Protokollen presenterer en rekke beste praksis-protokoller for innsamling av beinpulver fra åtte anbefalte anatomiske prøvetakingssteder (spesifikke steder på et gitt skjelettelement) over fem forskjellige skjelettelementer fra middelalderske individer (radiokarbon datert til en periode på ca. 1040-1400 CE, kalibrert 2-sigma rekkevidde).
Metodene som presenteres her søker å maksimere sjansene for utvinning av menneskelig DNA fra gamle arkeologiske rester samtidig som det begrenser inngangsprøvemateriale. Dette ble gjort ved å målrette anatomiske prøvetakingssteder som tidligere ble bestemt for å gi de høyeste mengdene gammelt DNA (aDNA) i en komparativ analyse av DNA-utvinning over skjelettet. Tidligere forskning har antydet at disse protokollene maksimerer sjansene for vellykket gjenoppretting av gammelt menneskelig og patogen DNA fra arkeologiske rester. DNA-utbytter ble tidligere vurdert av Parker et al. 2020 i en bred undersøkelse av aDNA-bevaring på tvers av flere skjelettelementer fra 11 individer gjenvunnet fra middelalderen (radiokarbon datert til en periode på ca. 1040-1400 e.Kr., kalibrert 2-sigma rekkevidde) kirkegård på Krakauer Berg, en forlatt middelaldersk bosetning nær Peißen Tyskland. Disse åtte prøvetakingspunktene, som spenner over fem skjelettelementer (pars petrosa, permanente molarer, thorax vertebra, distal phalanx og talus) ga vellykket høy kvalitet gammelt menneskelig DNA, hvor utbyttet var betydelig større enn det totale gjennomsnittet på tvers av alle elementer og individer. Avlingene var adekvate til bruk i de fleste vanlige nedstrøms populasjonsgenetiske analyser. Våre resultater støtter fortrinnsrett bruk av disse anatomiske prøvetakingsstedene for de fleste studier som involverer analyser av gammelt menneskelig DNA fra arkeologiske rester. Implementering av disse metodene vil bidra til å minimere ødeleggelsen av dyrebare arkeologiske prøver.
Prøvetaking av gamle menneskelige rester med henblikk på DNA-utvinning og analyse er iboende ødeleggende 1,2,3,4. Prøvene i seg selv er verdifulle eksemplarer, og morfologisk bevaring bør bevares der det er mulig. Som sådan er det viktig at prøvetakingspraksis optimaliseres for både å unngå unødvendig ødeleggelse av uerstattelig materiale og for å maksimere sannsynligheten for suksess. Nåværende beste praksis-teknikker er basert på en liten kohorte av studier begrenset til enten rettsmedisinske undersøkelser5,6, studier av gamle prøver der utviklingen av optimal prøvetaking ikke er det direkte målet med studien7, eller dedikerte studier som benytter enten ikke-menneskelige rester8 eller rettet mot et svært lite utvalg av anatomiske prøvetakingssteder (brukt her for å betegne et bestemt område av et skjelettelement hvorfra beinpulver, til bruk i nedstrøms DNA-analyser, ble generert)9,10. Prøvetakingsprotokollene som presenteres her ble optimalisert i den første storskala systematiske studien av DNA-bevaring på tvers av flere skjelettelementer fra flere individer11. Alle prøvene stammet fra skjelettelementer gjenfunnet fra 11 personer utgravd fra kirkekirkegården til den forlatte middelalderbosetningen Krakauer Berg nær Peißen, Sachsen-Anhalt, Tyskland (se tabell 1 for detaljert prøvedemografi) og kan derfor trenge modifisering for bruk med prøver utenfor dette geografiske / tidsmessige området.
Individ | Sex | Estimert alder ved død | 14 C datoer (CE, Cal 2-sigma) |
KRA001 | Mannlig | 25-35 | 1058-1219 |
KRA002 | Kvinnelig | 20-22 | 1227-1283 |
KRA003 | Mannlig | 25 | 1059-1223 |
KRA004 | Mannlig | 15 | 1284-1392 |
KRA005 | Mannlig | 10-12 | 1170-1258 |
KRA006 | Kvinnelig | 30-40 | 1218-1266 |
KRA007 | Kvinnelig | 25-30 | 1167-1251 |
KRA008 | Mannlig | 20 | 1301-1402 |
KRA009 | Mannlig | Ukjent | 1158-1254 |
KRA010 | Mannlig | 25 | 1276-1383 |
KRA011 | Kvinnelig | 30-45 | 1040-1159 |
Tabell 1: Genetisk bestemt kjønn, arkeologisk bestemt estimert alder ved død og radiokarbondatering (14C Cal 2-sigma) for alle de 11 individene som ble samplet. Denne tabellen er tilpasset fra Parker, C. et al. 202011.
Disse protokollene tillater en relativt enkel og effektiv generering av beinpulver fra åtte anatomiske prøvetakingssteder over fem skjelettelementer (inkludert pars petrosa) med begrenset laboratorieindusert DNA-forurensning. Av disse fem skjelettelementene har syv anatomiske prøvetakingssteder funnet på fire skjelettelementer blitt bestemt til å være levedyktige alternativer til den destruktive prøvetakingen av petrouspyramiden11,12. Disse inkluderer sementum, dentin og massekammer av permanente molarer; kortikale bein samlet fra det overlegne vertebrale hakket så vel som fra kroppen av thoraxvirvler; kortikal bein som stammer fra den dårligere overflaten av den apikale tuft og aksel av de distale phalanges; og det tette kortikale beinet langs den ytre delen av tali. Mens det er flere mye anvendte metoder for prøvetaking av pars petrosa 4,12,13,14, dentin og tannmassekammeret 1,2,15, publiserte metoder som beskriver den vellykkede generasjonen av beinpulver fra sementum 16 , vertebral kropp, dårligere vertebral hakk og talus kan være vanskelig å oppnå. Som sådan demonstrerer vi her optimaliserte prøvetakingsprotokoller for petrouspyramiden (trinn 3.1); cementum (trinn 3.2.1), dentin (trinn 3.2.2) og tannmasse (trinn 3.2.3) av voksne molarer; kortikale bein i vertebral kroppen (trinn 3.3.1) og overlegen vertebral bue (trinn 3.3.2); den distale falanksen (trinn 3.4); og talus (trinn 3.5) for å gjøre effektiv bruk av disse skjelettelementene for både aDNA og rettsmedisinsk forskning mer tilgjengelig.
Nåværende praksis i gammel menneskelig populasjonsgenetikk er å fortrinnsvis prøve fra pars petrosa (trinn 2.1) når det er mulig. Pars petrosa kan imidlertid være et vanskelig utvalg å oppnå, da det er høyt verdsatt for et mylder av skjelettvurderinger (f.eks. Befolkningshistorie 32, estimering av fosteralder ved død33 og kjønnsbestemmelse34), og historisk sett kan prøvetaking av pars petrosa for DNA-analyse være svært ødeleggende3,4 (inkludert protokollen som presenteres her, selv om nye, minimalt invasive protokoller13,14 nå er allment vedtatt for å lindre denne bekymringen). Dette forsterkes av det faktum at inntil ganske nylig, en storstilt, systematisk studie av menneskelig DNA-utvinning over skjelettet ikke hadde blitt forsøkt11, noe som gjør det utfordrende å finne en passende prøvetakingsstrategi når petrouspyramiden ikke er tilgjengelig.
Protokollene som presenteres her bidrar til å lindre denne utfordringen ved å gi et sett med optimaliserte prosedyrer for DNA-prøvetaking fra arkeologiske / rettsmedisinske skjelettrester, inkludert pars petrosa, samt syv alternative anatomiske prøvetakingssteder over fire ekstra skjelettelementer. De kritiske trinnene som er inkludert, er alle ment å minimere muligheten for DNA-tap / skade på grunn av enten ineffektiv prøvetaking (trinn 2.1.6 og 3.2.1.3) eller overoppheting av prøver under boring / kutting (trinn 3.1.6). I tillegg har det blitt bemerket gjennom hele protokollen at det kan være nødvendig å endre / utelate forbehandlingstrinnene for å sikre best mulig ytelse i svært forringede prøver. Det skal også bemerkes at selv blant de utvalgte elementene som presenteres her, er det fortsatt flere mulige alternative prøvetakingsteknikker (spesielt for pars petrosa13,14), samt god plass til ytterligere optimalisering av de underutnyttede anatomiske prøvetakingsstedene som presenteres her (dvs. talus: trinn 2.5 og ryggvirvlene: trinn 2.3).
Det er også viktig å huske på at disse protokollene er designet og testet ved hjelp av gamle juvenile-voksne rester av høy kvalitet (god morfologisk bevaring) med henblikk på endogene humane DNA-analyser. Resultatene som presenteres kan ikke strekke seg til mer høyt forringede materialer, andre bevaringskontekster, spedbarnsrester, ikke-menneskelige rester eller studier av patogener eller mikrobiomet, da det fortsatt er behov for en større undersøkelse av bruken av disse protokollene i flere sammenhenger. I tillegg kan de alternative skjelettelementene som presenteres her (tennene, ryggvirvlene, distal falanks og tali) være utfordrende å tildele et enkelt individ blant blandede rester, noe som nødvendiggjør prøvetaking fra flere elementer for å sikre en enkelt opprinnelse. Til tross for disse begrensningene kan det å gjøre disse protokollene allment tilgjengelige bidra til å lindre noe av heterogeniteten rundt prøvevalg og behandling ved å gi et generalisert og kvantitativt optimalisert rammeverk for bruk i et bredt spekter av fremtidige aDNA / rettsmedisinske studier på menneskelige rester.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke laboratoriepersonalet ved Max Planck Institute for Science of Human History for deres hjelp i utviklingen og implementeringen av disse protokollene. Dette arbeidet ville ikke vært mulig uten innspill og hardt arbeid fra Dr. Guido Brandt, Dr. Elizabeth Nelson, Antje Wissegot og Franziska Aron. Denne studien ble finansiert av Max Planck Society, Det europeiske forskningsrådet (ERC) under EUs Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogram under tilskuddsavtaler No 771234 – PALEoRIDER (WH, ABR) og Starting Grant No. 805268 CoDisEASe (til KIB).
#16 Dental Drill Bit | NTI | H1-016-HP | example drilling bit |
0.6 mm scroll saw blade | Fisher Scientific | 50-949-097 | blade for Jewellers Saw |
22mm diamond cutting wheel | Kahla | SKU 806 104 358 514 220 | Dremel cutting attachment |
Commercial Bleach | Fisher Scientific | NC1818018 | |
Control Company Ultra-Clean Supreme Aluminum Foil | Fisher Scientific | 15-078-29X | |
DNA LoBind Tubes (2 mL) | Eppendorf | 22431048 | |
Dremel 225-01 Flex Shaft Attachment | Dremel | 225-01 | Dremel flexible extension |
Dremel 4300 Rotary Tool | Dremel | 4300 | Example drill |
Dremel collet and nut kit | Dremel | 4485 | Adapters for various Dremel tool attachments/bits |
Eagle 33 Gallon Red Biohazard Waste Bag | Fisher Scientific | 17-988-501 | |
Eppendorf DNA LoBind 2 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 13-698-792 | |
Ethanol (Molecular Biology Grade) | Millipore Sigma | 1.08543 | |
FDA approved level 2 Surgical Mask | Fisher Scientific | 50-206-0397 | PPE |
Fisherbrand Comfort Nitrile Gloves | Fisher Scientific | 19-041-171X | PPE |
Fisherbrand Safety Glasses | Fisher Scientific | 19-130-208X | PPE |
Granger Stationary Vise | Fisher Scientific | NC1336173 | benchtop vise |
Invitrogen UltraPure DNase/Rnase free distilled water | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
Jewellers Saw | Fisher Scientific | 50-949-231 | |
Kimwipes | Sigma-Aldritch | Z188956 | |
Labconco Purifier Logic Biosafety cabinet | Fisher Scientific | 30-368-1101 | |
LookOut DNA Erase | Millipore Sigma | L9042-1L | |
Medium weighing boat | Heathrow Scientific | HS120223 | |
MSC 10pc plier/clamp set | Fisher Scientific | 50-129-5352 | Miscellaneous clamps/vise grips for securely holding samples while drilling/cutting |
Sartorius Quintix Semi-Micro Balance | Fisher Scientific | 14-560-019 | enclosed balance |
Tyvek coveralls with hood | Fisher Scientific | 01-361-7X | PPE |
Weigh paper | Heathrow Scientific | HS120116 |