Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Autofluorescentie beeldvorming om cellulair metabolisme te evalueren

Published: November 15, 2021 doi: 10.3791/63282
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University-College Station

Summary

Dit protocol beschrijft fluorescentiebeeldvorming en analyse van de endogene metabole co-enzymen, gereduceerd nicotinamide-adenine (fosfaat) dinucleotide (NAD (P) H) en geoxideerd flavine-adenine dinucleotide (FAD). Autofluorescentie beeldvorming van NAD(P)H en FAD biedt een labelvrije, niet-destructieve methode om het cellulaire metabolisme te beoordelen.

Abstract

Cellulair metabolisme is het proces waarbij cellen energie genereren en veel ziekten, waaronder kanker, worden gekenmerkt door een abnormaal metabolisme. Gereduceerd nicotinamide-adenine (fosfaat) dinucleotide (NAD(P)H) en geoxideerd flavine adenine dinucleotide (FAD) zijn co-enzymen van metabole reacties. NAD(P)H en FAD vertonen autofluorescentie en kunnen spectraal worden geïsoleerd door excitatie- en emissiegolflengten. Beide co-enzymen, NAD(P)H en FAD, kunnen bestaan in een vrije of eiwitgebonden configuratie, die elk een verschillende fluorescentielevensduur hebben - de tijd gedurende welke de fluorofoor in de aangeslagen toestand blijft. Fluorescentie lifetime imaging (FLIM) maakt kwantificering van de fluorescentie-intensiteit en levensduur van NAD(P)H en FAD mogelijk voor labelvrije analyse van cellulair metabolisme. Fluorescentie-intensiteit en levensduurmicroscopen kunnen worden geoptimaliseerd voor beeldvorming van NAD (P) H en FAD door de juiste excitatie- en emissiegolflengten te selecteren. Metabole verstoringen door cyanide verifiëren autofluorescentie beeldvormingsprotocollen om metabole veranderingen in cellen te detecteren. Dit artikel demonstreert de techniek van autofluorescentie beeldvorming van NAD(P)H en FAD voor het meten van cellulair metabolisme.

Introduction

Metabolisme is het cellulaire proces van het produceren van energie. Cellulair metabolisme omvat meerdere routes, waaronder glycolyse, oxidatieve fosforylering en glutaminolyse. Gezonde cellen gebruiken deze metabole routes om energie te genereren voor proliferatie en functie, zoals de productie van cytokines door immuuncellen. Veel ziekten, waaronder metabole stoornissen, kanker en neurodegeneratie, worden gekenmerkt door een veranderd cellulair metabolisme1. Sommige soorten kankercellen hebben bijvoorbeeld verhoogde glycolysesnelheden, zelfs in de aanwezigheid van zuurstof, om moleculen te genereren voor de synthese van nucleïnezuren, eiwitten en lipiden2,3. Dit fenomeen, bekend als het Warburg-effect, is een kenmerk van vele soorten kanker, waaronder borstkanker, longkanker en glioblastomen4. Vanwege de veranderingen van het cellulaire metabolisme geassocieerd met kankerprogressie, kan cellulair metabolisme een surrogaatbiomarker zijn voor medicijnrespons5,6. Bovendien is het begrijpen van de werkzaamheid van geneesmiddelen op cellulair niveau cruciaal, omdat celheterogeniteit kan leiden tot verschillende geneesmiddelresponsen bij individuen7,8.

Technologieën die veranderingen in het cellulaire metabolisme identificeren en kwantificeren, zijn essentieel voor studies naar kanker en medicijnrespons. Chemische en eiwitanalyses worden gebruikt om het metabolisme van cellen of weefsels te evalueren, maar missen eencellige resolutie en ruimtelijke informatie. Metabole plaatlezer-gebaseerde assays kunnen de pH en het zuurstofverbruik in het monster in de loop van de tijd en de daaropvolgende metabole verstoring door chemicaliën meten. De pH kan worden gebruikt om de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) te berekenen, wat inzicht geeft in de glycolytische activiteit van de cellen9. Beeldvormingsmethoden voor het hele lichaam, waaronder 2-[fluor-18] fluor-D-glucose positronemissietomografie (FDG PET) en magnetische resonantiespectroscopie (MRS), zijn niet-invasieve beeldvormingsmodaliteiten die klinisch worden gebruikt om tumorrecidief en werkzaamheid van geneesmiddelen te identificeren door middel van metabole metingen10,11,12,13,14.

FDG-PET brengt de weefselopname van FDG in beeld, een radioactief gelabeld glucose-analoog. Verhoogde opname van FDG-PET door tumoren ten opzichte van het omliggende weefsel is te wijten aan het Warburg-effect12,13. MRS toont gemeenschappelijke kernen van moleculen die worden gebruikt voor het metabolisme, zoals 13C en 31P, en kan dynamische informatie verkrijgen over hoe het metabolisme verandert als reactie op stimuli, zoals lichaamsbeweging of eten14. Hoewel FDG-PET en MRS klinisch kunnen worden gebruikt, missen deze technologieën de ruimtelijke resolutie om intratumorale heterogeniteit op te lossen. Evenzo worden metingen van het zuurstofverbruik uitgevoerd op een bulkpopulatie van cellen. Autofluorescentie beeldvorming overwint het ruimtelijke resolutie obstakel van deze technologieën en biedt een niet-invasieve methode voor het kwantificeren van cellulair metabolisme.

Figure 1
Figuur 1: NADH en FAD in gemeenschappelijke metabole routes. NADH en FAD zijn co-enzymen die worden gebruikt in glycolyse, de Krebs-cyclus en de elektronentransportketen. Autofluorescentie beeldvorming van deze moleculen geeft informatie over cellulair metabolisme. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Gereduceerd nicotinamide-adenine (fosfaat) dinucleotide (NAD (P)H) en geoxideerd flavine adenine dinucleotide (FAD) zijn co-enzymen van metabole reacties, waaronder glycolyse, oxidatieve fosforylering en glutaminolyse (figuur 1). Zowel NAD(P)H als FAD zijn autofluorescent en bieden endogene contrast voor fluorescentiebeeldvorming1,15. NADPH heeft vergelijkbare fluorescerende eigenschappen als NADH. Daarom wordt NAD(P)H vaak gebruikt om het gecombineerde signaal van NADH en NADPH2,16 weer te geven.

Fluorescence lifetime imaging (FLIM) kwantificeert de fluorescentielevensduur of de tijd waarvoor een fluorofoor zich in de aangeslagen toestand bevindt. Fluorescentielevensduur reageert op de micro-omgeving van de fluoroforen en geeft informatie over cellulair metabolisme17. NAD(P)H en FAD kunnen in cellen bestaan in eiwitgebonden of vrije conformaties, die elk een andere levensduur hebben. Vrije NAD(P)H heeft een kortere levensduur dan eiwitgebonden NAD(P)H; omgekeerd heeft vrije FAD een langere levensduur dan gebonden FAD18,19. De levensduur en het gewicht van de levensduurcomponenten kunnen worden gekwantificeerd op basis van gegevens over het levensduurverval van fluorescentie via Eq. (1)20:

I(t) = α 1e-t/τ1 + α 2e-t/τ2 + C (1)

Eq (1) vertegenwoordigt de genormaliseerde fluorescentie-intensiteit als functie van de tijd. De α 1 en α 2 in deze vergelijking vertegenwoordigen de proportionele componenten van korte en lange levensduur (respectievelijk α 1+ α 2=1), respectievelijk τ1 en τ2 vertegenwoordigen respectievelijk de korte en lange levensduur, en C is goed voor achtergrondlicht7,20. De amplitudegewogen levensduur, hier weergegeven als τm, wordt berekend met eq. (2).

τm= α 1τ1+ α 2τ2 (2)

Een gemiddelde levensduur kan worden berekend door het gemiddelde van "t" over het intensiteitsverval van de fluorofoor, wat voor een twee-exponentieel verval wordt aangetoond door Eq. (3)17,21.

τ*m= (α 1τ12+ α 2τ22)/ (α 1τ1+ α 2τ2) (3)

Een fluorescentie-intensiteitsbeeld kan worden berekend uit het levensduurbeeld door het fluorescentielevensverval te integreren. Autofluorescentie beeldvorming is een niet-destructieve en labelvrije methode die kan worden gebruikt om het metabolisme van levende cellen met een subcellulaire resolutie te karakteriseren. De optische redoxverhouding biedt een optische analoge metriek van de chemische redoxtoestand van de cel en wordt berekend als de verhouding van NAD(P)H- en FAD-intensiteiten. Hoewel de formule voor het berekenen van de optische redoxverhouding niet gestandaardiseerd is22,23,24,25, wordt deze hier gedefinieerd als de intensiteit van FAD over de gecombineerde intensiteiten van NAD(P)H en FAD. Deze definitie wordt gebruikt omdat de opgetelde intensiteit in de noemer de metriek tussen 0 en 1 normaliseert, en het verwachte resultaat van de cyanideremming een afname van de redoxverhouding is. De fluorescentielevensduur van vrije NAD(P)H en FAD geeft inzicht in veranderingen in de micro-omgeving van het metabole oplosmiddel, waaronder pH, temperatuur, nabijheid van zuurstof en osmolariteit17.

Veranderingen in de fluorescentielevensduur van de gebonden fracties van NAD(P)H en FAD kunnen wijzen op het gebruik van metabole routes en substraatspecifiek metabolisme26. Componentgewichten kunnen worden geïnterpreteerd voor veranderingen in de vrije tot de gebonden fractie van de co-enzymen18,19. Al met al maken deze kwantitatieve autofluorescentielevensduurmetingen de analyse van cellulair metabolisme mogelijk, en autofluorescentiebeeldvorming is gebruikt voor het identificeren van neoplasmata uit normale weefsels27,28, het karakteriseren van stamcellen29,30, het evalueren van de immuuncelfunctie31,32,33,34,35, het meten van neurologische activiteit36, 37,38, en inzicht in de werkzaamheid van geneesmiddelen bij kankersoorten zoals borstkanker en hoofd-halskanker21,39,40,41,42. Hoge-resolutie autofluorescentie beeldvorming kan worden gecombineerd met beeldsegmentatie voor eencellige analyse en kwantificering van intrapopulatie heterogeniteit43,44,45,46,47.

NAD(P)H en FAD kunnen worden afgebeeld op fluorescentiemicroscopen met één foton of multifotonen die zijn geconfigureerd voor intensiteits- of levenslange beeldvorming. Voor microscopen met één foton worden NAD(P)H en FAD meestal geëxciteerd op golflengten van respectievelijk 375-405 nm en 488 nm, als gevolg van gemeenschappelijke laserbronnen op deze golflengten48. Bij fluorescentie-excitatie van twee fotonen zullen NAD(P)H en FAD exciteren op golflengten van respectievelijk ongeveer 700 tot 750 nm en 700 tot 900 nm, 15,49. Zodra de fluoroforen zijn geëxciteerd, zenden NAD(P)H en FAD fotonen uit op golflengten tussen respectievelijk ~410 nm tot ~490 nm en ~510 nm tot ~640 nm15. De NAD(P)H en FAD maxima emissie golflengten zijn respectievelijk ongeveer 450 nm en 535 nm48.

Vanwege hun verschillende excitatie- en emissiegolflengten kan de fluorescentie van de twee metabole co-enzymen spectraal worden geïsoleerd. Een goed begrip van de spectrale kenmerken van NAD(P)H en FAD is noodzakelijk voor het ontwerp en de optimalisatie van autofluorescentie beeldvormingsprotocollen. Cyanide is een elektronentransportketen (ETC) complexe IV-remmer. De effecten van cyanide op het cellulair metabolisme en de autofluorescentie-intensiteiten en levensduur van NAD(P)H en FAD in cellen worden goed gekarakteriseerd27,40. Daarom is een cyanide perturbatie-experiment een effectief middel om NAD(P)H- en FAD-beeldvormingsprotocollen te valideren. Een succesvol cyanide-experiment geeft vertrouwen dat het NAD(P)H- en FAD-beeldvormingsprotocol kan worden gebruikt om het metabolisme van onbekende groepen of verstoringen te beoordelen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cell plating voor beeldvorming

  1. Zuig het medium op uit een 80-90% confluent T-75 kolf van MCF-7 cellen, spoel de cellen met 10 ml steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en voeg 2 ml 0,25% trypsine (1x) toe om de cellen los te maken van de kolfbodem.
  2. Incubeer de kolf bij 37 °C gedurende ~4 min. Controleer de cellen onder de microscoop om de onthechting te bevestigen.
  3. Voeg onmiddellijk 8 ml kweekmedium toe om de trypsine te deactiveren.
  4. Verzamel de cellen in een conische buis (15 ml of 50 ml). Tel de cellen met behulp van een hemocytometer.
  5. Centrifugeer de cellen 200 × g gedurende 5 minuten.
  6. Eenmaal gecentrifugeerd, aspirateer je het supernatant. Resuspend de pellet van cellen in 1 ml kweekmedium en zaai 4 × 105 cellen op een beeldschaal met glazen bodem van 35 mm (of de juiste monsterhouder voor de microscoop die wordt gebruikt).
  7. Voeg 2 ml kweekmedium toe aan de beeldvormingsschaal om het celmetabolisme te behouden.
  8. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 24-48 uur voorafgaand aan beeldvorming zodat de cellen zich hechten en de logaritmische groeifase bereiken.
    OPMERKING: De groeifase werd bepaald door eerdere ervaring met deze cellen en bevestigd met de cel datasheet.

2. Multifoton FLIM-beeldvorming van NAD (P) H en FAD

  1. Schakel alle componenten van de multifotonenfluorescentielevensmicroscoop in, inclusief de microscoop, de laserbron en de detectoren die worden gebruikt.
  2. Voorbeeld plaatsing
    1. Zet de brightfield-lamp aan. Zorg ervoor dat er licht in het oculair gaat. Kies een objectief, meestal 20x, 40x of 100x voor celbeeldvorming. Breng 1 druppel van het juiste onderdompelingsmedium aan op het doel [overslaan als u een luchtdoel gebruikt].
    2. Verplaats het doel naar beneden om het monster op de juiste manier te plaatsen zonder het doel aan te raken. Plaats de schaal met glazen bodem op de monsterhouder op het microscooppodium. Zorg ervoor dat het monster veilig is en niet beweegt tijdens het afbeelden.
    3. Centreer het monster met het doel met behulp van de X-Y-fasebesturing. Zodra dit is gebeurd, kijkt u in het oculair en verplaatst u het objectief naar boven om u op de cellen te concentreren.
    4. Als de microscoop zich in een behuizing bevindt, sluit u de deur van de lightbox. Open de beeldacquisitiesoftware, klik op het tabblad Multiphoton Imaging en stel de volgende multifoton-beeldparameters in: afbeeldingsgrootte = 256 x 256 pixels; pixel verblijftijd = 4-25 μs; totale beeldacquisitietijd = ~60 s; geoptimaliseerde detectorversterking voor het tellen van enkele fotonen = 85% (specifiek voor het gebruikte systeem).
  3. Imaging of Instrument Response Function (IRF) en fluorescentie levenslange standaard
    1. Plaats ureumkristallen op een schaal met glazen bodem en zet het deksel van de schotel vast met tape of parafilm.
      OPMERKING: Ureumkristallen blijven maandenlang stabiel bij kamertemperatuur.
    2. Stel je de ureumkristallen voor.
      1. Plaats de ureumschaal op het microscooppodium en richt u op een ureumkristal.
      2. Stel de golflengte van de excitatielaser in op 900 nm.
      3. Gebruik een emissiefilter dat golflengten van 450 nm opvangt.
      4. Verkrijg een fluorescentielevensduurbeeld van het ureumkristal met laservermogen bij het monster < 1 mW en gebruik de aanbevolen beeldparameters die zijn vermeld in stap 2.2.4.
    3. Stel je de geelgroene (YG) kralen voor als een standaard voor de levensduur van fluorescentie.
      1. Maak een YG-kraalschuif door de YG-kraaloplossing 1:1.000 in steriel water te verdunnen. Plaats een klein volume (~ 30 μL) op een schuif of een schaal met glazen bodem. Dek af met een coverslip en sluit de randen van de coverslip af met doorzichtige nagellak.
      2. Plaats de YG-kraalglaasjes op het microscooppodium met de coverslipzijde van de dia naar het objectief toe.
      3. Stel de golflengte van de excitatielaser in op 890 nm
      4. Gebruik een emissiefilter dat golflengten van ~500-600 nm opvangt.
      5. Verkrijg een fluorescentielevensduurbeeld van de YG-kraal met behulp van een laservermogen bij het monster <1 mW en de aanbevolen beeldparameters [stap 2.2.4].
      6. Controleer de levensduur van de kraal met behulp van de IRF van het ureum. Als de levensduur niet ~2,1 ns is, controleer dan of de kraal in contact staat met een andere kraal die bijdraagt aan het blussen van fluorescentie, de kraaloplossing is opgedroogd, de kraal onscherp is, IRF niet nauwkeurig is of de verschuiving tussen IRF en fluorescentieverval niet is geoptimaliseerd [zie stap 4.2.4].
        OPMERKING: De levensduur van ~ 2,1 ns is stabiel in de tijd.
  4. NAD(P)H beeldvorming
    1. Plaats de glazen schaal met de cellen op het microscoopstadium en concentreer je op de cellen.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen dat de cellen in een omgevingskamer worden geplaatst om warmte, vochtigheid en CO2-niveaus te handhaven tijdens beeldacquisitie, omdat deze parameters het cellulaire metabolisme kunnen beïnvloeden.
    2. Stel de versterking van de detector in op de optimale waarde voor FLIM. Wijzig bovendien de gewenste verblijftijd - een parameter die de tijd aangeeft die de laser doorbrengt bij elke pixel van het monster.
      OPMERKING: Deze parameters moeten gedurende de rest van de procedure HETZELFDE blijven. Dit is om consistentie in laserverlichting en detectorinstellingen te garanderen om de geldigheid van de op intensiteit gebaseerde metingen te garanderen, die afhankelijk zijn van laservermogen, scanparameters en detectorversterking. Er is een geoptimaliseerde detectorversterking voor het bedienen van detectoren in de telmodus voor één foton; de waarde is 85% voor het systeem waarnaar wordt verwezen.
    3. Stel de multifotonenlaser in op 750 nm. Zorg ervoor dat de stroomregeling voor de laser in eerste instantie op nul is ingesteld, zodat de cellen niet worden beschadigd bij het openen van de sluiter op de laser.
      OPMERKING: Excitatie bij 750 nm wordt aanbevolen voor NAD(P)H, hoewel het een brede absorptie heeft bij 700-750 nm. Excitatie bij 890 nm wordt aanbevolen voor FAD, hoewel het een brede absorptie heeft bij 700-900 nm.
    4. Stel een emissiefilter in of selecteer om emissiegolflengten op ~ 400-500 nm te verzamelen.
    5. Begin met het maken van beelden op een focus - of liveweergave-manier om de beeldinstellingen te optimaliseren.
      OPMERKING: De laser werkt nu. Open de microscoopbehuizing op dit punt niet. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.
    6. Verhoog langzaam het laservermogen tot ~ 3-8 mW bij het monster en zorg er tegelijkertijd voor dat de cellen scherp zijn. Eenmaal aangepast, registreert u het maximale gebruikte vermogen. Gebruik deze energie-instelling voor de beeldvorming op andere segmenten van de petrischaal voor NAD(P)H-beeldvorming.
      OPMERKING: Het is belangrijk om het laservermogen bij het monster of een pick-off venster te meten en niet te vertrouwen op de pockels celspanning omdat de pockels cellen niet stabiel zijn. Vaak wordt het laservermogen tijdens het beeld met een pick-off venster bewaakt in plaats van bij het monster. Met behulp van een tweede vermogensmeter bij het objectief kan de relatie tussen het vermogen bij het pick-off-venster en het vermogen bij het monster worden gebruikt om het geschatte vermogen bij het monster te schatten op basis van de metingen van het pick-offvenster.
    7. Verzamel een NAD(P)H FLIM-afbeelding met een beeldintegratietijd van 60 s.
    8. Controleer of het beeld voldoende fotonen heeft (piek van ~100 fotonen voor een cytoplasmapixel) binnen de fluorescentielevensvervalcurve. Als het aantal fotonen te laag is, verhoogt u het laservermogen of de duur van de beeldacquisitie.
      OPMERKING: Het minimale piekaantal fotonen binnen het exponentiële verval van de fluorescentie is afhankelijk van systeemparameters, waaronder temporele resolutie, IRF en achtergrondruis.
  5. FAD-beeldvorming
    1. Stel de multifotonenlaser in op 890 nm en wacht tot deze in de modus vergrendelt op de nieuwe golflengte. Zorg ervoor dat de stroomregeling voor de laser in eerste instantie op nul is ingesteld, zodat de cellen niet worden beschadigd bij het openen van de sluiter op de laser.
      OPMERKING: Verplaats het podium of de objectieve focus niet bij het uitvoeren van deze stap. Het FAD-gezichtsveld (FOV) moet voor deze afbeelding rechtstreeks overeenkomen met NAD(P)H FOV.
    2. Stel een emissiefilter in of selecteer om emissiegolflengten op ~ 500-600 nm te verzamelen.
    3. Begin met het maken van beelden op een focus - of liveweergave-manier om de beeldinstellingen te optimaliseren.
      OPMERKING: De laser werkt nu. Open de microscoopbehuizing op dit punt niet.
    4. Verhoog langzaam het laservermogen tot ~ 5-10 mW bij het monster en noteer het maximaal gebruikte vermogen. Gebruik dit als de energie-instelling voor de beeldvorming op andere segmenten van de petrischaal voor FAD-beeldvorming.
    5. Verzamel een FAD FLIM-afbeelding met een beeldintegratietijd van 60 s.
    6. Controleer of het beeld voldoende fotonen heeft (piek van ~100 fotonen voor een cytoplasmapixel) binnen de fluorescentielevensvervalcurve. Als het aantal fotonen te laag is, verhoogt u het laservermogen of de duur van de beeldacquisitie.
      OPMERKING: Het minimale piekaantal fotonen binnen het exponentiële verval van de fluorescentie is afhankelijk van systeemparameters, waaronder temporele resolutie, IRF en achtergrondruis.
  6. Herhaal stap 2.4-2.5 met nog eens vier tot vijf FOV's. Zorg ervoor dat elke afbeelding ten minste 2 FOV's verwijderd is van de afgebeelde locaties.

3. Voorbereiding van cyanide-experimenten

  1. Los 130,24 mg natriumcyanide op in 25 ml PBS om een natriumcyanideoplossing van 80 mM (20x) te maken.
    OPMERKING: Cyanide is giftig. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.
  2. Zuig 100 μL kweekmedium uit het gerecht. Vervang dit door 100 μL natriumcyanideoplossing om een cyanideconcentratie van 4 mM in de schaal te verkrijgen.
  3. Plaats de cellen gedurende 5 minuten in een incubator om de cellen te laten reageren met de cyanide-oplossing.
  4. Herhaal stap 2.4-2.6 om NAD(P)H- en FAD-beelden van de cellen te verkrijgen na blootstelling aan cyanide.
    OPMERKING: Langdurige blootstelling aan cyanide zal de cellen doden. Postcyanidebeelden worden verkregen binnen 30 minuten na de cyanidetoevoeging.

4. FLIM beeldanalyse

  1. Open de FLIM-software voor levensduuranalyse.
    1. Open het ureumbeeld om de gemeten IRF te verkrijgen.
    2. Importeer de ureumafbeelding. Selecteer een punt op de afbeelding van het ureumkristal dat moet worden gebruikt voor beeldanalyse. Verhoog de ruimtelijke bin-waarde om FLIM-gegevens van meerdere pixels te integreren in 1 of hoger voor een vervalpiek > 100 fotonen door de bin-variabele op de hoofdsoftware-interface te wijzigen.
    3. Sla de gegevens op als een IRF.
      1. Klik in de software waarnaar wordt verwezen op het vervolgkeuzemenu met de titel IRF en selecteer Kopiëren uit vervalgegevens. Klik hierna op Kopiëren naar klembord om te worden gebruikt in de afbeeldingsanalyse van de afbeelding die tijdens het experiment is gemaakt.
  2. Beeldanalyse van NAD(P)H en FAD lifetime images
    1. Importeer het afbeeldingsbestand in de software voor de levensduuranalyse van fluorescentie.
    2. Verbeter de beeldvisualisatie om de cellen en subcellulaire compartimenten te zien door indien nodig de intensiteit en het contrast te wijzigen.
      1. Klik op het vervolgkeuzemenu Opties en selecteer Intensiteit. Wijzig hier de intensiteit en het contrast naar wens en klik op OK.
    3. Importeer de IRF uit de ureumafbeelding.
      1. Klik op het vervolgkeuzemenu IRF en selecteer Plakken vanaf klembord.
    4. Stel multiexponentiële vervalparameters in50.
      1. Stel een drempelwaarde in om verval voor cytoplasmapixels te evalueren.
        OPMERKING: Hier werd een waarde van 50 gebruikt. De waarde werd geselecteerd door de fluorescentiepiekwaarden van verschillende representatieve achtergrond- en kernpixels te vergelijken met de piekwaarde van verschillende cytoplasmapixels. Voor de drempel is een waarde tussen de nucleuspixels en cytoplasmapixels geselecteerd.
    5. Controleer of de Shift-waarde de IRF uitlijnt ten opzichte van de oplopende rand van de fluorescentie. Pas de verschuiving indien nodig aan op een waarde die de Chi-kwadraatwaarde minimaliseert.
    6. Verhoog de ruimtelijke bin zodat cytoplasmapixels fluorescentiepiekwaarden hebben op of boven 100.
      OPMERKING: Het verhogen van de ruimtelijke bak zal leiden tot een verminderde ruimtelijke resolutie.
    7. Bereken de levensduur van fluorescentie voor alle pixels in de afbeelding.
      1. Klik in het programma waarnaar wordt verwezen op het vervolgkeuzemenu Berekenen | Verval matrix.
        OPMERKING: Succes wordt aangegeven met een afbeelding die vals gekleurd is voor de amplitudegewogen fluorescentielevensduur.
    8. Bewaar de gegevens over de levensduur van de fluorescentie.
      1. Klik op het vervolgkeuzemenu Bestand | Exporteren. Kies de gewenste parameters voor analyse en klik op OK. Sla de afbeelding op.
      2. Selecteer de knop Kleur in het vervolgkeuzemenu Opties om de weergegeven fluorescentielevensduurmetriek aan te passen, de kleurconfiguratie naar B-G-R en stel de specifieke minimum- en maximumwaarden van de kleurenbalk in om de kleurschaal van de fluorescentielevensduurafbeelding aan te passen.

Figure 2
Figuur 2: Gemeten IRF van ureumkristal. (A) Intensiteitsbeeld verkregen uit het ureum. Een representatieve pixel werd gekozen om de IRF-vervalcurve (B) te maken voor latere analyse van fluorescentielevensbeelden van cellen. Afkorting: IRF = instrument response functie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Celsegmentatie
    OPMERKING: Het hier beschreven protocol maakt gebruik van een beeldanalysesoftware51. Representatieve MCF-7-afbeeldingen en gegevensanalysecode worden verstrekt52.
    1. Download het bestand MCF7_Segmentation_Final.cpproj52.
    2. Importeer de MCF7_Segmentation Pipeline door op Bestand | | importeren Pijplijn uit bestand, selecteer het bestand MCF7_Segmentation_Final.cpproj.
    3. Klik op de module Afbeeldingen en voeg de NAD(P)H-intensiteitsafbeeldingen toe die u wilt segmenteren.
      OPMERKING: Afbeeldingen moeten de indeling .tif, .png of .jpg hebben.
    4. Druk op de knop Afbeeldingen analyseren linksonder.
      OPMERKING: Pipeline moet mogelijk worden geoptimaliseerd voor afbeeldingen die op verschillende systemen zijn verkregen. Probeer de volgende substappen voor het oplossen van problemen
      1. De testmodus gebruiken voor het testen van verschillende parameters: Klik op Testmodus starten en voer elke module uit door op de afspeelknop naast de modulenaam te klikken.
      2. Klik op de eerste module IdentificeerPrimaryObjecten en pas de standaarddiameter van objecten in pixeleenheden (Min, Max) aan om overeen te komen met de diameter van de cellen.
        OPMERKING: Voor MCF-7-cellen werden respectievelijk 10 en 40 pixels gebruikt voor het minimum en het maximum.
      3. Klik op de module EnhanceOrSuppressFeatures en pas de grootte van de functie aan om de identificatie van het geselecteerde objecttype te verbeteren.
        OPMERKING: Er is een objectgrootte van 10 pixels gebruikt voor MCF-7-cellen.
      4. Klik op de tweede EnhanceOrSuppressFeatures-module en pas het bereik van gatgroottes aan om de verbetering van de nucleaire regio's te optimaliseren.
        OPMERKING: Een bereik van 5-20 werd gebruikt voor MCF-7 cellen.
      5. Klik op de tweede module IdentifyPrimaryObjects en pas de parameters (Threshold strategy, Thresholding method, Threshold smoothing scale en Threshold correction factor) aan om de identificatie van kernen te optimaliseren. Klik op de parameter ? by each parameter om optimale instellingen te identificeren en toe te passen op de module IdentifySecondaryObjects .
      6. Klik op de module FilterObjects en pas de gebiedsvorm aan. Selecteer een minimale en maximale pixel van de te identificeren gebiedsvorm.
        OPMERKING: Voor de MCF-7-cellen werden respectievelijk 100 en 500 gebruikt voor het maximum en het minimum. Het proces van celsegmentatie door het identificeren van de kern en propagatie naar de celgrenzen wordt in detail uitgelegd door Walsh en Skala47.
    5. Met behulp van de celcytoplasmamaskers, gemiddelde van de fluorescentielevensduur outputvariabelen voor elke cel in het beeld.

Figure 3
Figuur 3: Identificatie en segmentatie van individuele cellen. Het NAD(P)H intensiteitsbeeld van MCF7-cellen (A) verkregen door integratie van een fluorescentielevensbeeld. Cellen werden in beeld gebracht met behulp van 750 nm excitatie bij 5 mW gedurende 60 s. De x- en y-as vertegenwoordigen de pixellocatie van de afbeelding. (A) Individuele cellen werden geïdentificeerd. De cellen werden gemaskeerd (B) om achtergrondgeluiden uit de dataset te verwijderen. De kern werd vervolgens geïdentificeerd (C) en geprojecteerd op het celmasker (D). De cellen werden vervolgens gefilterd (E) om gemaskeerde gebieden te verwijderen die niet passen bij de grootte van typische cellen. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Alternatieve methode: Beeldvorming van fluorescentie-intensiteit

