellerna var 24: e timme.
OBS: Efter mitomycin C-behandling kan de inaktiverade STO-cellerna inte föröka sig; Därför kan kolvarna som innehåller de inaktiverade STO-cellerna återanvändas för att generera konditionerat medium. - Förvara de folieförpackade 50 ml koniska rören som innehåller konditionerat, inaktiverat STO + O9-1 basalt odlingsmedium vid 4 °C tills totalt 500 ml av mediet har samlats in.
- O9-1 cellodling:
- Förbered O9-1 celltillväxtodlingsmedium med 500 ml konditionerat STO + O9-1 basalt medium och tillsätt 103 enheter leukemihämmande faktor (LIF) och 25 ng / ml basisk fibroblasttillväxtfaktor (basisk-FGF).
- Bered 0,1 % gelatinbelagda kolvar enligt beskrivningen i steg 1.3.2–1.3.3.
- Tina en injektionsflaska med O9-1-celler i ett 37 °C vattenbad. Överför omedelbart de tinade cellerna till ett 15 ml koniskt rör innehållande 5 ml nyberedt O9-1-tillväxtmedium.
OBS: O9-1-cellinjen är den enda stabila, multipotenta neurala vapencellinjen som har genererats från musen. Denna cellinje används ofta i neurala vapen in vitro-experiment . - Blanda försiktigt cellerna med en serologisk pipett. Tillsätt hela 6 ml celler till en gelatinbelagd 75 cm2 kolv.
- Tillsätt 6 ml O9-1 tillväxtmedium till kolven i en total volym av 12 ml. Placera kolven i 37 °C-inkubatorn så att cellerna kan fästa. Låt cellerna sprida sig i inkubatorn tills de når ~ 60-70% sammanflöde.
- Passaging O9-1-celler:
- Varmt O9-1 tillväxtmedium, 1x PBS och 0,25% trypsin-EDTA i ett 37 ° C vattenbad.
- Skölj försiktigt plattan som innehåller O9-1-celler med varm 1x PBS två gånger enligt beskrivningen i steg 1.2.2.1.
- Tillsätt 1 ml 0,25 % trypsin-EDTA till kolven och placera den i 37 °C inkubatorn i 5 minuter.
- Efter 5 minuters inkubation, ta bort kolven från inkubatorn och knacka försiktigt på kolven för att lossa eventuella vidhäftande celler.
- Tillsätt 9 ml O9-1 tillväxtmedium till kolven för att släcka trypsinet. Samla upp 10 ml av den trypsiniserade cellsuspensionen och tillsätt 10 ml av denna cellsuspension till ett 15 ml koniskt rör. Centrifugera röret vid 100 × g i 5 min.
- Ta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 10 ml O9-1 tillväxtmedium. För ytterligare passering, tillsätt 1 ml av de återsuspenderade cellerna till en 75 cm2 kolv. Tillsätt 11 ml O9-1 tillväxtmedium och placera kolven som innehåller cellerna i 12 ml medium i 37 °C-inkubatorn.
2. Plätering av celler i ett samodlingssystem
- Prätning av C2C12 cellkammare:
- Efter trypsinisering (som beskrivs i steg 1.2), återsuspendera C2C12-cellpelleten i 10 ml C2C12-medium. Späd cellerna i förhållandet 1:20 i C2C12-medium genom att avlägsna 0,5 ml av de återsuspenderade C2C12-cellerna och tillsätta dem till ett nytt 15 ml koniskt rör innehållande 9,5 ml färskt C2C12-medium. Blanda försiktigt suspensionen med en serologisk pipett.
- Tillsätt 1 ml av de 1:20-utspädda C2C12-cellerna till varje brunn i en ny 4-kammarbrunn med en P1000-pipett och placera den 4-kammarbrunnen i inkubatorn.
- Plätering av O9-1-cellinsatser:
- Efter trypsinisering, återsuspendera O9-1-cellpelleten i 10 ml O9-1-tillväxtmedium. Späd cellerna i ett förhållande 1:20 i O9-1-tillväxtmedium genom att avlägsna 0,5 ml av de återsuspenderade C2C12-cellerna och tillsätta dem till ett nytt 15 ml koniskt rör innehållande 9,5 ml färskt O9-1-tillväxtmedium. Blanda försiktigt suspensionen med en serologisk pipett.
- Placera en enda permeabel insats (se materialtabellen) inuti varje brunn i en ny 4-kammarbrunn fylld med 1 ml O9-1 tillväxtmedium.
OBS: Denna 4-kammarbrunn bör skilja sig från den som innehåller C2C12-cellerna från steg 2.1.3. - Tillsätt 300 μl av den utspädda O9-1-cellsuspensionen till varje insats med en P1000-pipett. Se till att botten av varje insats är nedsänkt i brunnen fylld med 1,3 ml O9-1 tillväxtmedium. Placera brunnen i 37 °C inkubatorn.
