Summary
هنا نصف طريقة بسيطة وقابلة للتكرار يمكن أن تحفز احتشاء عضلة القلب أو إصابة نقص تروية عضلة القلب في الفئران عن طريق الربط الدقيق للشريان التاجي الأمامي الأيسر النازل من خلال المعالجة الدقيقة.
Abstract
احتشاء عضلة القلب الحاد هو مرض قلبي وعائي شائع مع ارتفاع معدل الوفيات. يمكن لإصابة نضح عضلة القلب أن تقاوم الآثار المفيدة لإعادة تدفق القلب وتحفز إصابة عضلة القلب الثانوية. نموذج بسيط وقابل للتكرار لاحتشاء عضلة القلب وإصابة نقص تروية عضلة القلب هو أداة جيدة للباحثين. هنا ، يتم وصف طريقة قابلة للتخصيص لإنشاء نموذج احتشاء عضلة القلب (MI) و MIRI عن طريق الربط الدقيق للشريان التاجي الأمامي الأيسر الهابط (LAD) من خلال المعالجة الدقيقة. يساعد وضع الرباط الدقيق والقابل للتكرار في LAD في الحصول على نتائج متسقة لإصابة القلب. يمكن أن تساعد تغييرات مقطع ST في تحديد دقة النموذج. يستخدم مستوى مصل تروبونين القلب T (cTnT) لتقييم إصابة عضلة القلب ، ويتم استخدام الموجات فوق الصوتية للقلب لتقييم وظيفة انقباض عضلة القلب ، ويستخدم تلطيخ كلوريد إيفانز بلو / ثلاثي فينيل رباعي الثيازوليوم لقياس حجم الاحتشاء. بشكل عام ، يقلل هذا البروتوكول من مدة الإجراء ، ويضمن حجم احتشاء يمكن التحكم فيه ، ويحسن بقاء الماوس.
Introduction
احتشاء عضلة القلب الحاد (AMI) هو مرض قلبي وعائي شائع في جميع أنحاء العالم ويحمل معدل وفيات مرتفع1. التقدم في التقنيات يجعل إعادة التوعي المبكرة والفعالة متاحة لمرضى AMI. بعد هذه العلاجات في بعض المرضى ، يمكن أن تحدث إصابة نقص تروية عضلة القلب (MIRI)2. وبالتالي ، من الأهمية بمكان فهم آليات الإجراءات وكيفية تحسين MI / MIRI. تستخدم الفئران على نطاق واسع كنماذج بسبب تكلفتها المنخفضة ووقت التكاثر السريع وسهولة إجراء التعديلات الجينية3. طور العلماء طرقا مختلفة لنمذجة MIRI و MI فيالحيوان 4،5،6،7،8،9. تشجع هذه الاستراتيجية البحث ، لكن المعايير والأساليب المختلفة المستخدمة تعقد تفسير النتائج بين فرق البحث.
في الفئران ، تم تحفيز MI بواسطة الأيزوبروتيرينول 10 أو الإصابة بالتبريد11،12 أو الكي13. يمكن إحداث MI بسهولة عن طريق الأيزوبروتيرينول ، لكن العملية الفيزيولوجية المرضية تختلف عن تلك الموجودة في MI السريري. MI الناجم عن الإصابة بالتبريد لديه اتساق ضعيف ، ويثير تلفا مفرطا في عضلة القلب حول الشريان التاجي النازل الأمامي الأيسر (LAD) ، ويمكن أن يؤدي بسهولة إلى عدم انتظام ضربات القلب. يختلف MI الناجم عن الكي تماما عن العملية الطبيعية لاحتشاء عضلة القلب ، ويكون التفاعل الالتهابي في منطقة الحرق أكثر كثافة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن النهج الجراحي لديه صعوبات فنية. علاوة على ذلك ، هناك بعض المختبرات14 تقوم بتطوير نموذج MI في الخنازير الصغيرة باستخدام طريقة حجب البالون أو الانصمام أو الجلطة من خلال تقنية التدخل. كل هذه الطرق يمكن أن تسبب انسداد الشريان التاجي مباشرة ، ولكن الحاجة إلى أجهزة تصوير الأوعية التاجية ، وقبل كل شيء ، الشرايين التاجية الرقيقة جدا تجعل هذه العمليات غير عملية. بالنسبة ل MIRI ، كانت الاختلافات بين النماذج المختلفة متواضعة للغاية ، مثل استخدام أجهزة التنفس / المعالجة الدقيقة أم لا 5,6.
هنا ، يتم وصف طريقة بسيطة وموثوقة يمكن أن تحفز MI ونموذج MIRI ، مقتبسة من الطرق المنشورة سابقا4،5،6،7،8،9،15. يمكن لهذه الطريقة محاكاة العمليات الفيزيولوجية المرضية عن طريق الحصار المباشر ل LAD من خلال الربط. علاوة على ذلك ، من خلال تخفيف الربط ، يمكن لهذا النموذج أيضا محاكاة إصابة التروية. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام مجهر تشريح لتصور LAD. بعد ذلك ، يمكن للباحث تحديد LAD بسهولة. بعد ذلك ، يؤدي الربط الدقيق ل LAD إلى انسداد الدم القابل للتكرار ويمكن التنبؤ به ونقص تروية البطين. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام تغييرات تخطيط كهربية القلب (ECG) لتأكيد نقص التروية وإعادة التروية بالإضافة إلى تغيرات لون LAD التي لوحظت تحت المجهر. تؤدي هذه الاستراتيجية إلى مدة إجراء أقصر ، وانخفاض مخاطر المضاعفات الجراحية ، وعدد أقل من الفئران التجريبية اللازمة. كما تم وصف طرق اختبار التروبونين-T ، والموجات فوق الصوتية للقلب ، وتلطيخ كلوريد ثلاثي فينيل رباعي الأضلاع (TTC). بشكل عام ، هذا البروتوكول مفيد لدراسات آلية MI / MIR ، وكذلك لاكتشاف الأدوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على الدراسات على الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدامه بجامعة هواتشونغ للعلوم والتكنولوجيا (ووهان ، الصين).