  1. Schakel de apparatuur in die tijdens het experiment zal worden gebruikt.
    OPMERKING: Fluorescentie-intensiteitsbeelden kunnen worden verkregen met breedveldfluorescentiemicroscopen, confocale fluorescentiemicroscopen of multifotonenmicroscopen.
    1. Zorg ervoor dat de te gebruiken microscoop een geschikte excitatiebron heeft voor NAD(P)H (single-photon golflengte ~370-405 nm: twee-foton golflengte ~700-750 nm) en FAD (single-photon golflengte ~488 nm, twee-foton golflengte ~890 nm).
    2. Zorg ervoor dat de microscoop een filter heeft voor de isolatie van NAD(P)H-emissie (~400-500 nm).
      OPMERKING: 4',6-Diamidino-2-fenylindool (DAPI) instellingen werken vaak voor NAD(P)H.
    3. Zorg ervoor dat de microscoop een filter heeft voor isolatie van FAD-emissie (~ 500-600 nm).
      OPMERKING: Green fluorescent protein (GFP) instellingen werken vaak voor FAD.
  2. Bereid de microscoop voor.
    1. Zet de brightfield-lamp aan. Zorg ervoor dat er licht in het oculair gaat. Breng indien nodig 1 druppel van het juiste onderdompelingsmedium aan op het overeenkomstige doel.
    2. Beweeg het objectief naar beneden om de monsters op de juiste manier te plaatsen zonder enige interferentie. Plaats de petrischaal op de juiste manier op het podium. Zorg ervoor dat het monster veilig is en niet beweegt tijdens het afbeelden.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen dat de cellen in een omgevingskamer worden geplaatst om warmte, vochtigheid en CO2-niveaus te handhaven tijdens beeldacquisitie, omdat deze parameters het cellulaire metabolisme kunnen beïnvloeden.
    3. Centreer het monster met het doel. Zodra dit is gebeurd, kijkt u in het oculair en beweegt u het doel totdat de cellen scherp lijken te zijn.
  3. Begin met intensiteitsbeeldvorming.
    1. Open de beeldvormingssoftware en stel de excitatie- en emissieconfiguratie in om NAD(P)H vast te leggen door op het tabblad Vastleggen in de beeldacquisitiesoftware te klikken en het NAD(P)H-excitatie- en emissiefilter in de microscooptoren te plaatsen.
      OPMERKING: Een 357/44 excitatiefilter, 409 longpass dichroic en 447/60 emissiefilter werden gebruikt voor NAD(P)H beeldvorming.
    2. Optimaliseer de excitatieverlichting en detectorparameters. Als bleken een probleem is, verlaagt u de verlichtingsintensiteit en verhoogt u de beeldintegratietijd.
      OPMERKING: NAD (P) H is een zwak signaal; wees je bewust van bleken als er te veel stroom wordt gebruikt.
    3. Verkrijg een NAD(P)H-afbeelding met de gewenste afbeeldingsgrootte. Zorg ervoor dat de afbeelding is opgeslagen.
    4. Stel de excitatie- en emissieconfiguratie in om FAD op te vangen. Optimaliseer de excitatieverlichting en detectorparameters.
      OPMERKING: Een 458/64 excitatiefilter, 495 longpass dichroic en 550/88 emissiefilter werden gebruikt voor FAD-beeldvorming.
    5. Verkrijg een FAD-afbeelding. Zorg ervoor dat de afbeelding is opgeslagen.
      OPMERKING: NAD(P)H- en FAD-beeldacquisitieparameters (verlichtingsintensiteit, beeldgrootte, detectorversterking) moeten gedurende het hele beeldvormingsexperiment hetzelfde blijven.
    6. Herhaal het proces op nog eens vijf locaties, met een afstand van ten minste 2 FOV's van de afgebeelde locaties.
  4. Data-analyse van redoxratio's op afbeeldingsniveau
    1. Open de NAD(P)H- en FAD-intensiteitsbeelden in een beeldverwerkingsprogramma.
    2. Stel een drempel in op de NAD(P)H om cytoplasmapixels te behouden en stel achtergrond- en kernpixels in op 0.
    3. Bereken de afbeelding met de redoxverhouding door de vergelijking FAD/(NAD(P)H+FAD) bij elke pixel te evalueren met behulp van de gedrempelde NAD(P)H-afbeelding.
    4. Bereken de gemiddelde waarde van de niet-0 pixels.
      OPMERKING: Deze stappen kunnen worden uitgevoerd in beeldanalysesoftware of rechtstreeks worden gecodeerd met scripts.
  5. Analyse van de redoxverhouding op celniveau
    1. Volg de stappen 4.3.1-4.3.5 om een maskerafbeelding van de cellen in elke NAD(P)H-afbeelding te verkrijgen.
    2. Bereken de afbeelding met de redoxverhouding door de vergelijking FAD/(NAD(P)H+FAD) bij elke pixel te evalueren.
    3. Gebruik het celcytoplasmamasker om de redoxverhouding voor alle pixels voor elke cel in de afbeelding te gemiddelden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De epitheliale borstkanker cellijn, MCF-7, werd gekweekt in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine. Voor fluorescentiebeeldvorming werden de cellen gezaaid met een dichtheid van 4 × 105 cellen per 35 mm glazen bodembeeldschotel 48 uur vóór beeldvorming. De cellen werden voor en na de behandeling met cyanide in beeld gebracht met behulp van de hierboven vermelde protocollen. Het doel van het cyanide-experiment is om spectrale isolatie van NAD(P)H- en FAD-fluorescentie te bevestigen en het beeldvormingssysteem en analyseprotocol voor het detecteren van metabole veranderingen in cellen te valideren. Gepaarde NAD(P)H en FAD fluorescentielevensfoto's werden genomen op vijf verschillende locaties vóór cyanide en vijf verschillende locaties na de toevoeging van cyanide aan het medium. De parameters voor de levensduur van fluorescentie (optische redoxverhouding, NAD(P)H α 1, NAD(P)H τ1, NAD(P)H τ2, NAD(P)H τm, FAD τ1, FAD τ2, FAD α 1, FAD τ1, FAD τ2 en FAD τm) werden berekend met behulp van de gemeten IRF uit ureum (figuur 2) en gemiddeld over de pixels van het cytoplasma van elke cel die voor segmentatie werd gebruikt (figuur 3).

Multifoton fluorescentie lifetime imaging van NAD(P)H en FAD maakt visualisatie van celmorfologie en metabolisme mogelijk (figuur 4). De hoge resolutie bereikt met multifotonenmicroscopie maakt de identificatie van afzonderlijke cellen mogelijk. NAD(P)H en FAD bevinden zich voornamelijk in de mitochondriën en het cytoplasma, terwijl de kern, die metabole NAD(P)H en FAD mist, in vergelijking donker is23,53. De lifetime beelden bieden visualisatie van de amplitude-gewogen levensduur van NAD(P)H en FAD in de hele cel en als gevolg van cyanideblootstelling (figuur 4).

Figure 4
Figuur 4: Representatieve fluorescentielevensbeelden van MCF7-cellen voor en na cyanidebehandeling. (A) NAD(P)H-amplitudegewogen fluorescentielevensbeeld en (B) FAD-amplitudegewogen fluorescentielevensduurbeeld vóór cyanidebehandeling. (C) NAD(P)H amplitude-gewogen fluorescentie lifetime image en (D) FAD amplitude-gewogen fluorescentie lifetime image na cyanidebehandeling. De amplitudegewogen fluorescentielevensduur (aangegeven door de kleurenbalk) meet de tijd waarin een fluorofoor, in deze gevallen NAD(P)H en FAD, zich in een aangeslagen toestand bevindt. Nad(P)H-levensduur neemt af met cyanidebehandeling, terwijl de levensduur van DE FAD toeneemt na behandeling met cyanide. Het NADH-signaal werd in beeld gebracht met behulp van 750 nm excitatie bij 5 mW gedurende 60 s, en het FAD-signaal werd in beeld gebracht met behulp van 890 nm excitatie bij 7 mW gedurende 60 s. Beelden verkregen met een 40x water-immersie objectief, numeriek diafragma = 1.1. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Cyanide remt complex IV van de elektronentransportketen, dat oxidatieve fosforylering remt2,15. Na blootstelling aan cyanide en voorafgaand aan celdood hoopt NAD(P)H zich op in de mitochondriën en neemt de FAD af1,15. Vanwege deze goed gedefinieerde veranderingen in NAD(P)H- en FAD-intensiteit als gevolg van cyanideremming van het metabolisme, is de verstoring een standaardtest om autofluorescentiebeeldvorming en analyseprotocollen te verifiëren2,54. Zoals verwacht nam de optische redoxverhouding (FAD/(FAD+NAD(P)H)) van MCF-7-cellen af na behandeling met cyanide (figuur 5, p = 0,044, t-test van Welch). De optische redoxverhouding is geen gestandaardiseerde formule, maar van alle intensiteitsformules is aangetoond dat ze gelijkwaardig zijn20. FAD/(NAD(P)H+FAD) werd gekozen om de optische redoxverhouding te definiëren omdat de gecombineerde som van NAD(P)H en FAD in de noemer een genormaliseerde waarde tussen 0 en 120,55 oplevert. Het tegenovergestelde effect - een toename van de optische redoxverhouding - wordt verwacht voor cyanideverstoringen met optische redoxverhoudingen berekend met NAD(P)H in de teller.

Figure 5
Figuur 5: Optische redoxverhouding van MCF7-cellen neemt af met cyanidebehandeling. De boxplots tonen de mediaan en het eerste en derde kwartiel berekend op basis van de celgegevens. Het gemiddelde wordt weergegeven door het symbool met de zwarte stip en de mediaan wordt weergegeven door de zwarte lijn in het vak. De grijze gegevenspunten op elke boxplot vertegenwoordigen de gemiddelde waarde van alle cytoplasmapixels in elke cel. De controlegroep bestond uit 91 cellen uit vijf verschillende beelden en de cyanidegroep uit 95 cellen uit vijf verschillende beelden. p < 0,01, de t-test van Welch. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De amplitudegewogen NAD(P)H-levensduur (τm) van MCF7-cellen nam af met blootstelling aan cyanide (figuur 6A, p < 2,2 × 10-16, de t-test van Welch). Zowel de korte als de lange levensduur daalden voor NAD(P)H (figuur 6B,C), maar namen toe voor NAD(P)H α 1 (figuur 6D). Deze veranderingen in NAD(P)H-fluorescentielevensduur, afname van τm, toename van α 1 en afname van τ2 kwamen overeen met gepubliceerde waarden van cyanideverstoringen40,56. De afname van de levensduur van nad(p)h-amplitude met fluorescentie bij blootstelling aan cyanide duidt op een verhoogde doving in de micro-omgeving van NAD(P)H. Een toename van α 1 duidt op meer vrije NAD(P)H, zoals verwacht van de toename van NAD(P)H als gevolg van de effecten van cyanide op het cellulair metabolisme21.