- (Valfritt). Utför siRNA-knockdown i O9-1-cellerna eller C2C12-cellerna.
- Utför gen knockdown av siRNA 18-24 h efter plätering av antingen O9-1 cellinsatser eller C2C12 cellkammarbrunnar.
- Späd siRNA och transfektionsreagens i reducerat serummedium (se materialförteckningen) enligt tillverkarens rekommendationer och de önskade koncentrationerna för experimentet. Blanda försiktigt det utspädda siRNA och transfektionsreagenset (1:1) och inkubera blandningen vid rumstemperatur i 7 minuter.
OBS: I detta protokoll användes 50 nM-koncentrationer eftersom denna siRNA-koncentration bestämdes för att resultera i tillräcklig knockdown av målgenuttrycket. - Tillsätt siRNA-lipidkomplexen till antingen O9-1-cellinsatserna eller C2C12-cellkammarbrunnarna som bestäms av den experimentella designen och inkubera cellerna med siRNA-lipidkomplexen i ~ 36-48 h.
- Späd siRNA och transfektionsreagens i reducerat serummedium (se materialförteckningen) enligt tillverkarens rekommendationer och de önskade koncentrationerna för experimentet. Blanda försiktigt det utspädda siRNA och transfektionsreagenset (1:1) och inkubera blandningen vid rumstemperatur i 7 minuter.
- Utför gen knockdown av siRNA 18-24 h efter plätering av antingen O9-1 cellinsatser eller C2C12 cellkammarbrunnar.
3. Utföra såranalys och kvantitativt bedöma myoblastmigration
- Såranalys:
- Låt O9-1-cellinsatserna och C2C12-cellkammarbrunnarna fästa och sprida sig i inkubatorn tills båda cellerna har ~ 70-80% sammanflöde innan du fortsätter med denna del av protokollet. Om cellerna växer >90% sammanflytande, fortsätt inte med repanalysen, eftersom cellerna bara lossnar från brunnen.
- Värm 1x PBS och C2C12 medium genom att placera dem i ett 37 °C vattenbad.
- Ta bort supernatantmedium från C2C12-kammaren väl och tvätta cellerna en gång med 1x PBS. Ta bort 1x PBS och skrapa omedelbart cellerna med en steril P10-pipettspets.
- För den sterila P10-pipettspetsen ordentligt i en enda riktning för att sträcka sig över hela cellmonoskiktets längd eller bredd (t.ex. höger till vänster, uppifrån och ner). Var noga med att skrapa varje brunn som innehåller celler bara en gång.
OBS: För att optimera represultat, repa brunnar med olika experimentella förhållanden på en liknande nivå av sammanflöde. För att göra detta, se till att varje 4-kammarbrunn har celler för varje nödvändigt experimentellt tillstånd (t.ex. brunn #1 negativ kontroll, väl #2 positiv kontroll). Använd dessutom en ny steril P10-pipett för varje repa och applicera en liknande mängd kraft på pipetten varje gång. Försök inte skapa mer än en repa i varje brunn. - Efter repor, tillsätt snabbt 1 ml 1x PBS tillbaka i brunnen med en P1000-pipettspets. Upprepa denna process för varje brunn som kommer att repas.
OBS: Med tanke på variationen i samband med varje repa rekommenderas att flera brunnar (n = 3) används för sårskapande i varje experimentellt tillstånd. Arbeta snabbt eftersom det är viktigt att minimera varaktigheten för vilken cellerna är utan 1x PBS under dessa steg. Efter att ha tagit bort 1x PBS från varje brunn bör man inte ta mer än 5 s för att generera ett sår i varje brunn.
- För den sterila P10-pipettspetsen ordentligt i en enda riktning för att sträcka sig över hela cellmonoskiktets längd eller bredd (t.ex. höger till vänster, uppifrån och ner). Var noga med att skrapa varje brunn som innehåller celler bara en gång.
- Efter att ha genererat ett sår och lagt till 1x PBS tillbaka i varje brunn, avbilda repan med ett ljusfält inverterat mikroskop och använd den här bilden som baslinjesårstorlek (tid 0). Så här tar du bilder:
- Slå på datorn och mikroskopet (se materialförteckningen) genom att trycka på strömbrytaren. Placera kammarbilden på scenen och vrid målratten till 5x förstoring.
- Öppna bildbehandlingsprogrammet (se materialförteckningen) genom att dubbelklicka på programvaruikonen på datorns skrivbord. Klicka på fliken Kamera på programvarans startskärm. Klicka på knappen Live för att visualisera cellerna på fliken AxioCam IC .
- Se till att ljusfiltret dras hela vägen ut så att ljuset kan passera till kameran och datorskärmen. Flytta och/eller rotera kammarreglaget manuellt för att placera sårområdet i mitten av livebilden på fliken AxioCam IC .
- Om du vill ta bilder klickar du på fäst för att öppna en ny flik bredvid fliken AxioCam IC som innehåller bilden.
