Summary
Här beskriver vi en enkel och reproducerbar metod som kan inducera hjärtinfarkt eller myokardiell ischemi-reperfusionsskada hos möss genom precisionsligering av vänster främre nedåtgående kranskärl genom mikromanipulation.
Abstract
Akut hjärtinfarkt är en vanlig hjärt-kärlsjukdom med hög dödlighet. Myokardreperfusionsskada kan motverka de positiva effekterna av hjärtreflow och inducera sekundär myokardskada. En enkel och reproducerbar modell av hjärtinfarkt och hjärtischemi-reperfusionsskada är ett bra verktyg för forskare. Här beskrivs en anpassningsbar metod för att skapa en modell för hjärtinfarkt (MI) och MIRI genom precisionsligering av vänster främre nedåtgående kranskärl (LAD) genom mikromanipulation. Exakt och reproducerbar ligaturpositionering av LAD hjälper till att få konsekventa resultat för hjärtskada. ST-segmentsändringar kan hjälpa till att identifiera modellens noggrannhet. Serumnivån av hjärttroponin T (cTnT) används för att bedöma hjärtmuskelskadan, hjärtultraljud används för att utvärdera myokardens systoliska funktion och Evans-Blue/trifenyltetrazoliumkloridfärgning används för att mäta infarktstorleken. I allmänhet minskar detta protokoll procedurens varaktighet, säkerställer kontrollerbar infarktstorlek och förbättrar musens överlevnad.
Introduction
Akut hjärtinfarkt (AMI) är en vanlig hjärt-kärlsjukdom över hela världen och medför hög dödlighet1. Tekniska framsteg gör tidig och effektiv revaskularisering tillgänglig för AMI-patienter. Efter dessa behandlingar hos vissa patienter kan myokardiell ischemi-reperfusionsskada (MIRI) uppstå2. Det är därför av stor betydelse att förstå verkningsmekanismerna och hur man kan förbättra MIRI. Möss används ofta som modeller på grund av deras låga kostnad, snabba avelstid och lätthet att göra genetiska förändringar3. Forskare har utvecklat olika metoder för att modellera MIRI och MI i djur 4,5,6,7,8,9. Strategin främjar forskning, men de olika kriterier och metoder som används försvårar tolkningen av resultaten bland forskargrupperna.
Hos möss har hjärtinfarkt inducerats av isoproterenol10, kryoskada 11,12 eller kauterisering13. Hjärtinfarkt kan lätt induceras av isoproterenol, men den patofysiologiska processen skiljer sig från den vid klinisk hjärtinfarkt. Kryoskadeinducerad hjärtinfarkt har dålig konsistens, framkallar överdriven myokardskada runt vänster främre nedåtgående kranskärl (LAD) och kan lätt inducera arytmi. Kauteriseringsinducerad hjärtinfarkt skiljer sig ganska mycket från den naturliga processen för hjärtinfarkt, och den inflammatoriska reaktionen i det brännande området är mer intensiv; Dessutom har det kirurgiska tillvägagångssättet tekniska svårigheter. Dessutom finns det några laboratorier14 som utvecklar MI-modell hos minigrisar med hjälp av ballongblockering eller embolisering eller trombosmetod genom interventionsteknik. Alla dessa metoder kan orsaka ocklusion av kranskärl direkt, men att behöva kranskärlsröntgenapparater och framför allt de för tunna muskranskärlen gör att dessa operationer inte är praktiska. För MIRI var skillnaderna mellan olika modeller ganska blygsamma, till exempel användning av respiratorer/mikromanipulation eller inte 5,6.
Här beskrivs en enkel och tillförlitlig metod som kan inducera hjärtinfarkt och MIRI-modellen, anpassad från tidigare publicerade metoder 4,5,6,7,8,9,15. Denna metod kan simulera patofysiologiska processer genom direkt blockad av LAD genom ligering. Dessutom, genom att avlasta ligeringen, kan denna modell också simulera reperfusionsskada. I detta protokoll används ett dissekerande mikroskop för LAD-visualisering. Sedan kan forskaren lätt identifiera LAD. Därefter leder noggrann ligering av LAD till reproducerbar och förutsägbar blodocklusion och ventrikulär ischemi. Dessutom kan elektrokardiografiförändringar (EKG) användas för att bekräfta ischemi och reperfusion utöver de färgförändringar av LAD som observeras under ett mikroskop. Denna strategi leder till en kortare ingreppstid, lägre risk för kirurgiska komplikationer och färre experimentella möss behövs. Metoderna för troponin-T-test, hjärtultraljud och trifenyltetrazoliumklorid (TTC) färgning beskrivs också. Sammantaget är detta protokoll användbart för studier av MI/MIR-mekanismen, såväl som för läkemedelsupptäckt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurstudier har godkänts av Animal Care and Utilization Committee vid Huazhong University of Science and Technology (Wuhan, Kina).
OBS: Manliga C57BL/6J-möss (8-10 veckor) används som modeller. Möss har fri tillgång till mat och vatten och föds upp under specifika patogenfria förhållanden. Rummet hålls under kontrollerad temperatur (22 °C ± 2 °C) och luftfuktighet (45%-65%). Möss utsätts för en 12-timmars ljus/mörk miljö på djurvårdsanläggningen vid Tongji Medical School (Wuhan, Kina) enligt de riktlinjer som fastställts av denna institution. Använd sterila mikrokirurgiska instrument och kirurgiska förnödenheter. Kirurgiska handskar och masker krävs under hela ingreppet. Det experimentella arbetsflödet visas i figur 1A.
1. Preoperativ förberedelse
- Använd ett rektangulärt operationsbord (OT) med en förvärmd värmedyna (37 °C) under hela det kirurgiska ingreppet (Figur 1B). Desinficera brädan med ultraviolett ljus och 70 % alkohol innan proceduren påbörjas.
- Väg alla möss noggrant för att beräkna dosen av bedövningsmedel som behövs. Bedöva sedan mössen med ketamin (80 mg/kg) och xylazin (10 mg/kg) via intraperitoneal injektion. Säkerställ lämpligt anestesidjup genom frånvaro av en tillbakadragandereflex till tåklämnings- och blinkreflexer.
- Placera musen på rygg på OT med gasbinda under huvudet för att undvika överhettning av ögonen. Applicera ögonsalva på ögonen för att förhindra att de torkar ut.
- Raka pälsen på vänster bröstkorg med en rakhyvel. Använd en pälsborttagningskräm på den förrakade bröstkorgen och massera jämnt med en steril bomullspinne i ~1 min. Torka av överflödig lös päls med gasbinda.
- Använd povidon-jod, följt av 70 % alkohol för att rengöra området. Täck bröstkorgen med gasbinda.
- Använd en 4-0 sutur under de övre framtänderna och fäst den vid förankringspunkten (nära kanten av OT över näsan) för att hålla munnen något öppen och underlätta kanylering.
- Dra i svansen för att hålla kroppen rak och fäst svansen vid OT med hjälp av tejp. Fäst de fyra lemmarna och dra åt dem på de andra förankringspunkterna. Det är viktigt att inte översträcka de främre extremiteterna; Annars kan andningsproblem uppstå.
- Använd böjd pincett och pincett för att öppna käken och lyfta tungan. Använd en illuminator för att tydligt visualisera halsen och glottis.
- För försiktigt in en 22-G kanyl med en trubbig och avkortad nål i luftstrupen genom munnen ~1 cm ner i halsen. Använd ena handen för att hålla tungan, flytta den något uppåt med en trubbig pincett och använd samtidigt den andra handen för att försiktigt föra in röret i luftstrupen. Var försiktig så att du inte för in slangen i matstrupen.
- Ta försiktigt bort nålen. Kontrollera intubationen genom att placera slangen i vattnet för att se om det bildas bubblor innan du ansluter till ventilatorn.
- Anslut endotrakealtuben till en ventilator inställd på 120/min och tidalvolymen justerad till 250 μL.
OBS: Ventilatorns inställning justeras efter kroppsvikt (i allmänhet kräver en högre kroppsvikt en högre tidalvolym). - Verifiera intubationen genom att kontrollera bilateral symmetrisk bröstkorgsexpansion. Sedan fästs anslutningen på OT med tejp för att undvika att röret faller av.
- Placera EKG-elektroder på tassarna och anslut dem till EKG-inspelaren. Övervaka hjärtats elektrofysiologi under hela proceduren.
2. Thorakotomi
- Ta bort gasbindan på bröstkorgen. Desinficera igen med 70 % alkohol för snittområdena med tre skrubbcykler. Täck sedan musen med ett sterilt operationsdraperi med ett hål över operationsområdet för att minska kontamineringen av operationsområdet.
- Gör ett snett hudsnitt (0,8-1,0 cm) längs vänster mittklavikulär linje med en steril skalpell.
- Utför trubbig dissektion av subkutan vävnad för att exponera revbenen under. Var försiktig så att du inte skadar kärl, revben och lungor. Stoppa blödningen genom att använda sterila bomullsapplikatorer.
- Identifiera och gör ett snitt på cirka 6-8 mm i det tredje interkostala utrymmet. Utför sedan trubbig dissektion av vävnader i det interkustiska utrymmet för att öppna brösthålan. Var försiktig så att du inte skadar den inre bröstpulsådern.
- Använd pincett för att spänna över det interkostala utrymmet. Sätt in försteriliserade hemmagjorda upprullningsdon (Figur 1C) i bröstkorgen och dra tillbaka för att sprida snittet till ~6 mm i bredd. Fäst upprullningsdonen på OT med gummiband.
- Ta försiktigt bort de omgivande vävnaderna för att exponera hjärtat helt. Dra försiktigt av hjärtsäcken med en böjd pincett utan att skada hjärtat. Nu finns en tydlig bild av hjärtat.
3. LAD-ligering
OBS: LAD ser ut som en tunn röd linje som löper vinkelrätt från nära apex och ner genom vänster kammare. LAD har en klarröd färg, så var försiktig så att du inte misstar den för en ven. Vanligtvis är ligeringsstället ~1-2 mm under den vänstra öronen. Denna ligeringsposition kommer att producera cirka 40%-50% av ischemin i vänster kammare. En högre position kommer att skapa en mer omfattande infarktzon. En mer distal plats kommer att skapa en mindre infarktzon.
- Använd ett dissekerande mikroskop och rikta ett fokuserat och lämpligt ljus för LAD-visualisering. Tryck försiktigt på platsen under den valda ligeringspositionen för att förstora LAD tillfälligt (≤5 s per gång). Kontrollera LAD igen på detta sätt.
- Använd en avsmalnande nål (3/8, 2,5 x 5) för att passera en 8-0 silkesligatur under LAD under ett dissekerande mikroskop. Var försiktig med nåldjupet: inte för djupt för att komma in i vänster kammare och inte för grunt för att undvika att skada LAD.
- Knyt ligaturen med en lös dubbelknut. Öglans diameter är ca 2-3 mm.
- Placera en 2-3 mm PE-10-slang i en ögla parallellt med artären.
- Dra åt ligaturöglan försiktigt tills den är runt artären och slangen. Fäst sedan öglan med en slipknot. Var försiktig så att du inte skadar myokardväggen med överdrivet åtdragningstryck.
OBS: Ligering utförs inte för skenoperationsgruppen. - Bekräfta upphörande av blodflödet i LAD: observera en blekare färg i den främre väggen av LV efter ligering. Dessutom indikerar signifikant ST-höjning inom några få hjärtslag också ocklusion16. Om permanent ligering krävs (t.ex. MI), ta bort PE-10-slangen och knyt LAD direkt med en knut. Återuppta den återstående proceduren som nämns i steg 4.3 nedan.
- Ta bort upprullningsdonen från snittet. Stäng sedan såret tillfälligt med en bulldog-klämma. Ischemi varaktighet är enligt den experimentella designen. Se till att musen fortsätter att vara ansluten till ventilatorn.
4. Reperfusion
- När ischemperioden är över, ta bort bulldog-klämman och sätt in upprullningsdonen igen för att öppna snittet och exponera hjärtat (särskilt ligeringsstället).
- Lossa slipknoten och ta bort PE-10-slangen. Bekräfta återställandet av blodflödet i detta steg genom att observera färgförändringen tillbaka till rosa-röd inom 20 s. Samtidigt ska du titta noga på EKG:t: en potentiell upplösning av ST-höjning tyder också på reperfusion.
- Lämna 8-0 ligatur in situ för efterföljande Evans-Blue- och TTC-färgning. I andra fall tar du bort suturen i detta steg.
- Ta bort upprullningsdonen och stäng snittet genom att suturera det tredje och fjärde revbenet med en 4-0 nylonsutur. Var försiktig så att du inte skadar lungan. Tryck ut luften som kan vara instängd i brösthålan genom att trycka försiktigt på bröstet samtidigt som du knyter suturknutarna.
- Stäng muskellagren med kontinuerliga suturer. Stäng huden med en 4-0 nylonsutur; Kontinuerliga suturer och avbrutna suturer är acceptabla.
5. Postoperativ vård
- Observera musen noga för tecken på återhämtning från anestesi, till exempel rörelse av svansen eller morrhåren. Därefter återgår musen vanligtvis till ett normalt andningsmönster med en andningsfrekvens på cirka 150 slag per minut. Extubera musen genom att ta bort röret långsamt.
- Övervaka musen i ytterligare 3-5 minuter för att säkerställa att andnöd är frånvarande.
- Administrera 100 μl buprenorfin (0,1 mg/ml, s.c.) efter att musen börjat andas. Under de kommande 24 timmarna, ge en extra dos var 4-6:e timme. Ge ibuprofen som ytterligare smärtlindring i dricksvatten som en 0,2 mg/ml lösning i 2 dagar före och ≤7 dagar efter operationen.
- Håll mössen varma och minska risken för dödlighet genom att använda värmeisolerande filtar eftersom möss är benägna att drabbas av hypotermi efter narkosen.
6. Validering efter förfarandet
- Troponin-T-test
- Blodprov från retroorbital plexus samlas in och serum isoleras genom centrifugering (3 000 × g, 10 min, rumstemperatur).
- Späd 20 μl serum till 100 μl med koksaltlösning för troponin-T-testet. Förvara resten av proverna vid -80 °C.
- Detektera Troponin T (cTnT med hjälp av ett kommersiellt kit enligt tillverkarens instruktioner.
- Ultraljud av hjärtat
OBS: Hjärtultraljud används för att utvärdera hjärtfunktion och väggrörelseavvikelser i olika stadier före och efter operation enligt experimentell design17,18. Olika parametrar såsom kammarväggtjocklek, kammarvolym, kammarhålans diameter, ejektionsfraktion och kortaxlig förkortningsfraktion mäts.- Bedöva mössen med ketamin (80 mg/kg) och xylazin (10 mg/kg) via intraperitoneal injektion.
- Raka bröstet med en rakhyvel. Använd pälsborttagningskräm och massera jämnt. Torka av överflödig lös päls med gasbinda.
- Placera musen på OT och fäst de fyra lemmarna med tejp.
- Placera ultraljudssonden (30 MHz) på hjärtats främre region vid ~ 30° mot bröstbenet. Sonden i denna vy är i linje med hjärtats långa axel. Ställ in ultraljudet i B-läge; Vänster kammare, vänster förmak, mitralisklaff och stigande aorta kan tydligt identifieras. Använd videoinspelning för att hämta data för efterföljande analys.
- Genom att vrida givaren 90° medurs, få en parasternal kortaxel view i nivå med papillärmusklerna för att tydligt detektera vänster och höger kammare. Använd sedan B-Mode och M-Mode för att bedöma hjärtfunktion och morfometri.
- Beräkna vänster kammares enddiastoliska diameter (Dd), slutsystoliska diameter (Ds) och interventrikulära septumtjocklek genom att ange motsvarande plats i ultraljudsbilderna.
OBS: Maskinen skulle manuellt beräkna vänster kammares enddiastoliska volym (LVEDV) och slutsystoliska volym (LVESV). Maskinen skulle också beräkna värdena för fraktionerad förkortning (FS) och ejektionsfraktion (EF) med formlerna FS = (Dd-Ds)/Dd × 100 % och EF= (LVEDV-LVESV)/LVEDV × 100 %. Välj fem på varandra följande hjärtcykler och få fram deras medelvärden.
- Mätning av hjärtinfarktens storlek
OBS: Evans-Blue/TTC-färgning används för att mäta infarktstorleken eftersom den kan utvärdera vävnadens viabilitet19. Det rekommenderas att färga inom 72 timmar efter reperfusion eftersom ärret kommer att krympa. Detta steg utförs efter avlivning av djuret med 200 mg/kg pentobarbitalnatrium via intraperitoneal injektion.- Exponera hjärtat igen enligt de tidigare procedurerna från steg 2.2-2.5. Återligera sedan LAD på det ursprungliga stället som validerats av suturen som nämns i steg 4.3 i slutet av den önskade reperfusionstiden.
- Kanylera aortan och perfundera sedan hjärtat med 0,3 ml 1 % Evans Blue-lösning. Myokardium i det icke-ischemiska området är blått. Efter perfusion avlägsnas hjärtat snabbt genom att klippa av aortan med en sax.
- Tvätta sedan hjärtat i KCl-lösning (30 mM) för att stoppa hjärtat från att slå. Förvaras vid -20 °C i ≥4 timmar efter att den omgivande fettvävnaden avlägsnats.
- Skär hjärtat i fem skivor med tjockleken 1 mm med en vass skalpell. Väg skivorna och inkubera dem sedan med 2 % TTC i 40 minuter vid 37 °C.
OBS: Efter inkubationen avgränsas infarktområdena som vita, medan livsdugliga vävnader i icke-infarktområden förblir röda. - Fixera skivorna med 4% formaldehyd över natten.
OBS: Denna åtgärd kommer att öka kontrasten mellan infarktområdet och icke-infarktområdet. Det kommer också att krympa skivorna. - Fotografera skivorna med en digitalkamera. Beräkna sedan riskområdet (AAR), infarktområdet och den icke-ischemiska zonen med hjälp av grafikprogram.
OBS: Efter Evans-Blue/TTC dubbelfärgning är det blå området det "normala" området. De återstående områdena (inklusive vita och röda) är riskområdena för ischemi: det vita området är hjärtinfarktområdet (IA) och det röda området är det ischemiska (men inte infarkt) området. Med hänsyn till inkonsekvensen i storleken på hjärtskivorna justeras resultaten efter vikten.
Tilldela:
A1-A5 för Arean av infarktzonen/Arean av hjärtskivan;
B1-B5 för Område av icke-infarktzon/Område av hjärtskivan;
W1-W5 för vikten av hjärtskivan.
Då:
Total vikt av infarkt hjärtmuskel: W1 × A1 + W2 × A2 + W3 × A3 + W4 × A4 + W5 × A5;
Totalvikt för icke-infarkt hjärtmuskel: W1 × B1 + W2 × B2 + W3 × B3 + W4 × B4 + W5 × B5;
Totalvikt AAR = (W1 + W2 + W3 + W4 + W5) - (W1 × A1 + W2 × A2 + W3 × A3 + W4 × A4 + W5 × A5)
Slutligen:
Området för myokardiell ischemi beräknas som procentandelen AAR i vänster kammare:
Området för hjärtinfarkt beräknas som procentandelen IA i AAR:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det experimentella arbetsflödet visas i figur 1A. Forskaren kan schemalägga tidsnoderna enligt den experimentella designen vid studiestart. Varaktigheten av LAD-ligering är enligt forskningssyftet. För hjärtinfarkt kan forskningen bortse från reperfusionssteget. Hjärtultraljud är tillgängligt i olika stadier av studien eftersom det är icke-invasivt, medan Evans-Blue/TTC-färgning endast kan utföras när musen offras. För forskning som fokuserar på fibros och ventrikelremodellering är observationstiden mycket längre.
De typiska bilderna för en del av experimentprocessen visas i figur 2A, från endotrakeal intubation, hudsnitt, torakotomi, LAD-identifiering, LAD-ligering till reperfusion. För att verifiera myokardischemi och reperfusion visas de representativa EKG-bilderna med signifikant ST-höjning efter ligering och upplösning av ST-höjning när slipknuten är uppknuten i figur 2B.
Efter att ha tagit blodprover från alla möss kan troponin-T-testet genomföras för att validera infarkten. Figur 3A visar en signifikant ökning av cTnT i MIRI- och MI-grupperna jämfört med skengrupperna. Figur 3B visar dubbelfärgningen av Evans-Blue och TTC för fem på varandra följande tvärsnitt av hjärtat mellan skengruppen och MIRI-gruppen. Det blå området indikerar det normala området, det vita området indikerar hjärtinfarktområdet och det röda området indikerar det ischemiska men inte infarktområdet. Figur 3C visar de långaxliga bilderna av hjärtultraljud mellan sham-gruppen och MI-gruppen. Programvara kan användas för att beräkna olika funktionella parametrar, t.ex. ett högre värde på ejektionsfraktionen för skengruppen i figur 3C jämfört med det i MI-gruppen.
Figur 1: Kirurgisk inställning. (A) Översikt över den experimentella tidslinjen. (B) Operationsbord med förvärmd värmedyna och anslutning för EKG-elektroder. C) Hemmagjorda upprullningsdon. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Experimentell process och EKG-förändringar. (A)Bilder av endotrakeal intubation, hudsnitt, torakotomi, LAD-identifiering, LAD-ligering och reperfusion visas i 1, 2, 3, 4, 5 respektive 6. (B) Typiska EKG-bilder av MI och MIRI efter ligering och reperfusion. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 3: Validering efter proceduren. (A) Uttryck av hjärttroponin bland sham-, MIRI- 24 h- och MI 3 d-grupper. (B) Evans -Blå/TTC dubbelfärgning för sham- och MIRI 24 h-grupper. (C) Hjärtultraljud för sken- och hjärthjärtgrupper. LVID; d, enddiastolisk inre dimension av vänster kammare; LVID; s, systolisk inre dimension i vänster kammare. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under de senaste åren har skapandet av modeller för MI och MIRI i klinisk och vetenskaplig forskning utvecklats snabbt20,21. Det finns dock fortfarande några frågor, såsom verkningsmekanismerna och hur man kan förbättra MIRI/MIRI, som måste lösas. Här beskrivs ett modifierat protokoll för att etablera en musmodell av MI och MIRI. Flera viktiga punkter måste övervägas noggrant.
Den första nyckelpunkten är endotrakeal intubation. Vissa procedurer6,9 involverar snitt av livmoderhalshuden, vävnadsseparation, följt av exponering av sternohyoideusmuskeln för att se luftstrupen. På så sätt kan forskaren visualisera att slangen förs in i luftstrupen. Detta är ett bra steg för att minska risken för andnöd. I den aktuella metoden kan forskaren tydligt visualisera glottis stängning och öppning med andning under en belysning och sedan enkelt föra in slangen i luftstrupen. Därför görs inte ett cervikalt snitt för att minska hudtrauma och potentiella infektioner, vilket är viktigt i forskning om inflammatorisk signalering. Visuella laryngoskop används i stor utsträckning vid klinisk trakealintubation: kanske kan de också användas på möss. Mares et al.22 rapporterade kontinuerlig maskinhalationsanestesi utan endotrakeal intubation, som utfördes med 2 % isofluraninhalation efter 5 % isofluraninduktion med syrgas administrerad genom en icke-invasiv mask placerad över djurets nos och mun. Det kan undvika vävnadsskador och förbättra säkerheten och effektiviteten vid anestesi. En speciell inhalationsanestesimaskin behövs dock. Dessutom kan flyktiga bedövningsmedel orsaka fysisk skada på operatören.
Den andra och viktigaste nyckelpunkten är identifiering och ligering av LAD. Varje misstag i LAD-identifieringen och ligeringen kommer att leda till inkonsekventa resultat: antingen för stor infarktstorlek som leder till döden eller för liten infarktstorlek som resulterar i fel. Olika metoder kan användas för att identifiera LAD och verifiera dess ligering. Här används ett dissektionsmikroskop för att lokalisera LAD. LAD uppträder vanligtvis som en tunn röd linje som löper vinkelrätt från nära apex och ner genom vänster kammare. Genom att trycka försiktigt på platsen under den valda ligeringspositionen för att förstora LAD tillfälligt (≤5 s per gång) kan LAD kontrolleras igen. Efter ligering verifieras LAD-ocklusion av en blekare färg i den främre väggen av vänster kammare och signifikant ST-höjning inom några få hjärtslag. Därefter lossas ligeringen och reperfusionen valideras genom en färgförändring tillbaka till rosa-röd inom 20 s och potentiell upplösning av ST-höjning vid EKG. Slutligen används troponin-T-testet, TTC-färgning och hjärtultraljud för att utvärdera hjärtmuskelskadan. Dessa många försäkringar och ömsesidiga verifieringar gör de experimentella resultaten mycket tillförlitliga. Dessutom framkallar mikromanipulation högre noggrannhet och färre komplikationer (t.ex. blödning). En annan viktig fråga är antagandet att blodkärlen hos möss är normala, men i själva verket varierar vissa kranskärl mycket, och till och med kollateral cirkulation kan uppvisa23,24. Därför är infarktstorlekarna ibland inte konsekventa även om ligationerna anses vara på samma nivå. Fördelarna med mikroskopet visas här. Ligering kan inte göras enbart baserat på erfarenhet eller anatomiska landmärken: LAD och dess riktning måste verifieras tydligt före ligering, annars kommer resultaten att vara otillförlitliga. I vissa experiment 6,8 är möss i höger lateralt decubitus-läge för att underlätta observationen av den främre väggen i vänster kammare och kranskärl efter hjärtexponering.
Den här modellen har två huvudsakliga begränsningar. För det första kan LAD-ligering inte simulera ocklusion av höger kranskärl. Faktum är att på grund av anatomiska skillnader mellan djur25 sträcker sig LAD vanligtvis till toppen av hjärtat hos möss och råttor, och de vänstra cirkumflexa grenarna är inte utvecklade, så modellerna hos möss och råttor fastställs genom LAD-ligering. För stora och medelstora djur som kaniner och grisar är LAD relativt kort, medan den vänstra cirkumflexartären täcker ett stort område av hjärtat, så ligering av den vänstra cirkumflexartären väljs för att fastställa modellen. Sicard et al.26 rapporterade en ny metod för att undersöka högerkammardysfunktion och biventrikulär interaktion genom att ligera höger kranskärl hos möss, vilket skulle kunna avhjälpa denna begränsning. Den andra begränsningen är en inkonsekvent infarktstorlek på grund av variabilitet i kranskärlsanatomi27 och kirurgens erfarenhet. Som diskuterats ovan är mikroskopet mycket viktigt för att öka konsistensen genom att verifiera LAD och dess riktning före ligering, och för en erfaren forskare kan justering av ligeringspositionen efter en fullständig bedömning av vaskulär anatomi uppnås.
Det finns några andra frågor som förtjänar att nämnas. Till exempel kommer torakotomi och nålpiercing oundvikligen att orsaka små skador på muskler och hjärtmuskel, vilket kan ha effekter på inflammation. Dessutom rapporterades smärtstillande medel ha effekter på MI28. Därför måste dessa faktorer beaktas vid analys av inflammation eller dess effekter på hjärtinfarkt. För felsökning finns det flera faktorer som kan leda till att möss dör. Till exempel komplikationer relaterade till hjärtinfarkt, anestesiolycka och blödning. Dessutom kommer de inkonsekventa resultaten främst från olämpliga ligeringspositioner: för hög ligeringsposition skulle inducera för stor infarktstorlek till och med musdöd; Under tiden skulle den falska identifieringen av LAD resultera i modellfel. Vissa detaljer måste förbättras i denna metod. Till exempel skulle det vara bättre om en rektal sond kunde sättas in för att övervaka temperaturen under ingreppet. Sist men inte minst bör försöksledaren ha i åtanke skillnaderna mellan djurstudier och klinisk verklighet, särskilt att ischemitiden på 30 minuter faktiskt är ganska kort för klinisk. Vi uppmuntrar forskaren att ordna stegen enligt sin experimentdesign, inklusive ischemitiden. Endast på detta sätt kan detta protokoll vara användbart för studier av mekanism och behandling av MI/MIRI och läkemedelsutveckling.
I korthet tillhandahålls en enkel och reproduktiv murin modell för MIRI och MI. Denna modell kan användas för studier av MI/MIRI-mekanismer och terapeutisk forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar att det inte föreligger någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (82070317, 81700390 till Jibin Lin, 8210021880 till Bingjie Lv och 82000428 till Boyuan Wang) och National Key R&D Program of China (2017YFA0208000 till Shaolin He).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9 % sodium chloride solution | Kelun Industry Group,China | - | |
| 4% paraformaldehyde fixing solution | Servicebio,China | G1101 | - |
| 4-0 silk suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products,China | C412 | - |
| 8-0 suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products,China | H801 | - |
| Buprenorphine | IsoReag,China | IR-11190 | - |
| Camera | Canon,Japan | EOS 80D | - |
| Depilatory cream | Veet,French | - | |
| Elecsys Troponin T hs STAT | Roche,Germany | - | |
| Electrochemical luminescence immunoanalyzer | Roche,Germany | Elecsys 2010 | - |
| Evans blue | Sigma,America | E2129 | - |
| Eye scissors | Shanghai Medical Instruments,China | JC2303 | - |
| Haemostatic forceps | Shanghai Medical Instruments,China | J31020 | - |
| High frequency in vivo imaging systems | Visualsonics,Canada | Vevo2100 | - |
| Ibuprofen | PerFeMiKer,China | CLS-12921 | - |
| Intravenous catheter | Introcan,Germany | 4254090B | - |
| Ketamine | Sigma-Aldrich,America | K2753 | - |
| Medical alcohol | Huichang ,China | - | |
| Microneedle holders | Shanghai Medical Instruments,China | WA2040 | - |
| Microscopic shears | Shanghai Medical Instruments,China | WA1040 | - |
| Microsurgical forceps | Shanghai Medical Instruments,China | WA3020 | - |
| Mouse electrocardiograph | Techman,China | BL-420F | - |
| Needle holders | Shanghai Medical Instruments,China | JC3202 | - |
| operating floor | Chico,China | ZK-HJPT | - |
| PE-10 tube | Huamei,China | - | |
| Pentobarbital | Merck,America | 1030001 | - |
| Rodent Ventilator | Shanghai Alcott Biotech,China | ALC-V8S-P | - |
| Stereo microscope | Aomei Industry,China | SZM0745-STL3-T3 | - |
| Surgical thermostatic heating pad | Globalebio, China | GE0-20W | - |
| Triphenyltetrazolium chloride | Servicebio,China | G1017 | - |
| Xylazine | Huamaike Biochemicals and Life Science Research Prouducts,China | 323004 | - |
References
- Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P.
- Ibanez, B., Heusch, G., Ovize, M., Van de Werf, F. Evolving therapies for myocardial ischemia/reperfusion injury. Journal of the American College of Cardiology. 65 (14), 1454-1471 (2015).
- Bryda, E. C. The mighty mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
- Kim, S. C., et al. A murine closed-chest model of myocardial ischemia and reperfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3896 (2012).
- Xu, Z., Alloush, J., Beck, E., Weisleder, N. A murine model of myocardial ischemia-reperfusion injury through ligation of the left anterior descending artery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e51329 (2014).
- Xu, Z., McElhanon, K. E., Beck, E. X., Weisleder, N. A murine model of myocardial ischemia-reperfusion injury. Methods in Molecular Biology. 1717, 145-153 (2018).
- Muthuramu, I., Lox, M., Jacobs, F., De Geest, B. Permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice: a model of post-myocardial infarction remodelling and heart failure. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52206 (2014).
- Reichert, K., et al. Murine left anterior descending (LAD) coronary artery ligation: An improved and simplified model for myocardial infarction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (122), e55353 (2017).
- Lugrin, J., Parapanov, R., Krueger, T., Liaudet, L. Murine myocardial infarction model using permanent ligation of left anterior descending coronary artery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59591 (2019).
- Li, X., et al. Cardioprotective effects of Puerarin-V on isoproterenol-induced myocardial infarction mice is associated with regulation of PPAR-Y/NF-Kappa B pathway. Molecules. 23 (12), 3322 (2018).
- Vanden Bos, E. J., Mees, B. M., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: A comparison with coronary artery ligation. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 289 (3), 1291-1300 (2005).
- Wang, D., et al. A cryoinjury model to study myocardial infarction in the mouse. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), e59958 (2019).
- Brooks, W. W., Garibaldi, B. A., Conrad, C. H. Myocardial injury in the mouse induced by transthoracic cauterization. Laboratory Animal Science. 48 (4), 374-378 (1998).
- Tao, B., et al. Preclinical modeling and multimodality imaging of chronic myocardial infarction in minipigs induced by novel interventional embolization technique. EJNMMI Research. 6 (1), 59 (2016).
- Gao, E., et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse. Circulation Research. 107 (12), 1445-1453 (2010).
- Scofield, S. L., Singh, K. Confirmation of myocardial ischemia and reperfusion injury in mice using surface pad electrocardiography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54814 (2016).
- Gnyawali, S. C., et al. High-frequency high-resolution echocardiography: First evidence on non-invasive repeated measure of myocardial strain, contractility, and mitral regurgitation in the ischemia-reperfused murine heart. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), e1781 (2010).
- Pistner, A., Belmonte, S., Coulthard, T., Blaxall, B. Murine echocardiography and ultrasound imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2100 (2010).
- Shibata, R., et al. Adiponectin protects against myocardial ischemia-reperfusion injury through AMPK- and COX-2-dependent mechanisms. Nature Medicine. 11 (10), 1096-1103 (2005).
- Anderson, J. L., Morrow, D. A.
- Frank, A., et al. Myocardial ischemia reperfusion injury: From basic science to clinical bedside. Seminars in Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 16 (3), 123-132 (2012).
- Mares, R. G., et al. Studying the innate immune response to myocardial infarction in a highly efficient experimental animal model. Romanian Journal of Cardiology. 31 (3), 573-585 (2021).
- Fernandez, B., et al. The coronary arteries of the C57bl/6 mouse strains: Implications for comparison with mutant models. Journal of Anatomy. 212 (1), 12-18 (2008).
- Zhang, R., Hess, D. T., Reynolds, J. D., Stamler, J. S. Hemoglobin S-nitrosylation plays an essential role in cardioprotection. Journal of Clinical Investigation. 126 (12), 4654-4658 (2016).
- Sorop, O., et al. Experimental animal models of coronary microvascular dysfunction. Cardiovascular Research. 116 (4), 756-770 (2020).
- Sicard, P., et al. Right coronary artery ligation in mice: A novel method to investigate right ventricular dysfunction and biventricular interaction. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 316 (3), 684-692 (2019).
- Chen, J., Ceholski, D. K., Liang, L., Fish, K., Hajjar, R. J. Variability in coronary artery anatomy affects consistency of cardiac damage after myocardial infarction in mice. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 313 (2), 275-282 (2017).
- Kato, R., Foex, P. Myocardial protection by anesthetic agents against ischemia-reperfusion injury: An update for anesthesiologists. Canadian Journal of Anaesthesia. 49 (8), 777-791 (2002).