Figure 6
Figuur 6: NAD(P)H-fluorescentielevensduur van MCF7-cellen voor en na behandeling met cyanide. De boxplots in panelen A-D tonen de mediaan en het eerste en derde kwartiel berekend op basis van de gegevens op celniveau. Het gemiddelde wordt weergegeven door het symbool met de zwarte stip en de mediaan wordt weergegeven door de zwarte lijn in het vak. De grijze gegevenspunten die op elke boxplot zijn gelegd, vertegenwoordigen de gemiddelde waarde van alle cytoplasmapixels in een cel. De controlegroep bestond uit 91 cellen uit vijf verschillende beelden en de cyanidegroep uit 95 cellen uit vijf verschillende beelden. (A-D) vertonen de veranderingen in NAD(P)H-amplitudegewogen levensduur (τm), NAD(P)H korte levensduur (τ1), NAD(P)H lange levensduur (τ2) en NAD(P)H-proportionele component van de korte levensduur (α 1) als gevolg van cyanidebehandeling. p-waarden werden berekend met behulp van de t-test van Welch. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De amplitudegewogen FAD-levensduur (τm) van MCF7-cellen nam toe na blootstelling aan cyanide (figuur 7A, p = 3,688 × 10-12, de t-test van Welch). Zowel de korte als de lange levensduur namen toe voor FAD (figuur 7B,C), maar daalden voor FAD α 1 (figuur 7D). Veranderingen in de levensduur van FAD-fluorescentie, een toename van τm en τ2 en een afname van α 1 zijn consistent met gepubliceerde FAD-fluorescentielevensduurgegevens van cyanide-verstoring57. De verandering in levensduurwaarden en α 1 suggereren metabole veranderingen in de cellen, waaronder een verhoogde hoeveelheid vrije FAD21.

Figure 7
Figuur 7: Levensduur van FAD-fluorescentie voor en na behandeling met cyanide. De boxplots in A-D tonen de mediaan, het eerste en derde kwartiel, en het gemiddelde berekend op basis van de gegevens op celniveau. Het gemiddelde wordt weergegeven door het symbool met de zwarte stip en de mediaan wordt weergegeven door de zwarte lijn in het vak. De grijze gegevenspunten die op elke boxplot zijn gelegd, vertegenwoordigen de gemiddelde waarde van alle cytoplasmapixels in een cel. De controlegroep bestond uit 91 cellen uit vijf verschillende beelden en de cyanidegroep uit 95 cellen uit vijf verschillende beelden. (A-D) vertonen de veranderingen in de naar FAD-amplitude gewogen levensduur (τm), FAD korte levensduur (τ1), FAD lange levensduur (τ2) en FAD-proportionele component van de korte levensduur (α 1) van cyanidebehandeling. p-waarden werden berekend met behulp van de t-test van Welch. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Autofluorescentie-intensiteit en levenslange beeldvorming zijn op grote schaal gebruikt om het metabolisme in cellen te beoordelen21,55. FLIM heeft een hoge resolutie en lost daarom afzonderlijke cellen op, wat belangrijk is voor kankerstudies omdat cellulaire heterogeniteit bijdraagt aan tumoragressie en medicijnresistentie7,39,41,44,45,46,58. Evenzo is autofluorescentiebeeldvorming van cellulair metabolisme nuttig voor het afbeelden van immuuncellen, aangezien de immuuncelfunctie is gekoppeld aan cellulair metabolisme en immuuncelpopulaties vaak heterogeen zijn20,31. Standaard biochemische assays evalueren meestal immuuncellen op populatieniveau of vereisen intracellulaire etikettering na celpermeabilisatie34,59,60. Autofluorescentie beeldvorming is ook zeer geschikt voor hoge resolutie in vivo en dynamische metingen van het metabolisme vanwege de niet-destructieve aard van licht en het ontbreken van chemische of genetisch gecodeerde labels36,37,38,41,48,55 . Kritieke stappen voor het afbeelden van NAD(P)H- en FAD-fluorescentie-intensiteit en -levensduur omvatten de selectie van geschikte golflengten voor excitatie en emissie, verificatie dat de cellen geen synthetische of extra endogene fluoroforen bevatten die overlappende fluorescentie zullen bijdragen, en het gebruik van niet-absorberende laserkrachten.

Autofluorescentie beeldvorming van NAD(P)H en FAD vult een unieke niche als een labelvrije, hoge resolutie, kwantitatieve metabole beeldvormingstechnologie. Andere beeldvormingsmethoden, zoals FDG-PET en MRS, beelden weefselmetabolisme af, maar missen resolutie op cellulair niveau en kunnen dus de cellulaire heterogeniteit niet evalueren. Andere biochemische technieken, zoals zuurstofverbruikstests, metingen van metabolieten in de media of eiwitanalyse, vereisen dure reagentia voor eenmalig gebruik, verkrijgen metingen van gepoolde cellen en vereisen celdestructieve protocollen, waardoor tijdsverloopstudies of in vivo analyse61,62 worden voorkomen.

Hoewel autofluorescentiebeeldvorming van NAD(P)H en FAD beelden met een hoge resolutie biedt op een labelvrije en niet-destructieve manier, moeten enkele beperkingen van autofluorescentiebeeldvorming in overweging worden genomen bij het ontwerpen en interpreteren van experimenten. FLIM vereist gespecialiseerde en dure apparatuur die niet overal verkrijgbaar is. De FLIM-excitatie vereist een gepulseerde excitatiebron met picoseconde- of femtosecondepulsen met een herhalingssnelheid tussen 40 en 100 MHz met uitgangsvermogen > 50 mW63. Bovendien is de beeldacquisitie relatief traag, met een afweging tussen het aantal pixels of de beeldresolutie en de tijd voor het verwerven van afbeeldingen. De parameters die in dit protocol worden aanbevolen van 256 x 256 pixels en 60 s integratietijd zorgen voor een afbeelding met een redelijke resolutie binnen ongeveer 1 mi. De gebruiker kan ervoor kiezen om kleinere gebieden met minder pixels in beeld te brengen of lijnscans uit te voeren om de beeldsnelheid te verbeteren.

Als alternatief kunnen afbeeldingen met een hogere pixel worden verkregen met langere beeldintegratietijden. De data-analyse en interpretatie van autofluorescentielevensbeelden kan een uitdaging zijn, omdat FLIM specifieke biofysische informatie biedt over de metabole co-enzymen en hun moleculaire omgeving in plaats van specifieke metabole routes. Optische microscopie wordt ook beperkt door de diepte van lichtpenetratie in weefsel als gevolg van lichtverstrooiing en -absorptie. In vivo studies kunnen worden uitgevoerd, op diepten van ~0,5 mm met multifoton imaging systemen, van oppervlakteweefsels of via raamkamers2,20,21,64,65.

Hoewel NAD(P)H en FAD de primaire endogene fluoroforen in geïsoleerde cellen zijn, kunnen extra moleculen, waaronder collageen en elastine, autofluorescentiesignalen in weefsels bijdragen. De hoge resolutie beelden van multifotonenmicroscopie maken visualisatie van cellulaire en niet-cellulaire compartimenten mogelijk voor segmentatie van NAD(P)H- en FAD-pixels van de extracellulaire eiwitten40. Sommige cellen bevatten endogene moleculen met overlappende fluorescentie, zoals lipofuscine, retinol, tryptofaan en melanine66. Daarom kunnen autofluorescentiebeelden van NAD(P)H en FAD achtergrondbijdragen van andere endogene moleculen bevatten.

Evenzo, terwijl NAD (P) H en FAD kunnen worden gemultiplext met exogene fluoroforen die uitzenden op golflengten boven 600 nm, overlappen exogene labels, zoals DAPI of genetisch gecodeerde eiwitten zoals GFP, spectraal met autofluorescentiebeeldvorming. Het cyanide-perturbatie-experiment dat hier wordt beschreven, helpt verifiëren dat de excitatie- en emissiegolflengten NAD (P) H en FAD voldoende isoleren om metabole veranderingen in cellen op te vangen. Andere celtypen kunnen op dit protocol worden toegepast; de gebruiker moet echter de beeldparameters optimaliseren, inclusief laservermogen en beeldintegratietijd voor elk celtype, en experimenteren om fotobleaching te voorkomen. Fotobleaching kan worden geminimaliseerd door de snelheid van het aantal fotonen of de gemiddelde fluorescentie-intensiteit tijdens het afbeelden te controleren voor de duur van de levenslange scan. Een toename of afname van de fluorescentie-intensiteit geeft aan dat het laservermogen te hoog is. Als laserkrachten fotobleaching induceren, kan het vermogen worden verminderd en de totale beeldacquisitie worden verhoogd om voldoende fotonenverzameling te bereiken voor levenslange analyse.

Hoewel de fluorescentielevensduur onafhankelijk is van beeldvormingsparameters, waaronder laservermogen en detectorwinst, is de fluorescentie-intensiteit afhankelijk van deze parameters20. Daarom is het bij het uitvoeren van autofluorescentiebeeldvorming om de optische redoxverhouding te kwantificeren van cruciaal belang om consistente beeldvormingsparameters te gebruiken. Het protocol beveelt aan dat 5-6 beelden van verschillende FOV's worden verkregen van elke experimentele groep. Deze steekproefgrootte biedt voldoende gegevens op zowel beeld- als celniveau om de verwachte verschillen in fluorescentielevensduurparameters van confluente MCF7-cellen als gevolg van de cyanideverstoring op te lossen. Het optimale aantal verkregen beelden per groep is afhankelijk van het experimentele ontwerp en de effectgrootte. Bij het schakelen tussen NAD(P)H- en FAD-beelden moet het brandpuntsvlak op elke locatie hetzelfde blijven voor consistentie. Hoewel lifetime imaging doorgaans geen verzadiging van het aantal fotonen heeft, kunnen intensiteitsbeelden die met camera's of fotomultiplicatorbuizen zijn verkregen, verzadigd zijn. Pixelverzadiging moet worden vermeden om ervoor te zorgen dat het volledige bereik van fysiologische intensiteiten in de beelden wordt vastgelegd.

Bij het analyseren van fluorescentielevensduurbeelden kan een gemeten IRF of een gesimuleerde IRF worden gebruikt. De gesimuleerde IRF wordt geschat op basis van de opwaartse kracht van de fluorescerende levensduurcurve; de echte IRF die uit het systeem wordt verkregen, kan echter breder zijn, afhankelijk van het systeem en dus resulteren in nauwkeurigere levensduurwaarden. Hoewel de IRF meestal alleen verandert met hardware- of softwarewijzigingen, is een dagelijkse IRF-meting een goede praktijk om ervoor te zorgen dat het fluorescentielevensduursysteem werkt zoals verwacht.

Over het algemeen biedt autofluorescentiebeeldvorming van NAD (P) H en FAD een labelvrije, niet-destructieve methode om het cellulaire metabolisme op eencellig niveau in beeld te brengen en te analyseren. Deze methode biedt een stapsgewijze aanpak om de beeldvorming van NAD(P)H en FAD te valideren met behulp van cyanide om een goed gekarakteriseerde metabole verstoring in cellen te induceren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Acknowledgments

Financieringsbronnen zijn onder meer het Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP200668) en Texas A & M University. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-deoxy-d-glucose (2-DG) Sigma AC111980000; AC111980010; AC111980050; AC111980250
Antibiotic Antimicrobial (pen-strep) Gibco 15240096
Cell Samples American Type Culture Collection N/A MCF-7 cancer line
CellProfiler Broad Institute N/A Image analysis software
Conical Tube VWR 89039-664 15 mL conical tube
DMEM ThermoFisher 11965092 Culture media
FAD dichroic mirror Semrock FF495-Di03-25x36 495 nm
FAD emission filter Semrock FF01-550/88-25 550/88 nm
FAD excitation filter Semrock FF01-458/64-25 458/64 nm
FBS ThermoFisher 16000036
Fluorescence Lifetime Microscope 3i N/A
Glass bottom dish MatTek Corp P35G-1.0-14-C
Multiphoton Laser Coherent N/A 2P Coherent Laser, Tunable 680 nm-1080 nm
NAD(P)H dichroic mirror Semrock FF409-Di03-25x36 409 nm
NAD(P)H emission filter Semrock FF02-447/60-25 447/60 nm
NAD(P)H excitation filter Semrock FF01-357/44-25 357/44 nm
PBS ThermoFisher 70011044
Potassium Cyanide Sigma-Aldrich 380970
SlideBooks 6 3i N/A Image acquisition software
SPCImage Becker & Hickl GmbH N/A Fluorescence lifetime analysis software
Stage Top Incubator okoLab N/A
Trypsin Biosciences 786-262
Urea Sigma-Aldrich U5128
YG beads Polysciences 19096-2 Yg microspheres (20.0 µm)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heikal, A. A. Intracellular coenzymes as natural biomarkers for metabolic activities and mitochondrial anomalies. Biomarkers in Medicine. 4 (2), 241-263 (2010).
  2. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Optical imaging using endogenous contrast to assess metabolic state. Annual Review of Biomedical Engineering. 14, 351-367 (2012).
  3. Zheng, J. Energy metabolism of cancer: Glycolysis versus oxidative phosphorylation (Review). Oncology Letters. 4 (6), 1151-1157 (2012).
  4. Potter, M., Newport, E., Morten, K. J. The Warburg effect: 80 years on. Biochemical Society Transactions. 44 (5), 1499-1505 (2016).
  5. Zhao, Y., Butler, E. B., Tan, M. Targeting cellular metabolism to improve cancer therapeutics. Cell Death and Disease. 4 (3), 532 (2013).
  6. Patel, S., Ahmed, S. Emerging field of metabolomics: Big promise for cancer biomarker identification and drug discovery. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 63-74 (2015).
  7. Walsh, A. J., Cook, R. S., Skala, M. C. Functional optical imaging of primary human tumor organoids: Development of a personalized drug screen. Journal of Nuclear Medicine. 58 (9), 1367-1372 (2017).
  8. Zaal, E. A., Berkers, C. R. The influence of metabolism on drug response in cancer. Frontiers in Oncology. 8, 500 (2018).
  9. Little, A. C., et al. High-content fluorescence imaging with the metabolic flux assay reveals insights into mitochondrial properties and functions. Communications Biology. 3 (1), 271 (2020).
  10. Wang, X., et al. Comparison of magnetic resonance spectroscopy and positron emission tomography in detection of tumor recurrence in posttreatment of glioma: A diagnostic meta-analysis. Asia-Pacific Journal of Clinical Oncology. 11 (2), 97-105 (2015).
  11. Nabi, H. A., Zubeldia, J. M. Clinical applications of 18F-FDG in oncology. Journal of Nuclear Medicine Technology. 30 (1), 3-9 (2002).
  12. Kostakoglu, L., Agress, H., Goldsmith, S. J. Clinical role of FDG PET in evaluation of cancer patients. Radiographics. 23 (2), 315-340 (2003).
  13. Hoh, C. K. Clinical use of FDG PET. Nuclear Medicine and Biology. 34 (7), 737-742 (2007).
  14. van de Weijer, T., Schrauwen-Hinderling, V. B. Application of magnetic resonance spectroscopy in metabolic research. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1865 (4), 741-748 (2019).
  15. Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and Flavoprotein. Biophysical Journal. 82, 2811-2825 (2002).
  16. Lagarto, J. L., et al. Characterization of NAD(P)H and FAD autofluorescence signatures in a Langendorff isolated-perfused rat heart model. Biomedical Optics Express. 9 (10), 4961-4978 (2018).
  17. Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. , Springer. Boston, MA. (2013).
  18. Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Johnson, M. L. Fluorescence lifetime imaging of free and protein-bound NADH. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 89 (4), 1271-1275 (1992).
  19. Nakashima, N., Yoshihara, K., Tanaka, F., Yagi, K. Picosecond fluorescence lifetime of the coenzyme of D-amino acid oxidase. Journal of Biological Chemistry. 255 (11), 5261-5263 (1980).
  20. Hu, L., Wang, N., Cardona, E., Walsh, A. J. Fluorescence intensity and lifetime redox ratios detect metabolic perturbations in T cells. Biomedical Optics Express. 11 (10), 5674-5688 (2020).
  21. Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. Journal of Biomedical Optics. 25 (7), 1-43 (2020).
  22. Liu, Z., et al. Mapping metabolic changes by noninvasive, multiparametric, high-resolution imaging using endogenous contrast. Science Advances. 4 (3), (2018).
  23. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Optical imaging using endogenous contrast to assess metabolic state. Annual Review of Biomedical Engineering. 14, 351-367 (2012).
  24. Varone, A., et al. Endogenous two-photon fluorescence imaging elucidates metabolic changes related to enhanced glycolysis and glutamine consumption in precancerous epithelial tissues. Cancer Research. 74 (11), 3067-3075 (2014).
  25. Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals. Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).
  26. Sharick, J. T., et al. Protein-bound NAD(P)H lifetime is sensitive to multiple fates of glucose carbon. Scientific Reports. 8 (1), 5456 (2018).
  27. Skala, M. C., et al. In vivo multiphoton microscopy of NADH and FAD redox states, fluorescence lifetimes, and cellular morphology in precancerous epithelia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19494-19499 (2007).
  28. Skala, M. C., et al. In vivo multiphoton fluorescence lifetime imaging of protein-bound and free nicotinamide adenine dinucleotide in normal and precancerous epithelia. Journal of Biomedical Optics. 12 (2), 024014 (2007).
  29. Uchugonova, A. A., König, K. Two-photon autofluorescence and second-harmonic imaging of adult stem cells. Journal of Biomedical Optics. 13 (5), 054068 (2008).
  30. Miranda-Lorenzo, I., et al. Intracellular autofluorescence: a biomarker for epithelial cancer stem cells. Nature Methods. 11 (11), 1161-1169 (2014).
  31. Walsh, A. J., et al. Classification of T-cell activation via autofluorescence lifetime imaging. Nature Biomedical Engineering. 5 (1), 77-88 (2021).
  32. Heaster, T. M., Humayun, M., Yu, J., Beebe, D. J., Skala, M. C. Autofluorescence imaging of 3D tumor-macrophage microscale cultures resolves spatial and temporal dynamics of macrophage metabolism. Cancer Research. 80 (23), 5408-5423 (2020).
  33. Pavillon, N., Hobro, A. J., Akira, S., Smith, N. I. Noninvasive detection of macrophage activation with single-cell resolution through machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (12), 2676-2685 (2018).
  34. Chang, C. H., et al. Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis. Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).
  35. Kaech, S. M., Cui, W. Transcriptional control of effector and memory CD8+ T cell differentiation. Nature Reviews. Immunology. 12 (11), 749-761 (2012).
  36. Gómez, C. A., Fu, B., Sakadžić, S., Yaseena, M. A. Cerebral metabolism in a mouse model of Alzheimer's disease characterized by two-photon fluorescence lifetime microscopy of intrinsic NADH. Neurophotonics. 5 (4), 045008 (2018).
  37. Yaseen, M. A., et al. In vivo imaging of cerebral energy metabolism with two-photon fluorescence lifetime microscopy of NADH. Biomedical Optics Express. 4 (2), 307-321 (2013).
  38. Bower, A. J., et al. High-speed label-free two-photon fluorescence microscopy of metabolic transients during neuronal activity. Applied Physics Letters. 118 (8), 081104 (2021).
  39. Walsh, A. J., et al. Quantitative optical imaging of primary tumor organoid metabolism predicts drug response in breast cancer. Cancer Research. 74 (18), 5184-5194 (2014).
  40. Walsh, A. J., et al. Optical metabolic imaging identifies glycolytic levels, subtypes, and early-treatment response in breast cancer. Cancer Research. 73 (20), 6164-6174 (2013).
  41. Chowdary, M. V. P., et al. Autofluorescence of breast tissues: Evaluation of discriminating algorithms for diagnosis of normal, benign, and malignant conditions. Photomedicine and Laser Surgery. 27 (2), 241-252 (2009).
  42. Demos, S. G., Bold, R., White, R. D., Ramsamooj, R. Investigation of near-infrared autofluorescence imaging for the detection of breast cancer. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 11 (4), 791-798 (2005).
  43. Heaster, T. M., Humayun, M., Yu, J., Beebe, D. J., Skala, M. C. Autofluorescence imaging of 3D tumor-macrophage microscale cultures resolves spatial and temporal dynamics of macrophage metabolism. Cancer Research. 80 (23), 5408-5423 (2020).
  44. Sharick, J. T., et al. Cellular metabolic heterogeneity in vivo is recapitulated in tumor organoids. Neoplasia. 21 (6), 615-626 (2019).
  45. Shah, A. T., Diggins, K. E., Walsh, A. J., Irish, J. M., Skala, M. C. In vivo autofluorescence imaging of tumor heterogeneity in response to treatment. Neoplasia. 17 (12), 862-870 (2015).
  46. Walsh, A. J., Skala, M. C. Optical metabolic imaging quantifies heterogeneous cell populations. Biomedical Optics Express. 6 (2), 559-573 (2015).
  47. Walsh, A. J., Skala, M. C. An automated image processing routine for segmentation of cell cytoplasms in high-resolution autofluorescence images. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XIV. , (2014).
  48. Skala, M., Ramanujam, N. Methods in Molecular Biology. 594, 155-162 (2010).
  49. Stringari, C., et al. Multicolor two-photon imaging of endogenous fluorophores in living tissues by wavelength mixing. Scientific Reports. 7, 3792 (2017).
  50. SPCImage 2.9: Data analysis software for fluorescence lifetime imaging microscopy. SPCImage. , Available from: https://biology.uiowa.edu/sites/biology.uiowa.edu/files/SPCIMAGE29.pdf (2007).
  51. CellProfiler. , Available from: https://cellprofiler.org/releases (2007).
  52. Autofluorescence Imaging. GitHub. , Available from: https://github.com/walshlab/Autofluorescence-Imaging (2021).
  53. Ramey, N. A., Park, C. Y., Gehlbach, P. L., Chuck, R. S. Imaging mitochondria in living corneal endothelial cells using autofluorescence microscopy. Photochemistry and Photobiology. 83 (6), 1325-1329 (2007).
  54. Walsh, A., Cook, R. S., Rexer, B., Arteaga, C. L., Skala, M. C. Optical imaging of metabolism in HER2 overexpressing breast cancer cells. Biomedical Optics Express. 3 (1), 75-85 (2012).
  55. Kolenc, O. I., Quinn, K. P. Evaluating cell metabolism through autofluorescence imaging of NAD(P)H and FAD. Antioxidants & Redox Signaling. 30, 875-889 (2019).
  56. Bird, D. K., et al. Metabolic mapping of MCF10A human breast cells via multiphoton fluorescence lifetime imaging of the coenzyme NADH. Cancer Research. 65, 8766-8773 (2005).
  57. Walsh, A. J., et al. Optical metabolic imaging identifies glycolytic levels, subtypes, and early-treatment response in breast cancer. Cancer Research. 73 (20), 6164-6174 (2013).
  58. Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. Optical imaging of drug-induced metabolism changes in murine and human pancreatic cancer organoids reveals heterogeneous drug response. Pancreas. 45 (6), 863-869 (2016).
  59. Gubser, P. M., et al. Rapid effector function of memory CD8+ T cells requires an immediate-early glycolytic switch. Nature Immunology. 14 (10), 1064-1072 (2013).
  60. Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Review. Immunology. 18 (1), 35-45 (2018).
  61. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. The Journals of Gerontology: Series A. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  62. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio-protocol. 8 (10), 2850 (2018).
  63. Becker, W. The bh TCSPC Handbook. , Available from: https://www.becker-hickl.com/wp-content/uploads/2021/10/SPC-handbook-9ed-05a.pdf (2021).
  64. Gadella, T. W. J. Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity. Mason, W. T. 34, Ch. 34 467-479 (1999).
  65. Miller, D. R., Jarrett, J. W., Hassan, A. M., Dunna, A. K. Deep tissue iImaging with multiphoton fluorescence microscopy. Current Opinion in Biomedical Engineering. 4, 32-39 (2017).
  66. Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).

Tags

Bio-engineering FLIM Metabolisme NAD(P)H FAD Fluorescentie Microscopie
Autofluorescentie beeldvorming om cellulair metabolisme te evalueren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Theodossiou, A., Hu, L., Wang, N.,… More

Theodossiou, A., Hu, L., Wang, N., Nguyen, U., Walsh, A. J. Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism. J. Vis. Exp. (177), e63282, doi:10.3791/63282 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter