Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Autofluorescensbilleddannelse til evaluering af cellulær metabolisme

Published: November 15, 2021 doi: 10.3791/63282
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University-College Station

Summary

Denne protokol beskriver fluorescensbilleddannelse og analyse af de endogene metaboliske coenzymer, reduceret nicotinamid adenin (phosphat) dinukleotid (NAD (P) H) og oxideret flavin adenin dinukleotid (FAD). Autofluorescensbilleddannelse af NAD (P) H og FAD giver en etiketfri, ikke-destruktiv metode til vurdering af cellulær metabolisme.

Abstract

Cellulær metabolisme er den proces, hvormed celler genererer energi, og mange sygdomme, herunder kræft, er karakteriseret ved unormal metabolisme. Reduceret nicotinamid adenin (phosphat) dinukleotid (NAD (P) H) og oxideret flavin adenin dinukleotid (FAD) er coenzymer af metaboliske reaktioner. NAD (P) H og FAD udviser autofluorescens og kan spektralt isoleres ved excitation og emissionsbølgelængder. Begge coenzymer, NAD (P) H og FAD, kan eksistere i enten en fri eller proteinbundet konfiguration, som hver især har en særskilt fluorescenslevetid - den tid, hvor fluoroforen forbliver i ophidset tilstand. Fluorescenslevetidsbilleddannelse (FLIM) muliggør kvantificering af fluorescensintensiteten og levetiden for NAD (P) H og FAD til etiketfri analyse af cellulær metabolisme. Fluorescensintensitet og levetidsmikroskoper kan optimeres til billeddannelse af NAD (P) H og FAD ved at vælge de passende excitations- og emissionsbølgelængder. Metaboliske forstyrrelser af cyanid verificerer autofluorescensbilleddannelsesprotokoller for at detektere metaboliske ændringer i celler. Denne artikel vil demonstrere teknikken til autofluorescensbilleddannelse af NAD (P) H og FAD til måling af cellulær metabolisme.

Introduction

Metabolisme er den cellulære proces til produktion af energi. Cellulær metabolisme omfatter flere veje, herunder glykolyse, oxidativ fosforylering og glutaminolyse. Sunde celler bruger disse metaboliske veje til at generere energi til spredning og funktion, såsom produktion af cytokiner af immunceller. Mange sygdomme, herunder stofskifteforstyrrelser, kræft og neurodegeneration, er karakteriseret ved ændret cellulær metabolisme1. For eksempel har nogle kræftcelletyper forhøjede glykolysehastigheder, selv i nærvær af ilt, for at generere molekyler til syntese af nukleinsyrer, proteiner og lipider2,3. Dette fænomen, kendt som Warburg-effekten, er et kendetegn for mange kræfttyper, herunder brystkræft, lungekræft og glioblastomer4. På grund af ændringerne i cellulær metabolisme forbundet med kræftprogression kan cellulær metabolisme være en surrogatbiomarkør for lægemiddelrespons5,6. Desuden er forståelse af lægemiddeleffektivitet på celleniveau afgørende, da celleheterogenitet kan føre til forskellige lægemiddelresponser hos individer7,8.

Teknologier, der identificerer og kvantificerer ændringer i cellulær metabolisme, er afgørende for undersøgelser af kræft og lægemiddelrespons. Kemiske og proteinanalyser bruges til at evaluere metabolismen af celler eller væv, men mangler enkeltcelleopløsning og rumlig information. Metaboliske pladelæserbaserede assays kan måle pH og iltforbrug i prøven over tid og den efterfølgende metaboliske forstyrrelse af kemikalier. pH kan bruges til at beregne den ekstracellulære forsuringshastighed (ECAR), som giver et indblik i cellernes glykolytiske aktivitet9. Helkropsbilleddannelsesmetoder, herunder 2-[fluor-18] fluor-D-glucose positronemissionstomografi (FDG PET) og magnetisk resonansspektroskopi (MRS), er ikke-invasive billeddannelsesmetoder, der anvendes klinisk til at identificere tumorgentagelse og lægemiddeleffektivitet gennem metaboliske målinger10,11,12,13,14.

FDG-PET billeder vævsoptagelsen af FDG, en radioaktivt mærket glukoseanalog. Øget optagelse af FDG-PET af tumorer i forhold til omgivende væv skyldes Warburg-effekten12,13. MRS-billeder af almindelige kerner af molekyler, der anvendes til metabolisme, såsom 13C og 31P, og kan få dynamisk information om, hvordan stofskiftet ændres som reaktion på stimuli, såsom motion eller spisning14. Selvom FDG-PET og MRS kan bruges klinisk, mangler disse teknologier den rumlige opløsning til at løse intratumoral heterogenitet. Ligeledes foretages iltforbrugsmålinger på en bulkpopulation af celler. Autofluorescensbilleddannelse overvinder den rumlige opløsningshindring for disse teknologier og giver en ikke-invasiv metode til kvantificering af cellulær metabolisme.

Figure 1
Figur 1: NADH og FAD i fælles metaboliske veje. NADH og FAD er coenzymer, der anvendes i glykolyse, Krebs-cyklussen og elektrontransportkæden. Autofluorescensbilleddannelse af disse molekyler giver information om cellulær metabolisme. Klik her for at se en større version af denne figur.

Reduceret nicotinamid adenin (phosphat) dinukleotid (NAD (P) H) og oxideret flavin adenin dinukleotid (FAD) er coenzymer af metaboliske reaktioner, herunder glycolyse, oxidativ phosphorylering og glutaminolyse (figur 1). Både NAD(P)H og FAD er autofluorescerende og giver endogen kontrast til fluorescensbilleddannelse1,15. NADPH har lignende fluorescerende egenskaber som NADH. På grund af dette bruges NAD (P) H ofte til at repræsentere det kombinerede signal fra NADH og NADPH2,16.

Fluorescens levetidsbilleddannelse (FLIM) kvantificerer fluorescensens levetid eller den tid, hvor en fluorofor er i ophidset tilstand. Fluorescensens levetid reagerer på fluoroforernes mikromiljø og giver information om cellulær metabolisme17. NAD(P)H og FAD kan eksistere i celler i enten proteinbundne eller frie konformationer, som hver især har en anden levetid. Fri NAD(P)H har en kortere levetid end proteinbundet NAD(P)H; Omvendt har fri FAD en længere levetid end bundet FAD18,19. Levetiden og levetidskomponentvægtene kan kvantificeres ud fra fluorescensens levetidshenfaldsdata gennem Eq. (1)20:

I(t) = α 1e-t/τ1 + α 2e-t/τ2 + C (1)

Eq (1) repræsenterer den normaliserede fluorescensintensitet som funktion af tiden. De α 1 og α 2 i denne ligning repræsenterer de proportionale komponenter i korte og lange levetider (α 1+ α 2=1), henholdsvis τ1 og τ2 repræsenterer henholdsvis den korte og lange levetid, og C tegner sig for baggrundslys7,20. Den amplitudevægtede levetid, her repræsenteret som τm, beregnes ved hjælp af Eq. (2).

τm= α 1τ1+ α 2τ2 (2)

En gennemsnitlig levetid kan beregnes ved at beregne gennemsnittet af "t" over fluoroforens intensitetshenfald, som for et to-eksponentielt henfald er vist ved Eq. (3)17,21.

τ*m= (α 1τ12+ α 2τ22)/ (α 1τ1+ α 2τ2) (3)

Et fluorescensintensitetsbillede kan beregnes ud fra livstidsbilledet ved at integrere fluorescensens levetidshenfald. Autofluorescensbilleddannelse er en ikke-destruktiv og etiketfri metode, der kan bruges til at karakterisere metabolismen af levende celler ved en subcellulær opløsning. Det optiske redoxforhold tilvejebringer en optisk analog metrik af cellens kemiske redoxtilstand og beregnes som forholdet mellem NAD (P) H og FAD intensiteter. Selvom formlen til beregning af det optiske redoxforhold ikke er standardiseret22,23,24,25, defineres den her som intensiteten af FAD over de kombinerede intensiteter af NAD (P) H og FAD. Denne definition anvendes, fordi den opsummerede intensitet i nævneren normaliserer metrikken mellem 0 og 1, og det forventede resultat af cyanidhæmningen er et fald i redoxforholdet. Fluorescensleveterne for fri NAD(P)H og FAD giver indsigt i ændringer i det metaboliske opløsningsmiddelmikromiljø, herunder pH, temperatur, nærhed til ilt og osmolaritet17.

