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Bioengineering

सेलुलर चयापचय का मूल्यांकन करने के लिए Autofluorescence इमेजिंग

Published: November 15, 2021 doi: 10.3791/63282
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University-College Station

Summary

यह प्रोटोकॉल प्रतिदीप्ति इमेजिंग और अंतर्जात चयापचय coenzymes के विश्लेषण का वर्णन करता है, निकोटीनामाइड adenine (फॉस्फेट) डाइन्यूक्लियोटाइड (NAD (P)H) को कम करता है, और ऑक्सीकृत फ्लेविन एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड (FAD)। एनएडी (पी) एच और एफएडी की ऑटोफ्लोरेसेंस इमेजिंग सेलुलर चयापचय का आकलन करने के लिए एक लेबल-मुक्त, गैर-विनाशकारी विधि प्रदान करती है।

Abstract

सेलुलर चयापचय वह प्रक्रिया है जिसके द्वारा कोशिकाएं ऊर्जा उत्पन्न करती हैं, और कैंसर सहित कई बीमारियों को असामान्य चयापचय की विशेषता है। कम निकोटिनामाइड एडेनिन (फॉस्फेट) डाइन्यूक्लियोटाइड (एनएडी (पी) एच) और ऑक्सीकृत फ्लेविन एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड (एफएडी) चयापचय प्रतिक्रियाओं के कोएंजाइम हैं। एनएडी (पी) एच और एफएडी ऑटोफ्लोरेसेंस प्रदर्शित करते हैं और उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य द्वारा वर्णक्रमीय रूप से अलग किया जा सकता है। दोनों coenzymes, NAD (P)H और FAD, या तो एक मुक्त या प्रोटीन-बाउंड कॉन्फ़िगरेशन में मौजूद हो सकते हैं, जिनमें से प्रत्येक में एक अलग प्रतिदीप्ति जीवनकाल होता है- वह समय जिसके लिए फ्लोरोफोर उत्साहित अवस्था में रहता है। प्रतिदीप्ति जीवनकाल इमेजिंग (एफएलआईएम) सेलुलर चयापचय के लेबल-मुक्त विश्लेषण के लिए एनएडी (पी) एच और एफएडी के प्रतिदीप्ति तीव्रता और जीवनकाल के परिमाणीकरण की अनुमति देता है। प्रतिदीप्ति तीव्रता और जीवनभर माइक्रोस्कोप उचित उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का चयन करके इमेजिंग एनएडी (पी) एच और एफएडी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। साइनाइड द्वारा चयापचय संबंधी गड़बड़ी कोशिकाओं के भीतर चयापचय परिवर्तनों का पता लगाने के लिए ऑटोफ्लोरेसेंस इमेजिंग प्रोटोकॉल को सत्यापित करती है। यह लेख सेलुलर चयापचय को मापने के लिए एनएडी (पी) एच और एफएडी के ऑटोफ्लोरेसेंस इमेजिंग की तकनीक का प्रदर्शन करेगा।

Introduction

चयापचय ऊर्जा के उत्पादन की सेलुलर प्रक्रिया है। सेलुलर चयापचय में ग्लाइकोलाइसिस, ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन और ग्लूटामिनोलिसिस सहित कई मार्ग शामिल हैं। स्वस्थ कोशिकाएं प्रसार और कार्य के लिए ऊर्जा उत्पन्न करने के लिए इन चयापचय मार्गों का उपयोग करती हैं, जैसे कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा साइटोकिन्स का उत्पादन। चयापचय विकारों, कैंसर और न्यूरोडीजेनेरेशन सहित कई बीमारियों को परिवर्तित सेलुलर चयापचय 1 की विशेषता है। उदाहरण के लिए, कुछ कैंसर सेल प्रकारों में ग्लाइकोलाइसिस की उच्च दर होती है, यहां तक कि ऑक्सीजन की उपस्थिति में भी, न्यूक्लिक एसिड, प्रोटीन और लिपिड के संश्लेषण के लिए अणु उत्पन्न करने के लिए 2,3। यह घटना, जिसे वारबर्ग प्रभाव के रूप में जाना जाता है, स्तन कैंसर, फेफड़ों के कैंसर और ग्लियोब्लास्टोमास 4 सहित कई कैंसर प्रकारों की एक पहचान है। कैंसर की प्रगति से जुड़े सेलुलर चयापचय के परिवर्तन के कारण, सेलुलर चयापचय दवा प्रतिक्रिया 5,6 के लिए एक सरोगेट बायोमार्कर हो सकता है। इसके अलावा, एक सेलुलर स्तर पर दवा प्रभावकारिता को समझना महत्वपूर्ण है क्योंकि सेल विषमता व्यक्तियों में अलग-अलग दवा प्रतिक्रियाओं का कारण बन सकती है7,8।

सेलुलर चयापचय में परिवर्तन की पहचान और मात्रा निर्धारित करने वाली प्रौद्योगिकियां कैंसर और दवा प्रतिक्रिया के अध्ययन के लिए आवश्यक हैं। रासायनिक और प्रोटीन विश्लेषण का उपयोग कोशिकाओं या ऊतकों के चयापचय का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है लेकिन एकल-कोशिका रिज़ॉल्यूशन और स्थानिक जानकारी की कमी होती है। मेटाबोलिक प्लेट रीडर-आधारित assays समय के साथ नमूने में पीएच और ऑक्सीजन की खपत और रसायनों द्वारा बाद के चयापचय गड़बड़ी को माप सकते हैं। पीएच का उपयोग बाह्य कोशिकीय अम्लीकरण दर (ईसीएआर) की गणना करने के लिए किया जा सकता है, जो कोशिकाओं की ग्लाइकोलाइटिक गतिविधि में एक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। पूरे शरीर इमेजिंग विधियां, जिनमें 2-[फ्लोरीन -18] फ्लोरो-डी-ग्लूकोज पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी (FDG PET) और चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (MRS) शामिल हैं, गैर-आक्रामक इमेजिंग तरीके हैं जिनका उपयोग चयापचय माप 10,11,12,13,14 के माध्यम से ट्यूमर पुनरावृत्ति और दवा प्रभावकारिता की पहचान करने के लिए नैदानिक रूप से किया जाता है।

FDG-PET छवियों FDG, एक radiolabled ग्लूकोज एनालॉग के ऊतक अपटेक. आसपास के ऊतकों के सापेक्ष ट्यूमर द्वारा FDG-PET की वृद्धि वारबर्ग प्रभाव 12,13 के कारण है। एमआरएस चयापचय के लिए उपयोग किए जाने वाले अणुओं के सामान्य नाभिक को दर्शाता है, जैसे कि 13 सी और 31 पी, और इस बारे में गतिशील जानकारी प्राप्त कर सकता है कि चयापचय उत्तेजनाओं के जवाब में कैसे बदलता है, जैसे व्यायाम या खाने 14। हालांकि FDG-PET और MRS का उपयोग नैदानिक रूप से किया जा सकता है, इन प्रौद्योगिकियों में intratumoral विषमता को हल करने के लिए स्थानिक संकल्प की कमी है। इसी तरह, ऑक्सीजन की खपत माप कोशिकाओं की थोक आबादी पर की जाती है। Autofluorescence इमेजिंग इन प्रौद्योगिकियों की स्थानिक संकल्प बाधा को दूर करता है और सेलुलर चयापचय को मापने की एक noninvasive विधि प्रदान करता है।

Figure 1
चित्रा 1: सामान्य चयापचय मार्गों में एनएडीएच और एफएडी। NADH और FAD ग्लाइकोलाइसिस, क्रेब्स चक्र और इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला में उपयोग किए जाने वाले कोएंजाइम हैं। इन अणुओं की ऑटोफ्लोरेसेंस इमेजिंग सेलुलर चयापचय के बारे में जानकारी प्रदान करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

कम निकोटिनामाइड एडेनिन (फॉस्फेट) डाइन्यूक्लियोटाइड (एनएडी (पी) एच) और ऑक्सीकृत फ्लेविन एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड (एफएडी) चयापचय प्रतिक्रियाओं के कोएंजाइम हैं, जिनमें ग्लाइकोलाइसिस, ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन और ग्लूटामिनोलिसिस (चित्रा 1) शामिल हैं। एनएडी (पी) एच और एफएडी दोनों ऑटोफ्लोरोसेंट हैं और प्रतिदीप्ति इमेजिंग 1,15 के लिए अंतर्जात विपरीत प्रदान करते हैं। NADPH में NADH के समान फ्लोरोसेंट गुण होते हैं। इस वजह से, एनएडी (पी) एच का उपयोग अक्सर एनएडीएच और एनएडीपीएच 2, 16 के संयुक्त संकेत का प्रतिनिधित्व करने के लिए किया जाता है।

प्रतिदीप्ति जीवनकाल इमेजिंग (एफएलआईएम) प्रतिदीप्ति जीवनकाल या उस समय को निर्धारित करता है जिसके लिए एक फ्लोरोफोर उत्साहित अवस्था में होता है। प्रतिदीप्ति जीवनकाल फ्लोरोफोर के माइक्रोएन्वायरमेंट के लिए उत्तरदायी होते हैं और सेलुलर चयापचय 17 के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं। एनएडी (पी) एच और एफएडी या तो प्रोटीन-बाउंड या मुक्त संरचनाओं में कोशिकाओं के भीतर मौजूद हो सकते हैं, जिनमें से प्रत्येक का एक अलग जीवनकाल होता है। नि: शुल्क एनएडी (पी) एच प्रोटीन-बाउंड एनएडी (पी) एच की तुलना में कम जीवनकाल है; इसके विपरीत, मुक्त FAD बाध्य FAD18,19 की तुलना में एक लंबा जीवनकाल है। जीवनकाल और जीवनकाल घटक वजन Eq. (1) 20 के माध्यम से प्रतिदीप्ति जीवनकाल क्षय डेटा से परिमाणित किया जा सकता है:

I(t) = α 1e-t/π1 + α 2e-t/π2 + C (1)

Eq (1) समय के एक समारोह के रूप में सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है। इस समीकरण में α 1 और α 2 छोटे और लंबे जीवनकाल (α 1 + α 2 = 1) के आनुपातिक घटकों का प्रतिनिधित्व करते हैं, क्रमशः, π1 और π2 क्रमशः छोटे और लंबे जीवनकाल का प्रतिनिधित्व करते हैं, और सी पृष्ठभूमि light7,20 के लिए खाते हैं। आयाम-भारित जीवनकाल, जिसे यहां πm के रूप में दर्शाया गया है, की गणना Eq. (2) का उपयोग करके की जाती है।

πm= α 1π1+ α 2π2 (2)

फ्लोरोफोर की तीव्रता क्षय पर "टी" के औसत से एक औसत जीवनकाल की गणना की जा सकती है, जो दो-घातीय क्षय के लिए Eq. (3) 17,21 द्वारा दिखाया गया है।

π*m= (α 1π12+ α 2π22)/ (α 1π1+ α 2π2) (3)

प्रतिदीप्ति जीवनकाल क्षय को एकीकृत करके एक प्रतिदीप्ति तीव्रता छवि को जीवनकाल छवि से परिकलित किया जा सकता है। Autofluorescence इमेजिंग एक nondestructive और लेबल मुक्त विधि है कि एक उपकोशिकीय संकल्प पर जीवित कोशिकाओं के चयापचय को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ऑप्टिकल रेडॉक्स अनुपात सेल के रासायनिक रेडॉक्स राज्य का एक ऑप्टिकल एनालॉग मीट्रिक प्रदान करता है और इसकी गणना एनएडी (पी) एच और एफएडी तीव्रता के अनुपात के रूप में की जाती है। यद्यपि ऑप्टिकल रेडॉक्स अनुपात की गणना करने का सूत्र मानकीकृत नहीं है22,23,24,25, इसे यहां एनएडी (पी) एच और एफएडी की संयुक्त तीव्रता पर एफएडी की तीव्रता के रूप में परिभाषित किया गया है। इस परिभाषा का उपयोग इसलिए किया जाता है क्योंकि हर में अभिव्यक्त तीव्रता 0 और 1 के बीच मीट्रिक को सामान्य करती है, और साइनाइड निषेध का अपेक्षित परिणाम रेडॉक्स अनुपात में कमी है। मुक्त एनएडी (पी) एच और एफएडी के प्रतिदीप्ति जीवनकाल चयापचय विलायक माइक्रोएन्वायरमेंट में परिवर्तन में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, जिसमें पीएच, तापमान, ऑक्सीजन की निकटता और ऑस्मोलेरिटी 17 शामिल हैं।

एनएडी (पी) एच और एफएडी के बाध्य अंशों के प्रतिदीप्ति जीवनकाल में परिवर्तन चयापचय मार्ग उपयोग और सब्सट्रेट-विशिष्ट चयापचय 26 का संकेत दे सकते हैं। घटक भार coenzymes18,19 के बाध्य अंश के लिए मुक्त में परिवर्तन के लिए व्याख्या की जा सकती है। कुल मिलाकर, ये मात्रात्मक autofluorescence जीवनकाल मैट्रिक्स सेलुलर चयापचय के विश्लेषण की अनुमति देते हैं, और autofluorescence इमेजिंग का उपयोग सामान्य ऊतकों से नियोप्लाज्म की पहचान करने के लिए किया गया है27,28, स्टेम कोशिकाओं की विशेषता 29,30, प्रतिरक्षा सेल फ़ंक्शन का मूल्यांकन 31,32,33,34,35, न्यूरोलॉजिकल गतिविधि का आकलन करना36, 37,38, और स्तन कैंसर और सिर और गर्दन के कैंसर जैसे कैंसर के प्रकारों में दवा की प्रभावकारिता को समझना21,39,40,41,42। उच्च-रिज़ॉल्यूशन ऑटोफ्लोरेसेंस इमेजिंग को एकल-सेल विश्लेषण के लिए छवि विभाजन और इंट्रापॉपुलेशन विषमता 43,44,45,46,47 के परिमाणीकरण के साथ जोड़ा जा सकता है।

एनएडी (पी) एच और एफएडी को एकल-फोटॉन या मल्टीफोटॉन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर चित्रित किया जा सकता है जो तीव्रता या आजीवन इमेजिंग के लिए कॉन्फ़िगर किया गया है। एकल-फोटॉन माइक्रोस्कोप के लिए, एनएडी (पी) एच और एफएडी आमतौर पर क्रमशः 375-405 एनएम और 488 एनएम के तरंग दैर्ध्य पर उत्साहित होते हैं, क्रमशः, इन तरंग दैर्ध्य 48 पर सामान्य लेजर स्रोतों के कारण। दो-फोटॉन प्रतिदीप्ति उत्तेजना में, एनएडी (पी) एच और एफएडी क्रमशः लगभग 700 से 750 एनएम और 700 से 900 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर उत्तेजित होंगे। एक बार जब फ्लोरोफोर उत्साहित हो जाते हैं, तो एनएडी (पी) एच और एफएडी क्रमशः ~ 410 एनएम से ~ 490 एनएम और ~ 510 एनएम से ~ 640 एनएम के बीच तरंग दैर्ध्य पर फोटॉनों का उत्सर्जन करते हैं। एनएडी (पी) एच और एफएडी मैक्सिमा उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य क्रमशः लगभग 450 एनएम और 535 एनएम हैं।

उनके विभिन्न उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के कारण, दो चयापचय कोएंजाइम के प्रतिदीप्ति को वर्णक्रमीय रूप से अलग किया जा सकता है। एनएडी (पी) एच और एफएडी की वर्णक्रमीय विशेषताओं की समझ ऑटोफ्लोरेसेंस इमेजिंग प्रोटोकॉल के डिजाइन और अनुकूलन के लिए आवश्यक है। साइनाइड एक इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (ईटीसी) जटिल IV अवरोधक है। सेलुलर चयापचय पर साइनाइड के प्रभाव और कोशिकाओं के भीतर एनएडी (पी) एच और एफएडी के ऑटोफ्लोरेसेंस तीव्रता और जीवनकाल अच्छी तरह से विशेषता है27,40। इसलिए, एक साइनाइड गड़बड़ी प्रयोग एनएडी (पी) एच और एफएडी इमेजिंग प्रोटोकॉल को मान्य करने का एक प्रभावी साधन है। एक सफल साइनाइड प्रयोग विश्वास प्रदान करता है कि एनएडी (पी) एच और एफएडी इमेजिंग प्रोटोकॉल का उपयोग अज्ञात समूहों या गड़बड़ी के चयापचय का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

1. इमेजिंग के लिए सेल चढ़ाना

  1. MCF-7 कोशिकाओं के 80-90% confluent T-75 फ्लास्क से माध्यम को एस्पिरेट करें, बाँझ फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (PBS) के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को कुल्ला करें, और फ्लास्क तल से कोशिकाओं को अलग करने के लिए 0.25% ट्रिप्सिन (1x) के 2 एमएल जोड़ें।
  2. ~ 4 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर फ्लास्क को इनक्यूबेट करें। टुकड़ी की पुष्टि करने के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं की जांच करें।
  3. ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करने के लिए तुरंत 8 मिलीलीटर संस्कृति माध्यम जोड़ें।
  4. एक शंक्वाकार ट्यूब (15 एमएल या 50 एमएल) में कोशिकाओं को इकट्ठा करें। हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
  5. 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को 200 × ग्राम सेंट्रीफ्यूज करें।
  6. एक बार centrifuged, aspirate supernatant. संस्कृति माध्यम के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं के छर्रे को फिर से निलंबित करें, और बीज 4 × 105 कोशिकाओं को 35 मिमी ग्लास-बॉटम इमेजिंग डिश (या माइक्रोस्कोप के लिए उपयुक्त नमूना धारक का उपयोग किया जा रहा है) पर छोड़ दें।
  7. सेल चयापचय को बनाए रखने के लिए इमेजिंग डिश में 2 मिलीलीटर संस्कृति माध्यम जोड़ें।
  8. कोशिकाओं का पालन करने और लॉगरिदमिक विकास चरण तक पहुंचने के लिए इमेजिंग से पहले 24-48 घंटे के लिए 5% CO2 के साथ 37 °C पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    नोट:: विकास चरण इन कक्षों के साथ पूर्व अनुभव द्वारा निर्धारित किया गया था और कक्ष डेटा पत्रक के साथ पुष्टि की गई थी।

2. मल्टीफोटॉन एफएलआईएम एनएडी (पी) एच और एफएडी की इमेजिंग

  1. माइक्रोस्कोप, लेजर स्रोत, और उपयोग किए जा रहे डिटेक्टरों सहित मल्टीफोटॉन प्रतिदीप्ति जीवनकाल माइक्रोस्कोप के सभी घटकों को चालू करें।
  2. नमूना प्लेसमेंट
    1. ब्राइटफील्ड लैंप चालू करें। सुनिश्चित करें कि प्रकाश आईपीस में जा रहा है। सेल इमेजिंग के लिए एक उद्देश्य, आमतौर पर 20x, 40x, या 100x चुनें। उद्देश्य के शीर्ष पर उपयुक्त विसर्जन माध्यम की 1 बूंद लागू करें [यदि एक वायु उद्देश्य का उपयोग करके छोड़ दें]।
    2. उद्देश्य को छूने के बिना नमूने को ठीक से रखने के लिए उद्देश्य को नीचे ले जाएँ। माइक्रोस्कोप चरण पर नमूना धारक पर ग्लास-बॉटम डिश रखें। सुनिश्चित करें कि नमूना सुरक्षित है और इमेजिंग के दौरान स्थानांतरित नहीं होगा।
    3. एक्स-वाई चरण नियंत्रण का उपयोग करके उद्देश्य के साथ नमूने को केंद्र में रखें। एक बार जब यह हो जाता है, तो आईपीस को देखें और कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करने के लिए उद्देश्य को आगे बढ़ाएं।
    4. यदि माइक्रोस्कोप एक बाड़े के भीतर है, तो लाइटबॉक्स दरवाजा बंद करें। छवि अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर खोलें, मल्टीफोटॉन इमेजिंग टैब पर क्लिक करें, और निम्नलिखित मल्टीफोटॉन इमेजिंग पैरामीटर सेट करें: छवि का आकार = 256 x 256 पिक्सेल; पिक्सेल रहने का समय = 4-25 μs; कुल छवि अधिग्रहण समय = ~ 60 s; एकल-फोटॉन गिनती के लिए अनुकूलित डिटेक्टर लाभ = 85% (उपयोग किए जा रहे सिस्टम के लिए विशिष्ट)।
  3. इंस्ट्रूमेंट रिस्पांस फंक्शन (आईआरएफ) और फ्लोरोसेंट लाइफटाइम स्टैंडर्ड की इमेजिंग
    1. एक ग्लास-बॉटम डिश पर यूरिया क्रिस्टल रखें और डिश के ढक्कन को टेप या पैराफिल्म के साथ सुरक्षित करें।
      नोट: यूरिया क्रिस्टल महीनों के लिए कमरे के तापमान पर स्थिर रहते हैं।
    2. छवि यूरिया क्रिस्टल.
      1. माइक्रोस्कोप चरण पर यूरिया पकवान रखें और यूरिया क्रिस्टल पर ध्यान केंद्रित करें।
      2. उत्तेजना लेजर की तरंग दैर्ध्य को 900 एनएम पर सेट करें।
      3. एक उत्सर्जन फ़िल्टर का उपयोग करें जो 450 एनएम तरंग दैर्ध्य को कैप्चर करता है।
      4. नमूना <1 mW पर लेजर शक्ति के साथ यूरिया क्रिस्टल की एक प्रतिदीप्ति जीवनकाल छवि प्राप्त करें और चरण 2.2.4 में उल्लिखित अनुशंसित इमेजिंग मापदंडों का उपयोग करें।
    3. छवि पीले-हरे (YG) मोतियों एक प्रतिदीप्ति जीवनकाल मानक के रूप में.
      1. बाँझ पानी में YG मनका समाधान 1:1,000 को पतला करके एक YG मनका स्लाइड बनाएँ। एक स्लाइड या ग्लास-बॉटम डिश पर एक छोटी मात्रा (~ 30 μL) रखें। एक coverslip के साथ कवर और स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ coverslip के किनारों सील.
      2. उद्देश्य की ओर स्लाइड के coverslip पक्ष के साथ माइक्रोस्कोप मंच पर YG मनका स्लाइड जगह.
      3. उत्तेजना लेजर की तरंग दैर्ध्य को 890 एनएम पर सेट करें
      4. एक उत्सर्जन फ़िल्टर का उपयोग करें जो ~ 500-600 एनएम तरंग दैर्ध्य को कैप्चर करता है।
      5. नमूना <1 mW और अनुशंसित छवि पैरामीटर [चरण 2.2.4] पर एक लेजर शक्ति का उपयोग कर YG मनका की एक प्रतिदीप्ति जीवनकाल छवि प्राप्त करें।
      6. यूरिया के आईआरएफ का उपयोग करके मनका के जीवनकाल की जांच करें। यदि जीवनकाल ~ 2.1 एनएस नहीं है, तो जांचें कि क्या मनका प्रतिदीप्ति शमन में योगदान देने वाले किसी अन्य मनका के संपर्क में है, मनका समाधान सूख गया है, मनका फोकस से बाहर है, आईआरएफ सटीक नहीं है, या आईआरएफ और प्रतिदीप्ति क्षय के बीच बदलाव अनुकूलित नहीं है [चरण 4.2.4 देखें]।
        नोट: ~ 2.1 एनएस का जीवनकाल समय के साथ स्थिर है।
  4. NAD(P)H इमेजिंग
    1. माइक्रोस्कोप चरण पर कोशिकाओं के साथ ग्लास-बॉटम डिश रखें और कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करें।
      नोट: यह अनुशंसा की जाती है कि छवि अधिग्रहण के दौरान गर्मी, आर्द्रता और सीओ 2 के स्तर को बनाए रखने के लिए कोशिकाओं को एक पर्यावरण कक्ष में रखा जाए, क्योंकि ये पैरामीटर सेलुलर चयापचय को प्रभावित कर सकते हैं।
    2. FLIM के लिए इष्टतम मान के लिए डिटेक्टर के लाभ को समायोजित करें। इसके अतिरिक्त, वांछित रहने के समय में बदलें- एक पैरामीटर जो उस समय को इंगित करता है जो लेजर नमूने के प्रत्येक पिक्सेल पर खर्च करता है।
      नोट:: इन पैरामीटर्स प्रक्रिया के शेष में समान रहना चाहिए। यह तीव्रता-आधारित माप की वैधता सुनिश्चित करने के लिए लेजर रोशनी और डिटेक्टर सेटिंग्स में स्थिरता सुनिश्चित करना है, जो लेजर पावर, स्कैन पैरामीटर और डिटेक्टर लाभ पर निर्भर हैं। एकल-फोटॉन गिनती मोड में ऑपरेटिंग डिटेक्टरों के लिए एक अनुकूलित डिटेक्टर लाभ है; मान संदर्भित सिस्टम के लिए 85% है।
    3. मल्टीफोटॉन लेजर को 750 एनएम पर सेट करें। सुनिश्चित करें कि लेजर के लिए शक्ति नियंत्रण शुरू में शून्य पर सेट किया गया है ताकि लेजर पर शटर खोलने पर कोशिकाओं को नुकसान न पहुंचे।
      नोट: 750 एनएम पर उत्तेजना एनएडी (पी) एच के लिए अनुशंसित है, हालांकि इसमें 700-750 एनएम पर व्यापक अवशोषण है। एफएडी के लिए 890 एनएम पर उत्तेजना की सिफारिश की जाती है, हालांकि इसमें 700-900 एनएम पर व्यापक अवशोषण होता है।
    4. सेट करें या ~ 400-500 एनएम पर उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य एकत्र करने के लिए एक उत्सर्जन फ़िल्टर का चयन करें।
    5. छवि सेटिंग्स को ऑप्टिमाइज़ करने के लिए फ़ोकसिंग या लाइव-व्यू तरीके से इमेजिंग शुरू करें.
      नोट: लेजर अब काम कर रहा है। इस बिंदु पर माइक्रोस्कोप बाड़े को न खोलें। उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें।
    6. धीरे-धीरे नमूने पर ~ 3-8 mW के लिए लेजर शक्ति को बढ़ाएं, जबकि यह भी सुनिश्चित करें कि कोशिकाएं ध्यान में हैं। एक बार समायोजित होने के बाद, उपयोग की गई अधिकतम शक्ति रिकॉर्ड करें। NAD(P)H इमेजिंग के लिए पेट्री डिश के अन्य खंडों पर इमेजिंग के लिए इस पावर सेटिंग का उपयोग करें.
      नोट: नमूना या पिक-ऑफ विंडो पर लेजर पावर को मापना महत्वपूर्ण है और पॉकल्स सेल वोल्टेज पर भरोसा नहीं करता है क्योंकि पॉकल्स कोशिकाएं स्थिर नहीं हैं। अक्सर लेजर पावर को नमूने के बजाय पिक-ऑफ विंडो के साथ इमेजिंग के दौरान मॉनिटर किया जाता है। उद्देश्य पर एक दूसरे पावर मीटर का उपयोग करते हुए, पिक-ऑफ विंडो पर बिजली और नमूने पर बिजली के बीच संबंध का उपयोग पिक-ऑफ विंडो माप से नमूने पर अनुमानित शक्ति का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है।
    7. 60 s की एक छवि एकीकरण समय के साथ एक NAD (P) H FLIM छवि ले लीजिए।
    8. जांचें कि छवि में प्रतिदीप्ति जीवनकाल क्षय वक्र के भीतर पर्याप्त फोटॉन (साइटोप्लाज्म पिक्सेल के लिए ~ 100 फोटॉनों की चोटी) है। यदि फोटॉनों की संख्या बहुत कम है, तो लेजर शक्ति या छवि अधिग्रहण की अवधि बढ़ाएं।
      नोट: प्रतिदीप्ति घातीय क्षय के भीतर फोटॉनों की न्यूनतम चोटी संख्या अस्थायी संकल्प, IRF, और पृष्ठभूमि शोर सहित सिस्टम पैरामीटर पर निर्भर है।
  5. FAD इमेजिंग
    1. मल्टीफोटॉन लेजर को 890 एनएम पर सेट करें और नए तरंग दैर्ध्य पर मोड-लॉक करने के लिए प्रतीक्षा करें। सुनिश्चित करें कि लेजर के लिए शक्ति नियंत्रण शुरू में शून्य पर सेट किया गया है ताकि लेजर पर शटर खोलने पर कोशिकाओं को नुकसान न पहुंचे।
      नोट:: इस चरण का संचालन करते समय चरण या उद्देश्य फ़ोकस को न ले जाएँ। दृश्य के FAD फ़ील्ड (FOV) सीधे इस छवि के लिए NAD (P)H FOV से मेल खाना चाहिए।
    2. सेट करें या ~ 500-600 एनएम पर उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य एकत्र करने के लिए एक उत्सर्जन फिल्टर का चयन करें।
    3. छवि सेटिंग्स को ऑप्टिमाइज़ करने के लिए फ़ोकसिंग या लाइव-व्यू तरीके से इमेजिंग शुरू करें.
      नोट: लेजर अब काम कर रहा है। इस बिंदु पर माइक्रोस्कोप बाड़े को न खोलें।
    4. धीरे-धीरे नमूने पर लेजर शक्ति को ~ 5-10 mW तक बढ़ाएं और उपयोग की जाने वाली अधिकतम शक्ति को रिकॉर्ड करें। FAD इमेजिंग के लिए पेट्री डिश के अन्य खंडों पर इमेजिंग के लिए पावर सेटिंग के रूप में इसका उपयोग करें।
    5. 60 s की एक छवि एकीकरण समय के साथ एक FAD FLIM छवि ले लीजिए.
    6. जांचें कि छवि में प्रतिदीप्ति जीवनकाल क्षय वक्र के भीतर पर्याप्त फोटॉन (साइटोप्लाज्म पिक्सेल के लिए ~ 100 फोटॉनों की चोटी) है। यदि फोटॉनों की संख्या बहुत कम है, तो लेजर शक्ति या छवि अधिग्रहण की अवधि बढ़ाएं।
      नोट: प्रतिदीप्ति घातीय क्षय के भीतर फोटॉनों की न्यूनतम चोटी संख्या अस्थायी संकल्प, IRF, और पृष्ठभूमि शोर सहित सिस्टम पैरामीटर पर निर्भर है।
  6. एक अतिरिक्त चार से पांच FOVs पर चरण 2.4-2.5 दोहराएँ। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक छवि को कम से कम 2 FOVs को प्रतिबिंबित स्थानों से दूर रखा गया है।

3. साइनाइड प्रयोग की तैयारी

  1. 80 mM (20x) सोडियम साइनाइड समाधान बनाने के लिए PBS के 25 mL में 130.24 मिलीग्राम सोडियम साइनाइड को भंग करें।
    नोट: साइनाइड विषाक्त है। उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें।
  2. Aspirate पकवान से संस्कृति माध्यम के 100 μL. इसे 100 μL सोडियम साइनाइड समाधान के साथ बदलें ताकि पकवान में साइनाइड की 4 mM एकाग्रता प्राप्त की जा सके।
  3. कोशिकाओं को साइनाइड समाधान के साथ प्रतिक्रिया करने की अनुमति देने के लिए कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में रखें।
  4. साइनाइड एक्सपोजर के बाद एनएडी (पी) एच और कोशिकाओं की एफएडी छवियों को प्राप्त करने के लिए चरण 2.4-2.6 दोहराएँ।
    नोट: साइनाइड के लिए लंबे समय तक संपर्क कोशिकाओं को मार देगा। पोस्टसाइनाइड छवियों को साइनाइड के अलावा के 30 मिनट के भीतर प्राप्त किया जाता है।

4. FLIM छवि विश्लेषण

  1. FLIM आजीवन विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें।
    1. मापा IRF प्राप्त करने के लिए यूरिया छवि खोलें।
    2. यूरिया छवि आयात करें। छवि विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले यूरिया क्रिस्टल की छवि पर एक बिंदु का चयन करें। मुख्य सॉफ़्टवेयर इंटरफ़ेस पर स्थित बिन चर को बदलकर 100 फोटॉनों के > क्षय शिखर के लिए एकाधिक पिक्सेल से 1 या उच्चतर तक FLIM डेटा को एकीकृत करने के लिए स्थानिक बिन मान बढ़ाएँ.
    3. डेटा को IRF के रूप में सहेजें.
      1. संदर्भित सॉफ़्टवेयर में, IRF नामक ड्रॉपडाउन मेनू पर क्लिक करें, क्षय डेटा से प्रतिलिपि बनाएँ का चयन करें. इसके बाद, प्रयोग के दौरान ली गई छवि के छवि विश्लेषण में उपयोग करने के लिए क्लिपबोर्ड में प्रतिलिपि बनाएँ क्लिक करें.
  2. NAD (P)H और FAD जीवनकाल छवियों की छवि विश्लेषण
    1. प्रतिदीप्ति जीवनकाल विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में छवि फ़ाइल आयात करें।
    2. यदि आवश्यक हो तो तीव्रता और इसके विपरीत को बदलकर कोशिकाओं और उपकोशिकीय डिब्बों को देखने के लिए छवि विज़ुअलाइज़ेशन में सुधार करें।
      1. विकल्प ड्रॉपडाउन मेनू पर क्लिक करें और तीव्रता का चयन करें। यहाँ, वांछित के रूप में तीव्रता और इसके विपरीत बदलें और ठीक क्लिक करें।
    3. यूरिया छवि से IRF आयात करें।
      1. IRF ड्रॉपडाउन मेनू पर क्लिक करें और क्लिपबोर्ड से चिपकाएँ का चयन करें.
    4. बहुघातात्मक क्षय पैरामीटर50 सेट करें।
      1. साइटोप्लाज्म पिक्सेल के लिए क्षय का मूल्यांकन करने के लिए थ्रेशोल्ड मान सेट करें।
        नोट: यहाँ, 50 का एक मान का उपयोग किया गया था। मूल्य को कई प्रतिनिधि पृष्ठभूमि और नाभिक पिक्सेल के प्रतिदीप्ति शिखर मूल्यों की तुलना कई साइटोप्लाज्म पिक्सेल के शिखर मूल्य के साथ करके चुना गया था। थ्रेशोल्ड के लिए नाभिक पिक्सेल और साइटोप्लाज्म पिक्सेल के बीच एक मान चुना गया था।
    5. जाँचें कि Shift मान प्रतिदीप्ति के बढ़ते किनारे के सापेक्ष IRF संरेखित करता है। यदि आवश्यक हो तो शिफ्ट को किसी ऐसे मान पर समायोजित करें जो ची-वर्ग मान को कम करता है।
    6. स्थानिक बिन को बढ़ाएं ताकि साइटोप्लाज्म पिक्सेल में 100 या उससे ऊपर प्रतिदीप्ति शिखर मान हों।
      नोट: स्थानिक बिन को बढ़ाने से स्थानिक रिज़ॉल्यूशन में कमी आएगी।
    7. छवि में सभी पिक्सेल के लिए प्रतिदीप्ति जीवनकाल की गणना करें।
      1. संदर्भित प्रोग्राम में, ड्रॉपडाउन परिकलित करें मेनू | क्षय मैट्रिक्स.
        नोट: सफलता आयाम-भारित प्रतिदीप्ति जीवनकाल के लिए एक छवि गलत रंग के साथ इंगित किया गया है।
    8. प्रतिदीप्ति जीवनकाल डेटा सहेजें।
      1. | फ़ाइल ड्रॉपडाउन मेनू क्लिक करें निर्यात करें। विश्लेषण के लिए वांछित पैरामीटर चुनें और ठीक क्लिक करें. छवि सहेजें।
      2. प्रदर्शित प्रतिदीप्ति जीवनकाल मीट्रिक, रंग कॉन्फ़िगरेशन को B-G-R में समायोजित करने के लिए विकल्प ड्रॉपडाउन मेनू से रंग बटन का चयन करें, और प्रतिदीप्ति जीवनकाल छवि के रंग पैमाने को समायोजित करने के लिए विशिष्ट रंग पट्टी न्यूनतम और अधिकतम मान सेट करें।

Figure 2
चित्रा 2: यूरिया क्रिस्टल के मापा IRF. (ए) यूरिया से प्राप्त तीव्रता छवि। कोशिकाओं की प्रतिदीप्ति जीवनकाल छवियों के बाद के विश्लेषण के लिए आईआरएफ क्षय वक्र (बी) बनाने के लिए एक प्रतिनिधि पिक्सेल चुना गया था। संक्षिप्त नाम: IRF = साधन प्रतिक्रिया समारोह. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. सेल विभाजन
    नोट:: यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल एक छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर 51 का उपयोग करता है। प्रतिनिधि MCF-7 छवियों और डेटा विश्लेषण कोड प्रदान कर रहे हैं52.
    1. MCF7_Segmentation_Final.cpproj file52 डाउनलोड करें।
    2. फ़ाइल | पर क्लिक करके MCF7_Segmentation पाइपलाइन आयात करें | आयात करें फ़ाइल से पाइपलाइन, फ़ाइल MCF7_Segmentation_Final.cpproj का चयन करें।
    3. छवियाँ मॉड्यूल पर क्लिक करें और विभाजित करने के लिए NAD(P)H तीव्रता छवियों को जोड़ें।
      नोट:: छवियाँ में होना चाहिए.tif, .png, या .jpg स्वरूप।
    4. नीचे बाईं ओर छवियों का विश्लेषण करें बटन दबाएँ।
      नोट:: पाइपलाइन विभिन्न सिस्टमों पर अधिग्रहित छवियों के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। समस्या निवारण के लिए, निम्न उप-चरणों का प्रयास करें
      1. विभिन्न पैरामीटर्स का परीक्षण करने के लिए परीक्षण मोड का उपयोग करें: परीक्षण मोड प्रारंभ करें क्लिक करें और मॉड्यूल नाम के आगे प्ले बटन पर क्लिक करके प्रत्येक मॉड्यूल चलाएँ।
      2. पहले पहचानेंPrimaryObjects मॉड्यूल क्लिक करें और कक्षों के व्यास से मेल खाने के लिए पिक्सेल इकाइयों (Min, Max) में ऑब्जेक्ट्स के विशिष्ट व्यास को समायोजित करें।
        नोट: MCF-7 कक्षों के लिए, 10 और 40 पिक्सेल क्रमशः न्यूनतम और अधिकतम के लिए उपयोग किए गए थे।
      3. EnhanceOrSuppressFeatures मॉड्यूल पर क्लिक करें और चयनित सुविधा प्रकार की पहचान में सुधार करने के लिए सुविधा आकार समायोजित करें।
        नोट:: MCF-7 कक्षों के लिए 10 पिक्सेल का एक सुविधा आकार का उपयोग किया गया था।
      4. दूसरे EnhanceOrSuppressFeatures मॉड्यूल पर क्लिक करें और परमाणु क्षेत्रों की वृद्धि को अनुकूलित करने के लिए छेद आकार की सीमा को समायोजित करें।
        नोट:: MCF-7 कक्षों के लिए 5-20 की एक श्रेणी का उपयोग किया गया था।
      5. दूसरा पहचानेंPrimaryObjects मॉड्यूल पर क्लिक करें और नाभिक की पहचान को ऑप्टिमाइज़ करने के लिए पैरामीटर (थ्रेशोल्ड रणनीति, थ्रेशोल्डिंग विधि, थ्रेशोल्डिंग विधि, थ्रेशोल्ड स्मूथिंग स्केल, और थ्रेशोल्ड सुधार कारक) को समायोजित करें। इष्टतम सेटिंग्स की पहचान करने और पहचानेंSecondaryObjects मॉड्यूल पर लागू करने के लिए प्रत्येक पैरामीटर द्वारा ? पर क्लिक करें।
      6. FilterObjects मॉड्यूल पर क्लिक करें और क्षेत्र के आकार को समायोजित करें। पहचाने जाने वाले क्षेत्र आकार के न्यूनतम और अधिकतम पिक्सेल का चयन करें.
        नोट:: MCF-7 कक्षों के लिए, 100 और 500 क्रमशः अधिकतम और न्यूनतम के लिए उपयोग किया गया था। नाभिक की पहचान करके सेल विभाजन की प्रक्रिया और सेल सीमाओं के लिए प्रसार वाल्श और Skala47 द्वारा विस्तार से समझाया गया है।
    5. सेल साइटोप्लाज्म मास्क का उपयोग करते हुए, छवि के भीतर प्रत्येक सेल के लिए प्रतिदीप्ति जीवनकाल आउटपुट चर का औसत।

Figure 3
चित्र 3: अलग-अलग कोशिकाओं की पहचान और विभाजन। एक प्रतिदीप्ति जीवनकाल छवि को एकीकृत करके प्राप्त MCF7 कोशिकाओं (ए) की एनएडी (पी) एच तीव्रता छवि। कोशिकाओं को 60 सेकंड के लिए 5 mW पर 750 एनएम उत्तेजना का उपयोग करके चित्रित किया गया था। x और y अक्ष छवि के पिक्सेल स्थान का प्रतिनिधित्व करते हैं. (ए) अलग-अलग कोशिकाओं की पहचान की गई थी। डेटा सेट से किसी भी पृष्ठभूमि शोर को खत्म करने के लिए कोशिकाओं को नकाबपोश (बी) किया गया था। नाभिक को तब पहचाना गया था (सी) और सेल मास्क (डी) पर प्रक्षेपित किया गया था। तब कोशिकाओं को फ़िल्टर किया गया था (ई) नकाबपोश क्षेत्रों को हटाने के लिए जो विशिष्ट कोशिकाओं के आकार में फिट नहीं होते हैं। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

5. वैकल्पिक विधि: प्रतिदीप्ति तीव्रता इमेजिंग

  1. प्रयोग के दौरान उपयोग किए जाने वाले उपकरणों को चालू करें।
    नोट: प्रतिदीप्ति तीव्रता छवियों को व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप, confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप, या multiphoton माइक्रोस्कोप के साथ अधिग्रहित किया जा सकता है।
    1. सुनिश्चित करें कि उपयोग किए जाने वाले माइक्रोस्कोप में एनएडी (पी) एच (एकल-फोटॉन तरंग दैर्ध्य ~ 370-405 एनएम: दो-फोटॉन तरंग दैर्ध्य ~ 700-750 एनएम) और एफएडी (एकल-फोटॉन तरंग दैर्ध्य ~ 488 एनएम, दो-फोटॉन तरंग दैर्ध्य ~ 890 एनएम) के लिए एक उपयुक्त उत्तेजना स्रोत है।
    2. सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप में एनएडी (पी) एच उत्सर्जन (~ 400-500 एनएम) के अलगाव के लिए एक फिल्टर है।
      नोट: 4', 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) सेटिंग्स अक्सर NAD (P) H के लिए काम करते हैं।
    3. सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप में FAD उत्सर्जन (~ 500-600 nm) के अलगाव के लिए एक फ़िल्टर है।
      नोट: ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) सेटिंग्स अक्सर FAD के लिए काम करते हैं।
  2. माइक्रोस्कोप तैयार करें।
    1. ब्राइटफील्ड लैंप चालू करें। सुनिश्चित करें कि प्रकाश आईपीस में जा रहा है। यदि आवश्यक हो तो संबंधित उद्देश्य के शीर्ष पर उपयुक्त विसर्जन माध्यम की 1 बूंद लागू करें।
    2. बिना किसी हस्तक्षेप के नमूनों को ठीक से रखने के लिए उद्देश्य को नीचे ले जाएँ। पेट्री डिश को मंच पर ठीक से रखें। सुनिश्चित करें कि नमूना सुरक्षित है और इमेजिंग के दौरान स्थानांतरित नहीं होगा।
      नोट: यह अनुशंसा की जाती है कि छवि अधिग्रहण के दौरान गर्मी, आर्द्रता और सीओ 2 के स्तर को बनाए रखने के लिए कोशिकाओं को एक पर्यावरण कक्ष में रखा जाए, क्योंकि ये पैरामीटर सेलुलर चयापचय को प्रभावित कर सकते हैं।
    3. उद्देश्य के साथ नमूने को केंद्र में रखें। एक बार ऐसा करने के बाद, आईपीस में देखें और उद्देश्य को तब तक स्थानांतरित करें जब तक कि कोशिकाएं ध्यान में न हों।
  3. तीव्रता इमेजिंग शुरू करें।
    1. इमेजिंग सॉफ़्टवेयर खोलें और छवि अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर में कैप्चर टैब पर क्लिक करके और माइक्रोस्कोप बुर्ज में NAD (P) H उत्तेजना और उत्सर्जन फ़िल्टर की स्थिति बनाकर NAD(P)H पर कब्जा करने के लिए उत्तेजना और उत्सर्जन कॉन्फ़िगरेशन सेट करें।
      नोट: एक 357/44 उत्तेजना फ़िल्टर, 409 longpass dichroic, और 447/60 उत्सर्जन फ़िल्टर NAD (P) H इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था।
    2. उत्तेजना रोशनी और डिटेक्टर मापदंडों का अनुकूलन. यदि ब्लीचिंग एक मुद्दा है, तो रोशनी की तीव्रता को कम करें और छवि एकीकरण समय बढ़ाएं।
      नोट: एनएडी (पी) एच एक कमजोर संकेत है; ब्लीचिंग के बारे में जागरूक रहें यदि बहुत अधिक शक्ति का उपयोग किया जाता है।
    3. वांछित छवि आकार की एक NAD (P)H छवि प्राप्त करें. सुनिश्चित करें कि छवि सहेजी गई है।
    4. FAD कैप्चर करने के लिए उत्तेजना और उत्सर्जन कॉन्फ़िगरेशन सेट करें. उत्तेजना रोशनी और डिटेक्टर मापदंडों का अनुकूलन.
      नोट: एक 458/64 उत्तेजना फ़िल्टर, 495 longpass dichroic, और 550/88 उत्सर्जन फ़िल्टर FAD इमेजिंग के लिए उपयोग किया गया था।
    5. एक FAD छवि प्राप्त करें. सुनिश्चित करें कि छवि सहेजी गई है।
      नोट: एनएडी (पी) एच और एफएडी छवि अधिग्रहण पैरामीटर (रोशनी तीव्रता, छवि आकार, डिटेक्टर लाभ) को इमेजिंग प्रयोग के दौरान समान रहना चाहिए।
    6. एक अतिरिक्त पांच स्थानों पर प्रक्रिया को दोहराएं, कम से कम 2 FOVs को छवि वाले स्थानों से दूर रखा गया है।
  4. छवि-स्तर रेडॉक्स अनुपात डेटा विश्लेषण
    1. एक छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम में NAD (P)H और FAD तीव्रता छवियों को खोलें।
    2. साइटोप्लाज्म पिक्सेल को बनाए रखने और पृष्ठभूमि और नाभिक पिक्सेल को 0 पर सेट करने के लिए एनएडी (पी) एच पर एक थ्रेशोल्ड सेट करें।
    3. थ्रेशोल्ड NAD(P)H छवि का उपयोग करके प्रत्येक पिक्सेल पर समीकरण FAD/(NAD(P)H+FAD) का मूल्यांकन करके रेडॉक्स अनुपात छवि की गणना करें.
    4. गैर-0 पिक्सेल के माध्य मान की गणना करें.
      नोट:: इन चरणों छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में किया जा सकता है या स्क्रिप्ट के साथ सीधे कोडित किया जा सकता है।
  5. सेल-स्तर रेडॉक्स अनुपात विश्लेषण
    1. प्रत्येक NAD(P)H छवि के भीतर कक्षों की एक मुखौटा छवि प्राप्त करने के लिए चरण 4.3.1-4.3.5 का पालन करें।
    2. प्रत्येक पिक्सेल पर समीकरण FAD/(NAD(P)H+FAD) का मूल्यांकन करके रेडॉक्स अनुपात छवि की गणना करें.
    3. सेल साइटोप्लाज्म मास्क का उपयोग करते हुए, छवि के भीतर प्रत्येक सेल के लिए सभी पिक्सेल के लिए रेडॉक्स अनुपात का औसत।

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Representative Results

उपकला स्तन कैंसर सेल लाइन, MCF-7, DMEM में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक में सुसंस्कृत किया गया था। प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए, कोशिकाओं को इमेजिंग से पहले 4 × 105 कोशिकाओं प्रति 35 मिमी ग्लास-बॉटम इमेजिंग डिश के घनत्व पर 48 घंटे पहले बीज दिया गया था। कोशिकाओं को ऊपर बताए गए प्रोटोकॉल का उपयोग करके साइनाइड उपचार से पहले और बाद में चित्रित किया गया था। साइनाइड प्रयोग का लक्ष्य एनएडी (पी) एच और एफएडी प्रतिदीप्ति के वर्णक्रमीय अलगाव की पुष्टि करना और कोशिकाओं में चयापचय परिवर्तनों का पता लगाने के लिए इमेजिंग सिस्टम और विश्लेषण प्रोटोकॉल को मान्य करना है। युग्मित एनएडी (पी) एच और एफएडी प्रतिदीप्ति जीवनकाल छवियों को साइनाइड से पहले पांच अलग-अलग स्थानों पर लिया गया था और माध्यम में साइनाइड के अलावा पांच अलग-अलग स्थानों पर लिया गया था। प्रतिदीप्ति जीवनकाल पैरामीटर (ऑप्टिकल रेडॉक्स अनुपात, NAD(P)H α 1, NAD(P)H π1, NAD(P)H π2, NAD(P)H πm, FAD π1, FAD π2, FAD α 1, FAD π1, FAD π2, और FAD πm) की गणना यूरिया (चित्रा 2) से मापे गए IRF का उपयोग करके की गई थी और विभाजन के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक सेल के साइटोप्लाज्म के पिक्सेल में औसत (चित्रा 3)।

एनएडी (पी) एच और एफएडी के मल्टीफोटॉन प्रतिदीप्ति जीवनकाल इमेजिंग सेल आकृति विज्ञान और चयापचय (चित्रा 4) के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी के साथ प्राप्त उच्च रिज़ॉल्यूशन एकल कोशिकाओं की पहचान के लिए अनुमति देता है। एनएडी (पी) एच और एफएडी मुख्य रूप से माइटोकॉन्ड्रिया और साइटोप्लाज्म में स्थित हैं, जबकि नाभिक, जिसमें चयापचय एनएडी (पी) एच और एफएडी की कमी है, 23,53 की तुलना में अंधेरा है। जीवनभर की छवियां पूरे सेल में एनएडी (पी) एच और एफएडी के आयाम-भारित जीवनकाल का विज़ुअलाइज़ेशन प्रदान करती हैं और साइनाइड एक्सपोजर (चित्रा 4) के परिणामस्वरूप।

Figure 4
चित्रा 4: साइनाइड उपचार से पहले और बाद में MCF7 कोशिकाओं की प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति जीवनकाल छवियां। (A) NAD(P)H आयाम-भारित प्रतिदीप्ति जीवनकाल छवि और (B) साइनाइड उपचार से पहले FAD आयाम-भारित प्रतिदीप्ति जीवनकाल छवि। (सी) एनएडी (पी) एच आयाम-भारित प्रतिदीप्ति जीवनकाल छवि और (डी) एफएडी आयाम-भारित प्रतिदीप्ति जीवनकाल छवि साइनाइड उपचार के बाद। आयाम-भारित प्रतिदीप्ति जीवनकाल (रंग पट्टी द्वारा इंगित) उस समय को मापता है जिसके लिए एक फ्लोरोफोर, इन मामलों में एनएडी (पी) एच और एफएडी, एक उत्साहित अवस्था में है। एनएडी (पी) एच जीवनकाल साइनाइड उपचार के साथ कम हो जाता है, जबकि साइनाइड उपचार के बाद एफएडी जीवनकाल बढ़ जाता है। NADH सिग्नल को 60 s के लिए 5 mW पर 750 nm उत्तेजना का उपयोग करके चित्रित किया गया था, और FAD सिग्नल को 60 s के लिए 7 mW पर 890 nm उत्तेजना का उपयोग करके चित्रित किया गया था। एक 40x जल विसर्जन उद्देश्य के साथ अधिग्रहित छवियों, संख्यात्मक एपर्चर = 1.1. स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

साइनाइड इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के जटिल IV को रोकता है, जो ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन 2,15 को रोकता है। साइनाइड एक्सपोजर के बाद और सेल मृत्यु से पहले, एनएडी (पी) एच माइटोकॉन्ड्रिया के भीतर जमा हो जाता है, और एफएडी 1,15 कम हो जाता है। चयापचय के साइनाइड निषेध के कारण एनएडी (पी) एच और एफएडी तीव्रता में इन अच्छी तरह से परिभाषित परिवर्तनों के कारण, ऑटोफ्लोरेसेंस इमेजिंग और विश्लेषण प्रोटोकॉल 2,54 को सत्यापित करने के लिए गड़बड़ी एक मानक परीक्षण है। जैसा कि अपेक्षित था, एमसीएफ -7 कोशिकाओं के ऑप्टिकल रेडॉक्स अनुपात (एफएडी / (एफएडी + एनएडी (पी)एच)) साइनाइड उपचार के बाद कम हो गया (चित्रा 5, पी = 0.044, वेल्च का टी-टेस्ट)। ऑप्टिकल रेडॉक्स अनुपात एक मानकीकृत सूत्र नहीं है, फिर भी सभी तीव्रता सूत्रों को समतुल्य 20 दिखाया गया है। FAD/(NAD(P)H+FAD) को ऑप्टिकल रेडॉक्स अनुपात को परिभाषित करने के लिए चुना गया था क्योंकि हर में NAD(P)H और FAD का संयुक्त योग 0 और 120,55 के बीच एक सामान्यीकृत मान प्रदान करता है। विपरीत प्रभाव- ऑप्टिकल रेडॉक्स अनुपात में वृद्धि- अंश में एनएडी (पी) एच के साथ गणना किए गए ऑप्टिकल रेडॉक्स अनुपात के साथ साइनाइड गड़बड़ी के लिए उम्मीद की जाती है।

Figure 5
चित्रा 5: MCF7 कोशिकाओं का ऑप्टिकल रेडॉक्स अनुपात साइनाइड उपचार के साथ कम हो जाता है। बॉक्सप्लॉट्स सेल डेटा से परिकलित माध्यिका और पहले और तीसरे चतुर्थक को दिखाते हैं। माध्य को काले बिंदु प्रतीक द्वारा दर्शाया जाता है, और माध्यिका को बॉक्स के अंदर काली रेखा द्वारा दर्शाया जाता है। प्रत्येक बॉक्सप्लॉट पर ओवरलेड ग्रे डेटा पॉइंट्स प्रत्येक सेल के भीतर सभी साइटोप्लाज्म पिक्सेल के औसत मूल्य का प्रतिनिधित्व करते हैं। नियंत्रण समूह में पांच अलग-अलग छवियों से 91 कोशिकाएं शामिल थीं, और साइनाइड समूह में पांच अलग-अलग छवियों से 95 कोशिकाएं शामिल थीं। पी < 0.01, वेल्च का टी-टेस्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

MCF7 कोशिकाओं के आयाम-भारित NAD (P)H जीवनकाल (πm) साइनाइड एक्सपोजर के साथ कम हो गया (चित्रा 6A, p < 2.2 × 10-16, वेल्च का टी-टेस्ट)। एनएडी (पी) एच (चित्रा 6 बी, सी) के लिए छोटे और लंबे जीवनकाल दोनों में कमी आई, लेकिन एनएडी (पी) एच α 1 (चित्रा 6 डी) के लिए वृद्धि हुई। एनएडी (पी) एच प्रतिदीप्ति जीवनकाल में ये परिवर्तन, πm में कमी, α 1 में वृद्धि, और π2 में कमी साइनाइड गड़बड़ी 40,56 के प्रकाशित मूल्यों से मेल खाती है। साइनाइड एक्सपोजर के साथ एनएडी (पी) एच आयाम-भारित प्रतिदीप्ति जीवनकाल में कमी एनएडी (पी) एच के माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर बढ़ी हुई शमन को इंगित करती है। α 1 में वृद्धि अधिक मुक्त एनएडी (पी) एच को इंगित करती है, जैसा कि सेलुलर चयापचय 21 पर साइनाइड के प्रभावों के कारण एनएडी (पी) एच की वृद्धि से उम्मीद की जाती है।

Figure 6
चित्रा 6: एनएडी (पी) एच एमसीएफ 7 कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति जीवनकाल से पहले और साइनाइड उपचार के बाद। पैनल A-D में boxplots माध्यिका और सेल-स्तर डेटा से परिकलित पहले और तीसरे चतुर्थक को दिखाते हैं। माध्य को काले बिंदु प्रतीक द्वारा दर्शाया जाता है, और माध्यिका को बॉक्स के अंदर काली रेखा द्वारा दर्शाया जाता है। प्रत्येक बॉक्सप्लॉट पर ओवरलेड ग्रे डेटा पॉइंट्स एक सेल के भीतर सभी साइटोप्लाज्म पिक्सेल के औसत मूल्य का प्रतिनिधित्व करते हैं। नियंत्रण समूह में पांच अलग-अलग छवियों से 91 कोशिकाएं शामिल थीं, और साइनाइड समूह में पांच अलग-अलग छवियों से 95 कोशिकाएं शामिल थीं। (ए-डी) साइनाइड उपचार के कारण एनएडी (पी) एच आयाम-भारित जीवनकाल (πm), एनएडी (पी) एच छोटे जीवनकाल (π1), एनएडी (पी) एच लंबे जीवनकाल (π2), और एनएडी (पी) एच-आनुपातिक घटक में परिवर्तन प्रदर्शित करता है कम जीवनकाल (α 1)। पी-मानों की गणना वेल्च के टी-टेस्ट का उपयोग करके की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

MCF7 कोशिकाओं के आयाम-भारित FAD जीवनकाल (πm) साइनाइड एक्सपोजर के बाद बढ़ गया (चित्रा 7A, p = 3.688 × 10-12, वेल्च का टी-टेस्ट)। FAD (चित्रा 7B, C) के लिए छोटे और लंबे जीवनकाल दोनों में वृद्धि हुई, लेकिन FAD α 1 (चित्रा 7D) के लिए कम हो गई। FAD प्रतिदीप्ति जीवनकाल में परिवर्तन, πm और π2 में वृद्धि, और α 1 में कमी साइनाइड गड़बड़ी 57 के प्रकाशित FAD प्रतिदीप्ति जीवनकाल डेटा के अनुरूप हैं। जीवन भर के मूल्यों में परिवर्तन और α 1 कोशिकाओं के भीतर चयापचय परिवर्तन का सुझाव देते हैं, जिसमें मुक्त FAD21 की बढ़ी हुई मात्रा भी शामिल है।

Figure 7
चित्रा 7: साइनाइड उपचार से पहले और बाद में एफएडी प्रतिदीप्ति जीवनकाल। ए-डी में बॉक्सप्लॉट माध्यिका, पहले और तीसरे चतुर्थक, और सेल-स्तर डेटा से गणना का मतलब दिखाते हैं। माध्य को काले बिंदु प्रतीक द्वारा दर्शाया जाता है, और माध्यिका को बॉक्स के अंदर काली रेखा द्वारा दर्शाया जाता है। प्रत्येक बॉक्सप्लॉट पर ओवरलेड ग्रे डेटा पॉइंट्स एक सेल के भीतर सभी साइटोप्लाज्म पिक्सेल के औसत मूल्य का प्रतिनिधित्व करते हैं। नियंत्रण समूह में पांच अलग-अलग छवियों से 91 कोशिकाएं शामिल थीं, और साइनाइड समूह में पांच अलग-अलग छवियों से 95 कोशिकाएं शामिल थीं। (ए-डी) एफएडी आयाम-भारित जीवनकाल (πm), FAD छोटे जीवनकाल (π1), FAD लंबे जीवनकाल (π2), और साइनाइड उपचार से छोटे जीवनकाल (α 1) के FAD-आनुपातिक घटक में परिवर्तन प्रदर्शित करते हैं। पी-मानों की गणना वेल्च के टी-टेस्ट का उपयोग करके की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

Autofluorescence तीव्रता और जीवनभर इमेजिंग व्यापक रूप से कोशिकाओं में चयापचय का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है21,55. एफएलआईएम उच्च रिज़ॉल्यूशन है और इसलिए एकल कोशिकाओं को हल करता है, जो कैंसर के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि सेलुलर विषमता ट्यूमर आक्रामकता और दवा प्रतिरोध में योगदान देती है7,39,41,44,45,46,58। इसी तरह, सेलुलर चयापचय की ऑटोफ्लोरेसेंस इमेजिंग प्रतिरक्षा कोशिकाओं की इमेजिंग के लिए उपयोगी है क्योंकि प्रतिरक्षा कोशिका समारोह सेलुलर चयापचय से जुड़ा हुआ है, और प्रतिरक्षा कोशिका आबादी अक्सर विषम 20,31 होती है। मानक जैव रासायनिक assays आमतौर पर जनसंख्या स्तर पर प्रतिरक्षा कोशिकाओं का मूल्यांकन या सेल permeabilization34,59,60 के बाद इंट्रासेल्युलर लेबलिंग की आवश्यकता होती है। Autofluorescence इमेजिंग भी विवो में उच्च संकल्प के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है और प्रकाश की गैर विनाशकारी प्रकृति और रासायनिक या आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड लेबल की कमी के कारण चयापचय के गतिशील माप36,37,38,41,48,55 . इमेजिंग एनएडी (पी) एच और एफएडी प्रतिदीप्ति तीव्रता और जीवनकाल के लिए महत्वपूर्ण चरणों में उत्तेजना और उत्सर्जन के लिए उपयुक्त तरंग दैर्ध्य का चयन शामिल है, सत्यापन है कि कोशिकाओं में सिंथेटिक या अतिरिक्त अंतर्जात फ्लोरोफोरस नहीं होते हैं जो ओवरलैपिंग प्रतिदीप्ति में योगदान करेंगे, और नॉनडेमेजिंग लेजर शक्तियों का उपयोग।

एनएडी (पी) एच और एफएडी के ऑटोफ्लोरेसेंस इमेजिंग एक लेबल-मुक्त, उच्च-रिज़ॉल्यूशन, मात्रात्मक चयापचय इमेजिंग तकनीक के रूप में एक अद्वितीय आला भरता है। अन्य इमेजिंग विधियां, जैसे कि FDG-PET और MRS, छवि ऊतक चयापचय लेकिन सेलुलर स्तर के रिज़ॉल्यूशन की कमी है और इस प्रकार सेलुलर विषमता का मूल्यांकन नहीं कर सकते हैं। अन्य जैव रासायनिक तकनीकों, जैसे कि ऑक्सीजन की खपत, मीडिया में चयापचयों के माप, या प्रोटीन विश्लेषण, को महंगे एकल-उपयोग अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है, पूल की गई कोशिकाओं से माप प्राप्त करते हैं, और सेल-विनाशकारी प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है, समय-पाठ्यक्रम के अध्ययन को रोकते हैं या विवो विश्लेषण 61,62 में।

जबकि एनएडी (पी) एच और एफएडी की ऑटोफ्लोरेसेंस इमेजिंग एक लेबल-मुक्त और गैर-विनाशकारी तरीके से उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियां प्रदान करती है, प्रयोगों को डिजाइन और व्याख्या करते समय ऑटोफ्लोरेसेंस इमेजिंग की कुछ सीमाओं पर विचार किया जाना चाहिए। FLIM को विशेष और महंगे उपकरणों की आवश्यकता होती है जो व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं है। FLIM उत्तेजना को 50 mW63 के आउटपुट पावर के साथ 40 और 100 MHz के बीच पुनरावृत्ति दर पर picosecond या femtosecond दालों के साथ एक स्पंदित-उत्तेजना स्रोत > आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, छवि अधिग्रहण अपेक्षाकृत धीमा है, पिक्सेल या छवि रिज़ॉल्यूशन और छवि अधिग्रहण समय की संख्या के बीच एक व्यापार-बंद के साथ। 256 x 256 पिक्सेल और 60 s एकीकरण समय के इस प्रोटोकॉल में अनुशंसित पैरामीटर लगभग 1 मील के भीतर उचित रिज़ॉल्यूशन के साथ एक छवि प्रदान करते हैं। उपयोगकर्ता कम पिक्सेल के साथ छोटे क्षेत्रों की छवि चुन सकता है या इमेजिंग गति में सुधार करने के लिए लाइन स्कैन कर सकता है।

वैकल्पिक रूप से, उच्च-पिक्सेल छवियों को बढ़ी हुई छवि एकीकरण समय के साथ प्राप्त किया जा सकता है। डेटा विश्लेषण और autofluorescence जीवनकाल छवियों की व्याख्या चुनौतीपूर्ण हो सकता है क्योंकि FLIM विशिष्ट चयापचय मार्गों के बजाय चयापचय coenzymes और उनके आणविक वातावरण के बारे में विशिष्ट biophysical जानकारी प्रदान करता है। ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी भी प्रकाश प्रकीर्णन और अवशोषण के कारण ऊतक में प्रकाश प्रवेश की गहराई से सीमित है। विवो अध्ययन में किया जा सकता है, मल्टीफोटॉन इमेजिंग सिस्टम के साथ ~ 0.5 मिमी की गहराई पर, सतह के ऊतकों की या खिड़की के कक्षों के माध्यम से 2,20,21,64,65।

जबकि एनएडी (पी) एच और एफएडी अलग-अलग कोशिकाओं में प्राथमिक अंतर्जात फ्लोरोफोरस हैं, कोलेजन और इलास्टिन सहित अतिरिक्त अणु, ऊतकों में ऑटोफ्लोरेसेंस संकेतों का योगदान कर सकते हैं। मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियां बाह्य कोशिकीय प्रोटीन 40 से एनएडी (पी) एच और एफएडी पिक्सेल के विभाजन के लिए सेलुलर और गैर-कोशिकीय डिब्बों के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देती हैं। कुछ कोशिकाओं में ओवरलैपिंग प्रतिदीप्ति के साथ अंतर्जात अणु होते हैं, जैसे कि लिपोफ्यूसिन, रेटिनॉल, ट्रिप्टोफैन और मेलेनिन 66। इसलिए, एनएडी (पी) एच और एफएडी की ऑटोफ्लोरेसेंस छवियों में अन्य अंतर्जात अणुओं से पृष्ठभूमि योगदान हो सकता है।

इसी तरह, जबकि एनएडी (पी) एच और एफएडी को बहिर्जात फ्लोरोफोरस के साथ मल्टीप्लेक्स किया जा सकता है जो 600 एनएम से ऊपर तरंग दैर्ध्य पर उत्सर्जित होता है, बहिर्जात लेबल, जैसे कि डीएपीआई या आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड प्रोटीन जैसे जीएफपी, ऑटोफ्लोरेसेंस इमेजिंग के साथ वर्णक्रमीय रूप से ओवरलैप होते हैं। यहां वर्णित साइनाइड क्षोभ प्रयोग यह सत्यापित करने में मदद करता है कि उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य कोशिकाओं में चयापचय परिवर्तनों को कैप्चर करने के लिए एनएडी (पी) एच और एफएडी को पर्याप्त रूप से अलग करते हैं। अन्य सेल प्रकार इस प्रोटोकॉल पर लागू किए जा सकते हैं; हालांकि, उपयोगकर्ता को इमेजिंग पैरामीटर को अनुकूलित करना चाहिए, जिसमें प्रत्येक सेल प्रकार के लिए लेजर पावर और छवि एकीकरण समय शामिल है, और फोटोब्लीचिंग को रोकने के लिए प्रयोग करना चाहिए। फोटोब्लीचिंग को जीवनकाल स्कैन की अवधि के लिए इमेजिंग के दौरान फोटॉन गिनती दर या औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता की निगरानी करके कम से कम किया जा सकता है। प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि या कमी इंगित करती है कि लेजर शक्ति बहुत अधिक है। यदि लेजर शक्तियां फोटोब्लीचिंग को प्रेरित करती हैं, तो शक्ति को कम किया जा सकता है, और जीवन भर के विश्लेषण के लिए पर्याप्त फोटॉन संग्रह प्राप्त करने के लिए कुल छवि अधिग्रहण में वृद्धि हुई है।

यद्यपि प्रतिदीप्ति जीवनकाल इमेजिंग पैरामीटर से स्वतंत्र हैं, जिसमें लेजर पावर और डिटेक्टर लाभ शामिल हैं, प्रतिदीप्ति तीव्रता इन मापदंडों पर निर्भर करती है20। इसलिए, ऑप्टिकल रेडॉक्स अनुपात को मापने के लिए ऑटोफ्लोरेसेंस इमेजिंग का संचालन करते समय, सुसंगत इमेजिंग पैरामीटर का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। प्रोटोकॉल अनुशंसा करता है कि प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह से विभिन्न एफओवी की 5-6 छवियों का अधिग्रहण किया जाए। यह नमूना आकार साइनाइड गड़बड़ी के कारण confluent MCF7 कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति जीवनकाल मापदंडों में अपेक्षित अंतर को हल करने के लिए छवि और सेल दोनों स्तरों पर पर्याप्त डेटा प्रदान करता है। प्रति समूह अधिग्रहित छवियों की इष्टतम संख्या प्रयोगात्मक डिजाइन और प्रभाव आकार पर निर्भर करती है। एनएडी (पी) एच और एफएडी छवियों के बीच स्विच करते समय, फोकल प्लेन को स्थिरता के लिए प्रत्येक स्थान पर समान रहना चाहिए। हालांकि लाइफटाइम इमेजिंग में आमतौर पर फोटॉनों की संतृप्त संख्या नहीं होती है, कैमरों या फोटोमल्टीप्लायर ट्यूबों के साथ अधिग्रहित तीव्रता छवियों को संतृप्त किया जा सकता है। पिक्सेल संतृप्ति से यह सुनिश्चित करने के लिए बचा जाना चाहिए कि शारीरिक तीव्रता की पूरी श्रृंखला छवियों में कैप्चर की गई है।

प्रतिदीप्ति जीवनकाल छवियों का विश्लेषण करते समय, या तो एक मापा आईआरएफ या एक नकली आईआरएफ का उपयोग किया जा सकता है। सिम्युलेटेड आईआरएफ का अनुमान फ्लोरोसेंट लाइफटाइम वक्र के अपशूट से लगाया जाता है; हालांकि, सिस्टम से प्राप्त वास्तविक आईआरएफ सिस्टम के आधार पर व्यापक हो सकता है और इस प्रकार अधिक सटीक जीवनकाल मूल्यों में परिणाम हो सकता है। जबकि आईआरएफ आमतौर पर केवल हार्डवेयर या सॉफ़्टवेयर परिवर्तनों के साथ बदलता है, एक दैनिक आईआरएफ माप यह सुनिश्चित करने के लिए एक अच्छा अभ्यास है कि प्रतिदीप्ति जीवनकाल प्रणाली उम्मीद के अनुसार काम कर रही है।

कुल मिलाकर, एनएडी (पी) एच और एफएडी की ऑटोफ्लोरेसेंस इमेजिंग एकल-सेल स्तर पर सेलुलर चयापचय की छवि और विश्लेषण करने के लिए एक लेबल-मुक्त, गैर-विनाशकारी विधि प्रदान करती है। यह विधि कोशिकाओं में एक अच्छी तरह से विशेषता वाले चयापचय गड़बड़ी को प्रेरित करने के लिए साइनाइड का उपयोग करके एनएडी (पी) एच और एफएडी की इमेजिंग को मान्य करने के लिए एक चरण-दर-चरण दृष्टिकोण प्रदान करती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

वित्त पोषण स्रोतों में टेक्सास के कैंसर रोकथाम और अनुसंधान संस्थान (CPRIT RP200668) और टेक्सास ए एंड एम विश्वविद्यालय शामिल हैं। चित्रा 1 BioRender.com के साथ बनाया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-deoxy-d-glucose (2-DG) Sigma AC111980000; AC111980010; AC111980050; AC111980250
Antibiotic Antimicrobial (pen-strep) Gibco 15240096
Cell Samples American Type Culture Collection N/A MCF-7 cancer line
CellProfiler Broad Institute N/A Image analysis software
Conical Tube VWR 89039-664 15 mL conical tube
DMEM ThermoFisher 11965092 Culture media
FAD dichroic mirror Semrock FF495-Di03-25x36 495 nm
FAD emission filter Semrock FF01-550/88-25 550/88 nm
FAD excitation filter Semrock FF01-458/64-25 458/64 nm
FBS ThermoFisher 16000036
Fluorescence Lifetime Microscope 3i N/A
Glass bottom dish MatTek Corp P35G-1.0-14-C
Multiphoton Laser Coherent N/A 2P Coherent Laser, Tunable 680 nm-1080 nm
NAD(P)H dichroic mirror Semrock FF409-Di03-25x36 409 nm
NAD(P)H emission filter Semrock FF02-447/60-25 447/60 nm
NAD(P)H excitation filter Semrock FF01-357/44-25 357/44 nm
PBS ThermoFisher 70011044
Potassium Cyanide Sigma-Aldrich 380970
SlideBooks 6 3i N/A Image acquisition software
SPCImage Becker & Hickl GmbH N/A Fluorescence lifetime analysis software
Stage Top Incubator okoLab N/A
Trypsin Biosciences 786-262
Urea Sigma-Aldrich U5128
YG beads Polysciences 19096-2 Yg microspheres (20.0 µm)

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Theodossiou, A., Hu, L., Wang, N., Nguyen, U., Walsh, A. J. Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism. J. Vis. Exp. (177), e63282, doi:10.3791/63282 (2021).

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