ملاحظة: يتم استخدام ذكور الفئران C57BL / 6J (8-10 أسابيع) كنماذج. تتمتع الفئران بحرية الوصول إلى الطعام والماء ويتم تربيتها في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض. يتم الحفاظ على الغرفة تحت درجة حرارة مضبوطة (22 درجة مئوية ± 2 درجة مئوية) والرطوبة (45٪ -65٪). تتعرض الفئران لبيئة فاتحة / مظلمة لمدة 12 ساعة في مرفق رعاية الحيوان في كلية الطب تونغجي (ووهان ، الصين) وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها هذه المؤسسة. استخدم أدوات الجراحة المجهرية المعقمة والمستلزمات الجراحية. القفازات والأقنعة الجراحية مطلوبة طوال العملية. يظهر سير العمل التجريبي في الشكل 1 أ.
1. التحضير قبل الجراحة
- استخدم طاولة عمليات مستطيلة (OT) مع وسادة تسخين مسخنة مسبقا (37 درجة مئوية) طوال العملية الجراحية (الشكل 1 ب). تطهير المجلس مع الأشعة فوق البنفسجية والكحول 70 ٪ قبل بدء الإجراء.
- وزن جميع الفئران بدقة لحساب جرعة الأدوية المخدرة اللازمة. بعد ذلك ، قم بتخدير الفئران بالكيتامين (80 مجم / كجم) والزيلازين (10 مجم / كجم) عن طريق الحقن داخل الصفاق. تأكد من عمق التخدير المناسب من خلال عدم وجود منعكس انسحاب لقرص إصبع القدم وردود الفعل الومضة.
- ضع الماوس ضعيف على OT مع الشاش تحت الرأس لتجنب ارتفاع درجة حرارة العينين. ضع مرهم العيون على العينين لمنعهما من الجفاف.
- حلق الفراء على الصدر precordial الأيسر مع الحلاقة الكهربائية. استخدم كريم إزالة الفراء على الصدر المحلوق مسبقا وقم بالتدليك بالتساوي باستخدام قطعة قطن معقمة لمدة ~ 1 دقيقة. امسح الفراء الزائد السائب بالشاش.
- استخدم البوفيدون اليود ، متبوعا بنسبة 70٪ كحول لتنظيف المنطقة. تغطية الصدر مع الشاش.
- استخدم خياطة 4-0 أسفل القواطع العلوية وقم بتثبيتها إلى نقطة التثبيت (بالقرب من حافة OT فوق الأنف) لإبقاء الفم مفتوحا قليلا وتسهيل القنية.
- اسحب الذيل للحفاظ على الجسم مستقيما ، وقم بتثبيت الذيل إلى OT باستخدام شريط لاصق. تأمين الأطراف الأربعة وشدها على نقاط الربط الأخرى. الأهم من ذلك ، لا تفرط في تمديد الأطراف الأمامية ؛ خلاف ذلك ، قد يحدث حل وسط في الجهاز التنفسي.
- استخدم ملقط وملقط منحني لفتح الفك ورفع اللسان. استخدم مضيئا لتصور الحلق والمزمار بوضوح.
- أدخل قنية 22-G برفق بإبرة حادة ومبتورة في القصبة الهوائية من خلال الفم ~ 1 سم أسفل الحلق. استخدم إحدى يديك للإمساك باللسان ، وحركه لأعلى قليلا باستخدام ملقط غير حاد ، وفي نفس الوقت ، استخدم اليد الأخرى لإدخال الأنبوب برفق في القصبة الهوائية. احرص على عدم إدخال الأنبوب في المريء.
- أزل الإبرة برفق. تحقق من التنبيب عن طريق وضع الأنبوب في الماء لتكوين فقاعات قبل توصيله بجهاز التنفس الصناعي.
- قم بتوصيل أنبوب القصبة الهوائية بجهاز التنفس الصناعي مضبوط على 120 / دقيقة وحجم المد والجزر المعدل إلى 250 ميكرولتر.
ملاحظة: يتم ضبط إعداد جهاز التنفس الصناعي حسب وزن الجسم (بشكل عام ، يتطلب وزن الجسم الأعلى حجما أعلى من المد والجزر). - تحقق من التنبيب عن طريق التحقق من تمدد الصدر المتماثل الثنائي. بعد ذلك ، يتم تثبيت الاتصال ب OT بشريط لتجنب سقوط الأنبوب.
- ضع أقطاب ECG على الكفوف وقم بتوصيلها بمسجل تخطيط القلب. مراقبة الفيزيولوجيا الكهربية للقلب طوال العملية.
2. بضع الصدر
- إزالة الشاش على الصدر. قم بالتطهير مرة أخرى بالكحول بنسبة 70٪ لمناطق الشق باستخدام ثلاث دورات فرك. ثم قم بتغطية الفأر بستارة جراحية معقمة مع وجود ثقب فوق المجال الجراحي لتقليل تلوث موقع الجراحة.
- قم بعمل شق جلدي مائل (0.8-1.0 سم) على طول خط منتصف الترقوة الأيسر بمشرط معقم.
- إجراء تشريح حاد للأنسجة تحت الجلد لفضح الأضلاع تحتها. احرص على عدم إصابة الأوعية والأضلاع والرئتين. أوقف النزيف باستخدام أدوات تطبيق قطنية معقمة.
- تحديد وجعل شق من حوالي 6-8 ملم في الفضاء الوربي الثالث. ثم ، قم بإجراء تشريح حاد للأنسجة في الفضاء بين السواحل لفتح تجويف الصدر. احرص على عدم إصابة الشريان الصدري الداخلي.
- استخدم الملقط لتمتد المساحة الوربية. أدخل مبعدات محلية الصنع معقمة مسبقا (الشكل 1 ج) في القفص الصدري واسحبها للخلف لنشر الشق إلى ~ 6 مم في العرض. نعلق المبعدات إلى OT مع الأربطة المطاطية.
- قم بإزالة الأنسجة المحيطة بعناية لكشف القلب بالكامل. اسحب التأمور برفق باستخدام ملقط منحني دون إصابة القلب. الآن رؤية واضحة للقلب متاحة.
3. ربط LAD
ملاحظة: يظهر LAD كخط أحمر رفيع يمتد بشكل عمودي من بالقرب من القمة ولأسفل عبر البطين الأيسر. LAD لونه أحمر فاتح ، لذا احرص على عدم الخلط بينه وبين الوريد. عادة ، يكون موقع الربط ~ 1-2 مم أسفل الأذن اليسرى. سينتج موضع الربط هذا حوالي 40٪ -50٪ من نقص التروية في البطين الأيسر. سيخلق الموضع الأعلى منطقة احتشاء أكثر اتساعا. سيخلق الموقع البعيد منطقة احتشاء أصغر.
- استخدم مجهر تشريح وقم بتوجيه ضوء مركز ومناسب لتصور LAD. اضغط على الموقع الموجود أسفل موضع الربط المختار برفق لتكبير LAD مؤقتا (≤5 ثانية لكل مرة). أعد فحص LAD بهذه الطريقة.
- استخدم إبرة مدببة (3/8 ، 2.5 × 5) لتمرير 8-0 رباط حريري أسفل LAD تحت مجهر تشريح. كن حذرا مع عمق الإبرة: ليس عميقا جدا لدخول البطين الأيسر وليس ضحلا جدا لتجنب إتلاف LAD.
- ربط الرباط مع عقدة مزدوجة فضفاضة. قطر الحلقة حوالي 2-3 مم.
- ضع أنبوب PE-10 2-3 مم في حلقة موازية للشريان.
- شد حلقة الرباط برفق حتى تصبح حول الشريان والأنبوب. ثم قم بتأمين الحلقة بعقدة. احرص على عدم إتلاف جدار عضلة القلب بضغط تشديد مفرط.
ملاحظة: لا يتم إجراء الربط لمجموعة العمليات الوهمية. - تأكيد وقف تدفق الدم في LAD: لاحظ لونا شاحبا في الجدار الأمامي لل LV بعد الربط. بالإضافة إلى ذلك ، يشير الارتفاع الكبير في ST في غضون بضع دقات قلب أيضا إلى انسداد16. إذا كان الربط الدائم مطلوبا (على سبيل المثال ، MI) ، فقم بإزالة أنبوب PE-10 واربط LAD مباشرة بعقدة. استأنف الإجراء المتبقي كما هو مذكور في الخطوة 4.3 أدناه.
- قم بإزالة المبعدات من الشق. ثم أغلق الجرح مؤقتا بمشبك البلدغ. مدة نقص التروية وفقا للتصميم التجريبي. تأكد من استمرار توصيل الماوس بجهاز التنفس الصناعي.
4. التروية
- عندما تنتهي فترة نقص التروية ، قم بإزالة مشبك البلدغ وأدخل المبعدات مرة أخرى لفتح الشق وفضح القلب (خاصة موقع الربط).
- قم بفك العقدة المنزلقة وإزالة أنبوب PE-10. تأكد من استعادة تدفق الدم في هذه الخطوة من خلال مراقبة تغير اللون مرة أخرى إلى اللون الوردي والأحمر في غضون 20 ثانية. في الوقت نفسه ، راقب مخطط كهربية القلب بعناية: يشير الانحلال المحتمل لارتفاع ST أيضا إلى إعادة التروية.
- اترك 8-0 الرباط في الموقع لتلطيخ Evans-Blue و TTC اللاحق. في حالات أخرى ، قم بإزالة الخيط في هذه الخطوة.
- قم بإزالة المبعدات وأغلق الشق عن طريق خياطة الضلعين الثالث والرابع بخياطة من النايلون 4-0. احرص على عدم إصابة الرئة. ادفع الهواء الذي قد يكون محاصرا في تجويف الصدر عن طريق الضغط على الصدر برفق أثناء ربط عقدة الخياطة.
- أغلق طبقات العضلات بالغرز المستمرة. أغلق الجلد بخياطة من النايلون 4-0 ؛ الغرز المستمرة والخيوط المتقطعة مقبولة.
5. رعاية ما بعد الجراحة
- راقب الماوس بعناية بحثا عن علامات الشفاء من التخدير ، على سبيل المثال ، حركة الذيل أو الشعيرات. بعد ذلك ، يستأنف الفأر عادة نمط التنفس الطبيعي بمعدل تنفس يبلغ حوالي 150 نبضة في الدقيقة. قم بنزع الأنبوب بالماوس عن طريق إزالة الأنبوب ببطء.
- راقب الماوس لمدة 3-5 دقائق إضافية لضمان عدم وجود ضائقة تنفسية.
- تطبيق 100 ميكرولتر من البوبرينورفين (0.1 ملغ/مل، s.c) بعد أن يبدأ الفأر في التنفس. لمدة 24 ساعة القادمة ، قدم جرعة إضافية كل 4-6 ساعات. توفير ايبوبروفين كمسكن إضافي للألم في مياه الشرب كمحلول 0.2 ملغ / مل لمدة يومين قبل و ≤7 أيام بعد الجراحة.
- حافظ على دفء الفئران وقلل من خطر الوفاة باستخدام بطانيات العزل الحراري لأن الفئران عرضة لخفض حرارة الجسم بعد التخدير.
6. التحقق من الصحة بعد الإجراء
- اختبار تروبونين-تي
- جمع عينات الدم من الضفائر خلف الحجاج وعزل الأمصال عن طريق الطرد المركزي (3000 × جم ، 10 دقائق ، درجة حرارة الغرفة).
- تمييع 20 ميكرولتر من المصل إلى 100 ميكرولتر بمحلول ملحي لاختبار التروبونين-T. قم بتخزين باقي العينات في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
- اكتشف Troponin T (cTnT باستخدام مجموعة تجارية باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
- الموجات فوق الصوتية للقلب
ملاحظة: تستخدم الموجات فوق الصوتية للقلب لتقييم وظائف القلب وتشوهات حركة الجدار في مراحل مختلفة قبل الجراحة وبعدها وفقا للتصميم التجريبي17،18. يتم قياس معلمات مختلفة مثل سمك جدار البطين ، وحجم البطين ، وقطر تجويف البطين ، وجزء القذف ، وجزء تقصير المحور القصير.- تخدير الفئران بالكيتامين (80 ملغم/كغم) والزيلازين (10 ملغم/كغم) عن طريق الحقن داخل الصفاق.
- حلق الصدر بشفرة كهربائية. استخدم كريم إزالة الفراء وقم بالتدليك بالتساوي. امسح الفراء الزائد السائب بالشاش.
- ضع الماوس على OT وقم بتأمين الأطراف الأربعة بشريط لاصق.
- ضع مسبار الموجات فوق الصوتية (30 ميجاهرتز) على المنطقة الأمامية من القلب عند ~ 30 درجة إلى القص. المسبار في هذا العرض محاذ للمحور الطويل للقلب. ضبط الموجات فوق الصوتية في الوضع B ؛ يمكن تحديد البطين الأيسر والأذين الأيسر والصمام التاجي والشريان الأورطي الصاعد بوضوح. استخدم التقاط الفيديو للحصول على بيانات لتحليلها لاحقا.
- من خلال تدوير محول الطاقة 90 درجة في اتجاه عقارب الساعة ، احصل على عرض المحور القصير شبه القصي على مستوى العضلات الحليمية للكشف بوضوح عن البطينين الأيسر والأيمن. ثم استخدم B-Mode و M-Mode لتقييم وظيفة القلب وقياس التشكل.
- احسب قطر نهاية البطين الأيسر الانبساطي (Dd) ، وقطر نهاية الانقباض (Ds) ، وسمك الحاجز بين البطينين عن طريق تحديد الموقع المقابل في صور الموجات فوق الصوتية.
ملاحظة: سيقوم الجهاز يدويا بحساب حجم نهاية البطين الأيسر الانبساطي (LVEDV) وحجم نهاية الانقباض (LVESV). أيضا ، ستحسب الآلة قيم التقصير الكسري (FS) والكسر القذفي (EF) باستخدام الصيغ FS = (Dd-Ds) / Dd × 100٪ و EF = (LVEDV-LVESV) / LVEDV × 100٪. اختر خمس دورات قلبية متتالية واحصل على قيمها المتوسطة.
- قياس حجم احتشاء عضلة القلب
ملاحظة: يستخدم تلطيخ Evans-Blue / TTC لقياس حجم الاحتشاء لأنه يمكن تقييم صلاحية الأنسجة19. يوصى بالبقع في غضون 72 ساعة من التروية لأن الندبة ستتقلص. يتم تنفيذ هذه الخطوة بعد القتل الرحيم للحيوان ب 200 مجم / كجم من صوديوم بنتوباربيتال عن طريق الحقن داخل الصفاق.- كشف القلب مرة أخرى باتباع الإجراءات السابقة من الخطوات 2.2-2.5. بعد ذلك ، أعد ربط LAD في الموقع الأولي الذي تم التحقق من صحته بواسطة الخيط المذكور في الخطوة 4.3 في نهاية مدة إعادة التروية المطلوبة.
- قنية الشريان الأورطي ثم تخلل القلب مع 0.3 مل من محلول 1٪ Evans Blue. عضلة القلب في المنطقة غير الإقفارية ملطخة باللون الأزرق. بعد التروية ، قم بإزالة القلب بسرعة عن طريق قطع الشريان الأورطي بالمقص.
- ثم اغسل القلب في محلول KCl (30 مللي مول) لمنع القلب من النبض. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة ≥4 ساعة بعد إزالة الأنسجة الدهنية المحيطة.
- قطع القلب في الاتجاه العرضي إلى خمس شرائح بسمك 1 مم باستخدام مشرط حاد. قم بوزن الشرائح ثم احتضانها ب 2٪ TTC لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: بعد الحضانة ، يتم ترسيم مناطق الاحتشاء على أنها بيضاء ، بينما تظل الأنسجة القابلة للحياة في المناطق غير المحتشدة حمراء. - إصلاح شرائح مع 4 ٪ الفورمالديهايد بين عشية وضحاها.
ملاحظة: سيعزز هذا الإجراء التباين بين منطقة الاحتشاء والمنطقة غير المحتشية. وسوف أيضا تقليص الشرائح. - صور الشرائح بكاميرا رقمية. بعد ذلك ، احسب المنطقة المعرضة للخطر (AAR) ومنطقة الاحتشاء والمنطقة غير الإقفارية باستخدام برنامج الرسومات.
ملاحظة: بعد تلطيخ Evans-Blue / TTC المزدوج ، تكون المنطقة الزرقاء هي المنطقة "الطبيعية". المناطق المتبقية (بما في ذلك الأبيض والأحمر) هي مناطق "خطر نقص التروية": المنطقة البيضاء هي منطقة احتشاء عضلة القلب (IA) ، والمنطقة الحمراء هي منطقة نقص تروية (ولكن ليست احتشاء). مع مراعاة عدم تناسق أحجام شرائح القلب ، يتم تعديل النتائج للوزن.
تعيين:
A1-A5 لمنطقة منطقة الاحتشاء / منطقة شريحة القلب ؛
B1-B5 لمنطقة المنطقة غير الاحتشاء / منطقة شريحة القلب ؛
W1-W5 لوزن شريحة القلب.
ثم:
الوزن الكلي لعضلة القلب المحتشة: W1 × A1 + W2 × A2 + W3 × A3 + W4 × A4 + W5 × A5 ؛
الوزن الكلي لعضلة القلب غير المحتشة: W1 × B1 + W2 × B2 + W3 × B3 + W4 × B4 + W5 × B5 ؛
الوزن الكلي ل AAR = (W1 + W2 + W3 + W4 + W5) - (W1 × A1 + W2 × A2 + W3 × A3 + W4 × A4 + W5 × A5)
أخيرا:
يتم حساب منطقة نقص تروية عضلة القلب كنسبة مئوية من AAR في البطين الأيسر:
يتم حساب منطقة احتشاء عضلة القلب كنسبة مئوية من IA في AAR:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يظهر سير العمل التجريبي في الشكل 1 أ. يمكن للباحث جدولة العقد الزمنية وفقا للتصميم التجريبي عند بدء الدراسة. مدة ربط LAD وفقا لغرض البحث. بالنسبة ل MI ، يمكن أن يتجاهل البحث خطوة إعادة التروية. تتوفر الموجات فوق الصوتية للقلب في مراحل مختلفة من الدراسة لأنها غير جراحية ، بينما لا يمكن إجراء تلطيخ Evans-Blue / TTC إلا عند التضحية بالماوس. بالنسبة للأبحاث التي تركز على التليف وإعادة تشكيل البطين ، يكون وقت الملاحظة أطول بكثير.
يتم عرض الصور النموذجية لجزء من عملية التجربة في الشكل 2 أ ، من التنبيب الرغامي ، شق الجلد ، بضع الصدر ، تحديد LAD ، ربط LAD إلى إعادة التروية. للتحقق من نقص تروية عضلة القلب وإعادة التروية ، يتم عرض صور ECG التمثيلية ذات الارتفاع الكبير ST بعد الربط وانحلال ارتفاع ST عند فك العقدة المنزلقة في الشكل 2B.
بعد الحصول على عينات الدم من جميع الفئران ، يمكن إجراء اختبار troponin-T للتحقق من احتشاء. يوضح الشكل 3 أ زيادة كبيرة في cTnT في مجموعات MIRI و MI عند مقارنتها بالمجموعات الصورية. يوضح الشكل 3B التلوين المزدوج ل Evans-Blue و TTC لخمسة أقسام عرضية متتالية من القلب بين المجموعة الوهمية ومجموعة MIRI. تشير المنطقة الزرقاء إلى المنطقة الطبيعية ، وتشير المنطقة البيضاء إلى منطقة احتشاء عضلة القلب ، وتشير المنطقة الحمراء إلى المنطقة الإقفارية ولكن ليست المحتشة. يمثل الشكل 3C صور المحور الطويل للموجات فوق الصوتية القلبية بين المجموعة الوهمية ومجموعة MI. يمكن استخدام تطبيقات البرامج لحساب المعلمات الوظيفية المختلفة ، مثل قيمة أعلى للكسر القذفي للمجموعة الوهمية في الشكل 3C مقارنة بتلك الموجودة في مجموعة MI.
الشكل 1: الإعداد الجراحي. (أ) نظرة عامة على الجدول الزمني التجريبي. (ب) طاولة تشغيل مزودة بوسادة تدفئة مسبقة التسخين ووصلة لأقطاب تخطيط القلب. (ج) مبعدات محلية الصنع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: العملية التجريبية وتغيرات تخطيط القلب. (أ) تظهر صور التنبيب الرغامي ، وشق الجلد ، وبضع الصدر ، وتحديد LAD ، وربط LAD ، وإعادة التروية في 1 و 2 و 3 و 4 و 5 و 6 على التوالي. (ب) صور تخطيط القلب النموذجية ل MI و MIRI بعد الربط وإعادة التروية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التحقق بعد الإجراء. أ: التعبير عن التروبونين القلبي بين المجموعات الوهمية وMIRI 24 h وMI 3 d. (ب) Evans - Blue / TTC مزدوج التلوين لمجموعات الشام و MIRI 24 ساعة. ج: الموجات فوق الصوتية للقلب للمجموعات الوهمية وMI. لفيد. د ، البعد الداخلي للبطين الأيسر في نهاية الانبساطي ؛ لفيد. ق ، البعد الداخلي للبطين الأيسر الانقباضي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في السنوات الأخيرة ، تطور إنشاء نماذج ل MI و MIRI في البحث السريري والعلمي بسرعة20,21. ومع ذلك ، لا تزال هناك بعض الأسئلة ، مثل آليات الإجراءات وكيفية تحسين MI / MIRI ، التي يجب حلها. هنا ، يتم وصف بروتوكول معدل لإنشاء نموذج الفئران من MI و MIRI. يجب النظر بعناية في عدة نقاط رئيسية.
النقطة الرئيسية الأولى هي التنبيب الرغامي. تتضمن بعض الإجراءات 6,9 شق جلد عنق الرحم ، وفصل الأنسجة ، يليه تعرض العضلة القصية لرؤية القصبة الهوائية. بهذه الطريقة ، يمكن للباحث تصور إدخال الأنبوب في القصبة الهوائية. هذه خطوة جيدة لتقليل مخاطر الضائقة التنفسية. في الطريقة الحالية ، يمكن للباحث أن يتصور بوضوح إغلاق المزمار وفتحه مع التنفس تحت مصباح ثم إدخال الأنبوب في القصبة الهوائية بسهولة. وبالتالي ، لا يتم إجراء شق عنق الرحم لتقليل الصدمات الجلدية والالتهابات المحتملة ، وهو أمر مهم في البحث عن الإشارات الالتهابية. تستخدم مناظير الحنجرة البصرية على نطاق واسع في التنبيب الرغامي السريري: ربما يمكن استخدامها في الفئران أيضا. أبلغ Mares et al.22 عن التخدير المستمر لاستنشاق القناع دون التنبيب الرغامي ، والذي تم إجراؤه بواسطة استنشاق الأيزوفلوران بنسبة 2٪ بعد تحريض الأيزوفلوران بنسبة 5٪ مع الأكسجين الذي يتم إعطاؤه من خلال قناع غير جراحي يوضع على أنف وفم الحيوان. يمكن أن يتجنب تلف الأنسجة ويحسن سلامة وكفاءة التخدير. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى آلة تخدير استنشاق خاصة. علاوة على ذلك ، يمكن أن يسبب التخدير المتطاير ضررا جسديا للمشغل.
النقطة الرئيسية الثانية والأكثر أهمية هي تحديد وربط LAD. سيؤدي كل خطأ في تحديد LAD وربطه إلى نتائج غير متسقة: إما حجم احتشاء كبير جدا يؤدي إلى الوفاة أو حجم احتشاء صغير جدا يؤدي إلى الفشل. يمكن تطبيق طرق مختلفة لتحديد LAD والتحقق من ارتباطه. هنا ، يتم استخدام مجهر تشريح لتحديد موقع LAD. يظهر LAD عادة كخط أحمر رفيع يمتد عموديا من بالقرب من القمة ولأسفل عبر البطين الأيسر. بالضغط على الموقع الموجود أسفل موضع الربط المختار برفق لتكبير LAD مؤقتا (≤5 ثانية لكل مرة) ، يمكن فحص LAD مرة أخرى. بعد الربط ، يتم التحقق من انسداد LAD من خلال لون شاحب في الجدار الأمامي للبطين الأيسر وارتفاع كبير في ST في غضون بضع دقات قلب. بعد ذلك ، يتم فك الربط ، ويتم التحقق من صحة إعادة التروية عن طريق تغيير اللون مرة أخرى إلى اللون الوردي والأحمر في غضون 20 ثانية والذوبان المحتمل لارتفاع ST عند تخطيط القلب. أخيرا ، يتم استخدام اختبار troponin-T وتلطيخ TTC والموجات فوق الصوتية للقلب لتقييم إصابة عضلة القلب. هذه التأمينات المتعددة والتحقق المتبادل تجعل النتائج التجريبية موثوقة للغاية. علاوة على ذلك ، فإن المعالجة الدقيقة تثير دقة أعلى ومضاعفات أقل (مثل النزيف). قضية أخرى مهمة هي افتراض أن الأوعية الدموية للفئران طبيعية ، ولكن في الواقع ، تختلف بعض الشرايين التاجية اختلافا كبيرا ، وحتى الدورة الدموية الجانبية يمكن أن تقدم23,24. وبالتالي ، فإن أحجام الاحتشاء في بعض الأحيان غير متسقة على الرغم من أن الروابط تعتبر في نفس المستوى. يتم عرض مزايا المجهر هنا. لا يمكن إجراء الربط بناء على الخبرة أو المعالم التشريحية فقط: يجب التحقق من LAD واتجاهه بوضوح قبل الربط وإلا فإن النتائج ستكون غير موثوقة. في بعض التجارب6،8 ، تكون الفئران في وضع الاستلقاء الجانبي الأيمن لراحة مراقبة الجدار الأمامي للبطين الأيسر والشرايين التاجية بعد التعرض للقلب.
هذا النموذج له قيدان رئيسيان. أولا ، لا يمكن لربط LAD محاكاة انسداد الشريان التاجي الأيمن. في الواقع ، بسبب الاختلافات التشريحية بين الحيوانات25 ، يمتد LAD عادة إلى قمة القلب في الفئران والجرذان ، ولا يتم تطوير الفروع المحيطة اليسرى ، لذلك يتم إنشاء النماذج في الفئران والجرذان عن طريق ربط LAP. بالنسبة للحيوانات الكبيرة والمتوسطة الحجم مثل الأرانب والخنازير ، يكون LAD قصيرا نسبيا ، بينما يغطي الشريان المحيط الأيسر مساحة كبيرة من القلب ، لذلك يتم اختيار ربط الشريان المحيط الأيسر لإنشاء النموذج. أبلغ Sicard et al.26 عن طريقة جديدة للتحقيق في اختلال البطين الأيمن والتفاعل بين البطينين عن طريق ربط الشريان التاجي الأيمن في الفئران ، مما قد يعالج هذا القيد. القيد الثاني هو حجم احتشاء غير متسق بسبب التباين في تشريح الشريان التاجي27 وتجربة الجراح. كما نوقش أعلاه ، فإن المجهر مهم جدا لزيادة الاتساق من خلال التحقق من LAD واتجاهه قبل الربط ، وبالنسبة للباحث المتمرس ، يمكن ضبط موضع الربط بعد إجراء تقييم كامل لتشريح الأوعية الدموية.
وتجدر الإشارة إلى بعض المسائل الأخرى. على سبيل المثال ، سيؤدي بضع الصدر وثقب الإبرة حتما إلى تلف طفيف للعضلات وعضلة القلب ، مما قد يكون له تأثيرات على الالتهاب. بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن أن العوامل المسكنة لها تأثيرات على MI28. وبالتالي ، يجب أن تؤخذ هذه العوامل في الاعتبار عند تحليل الالتهاب أو آثاره على MI. لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها ، هناك العديد من العوامل التي من شأنها أن تؤدي إلى موت الفئران. على سبيل المثال ، المضاعفات المتعلقة باحتشاء عضلة القلب ، وحادث التخدير ، والنزيف. وعلاوة على ذلك، فإن النتائج غير المتسقة تأتي أساسا من مواضع الربط غير الملائمة: فموضع الربط المرتفع للغاية من شأنه أن يؤدي إلى موت احتشاء كبير جدا حتى موت الفئران؛ ومن شأن وضع الربط المرتفع جدا أن يؤدي إلى موت الفئران؛ ومن شأن وضع الربط المرتفع للغاية أن يؤدي إلى موت الفئران. وفي الوقت نفسه ، فإن التحديد الخاطئ ل LAD سيؤدي إلى فشل النموذج. بعض التفاصيل تحتاج إلى تحسين في هذه الطريقة. على سبيل المثال ، سيكون من الأفضل إدخال مسبار مستقيمي لمراقبة درجة الحرارة أثناء الإجراء. أخيرا وليس آخرا ، يجب على المجرب أن يضع في اعتباره الاختلافات بين الدراسات على الحيوانات والحقائق السريرية ، خاصة أن وقت نقص التروية البالغ 30 دقيقة هو في الواقع قصير جدا بالنسبة للطب السريري. نشجع الباحث على ترتيب الخطوات وفقا لتصميم تجربته ، بما في ذلك وقت نقص التروية. بهذه الطريقة فقط يمكن أن يكون هذا البروتوكول مفيدا لدراسات آلية وعلاج MI / MIRI واكتشاف الأدوية.
باختصار ، يتم توفير نموذج فأر بسيط وإنجابي ل MIRI و MI. يمكن استخدام هذا النموذج لدراسة آليات MI / MIRI والبحوث العلاجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82070317 ، 81700390 إلى Jibin Lin ، 8210021880 إلى Bingjie Lv و 82000428 إلى Boyuan Wang) والبرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2017YFA0208000 إلى Shaolin He).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9 % sodium chloride solution | Kelun Industry Group,China | - | |
| 4% paraformaldehyde fixing solution | Servicebio,China | G1101 | - |
| 4-0 silk suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products,China | C412 | - |
| 8-0 suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products,China | H801 | - |
| Buprenorphine | IsoReag,China | IR-11190 | - |
| Camera | Canon,Japan | EOS 80D | - |
| Depilatory cream | Veet,French | - | |
| Elecsys Troponin T hs STAT | Roche,Germany | - | |
| Electrochemical luminescence immunoanalyzer | Roche,Germany | Elecsys 2010 | - |
| Evans blue | Sigma,America | E2129 | - |
| Eye scissors | Shanghai Medical Instruments,China | JC2303 | - |
| Haemostatic forceps | Shanghai Medical Instruments,China | J31020 | - |
| High frequency in vivo imaging systems | Visualsonics,Canada | Vevo2100 | - |
| Ibuprofen | PerFeMiKer,China | CLS-12921 | - |
| Intravenous catheter | Introcan,Germany | 4254090B | - |
| Ketamine | Sigma-Aldrich,America | K2753 | - |
| Medical alcohol | Huichang ,China | - | |
| Microneedle holders | Shanghai Medical Instruments,China | WA2040 | - |
| Microscopic shears | Shanghai Medical Instruments,China | WA1040 | - |
| Microsurgical forceps | Shanghai Medical Instruments,China | WA3020 | - |
| Mouse electrocardiograph | Techman,China | BL-420F | - |
| Needle holders | Shanghai Medical Instruments,China | JC3202 | - |
| operating floor | Chico,China | ZK-HJPT | - |
| PE-10 tube | Huamei,China | - | |
| Pentobarbital | Merck,America | 1030001 | - |
| Rodent Ventilator | Shanghai Alcott Biotech,China | ALC-V8S-P | - |
| Stereo microscope | Aomei Industry,China | SZM0745-STL3-T3 | - |
| Surgical thermostatic heating pad | Globalebio, China | GE0-20W | - |
| Triphenyltetrazolium chloride | Servicebio,China | G1017 | - |
| Xylazine | Huamaike Biochemicals and Life Science Research Prouducts,China | 323004 | - |
References
- Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P.
- Ibanez, B., Heusch, G., Ovize, M., Van de Werf, F. Evolving therapies for myocardial ischemia/reperfusion injury. Journal of the American College of Cardiology. 65 (14), 1454-1471 (2015).
- Bryda, E. C. The mighty mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
- Kim, S. C., et al. A murine closed-chest model of myocardial ischemia and reperfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3896 (2012).
- Xu, Z., Alloush, J., Beck, E., Weisleder, N. A murine model of myocardial ischemia-reperfusion injury through ligation of the left anterior descending artery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e51329 (2014).
- Xu, Z., McElhanon, K. E., Beck, E. X., Weisleder, N. A murine model of myocardial ischemia-reperfusion injury. Methods in Molecular Biology. 1717, 145-153 (2018).
- Muthuramu, I., Lox, M., Jacobs, F., De Geest, B. Permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice: a model of post-myocardial infarction remodelling and heart failure. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52206 (2014).
- Reichert, K., et al. Murine left anterior descending (LAD) coronary artery ligation: An improved and simplified model for myocardial infarction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (122), e55353 (2017).
- Lugrin, J., Parapanov, R., Krueger, T., Liaudet, L. Murine myocardial infarction model using permanent ligation of left anterior descending coronary artery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59591 (2019).
- Li, X., et al. Cardioprotective effects of Puerarin-V on isoproterenol-induced myocardial infarction mice is associated with regulation of PPAR-Y/NF-Kappa B pathway. Molecules. 23 (12), 3322 (2018).
- Vanden Bos, E. J., Mees, B. M., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: A comparison with coronary artery ligation. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 289 (3), 1291-1300 (2005).
- Wang, D., et al. A cryoinjury model to study myocardial infarction in the mouse. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), e59958 (2019).
- Brooks, W. W., Garibaldi, B. A., Conrad, C. H. Myocardial injury in the mouse induced by transthoracic cauterization. Laboratory Animal Science. 48 (4), 374-378 (1998).
- Tao, B., et al. Preclinical modeling and multimodality imaging of chronic myocardial infarction in minipigs induced by novel interventional embolization technique. EJNMMI Research. 6 (1), 59 (2016).
- Gao, E., et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse. Circulation Research. 107 (12), 1445-1453 (2010).
- Scofield, S. L., Singh, K. Confirmation of myocardial ischemia and reperfusion injury in mice using surface pad electrocardiography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54814 (2016).
- Gnyawali, S. C., et al. High-frequency high-resolution echocardiography: First evidence on non-invasive repeated measure of myocardial strain, contractility, and mitral regurgitation in the ischemia-reperfused murine heart. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), e1781 (2010).
- Pistner, A., Belmonte, S., Coulthard, T., Blaxall, B. Murine echocardiography and ultrasound imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2100 (2010).
- Shibata, R., et al. Adiponectin protects against myocardial ischemia-reperfusion injury through AMPK- and COX-2-dependent mechanisms. Nature Medicine. 11 (10), 1096-1103 (2005).
- Anderson, J. L., Morrow, D. A.
- Frank, A., et al. Myocardial ischemia reperfusion injury: From basic science to clinical bedside. Seminars in Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 16 (3), 123-132 (2012).
- Mares, R. G., et al. Studying the innate immune response to myocardial infarction in a highly efficient experimental animal model. Romanian Journal of Cardiology. 31 (3), 573-585 (2021).
- Fernandez, B., et al. The coronary arteries of the C57bl/6 mouse strains: Implications for comparison with mutant models. Journal of Anatomy. 212 (1), 12-18 (2008).
- Zhang, R., Hess, D. T., Reynolds, J. D., Stamler, J. S. Hemoglobin S-nitrosylation plays an essential role in cardioprotection. Journal of Clinical Investigation. 126 (12), 4654-4658 (2016).
- Sorop, O., et al. Experimental animal models of coronary microvascular dysfunction. Cardiovascular Research. 116 (4), 756-770 (2020).
- Sicard, P., et al. Right coronary artery ligation in mice: A novel method to investigate right ventricular dysfunction and biventricular interaction. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 316 (3), 684-692 (2019).
- Chen, J., Ceholski, D. K., Liang, L., Fish, K., Hajjar, R. J. Variability in coronary artery anatomy affects consistency of cardiac damage after myocardial infarction in mice. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 313 (2), 275-282 (2017).
- Kato, R., Foex, P. Myocardial protection by anesthetic agents against ischemia-reperfusion injury: An update for anesthesiologists. Canadian Journal of Anaesthesia. 49 (8), 777-791 (2002).