- För att spara den här stillbilden, klicka på filen längst upp till vänster på programvarans hemsida | spara som | ange filnamnet i rutan filnamn. Spara figuren i Carl Zeiss-bildformat (*.czi) (standardinställningen) och välj skrivbord i fältet till vänster för att spara filen på skrivbordet som en .czi-fil, som bara kan öppnas i Zen lite 2012-programmet.
- Om du vill spara bilden som en .tiff klickar du på Arkiv | spara som | anger filnamn i rutan Filnamn. Spara figuren som taggad bildfil (*.tiff) genom att klicka på knappen Spara som typ och välja *.tiff i rullgardinsmenyn.
OBS: Det .tiff formatet kan öppnas i alla bildbehandlingsprogram. - Flytta kammarbilden manuellt för att ta ytterligare 2-3 bilder på andra punkter i såret i samma brunn.
OBS: Totalt kommer detta att resultera i 3-4 icke-överlappande, förstoringsbilder av såret i varje brunn.
- Ta bort 1x PBS från varje brunn och tillsätt 1 ml C2C12-medium.
OBS: Var försiktig så att du inte pipetterar för aggressivt när du tar bort eller lägger till lösningar i kammaren väl efter sårgenerering, eftersom detta kan få celler att lossna från kammaren väl. Luta dessutom kammaren väl så att aspiration och återinförande av lösningar kan göras i hörnen av varje brunn för att minimera cellmonolagerstörningar. - Montera brunnsinsatssystemet genom att manuellt placera insatserna som innehåller O9-1-cellerna i varje brunn i kammarbrunnen. Tryck försiktigt ner insatserna i brunnen så att insatsens botten sitter strax ovanför de underliggande C2C12-cellerna. Återställ brunnsinsatskonstruktionerna till inkubatorn.
OBS: Låt inte skärets botten fysiskt vidröra och mekaniskt störa de underliggande C2C12-cellerna. - Låt cellerna migrera i totalt 9–12 timmar. För att bestämma den optimala migrationstiden, kontrollera cellerna vid 6 timmar efter sårskapande, sedan var 2-3: e timme därefter. Avsluta experimentet när cellerna i kontroll eller positiva kontrollförhållanden börjar helt täcka såret.
OBS: Med tanke på konstruktionens beröringsfria natur behöver den överliggande insatsen inte tas bort från brunnarna när man kontrollerar intervallmigrationsprogressionen. Migrationsvariation kommer att observeras beroende på faktorer som celltyperna som används i denna analys, cellulär densitet vid tidpunkten för sårgenerering, bredden på det skapade såret och experimentella förhållanden för manipulerade celler (t.ex. gennedslagning, rekombinant proteintillsats). Koncentrationerna av dessa reagenser bör bestämmas experimentellt med vägledning från tillverkarens rekommendationer.
4. Immunofluorescensfärgning och avbildning av migrerande myoblaster
- Avsluta migreringsanalysen och dekonstruera brunnsinsatssystemet:
- Ta bort O9-1-cellinsatserna efter en 9-12 timmars migreringsperiod (eller alternativ tid som anges av experimentella förhållanden). Aspirera försiktigt C2C12-mediet med en P1000-pipett. Lägg till 0,5 ml 1x PBS i kammarbrunnarna och ta slutliga bilder av celler efter migrering.
- Aspirera försiktigt alla 0,5 ml 1x PBS blandat med medium och ta bort plastkamrarna från kammarbrunnarna med hjälp av kitinstruktioner och lämna den underliggande bilden som innehåller C2C12-cellerna.
OBS: Var försiktig så att du inte stör C2C12-cellerna som är vidhäftande med bilden när du tar bort kammarbrunnarna.
- Utför immunfärgning:
- Placera omedelbart objektsglaset i en objektsglas som innehåller 4 % paraformaldehyd (PFA) och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur. Häll ut 4% PFA och tillsätt 0,1% Triton X-100-innehållande 1x PBS (1x PBST) till glidhållaren för att tvätta bilden i 15 min vid rumstemperatur. Häll ut 1x PBST och tillsätt 1x PBS till glidhållaren för att tvätta bilden i 10 min vid rumstemperatur. Upprepa detta steg en gång till för totalt två 1x PBS-tvättar.
- Ta bort bilden från skjutreglaget. Spåra bildens ytterkanter med en hydrofob penna för att skapa en hydrofob gräns runt bilden för att förhindra att lösningar spills ut från bilden. Var försiktig så att du inte stör de vidhäftande cellerna.
- Tillsätt 1% bovint serumalbumin (BSA) blockerande lösning (utspädd i 1x PBS) till bilden (~ 0,5 ml per bild). Se till att lösningen finns inom den hydrofoba gränsen som skapades i steg 4.2.4. Inkubera bilden i 1 h vid rumstemperatur i en fuktad glidkammare.
OBS: Även om BSA-blockering inte krävs för falloidinimmunfärgning, möjliggör detta steg i protokollet koppling med fluorescensantikroppsfärgning. - Efter blockering i 1 timme, häll ut blockeringslösningen från objektsglaset, tillsätt falloidinantikropp (utspädd till 1:200 i 1% BSA-blockerande lösning genom att tillsätta 5 μL av antikroppen till 995 μL BSA-lösning) till objektsglaset och inkubera vid 4 °C över natten. Återigen, se till att lösningen finns inom den hydrofoba gränsen som skapades i steg 4.2.4. Med tanke på att falloidinantikroppen är konjugerad till Alexa Fluor-488-färgämnet, minimera ljusexponeringen av antikroppsreagenset före och efter tillsats till bilden.
- Följande dag placerar du bilden i en glidhållare som är skyddad från ljusexponering (t.ex. linda in glidhållaren i folie eller använd en icke-transparent glidhållare). Tvätta cellerna i glidhållaren med 1x PBS i 10 min vid rumstemperatur. Upprepa tvätten i totalt tre 10 min tvättar.
- Tillsätt 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI)-innehållande monteringsmedium och montera diabilderna med glaskåpor. Avbilda cellerna som har migrerat med hjälp av ett vanligt fluorescensmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effekter av NCC på migrationskapaciteten hos murina myoblaster
Denna analys tillämpades först för att utvärdera effekterna av NCC på myoblasternas migrationskapacitet. Figur 1 beskriver den schematiska modellen för analysen. För att testa denna påverkan utfördes repanalyser med myoblaster som odlades isolerat (utan NCC-insatser) jämfört med de som odlades i närvaro av skär. Som en positiv kontroll tillsattes 500 ng/ml rekombinant Wnt5a (rWnt5a) till kammarbrunnar med NCC-skär. Denna koncentration av rWnt5a bestämdes genom en dos-responsanalys utförd i C2C12-celler (kompletterande figur S1). Representativa bilder av NCC-skär visas i kompletterande figur S2, vilket visar att NCC: erna är friska vid denna tidpunkt. Immunofluorescens visar robust knockdown av Wnt5a på proteinnivå efter inkubation med 50 nM Wnt5a siRNA (kompletterande figur S3). Efter en 9 timmars migrationsperiod fann man att närvaron av NCC signifikant ökade myoblasternas migrationskapacitet jämfört med myoblaster som analyserades i frånvaro av NCC-insatser (72,6% såråterbefolkat område jämfört med 59,1% såråterbefolkat område, p = 0,033). Tillsatsen av rWnt5a till cokulturbrunnar påskyndade myoblastmigrationen, med vissa sårområden som visade fullständig återhämtning vid 9 timmars tidpunkt, som visas i figur 2. Som förväntat uppvisade migrerande myoblaster under alla tre tillstånden normal migrerande cellulär morfologi, inklusive välformad och utskjutande filopodia och lamellopodi och asymmetrisk polarisering av aktincytoskelettprojektioner (figur 2C).
Betydelsen av NCC-härledd Wnt5a för polariserad migration av myoblaster
För att utvärdera den parakrina effekten av NCC-härledd Wnt5a på myoblastmigration utfördes sårläkningsanalyser i myoblaster efter den siRNA-medierade knockdownen av Wnt5a i NCC. Först validerades Wnt5a knockdown-effektivitet i NCC genom kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid. Behandling med 50 nM siRNA mot Wnt5a visade sig minska Wnt5a-genuttrycket med 64% jämfört med negativt kontroll-siRNA (Figur 3A). Med hjälp av denna koncentration transfekterades O9-1-cellinsatser med antingen kontroll-siRNA eller Wnt5a siRNA 48 h före montering av coculture. C2C12-celler odlades under normala förhållanden och sår skapades vid lämplig sammanflöde. Omedelbart efter sårgenerering tillsattes negativa kontroll- eller Wnt5a-knockdown-NCC-skär till varje brunn. Efter en 10 timmars migrationsperiod fann man att knockdown av Wnt5a i NCC signifikant minskade underliggande myoblastmigrationskapacitet jämfört med myoblaster analyserade med kontroll NCC (39,1% såråterbefolkat område jämfört med 74,8% såråterbefolkat område, p < 0,001). Dessutom visade myoblaster som analyserades i närvaro av NCC med knockdown av Wnt5a onormal cytologisk morfologi genom immunfärgning, inklusive reducerade cytoplasmatiska områden och färre aktincytoskelettprojektioner (figur 3D). För att rädda myoblastmigration tillsattes exogent tillskott av 500 ng/ml rWnt5a till coculture wells innehållande Wnt5a knockdown-insatser. Tillägget av exogent rWnt5a visade sig helt rädda migrerande och morfologiska defekter som observerats i dessa myoblaster (figur 3C,D).
Wnt5a-signalering genom ROR2 i myoblaster som en drivkraft för polariserad migration
För att bättre förstå de signalmottagande cellmekanismerna i denna parakrina modell upprepades analysen efter knockdown av ROR2-receptorn i myoblaster. I detta experiment transfekterades myoblaster med 50 nM ROR2 siRNA ~ 40 h före sårgenerering, vilket visade sig vara tillräckligt för att slå ner ROR2-genuttryck med 54% (Figur 4A). Under denna tid odlades NCC-insatser parallellt under normala förhållanden. Efter att myoblaster nått lämplig sammanflöde utfördes repanalyser och kolkulturbrunninsatser monterades. Efter en 10 timmars migrationsperiod i närvaro av NCC-skär visade ROR2-knockdown-myoblaster minskad migrationskapacitet jämfört med myoblaster behandlade med negativt kontroll-siRNA (48,1% såråterbefolkat område jämfört med 75,7% såråterbefolkat område, p = 0,019) (Figur 4B,C). Tillägget av 500 ng/ml rWnt5a misslyckades med att rädda myoblastens migrationskapacitet efter ROR2-knockdown, vilket tyder på att ROR2-utarmning stör myoblasternas förmåga att ta emot Wnt5a-signaler (figur 4B,C). Immunfärgning för falloidin bekräftade migrationsdata och visade att en minskning av falloidinpositiv lamellopodi och filopodia i ROR2-knockdown-myoblaster inte återställdes genom kompletterande rWnt5a (Figur 4D).
Figur 1: Schematisk modell av analysen. Steg 1 inkluderar in vitro-expansion av C2C12-myoblaster och NCC med hjälp av STO-matarceller. Steg 2 involverar plätering av NCC- och C2C12-celler i cokultursystemet. Steg 3 inkluderar såranalysen som utförs i underliggande C2C12-celler för att utvärdera cellulär migrationskapacitet. Steg 4 involverar immunfärgning för falloidin för att utvärdera cytologisk arkitektur och morfologi hos migrerade celler. Förkortningar: NCC = neurala vapenceller; Ab = antikropp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Närvaron av neurala vapenceller ökar myoblastens migrationskapacitet . (A) Närvaron av neurala vapenceller (NCC) vid tidpunkten för sårgenerering leder till förbättrad myoblastmigration. Tillägget av exogen rekombinant Wnt5a (rWnt5a) till NCC-C2C12-kokulturer har den starkaste positiva effekten på myoblastmigration. (B) Kvantifiering av det genomsnittliga myoblaståterbefolkade området vid 9 timmar efter sårgenerering (felstaplar visar standardavvikelse). (C) Falloidinfärgning av myoblaster vid sårgränsen 9 timmar efter sårgenerering. Streckade rektanglar visar falloidinfärgade myoblaster vid migrationsfronten. Totalt n = 3 prover användes för varje experimentellt tillstånd kvantifierat i B. Skalstänger = 200 μm (för A och C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Neural crest cell-härledd Wnt5a är nödvändig för myoblastmigration. (A) Relativt mRNA-uttryck av Wnt5a för att validera siRNA-medierad knockdown i NCC. (B) Migration av C2C12-myoblaster reduceras signifikant efter Wnt5a-knockdown i NCC. Tillägg av exogent rWnt5a är tillräckligt för att rädda detta migrationsunderskott i myoblaster. (C) Kvantifiering av genomsnittligt myoblaståterbefolkat område vid 10 timmar efter sårgenerering (felstaplar visar standardavvikelse). (D) Falloidinfärgning av myoblaster vid sårgränsen 10 timmar efter sårgenerering. Streckade rektanglar visar falloidinfärgade myoblaster vid migrationsfronten. Totalt användes n = 3 prover för varje experimentellt tillstånd kvantifierat i C. Skalstänger = 200 μm (för B och D). Förkortningar: NCC = neurala vapenceller; siRNA = litet störande RNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Wnt5a signalerar genom ROR2-receptorer i myoblaster för att driva migration. (A) Relativt mRNA-uttryck av ROR2 för att validera siRNA-medierad knockdown i C2C12-celler. (B) Knockdown av ROR2 i myoblaster minskar deras migrationskapacitet trots närvaron av NCC. Exogena rWnt5a misslyckas med att rädda myoblastmigration efter ROR2 knockdown. (C) Kvantifiering av genomsnittligt myoblaståterbefolkat område vid 10 timmar efter sårgenerering (felstaplar visar standardavvikelse). (D) Falloidinfärgning av myoblaster vid sårgränsen 10 timmar efter sårgenerering. Streckade rektanglar visar falloidinfärgade myoblaster vid migrationsfronten. Totalt användes n = 3 prover för varje experimentellt tillstånd kvantifierat i C. Skalstänger = 200 μm. Förkortningar: NCC = neurala vapenceller; siRNA = litet störande RNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur S1: Dosberoende analys för rekombinant Wnt5a tillskott. Dosberoende analys för rekombinant Wnt5a tillskottstest 0 ng / ml, 100 ng / ml och 500 ng / ml fann att 500 ng / ml exogen rWnt5a var den optimala koncentrationen för att driva myoblastmigration och falloidin cytoarkitektoniska förändringar under en 12 timmars migrationsperiod in vitro. Skalstänger = 200 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S2: Representativa bilder av brunnsinsatser. Brightfield-bilder av brunnsinsatser som innehåller O9-1 neurala crest-celler behandlade med (A) 50 nM negativt kontroll-siRNA och (B) 50 nM Wnt5a siRNA. Skalstänger = 200 μm. Förkortning: siRNA = litet störande RNA. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S3: Representativa bilder av Wnt5a-proteinuttryck i O9-1-celler efter siRNA-medierad Wnt5a-knockdown. Immunofluorescensfärgning av Wnt5a-protein i cellodlingsbrunnar innehållande O9-1 neurala crestceller behandlade med (A) 50 nM negativt kontroll-siRNA och (B) 50 nM Wnt5a siRNA. Skalstänger = 20 μM. Förkortningar: siRNA = litet störande RNA; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den icke-kanoniska Wnt / planar cellpolaritet (PCP) signalvägen är en kritiskt viktig cellulär signalväg som har varit inblandad i flera utvecklingsprocesser 24,25 och sjukdomsprocesser 24,26. Under embryonal utveckling involverar icke-kanonisk Wnt-signalering ett expansivt nätverk av molekylära signaler från signalsändande celler som i slutändan inducerar förändringar i morfologi, asymmetrisk organisation och riktningsmigration i signalmottagande celler11. Tidigare studier har visat att de specifika ligandreceptorvägarna som driver denna signalering är olika, kontextberoende och ofta varierar mellan celltyperna12,13,14,15. På grund av denna molekylära komplexitet har förmågan att bedöma parakrina icke-kanoniska Wnt-signalinteraktioner med hjälp av konventionella genetiska rekombinationsmetoder in vivo varit begränsad. Medan in vitro-system i allt högre grad har använts som ett alternativt tillvägagångssätt för att studera icke-kanoniska Wnt-cellulära fenotyper, fokuserar tillgängliga protokoll uteslutande på nedströms signalmottagande aspekter av vägen och misslyckas med att tillräckligt modellera den intercellulära och parakrina naturen hos dessa signalhändelser. Därför var målet med denna studie att utveckla ett protokoll för ett beröringsfritt coculture-system som rekapitulerar parakrina Wnt-interaktioner in vitro. Fokus för detta protokoll var att modellera två karakteristiska aspekter av funktionell icke-kanonisk Wnt-signalering in vitro, inklusive organisationen av intracellulära filamentproteiner och polariserad migrationskapacitet.
Som ett bevis på konceptet tillämpades detta protokoll för att studera parakrina mekanismer i samband med hjärtutveckling. Under kardiogenesen är ömsesidiga signalhändelser mellan hjärt-NCC och SHF-stamceller avgörande för lämplig mognad av hjärtutflödeskanalen (OFT)27,28,29. Tidigare arbete har visat att under mushjärtats utveckling krävs NCC-medierad Wnt/PCP-signalering i svalgceller för shf-cellinkorporering i SHF-stamcellsinkorporering i den utvecklande OFT och för normal OFT-inriktning21. och andra har visat att genetisk knockout av genen som kodar för Wnt / PCP-liganden, Wnt5, har visat sig störa SHF-stamcellsorganisationen och migrationskapaciteten, vilket resulterar i en förskjuten och feljusterad hjärt-OFT22,23,30. Med etablerade murina NCC (O9-1)31 och myoblast (C2C12) cellinjer visar detta protokoll att samodling med NCC är associerat med ökad falloidinpositiv cytoplasmatisk filopodia och lamellipodi och förbättrar myoblastens migrationskapacitet i en sårläkningsanalys. Dessa molekylära och funktionella endpoints in vitro bygger på tidigare publicerade protokoll för NCC-manipulation31 och modellerar noggrant de in vivo fenotypiska förändringarna som beskrivs i Wnt5a globala knockout-möss, vilket validerar nyttan av denna modell.
För att bestämma den specifika molekylära vägen som driver icke-kanonisk Wnt-signalering mellan NCC och myoblaster utfördes parallella cellspecifika knockdown-experiment för generna som kodar för kandidatliganden, Wnt5a, i NCC och dess motsvarande receptor, ROR2, i myoblaster. Som förväntat störde knockdown av molekyler i både signalsändande (Wnt5a i NCC) och signalmottagande (ROR2 i myoblaster) celler oberoende Wnt / PCP-relaterade aktincytoarkitektoniska förändringar och hämmade myoblastmigration. Viktigt är att fenotypisk räddning med rekombinant Wnt5a endast observerades i NCC-Wnt5a knockdown-tillståndet, vilket stöder en mekanism varigenom NCC-härledd Wnt5a aktiverar PCP-signalering i myoblaster genom ROR2-receptorer. Dessa resultat överensstämmer med data från musgenetiska studier som identifierar Wnt5a-ROR2-axeln som en avgörande Wnt / PCP-signalaxel mellan NCC och SHF-celler under embryonal hjärtutveckling 3,21. Även om det inte testas experimentellt i detta protokoll, är det fortfarande oklart om SHF-härledd Wnt5a ger ömsesidiga parakrina signaler till neuralkammen genom ROR2-receptorer. Denna hypotes kan testas med hjälp av detta protokoll genom att upprepa experimenten med C2C12-celler på toppen och O9-1-celler på botten av brunnsinsatskonstruktionen. Om SHF-härledd Wnt5a ger en ömsesidig parakrin signal genom NCC-ROR2, skulle man förvänta sig att knockdownen av Wnt5a i C2C12-celler hämmar migrationskapacitet och aktinpolymerisation av de underliggande O9-1-cellerna.
Det finns flera unika styrkor i detta protokoll. För det första är det ett kontaktfritt brunnsinsatssystem som innehåller sekventiell användning av sårläkningsanalyser och immunfärgningstekniker för att utvärdera funktionella och molekylära Wnt / PCP-egenskaper i samma population av signalmottagande celler. Detta ger inte bara ett robust tillvägagångssätt för fenotypning av icke-kanonisk Wnt-inducerad intracellulär filamentorganisation och polariserade migrationsförändringar in vitro utan tillåter också mer detaljerade bedömningar av signaltransduktionsmekanismer. Även om detta protokoll ger principbevis angående Wnt5a-ROR2-molekyler, lämpar sig modellen också lätt för att utvärdera effekterna av andra ligander och receptorer i den icke-kanoniska Wnt-signalvägen. Man kan ytterligare anpassa immunfärgningsprotokollet för att utvärdera uttrycket av flera potentiella nedströms effektorproteiner (t.ex. RhoA, p-JNK, Daam1, Rac1) som har visat sig transducera icke-kanoniska Wnt-signaler in vivo. Dessutom kan proteinnivåerna av dessa olika effektormolekyler korreleras med antingen migrerande eller aktincytoarkitekturfenotyper. För det andra möjliggör cokultursystemets beröringsfria natur oberoende manipulering av specifika signalsändande kontra signalmottagande molekyler i Wnt / PCP-vägen. I dessa representativa resultat valdes det att utföra cellspecifik siRNA-knockdown. Detta protokoll är emellertid också mottagligt för användning av farmakologiska hämmare eller genetiskt modifierade cellinjer för att utvärdera kandidatligandreceptorvägar för klinisk tillämpning. På samma sätt kan man utföra fenotypiska räddningsexperiment genom att tillsätta molekylära eller farmakologiska föreningar till cokulturmediet, vilket visades med rekombinant Wnt5a. Att rikta in sig på dessa föreningar för att selektivt rädda signalsändande kontra signalmottagande störningar validerar ytterligare parakrina mekanistiska vägar på sätt som inte är tillåtna med nuvarande in vivo-modellsystem .
Det finns många kritiska steg i detta protokoll. För det första är det viktigt att se till att primära celler expanderas och upprätthålls vid lämplig sammanflöde under hela protokollet. Om C2C12-myoblaster tillåts sprida sig till 100% sammanflöde, kommer de att börja smälta och skilja från myoblaster till myotubes. Därför måste dessa celler passeras med lämplig densitet enligt beskrivningen. För det andra, med tanke på att STO-matarceller behövs för att generera konditionerat medium för att odla O9-1-celler, är det absolut nödvändigt att man på lämpligt sätt inaktiverar STO-celler med mitomycin C och gör tillräckligt med (minst 500 ml) O9-1-tillväxtmedium med inaktiverade STO-celler före upptining och plätering av O9-1-celler. Det kanske mest kritiska steget i detta protokoll är genereringen av lämpliga repor med enhetlig geometri och bredd i myoblastmonolagret32,33. Steg 3.1.4 beskriver flera tips för att optimera denna del av protokollet. Trots dessa rekommendationer bör det erkännas att variationen i samband med standard 2D-repanalyser fortfarande är en teknisk utmaning och en begränsning av detta protokoll. Därför är det nödvändigt att ha flera tekniska replikat av varje experimentellt tillstånd.
Slutligen, även om resultaten som presenteras här genererades med hjälp av murina NCC och myoblaster, kan detta protokoll i princip anpassas för att inkludera alla signalsändande och signalmottagande celler av intresse. Som ett resultat har detta system inte bara applikationer för att främja grundläggande mekanismer för parakrin icke-kanonisk Wnt-signalering i en mängd olika utvecklingssammanhang, utan det kan också användas för att testa terapeutiska mekanismer för Wnt / PCP-relaterade sjukdomsprocesser. Exempel inkluderar farmakologisk screening för läkemedel som hämmar Wnt / PCP-inducerad migrationskapacitet hos maligna celler eller återställer riktningsmigration av patient-härledda terminala celltyper med defekt PCP-signalkapacitet vid baslinjen. Utöver den icke-kanoniska Wnt-signalvägen kan detta protokoll också anpassas för att studera andra parakrina signalmekanismer och vägar mellan två celltyper. Till exempel kan siRNA-medierad knockdown av kända sekretoriska molekyler i andra vägar (t.ex. Notch, Bmp / Tgf-β, Fgf) i O9-1-celler kombineras med immunfärgning av proliferativa, differentierande eller apoptotiska markörer i underliggande myoblaster.
Sammanfattningsvis etablerar detta protokoll ett nytt och mycket lätthanterligt experimentellt protokoll för att studera mekanismer för icke-kanonisk Wnt-relaterad intracellulär filamentorganisation och polariserad migration in vitro. De metoder som beskrivs här förbättrar befintliga tekniker genom att upprätthålla den intercellulära och parakrina naturen hos Wnt-interaktioner och möjliggör oberoende bedömning av signalsändande kontra signalmottagande komponenter i denna väg. Detta protokoll kan tillämpas brett för att undersöka grundläggande parakrina Wnt / PCP-signaleringsmekanismer mellan två celltyper och screena för nya terapeutiska föreningar riktade mot Wnt / PCP-relaterade sjukdomsprocesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som kan tolkas som en potentiell intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av NIH-utmärkelserna F30HL154324 till OT och K08HL121191 och R03HL154301 till S.R.K. Författarna vill erkänna att schemat i figur 1 i detta manuskript skapades med biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M-7522 | |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | Stored at 4 °C |
| Bovine serum albumin | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323 | Stored at 4 °C |
| C2C12 murine myoblast cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Cell culture flasks, 75 cm2 | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| Chamber Slide System, 4-well | ThermoFisher Scientific | 154526 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM) | Corning | 10-017-CV | Stored at 4 °C |
| Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membrane | Corning | 353095 | |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | W3381E | Stored in 50 mL aliquots at -20 °C |
| Gelatin solution, 0.1% | ATCC | PCS-999-027 | Stored at 4 °C |
| Graduated and sterile pipette tips, 10 µL | USA Scientific | 1111-3810 | |
| Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Corning | 10-022-CV | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm | Springside Scientific | HRTCG2455 | |
| O9-1 neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| Opti-MEM I, 1x | Gibco | 31985-070 | |
| Paraformaldehyde solution in PBS, 4% | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Stored at 4 °C |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin) | Fisher Scientific | W3470H | Stored in 10 mL aliquots at -20 °C |
| Phalloidin-iFluor 488 | Abcam | ab176753 | Stored at -20 °C, Keep out of light |
| Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CV | Stored at 4 °C |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Recombinant human/mouse Wnt5a protein | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Gibco | 11360-070 | |
| Square Petri dish with grid | Thomas Scientific | 1219C98 | |
| STO murine fibroblast feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Fisher Scientific | W3513C | Stored at 4 °C |
| Zeiss Apotome.2 fluoresence microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zen lite 2012 microscopy software | Carl Zeiss AG | imaging software |
References
- Ho, H. Y. H., et al. Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).
- Čapek, D., et al. Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration. Elife. (8), 42093 (2019).
- Li, D., et al. Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation. Development. 146 (20), 181719 (2019).
- Lutze, G., et al. Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling. Scientific Reports. 9 (1), 4739 (2019).
- Buttler, K., et al.
- Betterman, K. L., et al. Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow. Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).
- Descamps, B., et al. Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling. Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).
- Weeraratna, A. T., et al. Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma. Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).
- Henry, C., et al. Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).
- Anastas, J. N., et al. A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression. Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).
- Niehrs, C. The complex world of WNT receptor signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).
- Dong, B., et al. Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles. Development. 145 (19), (2018).
- Bernascone, I., et al. Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels. Nature Communications. 10 (1), 2481 (2019).
- Hendrickx, G., et al. WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts. Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).
- Avgustinova, A., et al. Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness. Nature Communications. (7), 10305 (2016).
- Tseng, J. C., et al. CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling. Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).
- Wang, Q., et al. A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer. PLoS One. 5 (5), 10456 (2010).
- Gibbs, B. C., et al. Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects. Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).
- Cui, C., et al. a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton. PLoS Biology. 11 (11), 1001720 (2013).
- Gombos, R., et al. The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).
- Toubat, O., et al. Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells. Circulation. 142, Suppl_3 12540 (2020).
- Li, D., et al. Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment. Developmental Biology. 412 (1), 18-31 (2016).
- Sinha, T., et al. Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome. Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).
- Humphries, A. C., et al. From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer. Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).
- Shi, D. L. Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370 (2020).
- Butler, M. T., et al. Planar cell polarity in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).
- Bradshaw, L., et al. Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H. Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).
- Kodo, K., et al. Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development. Scientific Reports. 7 (1), 6771 (2017).
- Waldo, K. L., et al. Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field. Developmental Biology. 281 (1), 66-77 (2005).
- Schleiffarth, J. R., et al. Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice. Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).
- Nguyen, B. H., et al. Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).
- Martinotti, S., et al.