Ændringer i fluorescenslevetid for de bundne fraktioner af NAD(P)H og FAD kan indikere udnyttelse af metabolisk vej og substratspecifik metabolisme26. Komponentvægte kan fortolkes for ændringer i den frie til den bundne brøkdel af coenzymerne18,19. Alt i alt tillader disse kvantitative autofluorescenslevetidsmålinger analyse af cellulær metabolisme, og autofluorescensbilleddannelse er blevet anvendt til at identificere neoplasmer fra normalt væv27,28, karakterisere stamceller29,30, evaluere immuncellefunktion31,32,33,34,35, måle neurologisk aktivitet36, 37,38 og forståelse af lægemiddeleffektivitet i kræfttyper som brystkræft og hoved- og halskræft21,39,40,41,42. Autofluorescensbilleddannelse i høj opløsning kan kombineres med billedsegmentering til enkeltcelleanalyse og kvantificering af intrapopulationsheterogenitet43,44,45,46,47.

NAD(P)H og FAD kan afbildes på enkeltfoton- eller multifotonfluorescensmikroskoper, der er konfigureret til intensitets- eller levetidsbilleddannelse. For enkeltfotonmikroskoper er NAD(P)H og FAD typisk spændte ved bølgelængder på henholdsvis 375-405 nm og 488 nm på grund af almindelige laserkilder ved disse bølgelængder48. I to-fotonfluorescens excitation vil NAD (P) H og FAD ophidse ved bølgelængder på henholdsvis ca. 700 til 750 nm og 700 til 900 nm15,49. Når fluoroforerne er spændte, udsender NAD (P) H og FAD fotoner ved bølgelængder mellem ~ 410 nm til ~ 490 nm og ~ 510 nm til ~ 640 nm, henholdsvis15. NAD(P)H- og FAD maxima-emissionsbølgelængderne er henholdsvis ca. 450 nm og 535 nm48.

På grund af deres forskellige excitations- og emissionsbølgelængder kan fluorescensen af de to metaboliske coenzymer isoleres spektralt. En forståelse af de spektrale egenskaber ved NAD (P) H og FAD er nødvendig for design og optimering af autofluorescensbilleddannelsesprotokoller. Cyanid er en elektrontransportkæde (ETC) kompleks IV-hæmmer. Virkningerne af cyanid på cellulær metabolisme og autofluorescensintensiteterne og levetiderne for NAD (P) H og FAD i celler er godt karakteriseret27,40. Derfor er et cyanidforstyrrelseseksperiment et effektivt middel til validering af NAD (P) H- og FAD-billeddannelsesprotokoller. Et vellykket cyanideeksperiment giver tillid til, at NAD (P) H og FAD-billeddannelsesprotokollen kan bruges til at vurdere metabolismen af ukendte grupper eller forstyrrelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cellebelægning til billeddannelse

  1. Aspirer mediet fra en 80-90% sammenflydende T-75-kolbe mcF-7-celler, skyl cellerne med 10 ml sterilt fosfatbufret saltvand (PBS), og tilsæt 2 ml 0,25% trypsin (1x) for at løsne cellerne fra kolbebunden.
  2. Kolben inkuberes ved 37 °C i ~4 min. Kontroller cellerne under mikroskopet for at bekræfte løsrivelse.
  3. Tilsæt straks 8 ml kulturmedium for at deaktivere trypsinen.
  4. Saml cellerne i et konisk rør (15 ml eller 50 ml). Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer.
  5. Centrifugering af cellerne 200 × g i 5 min.
  6. Når den er centrifugeret, aspireres supernatanten. Resuspend pellet af celler i 1 ml dyrkningsmedium, og frø 4 × 105 celler på en 35 mm glasbund billedskål (eller den passende prøveholder til mikroskopet, der anvendes).
  7. Tilsæt 2 ml kulturmedium til billeddannelsesskålen for at opretholde cellemetabolismen.
  8. Inkuber cellerne ved 37 °C med 5 % CO2 i 24-48 timer før billeddannelse, så cellerne kan klæbe og nå den logaritmiske vækstfase.
    BEMÆRK: Vækstfasen blev bestemt af tidligere erfaringer med disse celler og bekræftet med celledatabladet.

2. Multifoton FLIM-billeddannelse af NAD (P) H og FAD

  1. Tænd for alle komponenter i multifotonfluorescensmikroskopet, herunder mikroskopet, laserkilden og de detektorer, der bruges.
  2. Placering af prøve
    1. Tænd lysfeltlampen. Sørg for, at der kommer lys ind i okularet. Vælg et mål, normalt 20x, 40x eller 100x til cellebilleddannelse. Påfør 1 dråbe af det relevante nedsænkningsmedium oven på målet [spring over, hvis du bruger et luftmål].
    2. Flyt målet ned for at placere prøven korrekt uden at røre ved målet. Anbring glassbundsfadet på prøveholderen på mikroskoptrinnet. Sørg for, at prøven er sikker og ikke bevæger sig under billeddannelse.
    3. Centrer prøven med målet ved hjælp af X-Y-trinkontrollen. Når dette er gjort, skal du kigge ind i okularet og flytte målet op for at fokusere på cellerne.
    4. Hvis mikroskopet er inden for et kabinet, skal du lukke døren til lyskassen. Åbn billedoptagelsessoftwaren, klik på fanen Multiphoton Imaging , og indstil følgende multifotonbilleddannelsesparametre: billedstørrelse = 256 x 256 pixels; pixel opholdstid = 4-25 μs; samlet billedoptagelsestid = ~ 60 s; optimeret detektorforstærkning til enkeltfotontælling = 85% (specifikt for det anvendte system).
  3. Billeddannelse af instrumentresponsfunktion (IRF) og fluorescerende levetidsstandard
    1. Læg urinstofkrystaller på et glasbundsfad og fastgør opvaskelåget med tape eller parafilm.
      BEMÆRK: Urinstofkrystaller forbliver stabile ved stuetemperatur i flere måneder.
    2. Billede urinstofkrystallerne.
      1. Placer urinstofskålen på mikroskopstadiet og fokuser på en urinstofkrystal.
      2. Indstil excitationslaserens bølgelængde til 900 nm.
      3. Brug et emissionsfilter, der fanger 450 nm bølgelængder.
      4. Der opnås et fluorescenslevetidsbillede af urinstofkrystallen med lasereffekt ved prøven <1 mW, og brug de anbefalede billeddannelsesparametre, der er nævnt i trin 2.2.4.
    3. Forestil dig de gulgrønne (YG) perler som en fluorescens levetidsstandard.
      1. Opret en YG-perleglider ved at fortynde YG-perleopløsningen 1:1.000 i sterilt vand. Læg et lille volumen (~ 30 μL) på en dias- eller glasbundsskål. Dæk med et coverlip og forsegl kanterne på dækslet med klar neglelak.
      2. Placer YG-perleglideren på mikroskopscenen med dækslipsiden af diaset mod målet.
      3. Indstil excitationslaserens bølgelængde til 890 nm
      4. Brug et emissionsfilter, der fanger ~ 500-600 nm bølgelængder.
      5. Der opnås et fluorescenslevetidsbillede af YG-perlerne ved hjælp af en lasereffekt ved prøven <1 mW og de anbefalede billedparametre [trin 2.2.4].
      6. Kontroller perlernes levetid ved hjælp af urinstofets IRF. Hvis levetiden ikke er ~ 2,1 ns, skal du kontrollere, om adlen er i kontakt med en anden perle, der bidrager til fluorescensslukning, perleopløsningen er tørret, adlen er ude af fokus, IRF er ikke nøjagtig, eller skiftet mellem IRF og fluorescenshenfald er ikke optimeret [se trin 4.2.4].
        BEMÆRK: Levetiden på ~ 2,1 ns er stabil over tid.
  4. NAD(P)H-billeddannelse
    1. Placer glasbundsfadet med cellerne på mikroskopstadiet og fokuser på cellerne.
      BEMÆRK: Det anbefales, at cellerne placeres i et miljøkammer for at opretholde varme-, fugtigheds- og CO2-niveauer under billedoptagelse, da disse parametre kan påvirke cellulær metabolisme.
    2. Juster detektorens forstærkning til den optimale værdi for FLIM. Derudover skal du skifte til den ønskede opholdstid - en parameter, der angiver den tid, laseren bruger på hver pixel i prøven.
      BEMÆRK: Disse parametre skal forblive de SAMME under resten af proceduren. Dette er for at sikre konsistens i laserbelysnings- og detektorindstillinger for at sikre gyldigheden af de intensitetsbaserede målinger, som er afhængige af lasereffekt, scanningsparametre og detektorforstærkning. Der er en optimeret detektorforstærkning til betjening af detektorer i enkeltfotontællingstilstand; værdien er 85 % for det system, der henvises til.
    3. Indstil multifotonlaseren til 750 nm. Sørg for, at laserens strømstyring oprindeligt er indstillet til nul, så cellerne ikke beskadiges, når lukkeren på laseren åbnes.
      BEMÆRK: Excitation ved 750 nm anbefales til NAD (P) H, selvom den har bred absorption ved 700-750 nm. Excitation ved 890 nm anbefales til FAD, selvom den har bred absorption ved 700-900 nm.
    4. Indstil eller vælg et emissionsfilter til at indsamle emissionsbølgelængder ved ~ 400-500 nm.
    5. Begynd at billed billedbehandling på en fokuserende eller live-view måde for at optimere billedindstillingerne.
      BEMÆRK: Laseren er nu i drift. Åbn ikke mikroskopkabinettet på dette tidspunkt. Brug passende personlige værnemidler.
    6. Øg langsomt lasereffekten til ~ 3-8 mW ved prøven, samtidig med at cellerne er i fokus. Når den er justeret, skal du registrere den maksimale anvendte effekt. Brug denne effektindstilling til billeddannelse på andre segmenter af petriskålen til NAD(P)H-billeddannelse.
      BEMÆRK: Det er vigtigt at måle lasereffekten ved prøven eller et pick-off-vindue og ikke stole på pockels-cellespændingen, da pockelscellerne ikke er stabile. Ofte overvåges lasereffekt under billeddannelse med et pick-off-vindue i stedet for ved prøven. Ved hjælp af en anden effektmåler ved målet kan forholdet mellem effekten ved afhentningsvinduet og effekten ved prøven bruges til at estimere den omtrentlige effekt ved prøven fra pick-off-vinduesmålingerne.
    7. Saml et NAD(P)H FLIM-billede med en billedintegrationstid på 60 s.
    8. Kontroller, at billedet har tilstrækkelige fotoner (top på ~ 100 fotoner til en cytoplasmapixel) inden for fluorescensens levetidshenfaldskurve. Hvis antallet af fotoner er for lavt, skal du øge lasereffekten eller varigheden af billedoptagelsen.
      BEMÆRK: Det mindste maksimale antal fotoner inden for fluorescensens eksponentielle henfald afhænger af systemparametre, herunder tidsmæssig opløsning, IRF og baggrundsstøj.
  5. FAD-billeddannelse
    1. Indstil multifotonlaseren til 890 nm, og vent på, at den låses ved den nye bølgelængde. Sørg for, at laserens strømstyring oprindeligt er indstillet til nul, så cellerne ikke beskadiges, når lukkeren på laseren åbnes.
      BEMÆRK: Flyt ikke scenen eller det objektive fokus, når du udfører dette trin. FAD-synsfeltet (FOV) skal svare direkte til NAD(P)H FOV for dette billede.
    2. Indstil eller vælg et emissionsfilter til at indsamle emissionsbølgelængder ved ~ 500-600 nm.
    3. Begynd at billed billedbehandling på en fokuserende eller live-view måde for at optimere billedindstillingerne.
      BEMÆRK: Laseren er nu i drift. Åbn ikke mikroskopkabinettet på dette tidspunkt.
    4. Øg langsomt lasereffekten til ~5-10 mW ved prøven, og registrer den maksimale effekt, der bruges. Brug dette som effektindstilling for billeddannelsen på andre segmenter af petriskålen til FAD-billeddannelse.
    5. Saml et FAD FLIM-billede med en billedintegrationstid på 60 s.
    6. Kontroller, at billedet har tilstrækkelige fotoner (top på ~ 100 fotoner til en cytoplasmapixel) inden for fluorescensens levetidshenfaldskurve. Hvis antallet af fotoner er for lavt, skal du øge lasereffekten eller varigheden af billedoptagelsen.
      BEMÆRK: Det mindste maksimale antal fotoner inden for fluorescensens eksponentielle henfald afhænger af systemparametre, herunder tidsmæssig opløsning, IRF og baggrundsstøj.
  6. Gentag trin 2.4-2.5 ved yderligere fire til fem FOV'er. Sørg for, at hvert billede er placeret mindst 2 FOV'er væk fra de afbildede placeringer.

3. Forberedelse af cyanidforsøg

  1. 130,24 mg natriumcyanid opløses i 25 ml PBS for at fremstille en 80 mM (20x) natriumcyanidopløsning.
    BEMÆRK: Cyanid er giftigt. Brug passende personlige værnemidler.
  2. Aspirer 100 μL kulturmedium fra fadet. Udskift dette med 100 μL natriumcyanidopløsning for at opnå en 4 mM koncentration af cyanid i fadet.
  3. Sæt cellerne i en inkubator i 5 minutter for at give cellerne mulighed for at reagere med cyanidopløsningen.
  4. Gentag trin 2.4-2.6 for at erhverve NAD(P)H- og FAD-billeder af cellerne efter cyanideksponering.
    BEMÆRK: Langvarig eksponering for cyanid vil dræbe cellerne. Postcyanidbilleder erhverves inden for 30 minutter efter cyanidtilsætningen.

4. FLIM billedanalyse

  1. Åbn FLIM-levetidsanalysesoftwaren.
    1. Åbn urinstofbilledet for at erhverve den målte IRF.
    2. Importer urinstofbilledet. Vælg et punkt på billedet af urinstofkrystallen, der skal bruges til billedanalyse. Forøg den rumlige placeringsværdi for at integrere FLIM-data fra flere pixels til 1 eller højere for en henfaldstop > 100 fotoner ved at ændre bin-variablen , der findes på hovedsoftwaregrænsefladen.
    3. Gem dataene som en IRF.
      1. I den software, der refereres til, skal du klikke på rullemenuen med titlen IRF, vælge Kopiér fra henfaldsdata. Klik derefter på Kopiér til udklipsholder for at blive brugt i billedanalysen af det billede, der er taget under eksperimentet.
  2. Billedanalyse af NAD(P)H- og FAD-levetidsbilleder
    1. Importer billedfilen til fluorescens levetid analyse software.
    2. Forbedre billedvisualiseringen for at se cellerne og de undercellulære rum ved at ændre intensiteten og kontrasten, hvis det er nødvendigt.
      1. Klik på rullemenuen Indstillinger , og vælg Intensitet. Her skal du ændre intensiteten og kontrasten som ønsket og klikke på Ok.
    3. Importer IRF fra urinstofbilledet.
      1. Klik på rullemenuen IRF , og vælg Indsæt fra udklipsholder.
    4. Indstil parametre for multieksponentielt henfald50.
      1. Indstil en tærskelværdi for at evaluere henfald for cytoplasmapixels.
        BEMÆRK: Her blev der brugt en værdi på 50. Værdien blev valgt ved at sammenligne fluorescenstopværdierne for flere repræsentative baggrunds- og kernepixels med topværdien af flere cytoplasmapixels. En værdi mellem kernepixels og cytoplasmapixels blev valgt til tærsklen.
    5. Kontroller, at Shift-værdien justerer IRF i forhold til fluorescensens stigende kant. Juster skiftet, hvis det er nødvendigt, til en værdi, der minimerer den Chi-kvadrerede værdi.
    6. Forøg den rumlige skraldespand, så cytoplasmapixels har fluorescenstopværdier på eller over 100.
      BEMÆRK: Forøgelse af den rumlige skraldespand vil føre til nedsat rumlig opløsning.
    7. Beregn fluorescenslevet levetider for alle pixels i billedet.
      1. I det program, der refereres til, skal du klikke på rullemenuen Beregn | Forfald matrix.
        BEMÆRK: Succes er angivet med et billede falsk farvet til den amplitudevægtede fluorescenslevetid.
    8. Gem fluorescensens levetidsdata.
      1. Klik på rullemenuen Filer | Eksportér. Vælg de ønskede parametre til analyse, og klik på Ok. Gem billedet.
      2. Vælg knappen Farve i rullemenuen Indstillinger for at justere den viste måling af fluorescensens levetid, farvekonfigurationen til B-G-R, og indstil de specifikke minimums- og maksimumværdier for farvelinjen for at justere farveskalaen for fluorescensens levetidsbillede.

Figure 2
Figur 2: Målt IRF af urinstofkrystal. A) Intensitetsbillede fra urinstoffet. En repræsentativ pixel blev valgt til at skabe IRF-henfaldskurven (B) til efterfølgende analyse af fluorescenslevetidsbilleder af celler. Forkortelse: IRF = instrumentresponsfunktion. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Cellesegmentering
    BEMÆRK: Den protokol, der er beskrevet her, bruger en billedanalysesoftware51. Repræsentative MCF-7-billeder og dataanalysekode leveres52.
    1. Hent filen MCF7_Segmentation_Final.cpproj52.
    2. Importer MCF7_Segmentation Pipeline ved at klikke på File | Import | Pipeline fra fil, vælg filen MCF7_Segmentation_Final.cpproj.
    3. Klik på modulet Billeder , og tilføj nad(P)H-intensitetsbillederne, der skal segmenteres.
      BEMÆRK: Billeder skal være i.tif, .png eller .jpg format.
    4. Tryk på knappen Analysér billeder nederst til venstre.
      BEMÆRK: Pipeline kan have brug for optimering af billeder, der er erhvervet på forskellige systemer. Prøv følgende undertrin for at få fejlfinding
      1. Brug testtilstand til at teste forskellige parametre: Klik på Start testtilstand , og kør hvert modul ved at klikke på afspilningsknappen ud for modulnavnet.
      2. Klik på det første IdentifyPrimaryObjects-modul , og juster objekternes typiske diameter i pixelenheder (Min, Max), så den svarer til cellernes diameter.
        BEMÆRK: For MCF-7-celler blev der brugt 10 og 40 pixels til henholdsvis minimum og maksimum.
      3. Klik på modulet EnhanceOrSuppressFeatures, og juster funktionsstørrelsen for at forbedre identifikationen af den valgte funktionstype.
        BEMÆRK: En funktionsstørrelse på 10 pixels blev brugt til MCF-7-celler.
      4. Klik på det andet EnhanceOrSuppressFeatures-modul, og juster rækkevidden af hulstørrelser for at optimere forbedringen af de nukleare regioner.
        BEMÆRK: Et interval på 5-20 blev anvendt til MCF-7-celler.
      5. Klik på det andet IdentifyPrimaryObjects-modul , og juster parametrene (Tærskelstrategi, Tærskelmetode, Tærskeludjævningsskala og Tærskelkorrektionsfaktor) for at optimere identifikationen af kerner. Klik på ? ved hver parameter for at identificere optimale indstillinger og anvende på IdentifySecondaryObjects-modulet .
      6. Klik på FilterObjects-modulet , og juster områdeformen. Vælg en minimums- og maksimumspixel for den områdeform, der skal identificeres.
        BEMÆRK: For MCF-7-cellerne blev 100 og 500 anvendt til henholdsvis maksimum og minimum. Processen med cellesegmentering ved at identificere kernen og formeringen til cellegrænserne forklares detaljeret af Walsh og Skala47.
    5. Ved hjælp af cellecytoplasmamaskerne gennemsnit fluorescensens levetidsoutputvariabler for hver celle i billedet.

Figure 3
Figur 3: Identifikation og segmentering af individuelle celler. NAD(P)H-intensitetsbilledet af MCF7-celler (A) opnået ved at integrere et fluorescenslevetidsbillede. Celler blev afbildet ved hjælp af 750 nm excitation ved 5 mW i 60 s. Akserne x og y repræsenterer billedets pixelplacering. (A) Individuelle celler blev identificeret. Cellerne blev maskeret (B) for at fjerne baggrundsstøj fra datasættet. Kernen blev derefter identificeret (C) og projiceret på cellemasken (D). Cellerne blev derefter filtreret (E) for at fjerne maskerede områder, der ikke passer til størrelsen af typiske celler. Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

5. Alternativ metode: Billeddannelse af fluorescensintensitet

  1. Tænd for det udstyr, der skal bruges under eksperimentet.
    BEMÆRK: Fluorescensintensitetsbilleder kan erhverves med vidvinkelfluorescensmikroskoper, konfokale fluorescensmikroskoper eller multifotonmikroskoper.
    1. Sørg for, at mikroskopet, der skal bruges, har en passende excitationskilde til NAD (P) H (enkeltfotonbølgelængde ~ 370-405 nm: to-fotonbølgelængde ~ 700-750 nm) og FAD (enkeltfotonbølgelængde ~ 488 nm, to-fotonbølgelængde ~ 890 nm).
    2. Sørg for, at mikroskopet har et filter til isolering af NAD (P) H-emission (~ 400-500 nm).
      BEMÆRK: 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) indstillinger fungerer ofte for NAD (P) H.
    3. Sørg for, at mikroskopet har et filter til isolering af FAD-emission (~ 500-600 nm).
      BEMÆRK: Grønne fluorescerende proteinindstillinger (GFP) fungerer ofte for FAD.
  2. Forbered mikroskopet.
    1. Tænd lysfeltlampen. Sørg for, at der kommer lys ind i okularet. Påfør 1 dråbe af det relevante nedsænkningsmedium oven på det tilsvarende mål, hvis det er nødvendigt.
    2. Flyt målet ned for at placere prøverne korrekt uden indblanding. Placer petriskålen korrekt på scenen. Sørg for, at prøven er sikker og ikke bevæger sig under billeddannelse.
      BEMÆRK: Det anbefales, at cellerne placeres i et miljøkammer for at opretholde varme-, fugtigheds- og CO2-niveauer under billedoptagelse, da disse parametre kan påvirke cellulær metabolisme.
    3. Centrer prøven med målet. Når dette er gjort, skal du kigge ind i okularet og flytte målet, indtil cellerne ser ud til at være i fokus.
  3. Begynd intensitetsbilleddannelse.
    1. Åbn billedbehandlingssoftwaren, og indstil excitations- og emissionskonfigurationen til at fange NAD(P)H ved at klikke på fanen Capture i billedoptagelsessoftwaren og placere NAD(P)H-excitations- og emissionsfilteret i mikroskoptårnet.
      BEMÆRK: Et 357/44 excitationsfilter, 409 longpass dichroic og 447/60 emissionsfilter blev brugt til NAD (P) H-billeddannelse.
    2. Optimer excitationsbelysnings- og detektorparametrene. Hvis blegning er et problem, skal du reducere belysningsintensiteten og øge billedintegrationstiden.
      BEMÆRK: NAD(P)H er et svagt signal; Vær opmærksom på blegning, hvis der bruges for meget strøm.
    3. Få et NAD(P)H-billede med den ønskede billedstørrelse. Sørg for, at billedet er gemt.
    4. Indstil konfigurationen af excitation og emission til at registrere FAD. Optimer excitationsbelysnings- og detektorparametrene.
      BEMÆRK: Et 458/64 excitationsfilter, 495 longpass dichroic og 550/88 emissionsfilter blev brugt til FAD-billeddannelse.
    5. Erhverv et FAD-billede. Sørg for, at billedet er gemt.
      BEMÆRK: NAD(P)H- og FAD-billedoptagelsesparametre (belysningsintensitet, billedstørrelse, detektorforøgelse) skal forblive de samme under hele billeddannelseseksperimentet.
    6. Gentag processen på yderligere fem placeringer med mindst 2 FOV'er væk fra de afbildede placeringer.
  4. Dataanalyse af redoxforhold på billedniveau
    1. Åbn NAD(P)H- og FAD-intensitetsbillederne i et billedbehandlingsprogram.
    2. Indstil en tærskel på NAD (P) H for at bevare cytoplasmapixels og indstil baggrunds- og kernepixels til 0.
    3. Beregn redoxforholdsbilledet ved at evaluere ligningen FAD/(NAD(P)H+FAD) ved hver pixel ved hjælp af det tærskelformede NAD(P)H-billede.
    4. Beregn middelværdien af de ikke-0 pixels.
      BEMÆRK: Disse trin kan udføres i billedanalysesoftware eller kodes direkte med scripts.
  5. Analyse af redoxforholdet på celleniveau
    1. Følg trin 4.3.1-4.3.5 for at få et maskebillede af cellerne i hvert NAD(P)H-billede.
    2. Beregn redoxforholdsbilledet ved at evaluere ligningen FAD/(NAD(P)H+FAD) ved hver pixel.
    3. Ved hjælp af cellecytoplasmamasken skal du gennemsnitligt gennemsnit redoxforholdet for alle pixels for hver celle i billedet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Epitelets brystkræftcellelinjen, MCF-7, blev dyrket i DMEM suppleret med 10% føtalt kvægserum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin. Til fluorescensbilleddannelse blev cellerne podet med en densitet på 4 × 105 celler pr. 35 mm glasbundsbilleddannelsesskål 48 timer før billeddannelse. Cellerne blev afbildet før og efter cyanidbehandling ved hjælp af ovennævnte protokoller. Målet med cyanideeksperimentet er at bekræfte spektralisolering af NAD (P) H og FAD fluorescens og validere billeddannelsessystemet og analyseprotokollen til påvisning af metaboliske ændringer i celler. Parrede NAD(P)H- og FAD-fluorescenslivsbilleder blev taget fem forskellige steder før cyanid og fem forskellige steder efter tilsætning af cyanid til mediet. Fluorescenslevetidsparametre (optisk redoxforhold, NAD(P)H α 1, NAD(P)H τ1, NAD(P)H τ2, NAD(P)H τm, FAD τ1, FAD τ2, FAD α 1, FAD τ1, FAD τ2 og FAD τm) blev beregnet ved hjælp af den målte IRF fra urinstof (figur 2) og i gennemsnit på tværs af pixels i cytoplasmaet for hver celle, der blev anvendt til segmentering (figur 3).

Multifotonfluorescens levetidsbilleddannelse af NAD (P) H og FAD tillader visualisering af cellemorfologi og metabolisme (figur 4). Den høje opløsning, der opnås med multifotonmikroskopi, gør det muligt at identificere enkeltceller. NAD(P)H og FAD er primært placeret i mitokondrierne og cytoplasmaet, mens kernen, der mangler metabolisk NAD(P)H og FAD, er mørk i sammenligning23,53. Levetidsbillederne giver visualisering af de amplitudevægtede levetider for NAD(P)H og FAD i hele cellen og som følge af cyanideksponering (figur 4).

Figure 4
Figur 4: Repræsentative fluorescenslevetidsbilleder af MCF7-celler før og efter cyanidbehandling. (A) NAD(P)H amplitudevægtet fluorescenslevetidsbillede og (B) FAD-amplitudevægtet fluorescenslevetidsbillede før cyanidbehandling. (C) NAD(P)H amplitudevægtet fluorescenslevetidsbillede og (D) FAD-amplitudevægtet fluorescenslevetidsbillede efter cyanidbehandling. Den amplitudevægtede fluorescenslevetid (angivet med farvebjælken) måler den tid, hvor en fluorofor, i disse tilfælde NAD (P) H og FAD, er i en ophidset tilstand. NAD(P)H-levetiden falder med cyanidbehandling, mens FAD's levetid øges efter cyanidbehandling. NADH-signalet blev afbildet ved hjælp af 750 nm excitation ved 5 mW i 60 s, og FAD-signalet blev afbildet ved hjælp af 890 nm excitation ved 7 mW i 60 s. Billeder erhvervet med et 40x vandnedsænkningsmål, numerisk blænde = 1,1. Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Cyanid hæmmer kompleks IV i elektrontransportkæden, som hæmmer oxidativ phosphorylering2,15. Efter cyanideksponering og før celledød akkumuleres NAD (P) H i mitokondrierne, og FAD falder1,15. På grund af disse veldefinerede ændringer i NAD (P) H og FAD-intensitet på grund af cyanidhæmning af metabolisme er forstyrrelsen en standardtest for at verificere autofluorescensbilleddannelses- og analyseprotokoller2,54. Som forventet faldt det optiske redoxforhold (FAD/(FAD+NAD(P)H)) af MCF-7-celler efter cyanidbehandling (figur 5, p = 0,044, Welchs t-test). Det optiske redoxforhold er ikke en standardiseret formel, men alligevel har alle intensitetsformler vist sig at være ækvivalente20. FAD / (NAD (P) H + FAD) blev valgt til at definere det optiske redoxforhold, fordi den kombinerede sum af NAD (P) H og FAD i nævneren giver en normaliseret værdi mellem 0 og 120,55. Den modsatte effekt - en stigning i det optiske redoxforhold - forventes for cyanidforstyrrelser med optiske redoxforhold beregnet med NAD(P)H i tælleren.

Figure 5
Figur 5: Optisk redoxforhold mellem MCF7-celler falder med cyanidbehandling. Boxplottene viser medianen og den første og tredje kvartil beregnet ud fra celledataene. Middelværdien er repræsenteret af det sorte prikkesymbol, og medianen er repræsenteret af den sorte linje inde i boksen. De grå datapunkter, der er overlejret på hvert boxplot, repræsenterer den gennemsnitlige værdi af alle cytoplasmapixels i hver celle. Kontrolgruppen bestod af 91 celler fra fem forskellige billeder, og cyanidgruppen bestod af 95 celler fra fem forskellige billeder. p < 0,01, Welchs t-test. Klik her for at se en større version af denne figur.

Den amplitudevægtede NAD (P) H-levetid (τm) af MCF7-celler faldt med cyanideksponering (figur 6A, p < 2,2 × 10-16, Welchs t-test). Både den korte og den lange levetid faldt for NAD(P)H (figur 6B,C), men steg for NAD(P)H α 1 (figur 6D). Disse ændringer i NAD(P)H-fluorescenslevethedstider, fald i τm, stigning i α 1 og fald i τ2 matchede offentliggjorte værdier af cyanidforstyrrelser40,56. Faldet i NAD(P)H amplitudevægtet fluorescenslevetid med cyanideksponering indikerer øget slukning inden for mikromiljøet af NAD(P)H. En stigning i α 1 indikerer mere fri NAD(P)H, som forventet af stigningen i NAD(P)H på grund af cyanids virkninger på cellulær metabolisme21.

Figure 6
Figur 6: NAD(P)H-fluorescenslevetid for MCF7-celler før og efter cyanidbehandling. Boxplottene i panelerne A-D viser medianen og den første og tredje kvartil beregnet ud fra data på celleniveau. Middelværdien er repræsenteret af det sorte prikkesymbol, og medianen er repræsenteret af den sorte linje inde i boksen. De grå datapunkter, der er overlejret på hvert boxplot, repræsenterer den gennemsnitlige værdi af alle cytoplasmapixels i en celle. Kontrolgruppen bestod af 91 celler fra fem forskellige billeder, og cyanidgruppen bestod af 95 celler fra fem forskellige billeder. (A-D) udviser ændringerne i NAD(P)H amplitudevægtet levetid (τm), NAD(P)H kort levetid (τ1), NAD(P)H lang levetid (τ2) og NAD(P)H-proportional komponent i den korte levetid (α 1) på grund af cyanidbehandling. p-værdier blev beregnet ved hjælp af Welchs t-test. Klik her for at se en større version af denne figur.

Den amplitudevægtede FAD-levetid (τm) for MCF7-celler steg efter cyanideksponering (figur 7A, p = 3.688 × 10-12, Welchs t-test). Både den korte og den lange levetid steg for FAD (figur 7B,C), men faldt for FAD α 1 (figur 7D). Ændringer i FAD-fluorescenslevethed, en stigning i τm og τ2 og et fald i α 1 er i overensstemmelse med offentliggjorte FAD-fluorescenslevetidsdata for cyanidforstyrrelse57. Ændringen i levetidsværdier og α 1 tyder på metaboliske ændringer i cellerne, herunder en øget mængde fri FAD21.

Figure 7
Figur 7: FAD fluorescens levetid før og efter cyanidbehandling. Boxplottene i A-D viser medianen, den første og tredje kvartil og middelværdien beregnet ud fra data på celleniveau. Middelværdien er repræsenteret af det sorte prikkesymbol, og medianen er repræsenteret af den sorte linje inde i boksen. De grå datapunkter, der er overlejret på hvert boxplot, repræsenterer den gennemsnitlige værdi af alle cytoplasmapixels i en celle. Kontrolgruppen bestod af 91 celler fra fem forskellige billeder, og cyanidgruppen bestod af 95 celler fra fem forskellige billeder. (A-D) udviser ændringerne i FAD-amplitudevægtet levetid (τm), FAD-kort levetid (τ1), FAD-lang levetid (τ2) og FAD-proportional komponent i den korte levetid (α 1) fra cyanidbehandling. p-værdier blev beregnet ved hjælp af Welchs t-test. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Autofluorescensintensitet og levetidsbilleddannelse er blevet brugt i vid udstrækning til at vurdere metabolisme i celler21,55. FLIM er høj opløsning og løser derfor enkeltceller, hvilket er vigtigt for kræftundersøgelser, fordi cellulær heterogenitet bidrager til tumoraggression og lægemiddelresistens7,39,41,44,45,46,58. Ligeledes er autofluorescensbilleddannelse af cellulær metabolisme nyttig til billeddannelse af immunceller, da immuncellefunktionen er forbundet med cellulær metabolisme, og immuncellepopulationer er ofte heterogene20,31. Standard biokemiske assays evaluerer typisk immunceller på populationsniveau eller kræver intracellulær mærkning efter cellepermeabilisering34,59,60. Autofluorescensbilleddannelse er også velegnet til in vivo-målinger i høj opløsning og dynamiske målinger af stofskiftet på grund af lysets ikke-destruktive karakter og mangel på kemiske eller genetisk kodede etiketter36,37,38,41,48,55 . Kritiske trin til billeddannelse af NAD (P) H og FAD fluorescensintensitet og levetid omfatter udvælgelse af passende bølgelængder til excitation og emission, verifikation af, at cellerne ikke indeholder syntetiske eller yderligere endogene fluoroforer, der vil bidrage med overlappende fluorescens, og brugen af ikke-nedsættende laserkræfter.

Autofluorescensbilleddannelse af NAD (P) H og FAD udfylder en unik niche som en etiketfri, højopløselig, kvantitativ metabolisk billeddannelsesteknologi. Andre billeddannelsesmetoder, såsom FDG-PET og MRS, billedvævsmetabolisme, men mangler celleniveauopløsning og kan derfor ikke evaluere cellulær heterogenitet. Andre biokemiske teknikker, såsom iltforbrugsassays, målinger af metabolitter i medierne eller proteinanalyse, kræver dyre engangsreagenser, opnår målinger fra poolede celler og kræver celledestruktive protokoller, der forhindrer tidsforløbsundersøgelser eller in vivo-analyse61,62.

Mens autofluorescensbilleddannelse af NAD (P) H og FAD giver billeder i høj opløsning på en etiketfri og ikke-destruktiv måde, skal nogle begrænsninger af autofluorescensbilleddannelse overvejes, når man designer og fortolker eksperimenter. FLIM kræver specialiseret og dyrt udstyr, der ikke er bredt tilgængeligt. FLIM-excitationen kræver en pulserende excitationskilde med picosekund- eller femtosekundimpulser med en gentagelseshastighed mellem 40 og 100 MHz med udgangseffekt > 50 mW63. Derudover er billedoptagelse relativt langsom med en afvejning mellem antallet af pixels eller billedopløsning og billedoptagelsestid. De parametre, der anbefales i denne protokol på 256 x 256 pixels og 60 s integrationstid, giver et billede med rimelig opløsning inden for ca. 1 mi. Brugeren kan vælge at afbilde mindre områder med færre pixels eller udføre linjescanninger for at forbedre billedhastigheden.

Alternativt kan billeder med højere pixel erhverves med øgede billedintegrationstider. Dataanalysen og fortolkningen af autofluorescensens levetidsbilleder kan være udfordrende, da FLIM giver specifik biofysisk information om de metaboliske coenzymer og deres molekylære miljø snarere end specifikke metaboliske veje. Optisk mikroskopi er også begrænset af dybden af lysindtrængning i væv på grund af lysspredning og absorption. In vivo-undersøgelser kan udføres på dybder på ~ 0,5 mm med multifotonbilleddannelsessystemer af overfladevæv eller gennem vindueskamre2,20,21,64,65.

Mens NAD (P) H og FAD er de primære endogene fluoroforer i isolerede celler, kan yderligere molekyler, herunder kollagen og elastin, bidrage med autofluorescenssignaler i væv. Billederne i høj opløsning af multifotonmikroskopi tillader visualisering af cellulære og ikke-cellulære rum til segmentering af NAD(P)H- og FAD-pixels fra de ekstracellulære proteiner40. Nogle celler indeholder endogene molekyler med overlappende fluorescens, såsom lipofuscin, retinol, tryptofan og melanin66. Derfor kan autofluorescensbilleder af NAD(P)H og FAD indeholde baggrundsbidrag fra andre endogene molekyler.

Ligeledes, mens NAD (P) H og FAD kan multiplexeres med eksogene fluoroforer, der udsender ved bølgelængder over 600 nm, overlapper eksogene etiketter, såsom DAPI eller genetisk kodede proteiner såsom GFP, spektralt med autofluorescensbilleddannelse. Cyanidforstyrrelseseksperimentet, der er beskrevet her, hjælper med at verificere, at excitations- og emissionsbølgelængderne isolerer NAD (P) H og FAD tilstrækkeligt til at fange metaboliske ændringer i celler. Andre celletyper kan anvendes på denne protokol; Brugeren skal dog optimere billeddannelsesparametre, herunder lasereffekt og billedintegrationstid for hver celletype, og eksperimentere for at forhindre fotoblegning. Fotoblegning kan minimeres ved at overvåge fotontællingshastigheden eller den gennemsnitlige fluorescensintensitet under billeddannelsen i løbet af levetidsscanningen. En stigning eller et fald i fluorescensintensiteten indikerer, at lasereffekten er for høj. Hvis laserkræfter inducerer fotoblegning, kan effekten reduceres, og den samlede billedoptagelse øges for at opnå tilstrækkelig fotonopsamling til levetidsanalyse.

Selv om fluorescensens levetid er uafhængig af billeddannelsesparametre, herunder lasereffekt og detektorforstærkning, er fluorescensintensiteten afhængig af disse parametre20. Derfor, når der udføres autofluorescensbilleddannelse for at kvantificere det optiske redoxforhold, er det vigtigt at anvende konsistente billeddannelsesparametre. Protokollen anbefaler, at der erhverves 5-6 billeder af forskellige FOV'er fra hver eksperimentel gruppe. Denne prøvestørrelse giver tilstrækkelige data på både billed- og celleniveau til at løse de forventede forskelle i fluorescenslevetidsparametre for sammenflydende MCF7-celler på grund af cyanidforstyrrelsen. Det optimale antal billeder, der er erhvervet pr. Gruppe, afhænger af det eksperimentelle design og effektstørrelsen. Når der skiftes mellem NAD(P)H- og FAD-billeder, skal brændplanet forblive det samme på hvert sted for at opnå konsistens. Selvom levetidsbilleddannelse typisk ikke har et mættende antal fotoner, kan intensitetsbilleder, der er erhvervet med kameraer eller fotomultiplikatorrør, mættes. Pixelmætning bør undgås for at sikre, at hele spektret af fysiologiske intensiteter fanges i billederne.

Ved analyse af fluorescenslevetidsbilleder kan enten en målt IRF eller en simuleret IRF anvendes. Den simulerede IRF estimeres ud fra opskridelsen af den fluorescerende levetidskurve; den reelle IRF, der opnås fra systemet, kan dog være bredere afhængigt af systemet og dermed resultere i mere nøjagtige levetidsværdier. Mens IRF typisk kun ændres med hardware- eller softwareændringer, er en daglig IRF-måling en god praksis for at sikre, at fluorescensens levetidssystem fungerer som forventet.

Samlet set giver autofluorescensbilleddannelse af NAD (P) H og FAD en etiketfri, ikke-destruktiv metode til at afbilde og analysere cellulær metabolisme på enkeltcelleniveau. Denne metode giver en trinvis tilgang til validering af billeddannelsen af NAD (P) H og FAD ved hjælp af cyanid til at inducere en velkaraktereret metabolisk forstyrrelse i celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Finansieringskilder omfatter Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP200668) og Texas A & M University. Figur 1 blev oprettet med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-deoxy-d-glucose (2-DG) Sigma AC111980000; AC111980010; AC111980050; AC111980250
Antibiotic Antimicrobial (pen-strep) Gibco 15240096
Cell Samples American Type Culture Collection N/A MCF-7 cancer line
CellProfiler Broad Institute N/A Image analysis software
Conical Tube VWR 89039-664 15 mL conical tube
DMEM ThermoFisher 11965092 Culture media
FAD dichroic mirror Semrock FF495-Di03-25x36 495 nm
FAD emission filter Semrock FF01-550/88-25 550/88 nm
FAD excitation filter Semrock FF01-458/64-25 458/64 nm
FBS ThermoFisher 16000036
Fluorescence Lifetime Microscope 3i N/A
Glass bottom dish MatTek Corp P35G-1.0-14-C
Multiphoton Laser Coherent N/A 2P Coherent Laser, Tunable 680 nm-1080 nm
NAD(P)H dichroic mirror Semrock FF409-Di03-25x36 409 nm
NAD(P)H emission filter Semrock FF02-447/60-25 447/60 nm
NAD(P)H excitation filter Semrock FF01-357/44-25 357/44 nm
PBS ThermoFisher 70011044
Potassium Cyanide Sigma-Aldrich 380970
SlideBooks 6 3i N/A Image acquisition software
SPCImage Becker & Hickl GmbH N/A Fluorescence lifetime analysis software
Stage Top Incubator okoLab N/A
Trypsin Biosciences 786-262
Urea Sigma-Aldrich U5128
YG beads Polysciences 19096-2 Yg microspheres (20.0 µm)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heikal, A. A. Intracellular coenzymes as natural biomarkers for metabolic activities and mitochondrial anomalies. Biomarkers in Medicine. 4 (2), 241-263 (2010).
  2. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Optical imaging using endogenous contrast to assess metabolic state. Annual Review of Biomedical Engineering. 14, 351-367 (2012).
  3. Zheng, J. Energy metabolism of cancer: Glycolysis versus oxidative phosphorylation (Review). Oncology Letters. 4 (6), 1151-1157 (2012).
  4. Potter, M., Newport, E., Morten, K. J. The Warburg effect: 80 years on. Biochemical Society Transactions. 44 (5), 1499-1505 (2016).
  5. Zhao, Y., Butler, E. B., Tan, M. Targeting cellular metabolism to improve cancer therapeutics. Cell Death and Disease. 4 (3), 532 (2013).
  6. Patel, S., Ahmed, S. Emerging field of metabolomics: Big promise for cancer biomarker identification and drug discovery. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 63-74 (2015).
  7. Walsh, A. J., Cook, R. S., Skala, M. C. Functional optical imaging of primary human tumor organoids: Development of a personalized drug screen. Journal of Nuclear Medicine. 58 (9), 1367-1372 (2017).
  8. Zaal, E. A., Berkers, C. R. The influence of metabolism on drug response in cancer. Frontiers in Oncology. 8, 500 (2018).
  9. Little, A. C., et al. High-content fluorescence imaging with the metabolic flux assay reveals insights into mitochondrial properties and functions. Communications Biology. 3 (1), 271 (2020).
  10. Wang, X., et al. Comparison of magnetic resonance spectroscopy and positron emission tomography in detection of tumor recurrence in posttreatment of glioma: A diagnostic meta-analysis. Asia-Pacific Journal of Clinical Oncology. 11 (2), 97-105 (2015).
  11. Nabi, H. A., Zubeldia, J. M. Clinical applications of 18F-FDG in oncology. Journal of Nuclear Medicine Technology. 30 (1), 3-9 (2002).
  12. Kostakoglu, L., Agress, H., Goldsmith, S. J. Clinical role of FDG PET in evaluation of cancer patients. Radiographics. 23 (2), 315-340 (2003).
  13. Hoh, C. K. Clinical use of FDG PET. Nuclear Medicine and Biology. 34 (7), 737-742 (2007).
  14. van de Weijer, T., Schrauwen-Hinderling, V. B. Application of magnetic resonance spectroscopy in metabolic research. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1865 (4), 741-748 (2019).
  15. Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and Flavoprotein. Biophysical Journal. 82, 2811-2825 (2002).
  16. Lagarto, J. L., et al. Characterization of NAD(P)H and FAD autofluorescence signatures in a Langendorff isolated-perfused rat heart model. Biomedical Optics Express. 9 (10), 4961-4978 (2018).
  17. Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. , Springer. Boston, MA. (2013).
  18. Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Johnson, M. L. Fluorescence lifetime imaging of free and protein-bound NADH. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 89 (4), 1271-1275 (1992).
  19. Nakashima, N., Yoshihara, K., Tanaka, F., Yagi, K. Picosecond fluorescence lifetime of the coenzyme of D-amino acid oxidase. Journal of Biological Chemistry. 255 (11), 5261-5263 (1980).
  20. Hu, L., Wang, N., Cardona, E., Walsh, A. J. Fluorescence intensity and lifetime redox ratios detect metabolic perturbations in T cells. Biomedical Optics Express. 11 (10), 5674-5688 (2020).
  21. Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. Journal of Biomedical Optics. 25 (7), 1-43 (2020).
  22. Liu, Z., et al. Mapping metabolic changes by noninvasive, multiparametric, high-resolution imaging using endogenous contrast. Science Advances. 4 (3), (2018).
  23. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Optical imaging using endogenous contrast to assess metabolic state. Annual Review of Biomedical Engineering. 14, 351-367 (2012).
  24. Varone, A., et al. Endogenous two-photon fluorescence imaging elucidates metabolic changes related to enhanced glycolysis and glutamine consumption in precancerous epithelial tissues. Cancer Research. 74 (11), 3067-3075 (2014).
  25. Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals. Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).
  26. Sharick, J. T., et al. Protein-bound NAD(P)H lifetime is sensitive to multiple fates of glucose carbon. Scientific Reports. 8 (1), 5456 (2018).
  27. Skala, M. C., et al. In vivo multiphoton microscopy of NADH and FAD redox states, fluorescence lifetimes, and cellular morphology in precancerous epithelia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19494-19499 (2007).
  28. Skala, M. C., et al. In vivo multiphoton fluorescence lifetime imaging of protein-bound and free nicotinamide adenine dinucleotide in normal and precancerous epithelia. Journal of Biomedical Optics. 12 (2), 024014 (2007).
  29. Uchugonova, A. A., König, K. Two-photon autofluorescence and second-harmonic imaging of adult stem cells. Journal of Biomedical Optics. 13 (5), 054068 (2008).
  30. Miranda-Lorenzo, I., et al. Intracellular autofluorescence: a biomarker for epithelial cancer stem cells. Nature Methods. 11 (11), 1161-1169 (2014).
  31. Walsh, A. J., et al. Classification of T-cell activation via autofluorescence lifetime imaging. Nature Biomedical Engineering. 5 (1), 77-88 (2021).
  32. Heaster, T. M., Humayun, M., Yu, J., Beebe, D. J., Skala, M. C. Autofluorescence imaging of 3D tumor-macrophage microscale cultures resolves spatial and temporal dynamics of macrophage metabolism. Cancer Research. 80 (23), 5408-5423 (2020).
  33. Pavillon, N., Hobro, A. J., Akira, S., Smith, N. I. Noninvasive detection of macrophage activation with single-cell resolution through machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (12), 2676-2685 (2018).
  34. Chang, C. H., et al. Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis. Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).
  35. Kaech, S. M., Cui, W. Transcriptional control of effector and memory CD8+ T cell differentiation. Nature Reviews. Immunology. 12 (11), 749-761 (2012).
  36. Gómez, C. A., Fu, B., Sakadžić, S., Yaseena, M. A. Cerebral metabolism in a mouse model of Alzheimer's disease characterized by two-photon fluorescence lifetime microscopy of intrinsic NADH. Neurophotonics. 5 (4), 045008 (2018).
  37. Yaseen, M. A., et al. In vivo imaging of cerebral energy metabolism with two-photon fluorescence lifetime microscopy of NADH. Biomedical Optics Express. 4 (2), 307-321 (2013).
  38. Bower, A. J., et al. High-speed label-free two-photon fluorescence microscopy of metabolic transients during neuronal activity. Applied Physics Letters. 118 (8), 081104 (2021).
  39. Walsh, A. J., et al. Quantitative optical imaging of primary tumor organoid metabolism predicts drug response in breast cancer. Cancer Research. 74 (18), 5184-5194 (2014).
  40. Walsh, A. J., et al. Optical metabolic imaging identifies glycolytic levels, subtypes, and early-treatment response in breast cancer. Cancer Research. 73 (20), 6164-6174 (2013).
  41. Chowdary, M. V. P., et al. Autofluorescence of breast tissues: Evaluation of discriminating algorithms for diagnosis of normal, benign, and malignant conditions. Photomedicine and Laser Surgery. 27 (2), 241-252 (2009).
  42. Demos, S. G., Bold, R., White, R. D., Ramsamooj, R. Investigation of near-infrared autofluorescence imaging for the detection of breast cancer. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 11 (4), 791-798 (2005).
  43. Heaster, T. M., Humayun, M., Yu, J., Beebe, D. J., Skala, M. C. Autofluorescence imaging of 3D tumor-macrophage microscale cultures resolves spatial and temporal dynamics of macrophage metabolism. Cancer Research. 80 (23), 5408-5423 (2020).
  44. Sharick, J. T., et al. Cellular metabolic heterogeneity in vivo is recapitulated in tumor organoids. Neoplasia. 21 (6), 615-626 (2019).
  45. Shah, A. T., Diggins, K. E., Walsh, A. J., Irish, J. M., Skala, M. C. In vivo autofluorescence imaging of tumor heterogeneity in response to treatment. Neoplasia. 17 (12), 862-870 (2015).
  46. Walsh, A. J., Skala, M. C. Optical metabolic imaging quantifies heterogeneous cell populations. Biomedical Optics Express. 6 (2), 559-573 (2015).
  47. Walsh, A. J., Skala, M. C. An automated image processing routine for segmentation of cell cytoplasms in high-resolution autofluorescence images. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XIV. , (2014).
  48. Skala, M., Ramanujam, N. Methods in Molecular Biology. 594, 155-162 (2010).
  49. Stringari, C., et al. Multicolor two-photon imaging of endogenous fluorophores in living tissues by wavelength mixing. Scientific Reports. 7, 3792 (2017).
  50. SPCImage 2.9: Data analysis software for fluorescence lifetime imaging microscopy. SPCImage. , Available from: https://biology.uiowa.edu/sites/biology.uiowa.edu/files/SPCIMAGE29.pdf (2007).
  51. CellProfiler. , Available from: https://cellprofiler.org/releases (2007).
  52. Autofluorescence Imaging. GitHub. , Available from: https://github.com/walshlab/Autofluorescence-Imaging (2021).
  53. Ramey, N. A., Park, C. Y., Gehlbach, P. L., Chuck, R. S. Imaging mitochondria in living corneal endothelial cells using autofluorescence microscopy. Photochemistry and Photobiology. 83 (6), 1325-1329 (2007).
  54. Walsh, A., Cook, R. S., Rexer, B., Arteaga, C. L., Skala, M. C. Optical imaging of metabolism in HER2 overexpressing breast cancer cells. Biomedical Optics Express. 3 (1), 75-85 (2012).
  55. Kolenc, O. I., Quinn, K. P. Evaluating cell metabolism through autofluorescence imaging of NAD(P)H and FAD. Antioxidants & Redox Signaling. 30, 875-889 (2019).
  56. Bird, D. K., et al. Metabolic mapping of MCF10A human breast cells via multiphoton fluorescence lifetime imaging of the coenzyme NADH. Cancer Research. 65, 8766-8773 (2005).
  57. Walsh, A. J., et al. Optical metabolic imaging identifies glycolytic levels, subtypes, and early-treatment response in breast cancer. Cancer Research. 73 (20), 6164-6174 (2013).
  58. Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. Optical imaging of drug-induced metabolism changes in murine and human pancreatic cancer organoids reveals heterogeneous drug response. Pancreas. 45 (6), 863-869 (2016).
  59. Gubser, P. M., et al. Rapid effector function of memory CD8+ T cells requires an immediate-early glycolytic switch. Nature Immunology. 14 (10), 1064-1072 (2013).
  60. Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Review. Immunology. 18 (1), 35-45 (2018).
  61. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. The Journals of Gerontology: Series A. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  62. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio-protocol. 8 (10), 2850 (2018).
  63. Becker, W. The bh TCSPC Handbook. , Available from: https://www.becker-hickl.com/wp-content/uploads/2021/10/SPC-handbook-9ed-05a.pdf (2021).
  64. Gadella, T. W. J. Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity. Mason, W. T. 34, Ch. 34 467-479 (1999).
  65. Miller, D. R., Jarrett, J. W., Hassan, A. M., Dunna, A. K. Deep tissue iImaging with multiphoton fluorescence microscopy. Current Opinion in Biomedical Engineering. 4, 32-39 (2017).
  66. Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).

Tags

Bioengineering udgave 177 FLIM Metabolisme NAD(P)H FAD Fluorescens Mikroskopi
Autofluorescensbilleddannelse til evaluering af cellulær metabolisme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Theodossiou, A., Hu, L., Wang, N.,… More

Theodossiou, A., Hu, L., Wang, N., Nguyen, U., Walsh, A. J. Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism. J. Vis. Exp. (177), e63282, doi:10.3791/63282 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter