Summary
Настоящий протокол описывает уникальную, клинически значимую модель заболевания периферических артерий, которая сочетает электрокоагуляцию бедренной артерии и вен с введением ингибитора синтазы оксида азота для индуцирования гангрены задних конечностей у мышей FVB. Внутрисердечная перфузия DiI затем используется для трехмерной визуализации сосудов подножки с высоким разрешением.
Abstract
Заболевание периферических артерий (PAD) является значительной причиной заболеваемости, возникающей в результате хронического воздействия атеросклеротических факторов риска. Пациенты, страдающие от его наиболее тяжелой формы, хронической угрожающей конечностям ишемии (ХМТ), сталкиваются с существенными нарушениями повседневной жизни, включая хроническую боль, ограниченное расстояние ходьбы без боли и незаживающие раны. Доклинические модели были разработаны на различных животных для изучения PAD, но ишемия задних конечностей мыши остается наиболее широко используемой. В этих моделях могут быть значительные различия в реакции на ишемическое оскорбление в зависимости от используемого штамма мыши, а также от места, количества и средств нарушения артериальной артерии. Этот протокол описывает уникальный метод, сочетающий электрокоагуляцию бедренной артерии и вен с введением ингибитора синтазы оксида азота (NOS) для надежного индуцирования гангрены подножки у мышей Friend Virus B (FVB), что напоминает потерю тканей CLTI. В то время как традиционные средства оценки реперфузии, такие как лазерная допплеровская перфузионная визуализация (LDPI), по-прежнему рекомендуются, внутрисердечная перфузия липофильного красителя 1,1'-диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндокарбоцианинперхлорат (DiI) используется для маркировки сосудистой системы. Последующая конфокальная лазерная сканирующая микроскопия с высоким разрешением позволяет проводить трехмерную (3D) реконструкцию сосудистых сетей подножки, что дополняет традиционные средства оценки реперфузии в моделях ишемии задних конечностей.
Introduction
Заболевание периферических артерий (PAD), характеризующееся снижением притока крови к конечностям из-за атеросклероза, поражает 6,5 миллиона человек в Соединенных Штатах и 200 миллионов человек во всем мире1. Пациенты с PAD испытывают снижение функции конечностей и качества жизни, а пациенты с CLTI, наиболее тяжелой формой PAD, подвергаются повышенному риску ампутации и смерти с 5-летней смертностью, приближающейся к 50%2. В клинической практике пациенты с голеностопно-плечевыми индексами (ABI) <0,9 считаются имеющими PAD, а пациенты с ABI <0,4, связанными либо с болью в покое, либо с потерей тканей, как имеющие CLTI3. Симптомы варьируются среди пациентов с аналогичными ИБИ в зависимости от повседневной активности, мышечной толерантности к ишемии, анатомических вариаций и различий в коллатеральном развитии4. Гангрена пальцев и конечностей является наиболее тяжелым проявлением всех сосудистых окклюзионных заболеваний, которые приводят к ХЛМ. Это форма сухого некроза, которая мумифицирует мягкие ткани. Помимо атеросклеротической PAD, она также может наблюдаться у больных сахарным диабетом, васкулитами, такими как болезнь Бюргера и феномен Рейно, или кальцифилаксией в условиях терминальной стадии почечной недостаточности5,6.
Было разработано несколько доклинических моделей для изучения патогенеза PAD/ CLTI и проверки эффективности потенциальных методов лечения, наиболее распространенным из которых остается ишемия задних конечностей мышей. Индуцирование ишемии задних конечностей у мышей обычно осуществляется путем обструкции кровотока из подвздошных или бедренных артерий, либо путем перевязки швов, электрокоагуляции или других средств сужения желаемого сосуда7. Эти методы резко уменьшают перфузию до задней конечности и стимулируют неоваскуляризацию в мышцах бедра и икр. Однако существуют существенные зависящие от штамма мышей различия в чувствительности к ишемическому инсульту, частично обусловленные анатомическими различиями в коллатеральном распределении8,9. Например, мыши C57BL/6 относительно устойчивы к ишемии задних конечностей, демонстрируя снижение функции конечностей, но, как правило, отсутствие признаков гангрены в подушечке ноги. С другой стороны, мыши BALB/c по своей природе имеют плохую способность восстанавливаться после ишемии и обычно развивают аутоампутацию стопы или голени только после перевязки бедренной артерии. Эта тяжелая реакция на ишемию сужает терапевтическое окно и может препятствовать продольной оценке реперфузии и функции конечностей. Интересно, что генетические различия в одном количественном локусе признака, расположенном на мышиной хромосоме 7, были вовлечены в эти дифференциальные восприимчивости мышей C57BL/6 и BALB/c к некрозу тканей и реперфузии конечностей10.
По сравнению со штаммами C57BL/6 и BALB/c, мыши FVB демонстрируют промежуточный, но непоследовательный ответ только на перевязку бедренной артерии. У некоторых животных развивается гангрена ног в виде черных ишемических ногтей или мумифицированных пальцев, а у других без каких-либо явных признаков ишемии11. Одновременное введение Nω-nitro-L-аргинина метилового эфира гидрохлорида (L-NAME), ингибитора синтазы оксида азота (NOS)12, предотвращает компенсаторные сосудорасширяющие механизмы и еще больше увеличивает окислительный стресс в ткани задних конечностей. В сочетании с перевязкой или коагуляцией бедренной артерии этот подход последовательно вызывает потерю ткани подножки у мышей FVB, которая напоминает атрофические изменения CLTI, но редко прогрессирует до аутоампутации конечностей11. Окислительный стресс является одной из отличительных черт PAD/CLTI и распространяется эндотелиальной дисфункцией и снижением биодоступности оксида азота (NO)13,14. NO представляет собой плюрипотентную молекулу, которая обычно оказывает благотворное влияние на артериальный и капиллярный кровоток, адгезию и агрегацию тромбоцитов, а также рекрутирование и активацию лейкоцитов13. Было также показано, что пониженные уровни NOS активируют ангиотензинпревращающий фермент, который индуцирует окислительный стресс и ускоряет прогрессирование атеросклероза15.
После того, как модель ишемии задних конечностей установлена, необходим мониторинг последующей реперфузии конечностей и терапевтического эффекта любых потенциальных методов лечения. В предложенной модели гангрены мышей степень потери тканей может быть сначала количественно определена с использованием оценки Фабера для оценки грубого внешнего вида стопы (0: нормальная, 1-5: потеря ногтей, где оценка представляет собой количество пораженных ногтей, 6-10: атрофия пальцев, где оценка представляет количество пораженных цифр, 11-12: частичная и полная атрофия стопы, соответственно)9. Количественные измерения перфузии задних конечностей затем обычно производятся с использованием LDPI, который опирается на доплеровские взаимодействия между лазерным светом и эритроцитами для указания перфузии на уровне пикселей в интересующей области (ROI)16. Хотя этот метод является количественным, неинвазивным и идеально подходит для повторных измерений, он не обеспечивает зернистую анатомическую детализацию сосудистой системы задних конечностей16. Другие методы визуализации, такие как микрокомпьютерная томография (микро-КТ), магнитно-резонансная ангиография (МРА) и рентгеновская микроангиография, оказываются либо дорогостоящими, требующими сложных инструментов, либо иным образом технически сложными16. В 2008 году Li et al. описали технику маркировки кровеносных сосудов в сетчатке липофильным карбоцианиновым красителем DiI17. DiI включается в эндотелиальные клетки и путем прямой диффузии окрашивает сосудистые мембранные структуры, такие как ангиогенные ростки и псевдоподальные процессы17,18. Благодаря его прямой доставке в эндотелиальные клетки и высокофлуоресцентной природе красителя, эта процедура обеспечивает интенсивную и длительную маркировку кровеносных сосудов. В 2012 году Boden et al. адаптировали технику перфузии DiI к модели ишемии задних конечностей мышей с помощью полной визуализации собранных мышц-аддукторов бедра после перевязки бедренной артерии19.
Текущий метод обеспечивает относительно недорогой и технически осуществимый способ оценки неоваскуляризации в ответ на ишемию заднего края и генную или клеточную терапию. В дальнейшей адаптации этот протокол описывает применение перфузии DiI для изображения сосудистой системы подножки в высоком разрешении и 3D в мышиной модели гангрены задних конечностей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных, описанные в протоколе, были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Университета Майами (IACUC). Для исследования использовались мыши FVB, как самцы, так и самки, в возрасте 8-12 недель.
1. Приготовление раствора L-NAME
- В стерильных условиях в ламинарной проточной вытяжке приготовьте раствор L-NAME, растворив 1 г порошка L-NAME (см. Таблицу материалов) в 20 мл стерильной воды для получения 50 мг/мл раствора. Хранить раствор в 300-500 мкл аликвот при -20 °C до 3 месяцев.
- Чтобы получить рабочий раствор L-NAME, разморозьте аликвоту раствора L-NAME и разбавьте PBS (1:4) в стерильных условиях для получения окончательной концентрации 10 мг/мл.
- Для приготовления PBS (рН 7,4) растворяют 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na2HPO4 и 0,23 г NaH2PO4 в 800 мл дистиллированной воды. Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью HCl. Добавьте воду до общего объема 1000 мл и фильтруйте через верхний фильтр бутылки 0,22 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Внутрибрюшинная (IP) инъекция 4 мкл/г рабочего раствора L-NAME эквивалентна желаемой дозе L-NAME 40 мг/кг. Рабочий раствор L-NAME следует держать на льду во время использования, а новые разведения следует производить ежедневно, используя свежеотмороженные аликвоты запасного раствора.
2. Химическая и хирургическая индукция гангрены задних конечностей
- Получите мышей FVB в возрасте 8-12 недель либо от заводчика, либо выведенных на объекте (см. Таблицу материалов). За 2 ч до операции вводят дозу L-NAME 40 мг/кг IP.
- Обезболивать мышей иП-инъекцией 100 мг/кг кетамина и 10 мг/кг ксилазина (см. Таблицу материалов), разбавленной в PBS. Подтвердите адекватную седацию отсутствием рефлекса защемления пальцев ног и продолжайте контролировать частоту дыхания во время процедуры.
- Удалите волосы с двусторонних задних конечностей и паха с помощью ножниц и / или крема для депиляции. Расположите животное под хирургическим микроскопом лежа на спине; вытянуть и заклеить конечности на месте. Стерилизуют хирургическое поле путем окружного нанесения раствора повидона-йода на место операции.
- Под 10-20-кратным увеличением используйте ножницы или скальпель, чтобы сделать разрез 1 см вдоль паховой складки, чуть ниже паховой связки. Используйте тонкие щипцы и стерильный аппликатор хлопчатобумажного наконечника, чтобы тупо рассекнуть паховую жировую подушку сбоку от паховой связки и обнажить подлежащую бедренную оболочку, чтобы бедренная артерия, вена и нерв были четко идентифицированы (рисунок 1).
- С помощью тонких щипцов проткните бедренную оболочку. Осторожно отмахните бедренный нерв от бедренной артерии. Определите взлет боковой циркумфлексной ветви бедренной артерии (LCFA) глубоко к бедренному нерву (рисунок 1).
- Продолжайте электрокоагуляцию бедренной артерии и вены непосредственно проксимально к LCFA, активируя устройство прижигания (см. Таблицу материалов) и осторожно контактируя с сосудами движением из стороны в сторону, гарантируя, что бедренный нерв хорошо изолирован и остается защищенным от термического повреждения. Разделите свернутый сегмент сосуда ножницами.
- Приступают к обнажению дистальной бедренной артерии и вены путем мобилизации паховой жировой подушки медиально. Выявляют поверхностную эпигастральную артерию и сафенополитный узел более дистально.
- Проткните бедренную оболочку между этими двумя местами и тщательно рассекните бедренный нерв от бедренных сосудов. Продолжайте свертывание и трансекцию бедренной артерии и вены, как описано на этапе 2.4.1.
- Орошайте хирургическое поле с помощью шприца, заполненного стерильным PBS. Получить гемостаз можно путем мягкого надавливания аппликатором хлопкового наконечника в течение 3-5 мин на любые участки кровотечения.
- Приступайте к закрытию разреза с помощью рассасывающегося шва 5-0 простым непрерывным способом. Вводят 1 мг/кг подкожной дозы бупренорфина с пролонгированным высвобождением (см. Таблицу материалов) для послеоперационного обезболивания.
- Подтвердите потерю перфузии подножки в лигированной задней конечности LDPI (см. Таблицу материалов). Пока животное все еще обезболено, поместите животное на темную поролоновую подушку в положение лежа под машиной LDPI и используйте петли электрической ленты, чтобы закрепить ноги на месте.
- Приступайте к LDPI двусторонних ног. После завершения сканирования нарисуйте рентабельность инвестиций вокруг каждой подножки и получите средние значения потока.
- Рассчитайте индекс перфузии как отношение средних значений потока от лигированной к нелигированной подножке. Убедитесь, что индекс перфузии меньше 0,1.
- Переместите животное обратно в чистую клетку с грелкой или верхней лампой для поддержания температуры тела. Обеспечьте полное восстановление после анестезии перед переводом мышей обратно в учреждение для животных.
3. Послеоперационное введение L-NAME и мониторинг гангрены задних конечностей
- В послеоперационные дни 1-3 вводят дополнительно 40 мг/кг IP дозы L-NAME каждому животному. При этом внимательно оцените стопу от ишемической конечности.
- Количественно оцените степень ишемии заднего конечного сустава и гангрены, используя показатель ишемии заднего конечности Фабера9. Баллы 1-5: количество ишемических ногтей; баллы 6-10: 1-5 ишемических цифр; баллы 11 и 12: частичная и полная атрофия стопы. Записывайте оценки Фабера в послеоперационные дни 1-3, а затем еженедельно.
4. Приготовление DiI и рабочих растворов для перфузии животных
- Для приготовления раствора DiI растворите 100 мг кристаллов DiI (см. Таблицу материалов) в 16,7 мл 100% этанола. Накрыть алюминиевой фольгой и оставить на качающейся платформе на ночь в темноте при комнатной температуре.
- Для приготовления разбавителя растворите 50 г глюкозы в 1000 мл дистиллированной воды с получением 5% раствора глюкозы. Фильтруйте через верхний фильтр для бутылок толщиной 0,22 мкм. Смешайте PBS и 5% растворы глюкозы в соотношении 1:4 для приготовления рабочего раствора разбавителя.
5. Настройка оборудования и перфузия DiI
- Сделайте DiI рабочим раствором, добавив 200 мкл раствора DiI к 10 мл рабочего раствора разбавителя (приготовленного на этапе 4.2) непосредственно перед использованием. Встряхните вручную, чтобы хорошо перемешать.
- Соедините два или три 3-позиционных запорных крана и иглу бабочки 25 G последовательно. Приготовьте шприцы 10 мл с 4 мл PBS, 10 мл раствора DiI и 10 мл 10% нейтрального буферизованного формалина (см. Таблицу материалов).
- Подключите шприц с формалином к проксимальному входному отверстию и введите раствор для промывки воздуха из линии; поверните запорный кран, чтобы закрыть порт. Повторите ту же процедуру последовательно, соединив шприцы с DiI, а затем PBS со средним и дистальным входными портами соответственно, позаботившись о том, чтобы промыть все пузырьки воздуха через узел запорного крана.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что в любой части запорного крана или трубки нет пузырьков воздуха. Пузырьки воздуха могут закупоривать мелкие артерии во время перфузии, что приводит к плохому внутрисосудистому распределению DiI и нарушению результатов визуализации. - Как только установка будет завершена, усыпьте животное передозировкой CO2 в индукционной камере.
- Поместите животное для перфузии в положение лежа на спине на абсорбирующей прокладке и закрепите подмышечные и нижние конечности иглами.
- С помощью ножниц сделайте поперечный разрез, чтобы открыть брюшную полость. Обнажите, а затем разделите левую и правую диафрагму для доступа к грудной полости.
- Отрежьте стенку грудной клетки по обе стороны грудины от нижних ребер до первого или второго ребер, избегая внутренних грудных (молочных) артерий медиально. Используйте гемостат (см. Таблицу материалов), чтобы захватить нижний конец грудины и отразить его к голове животного, чтобы обнажить грудную полость.
- Определите левый желудочек, который выглядит светлее по цвету, чем правый желудочек. Осторожно обхватите сердце тупыми щипцами и вставьте иглу бабочки в левый желудочек.
- Используйте ножницы или иглу весом 18 г, чтобы проколоть правое предсердие, позволяя крови и перфузионным растворам возвращаться к сердцу для дренажа. Стабилизируйте иглу одной или двумя руками, следя за тем, чтобы случайно не проколоть правый желудочек и не перфузировать легочное, а не системное кровообращение.
- Откройте порт к шприцу с PBS и вручную введите 2-4 мл со скоростью 1-2 мл/мин в течение 1-2 мин для вымывания крови из сосудистой системы. Обеспечьте успешную перфузию, наблюдая кровотечение из правого предсердия. После инъекции закройте порт шприца PBS.
- Откройте порт к шприцу с помощью DiI и введите 5-10 мл со скоростью 1-2 мл/мин в течение 5 мин. Следите за ушами, носом и ладонями, которые должны слегка порозоветь при инъекции раствора DiI. После инъекции закройте порт шприца DiI и подождите 2 мин, чтобы можно было внести краситель перед инъекцией фиксатора.
- Откройте порт к шприцу с формалином и введите 5-10 мл со скоростью 1-2 мл/мин в течение 5 мин. После инъекции извлеките иглу из левого желудочка и приступайте к сбору интересующих тканей.
- С помощью тяжелых ножниц вывихните большеберцовую кость на лодыжке, полностью отделив левую и правую ступни от голени. Поместите собранные ножки в 6- или 12-луночную плиту с 1-2 мл 10% раствора формалина. Оберните тарелку фольгой и храните при температуре 4 °C в течение ночи.
6. Подготовка ткани подушечки для конфокальной лазерной сканирующей микроскопии
- На следующий день замените фиксирующий раствор в 6- или 12-луночной пластине на 1-2 мл ПБС на скважину.
- Для снятия кожи стопы сначала делают продольный разрез скальпелем на подошвенном и спинном аспектах стопы. Затем, используя зубчатые щипцы и небольшой гемостат, аккуратно удалите всю кожу с стопы и пальцев, не повредив подлежащие мягкие ткани.
- Приступают к монтажу и визуализации тканей, желательно в течение 1-2 дней после перфузии и сбора урожая. В качестве альтернативы можно вернуть подножки на 6- или 12-луночные пластины с 1-2 мл PBS; покрыть фольгой и хранить при 4 °C для поддержания флуоресценции до 1 месяца.
- Для крепления тканей по отдельности поместите ножки между двумя предметными стеклами микроскопа с сложенной над собой пенопластовой биопсийной прокладкой (один или два раза в зависимости от толщины ткани) на каждом конце (см. Таблицу материалов). Используйте два небольших зажима для связующего, чтобы сжать стеклянные слайды вместе на каждом конце (окончательная толщина примерно 1 мм).
ПРИМЕЧАНИЕ: Более толстые ткани потребуют более длительного времени сканирования. Подушечка для ног с кожей может быть сжата между стеклянными слайдами за один день до визуализации, чтобы уменьшить толщину ткани.
7. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия
- Подготовьтесь к сеансу обработки изображений: включите систему обработки изображений и запустите программное обеспечение для сбора данных (см. Таблицу материалов). Используйте объектив с низким увеличением / низкой числовой диафрагмой (например, x5 / 0,15) для захвата изображений, поскольку линзы с более низким увеличением обычно имеют более длинные рабочие расстояния, необходимые для этого эксперимента.
- Нажмите кнопку Да в диалоговом окне Активировать этап. Активируйте лазер 561 нм на вкладке Конфигурация. На главном экране активируйте видимый путь луча, нажав на кнопку Видимый . Установите детектор в диапазон 570-600 нм, нажав на соответствующий флажок Active .
- Выберите значок «Сканирование плитки» на вкладке «Получение > и задайте требуемое разрешение (512 x 512 или 1024 x 1024).
- Поместите сухо установленный (без добавления воды или PBS) образец ткани, сжатый между стеклянными слайдами на ступени микроскопа, и поместите ткань в фокус.
- Чтобы задать границы сканирования, перейдите в левый верхний или правый угол образца. На вкладке Приобретение в меню Сканирование плитки нажмите кнопку Пометить положение . Перейдите в противоположный угол (внизу справа или слева соответственно) и нажмите кнопку «Отметить позицию» еще раз.
- Чтобы задать глубину Z-стека, нажмите кнопку Live в левом нижнем углу экрана и перейдите к центру образца. Используйте ручку оси Z для прокрутки до нижней части образца.
- На вкладке Приобретение в меню Z-Stack нажмите кнопку Начать . Прокрутите образец до конца и нажмите кнопку Конец . Нажмите на Z-шаг Размер и установите нужное значение (например, 50 мкм).
- В правом нижнем углу экрана нажмите кнопку Пуск , чтобы начать получение изображения.
8. Количественный анализ и 3D реконструкция васкулярности подушечки стопы
- Загрузите и установите последнюю версию Fiji (ImageJ), а также плагин Vessel Analysis20. Откройте файлы изображений микроскопии на Фиджи, которые объединят отдельные Z-серии в Z-стеки, которые можно просматривать по оси Z с помощью ползунка в нижней части изображения.
- Выберите составное изображение Z-стека, а затем в меню Изображение выберите Стеки > Z Project , чтобы создать двумерную проекцию. Затем преобразуйте Z-проекцию в двоичный в разделе Process > Binary > Make Binary.
- Запустите плагин «Плотность сосудов» в разделе «Плагины > «Плотность сосудов». При появлении запроса используйте курсор для трассировки ROI по периметру подножки и цифр. Обратите внимание на сообщаемую плотность сосудов, которая выражается в процентах от ROI (фракция сосудистой области).
- Чтобы создать 3D-реконструкции на Фиджи, выберите Стеки > 3D Project и задайте нужную ось поворота, угол и скорость в меню Изображение. Кроме того, выберите Volume Viewer в меню «Плагины», чтобы визуализировать изображения в виде фрагментов или манипулировать реконструкцией по нужным осям.
- Для более сложного 3D-рендеринга используйте альтернативное программное обеспечение для анализа и обработки изображений (см. Таблицу материалов). Конвертируйте файлы в нужный формат программного обеспечения и сшивайте отдельные сканы плиток с помощью функции сшивания плиток.
- После сшивания отдельных сканов плиток откройте составной файл и приступайте к рендерингу объемной поверхности. Щелкните Добавить новую поверхность , чтобы открыть мастер создания surface, и используйте стрелки для переключения между меню, в частности, для настройки рентабельности инвестиций и пороговой интенсивности. После того, как вы удовлетворены рендерингом поверхности, используйте функциональность анимации для создания видео обработанного изображения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом протоколе подробно описывается надежное средство индуцирования ишемии и потери тканей в подножке мышей с использованием комбинации коагуляции бедренной артерии и вены с введением L-NAME, ингибитором синтазы оксида азота, у восприимчивых мышей FVB. На рисунке 1 подробно описана анатомия сосудистой системы задних конечностей мышей и указаны участки коагуляции бедренной артерии и вены (желтый X), непосредственно проксимально к боковой циркумфлексной бедренной артерии (LCFA) и проксимально к подкожно-подкожному соединению. LCFA должен быть идентифицирован, и участки коагуляции, соответствующие этой структуре, остаются последовательными на протяжении всех хирургических процедур. Как описано, за 2 ч до хирургических процедур и на 1-3 послеоперационные дни мышам также вводили 40 мг/кг IP L-NAME для поддержания повышенного уровня окислительного стресса в тканях. На рисунке 2 показаны изменения потери тканей, которые можно ожидать от этой модели через неделю после операции, причем баллы Фабера9 записываются в правом нижнем углу каждого изображения.
Перфузию DiI проводили у мышей FVB через 5 и 20 дней после коагуляции бедренной артерии и вен для оценки реперфузии задних конечностей после индукции ишемии. Рисунок 3А иллюстрирует анатомию мышей после рассечения для обнажения грудной полости. Игла бабочки вводится в левый желудочек, чтобы начать сердечную перфузию. Обратите внимание, что левый желудочек выглядит немного бледнее по цвету, чем правый желудочек. На рисунке 3B показано оборудование, установленное с запорными кранами, соединенными последовательно, и тремя шприцами, заполненными PBS, раствором DiI и фиксатором. После перфузии DiI ноги собирали, снимали кожу и сжимали между слайдами микроскопа, как показано на рисунке 3C, D перед визуализацией с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа под 5-кратным увеличением. Снимки реконструкционной микроскопии показали нормальную анатомию сосудов в нелигированной контрольной подушечке стопы (рисунок 4A) по сравнению с сильно уменьшенной перфузией к подушечке ноги перевязанного заднего скольжения через 5 дней после операции (рисунок 4B). Через двадцать дней после операции перфузия в подушечку ноги значительно улучшилась (рисунок 4C, D и рисунок 5B), хотя и не до степени нелигированного контроля (рисунок 4A и рисунок 5A). Васкулярность была количественно определена, как описано выше, с использованием плагина плотности сосудов на Фиджи. Сосудистая фракция для контрольной подножки составила 28%. Через пять дней после операции сосудистая фракция подушечки ног была сильно снижена до 2%, но постепенно восстановилась до 15% и 18% у двух отдельных мышей к 20 дням после операции. Чтобы визуализировать сосудистую анатомию подножки в 3D, мы импортировали сшитое микроскопическое изображение в альтернативное программное обеспечение для анализа и обработки изображений для создания рендеринга поверхности, как описано ранее (дополнительный рисунок 1). Затем было создано видео рендеринга поверхности с использованием функции анимации (Видео 1).
Рисунок 1: Анатомия сосудистой системы задних конечностей мышей и участков коагуляции бедренной артерии и вен. Наружная подвздошная артерия продолжается как бедренная артерия (ФА) дистальнее паховой связки. Первые ветви бедренной артерии включают латеральный циркумфлекс (LCFA) и глубокие бедренные артерии (не изображены). Более дистально проксимальная каудальная бедренная (PCFA) и поверхностная каудальная эпигастральная артерии (SCEA) разветвляются от FA проксимальной до бифуркации подкожных (SA) и подколенных артерий (PA). Бедренный нерв (FN) проходит рядом с бедренными сосудами и должен быть осторожно изолирован перед коагуляцией бедренных сосудов. Также показаны места свертывания ФА и бедренной вены (FV) (X). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативные изображения гангрены задних конечностей у мышей FVB с соответствующими оценками Фабера. Степень ишемических изменений, индуцированных этой моделью, варьируется от одного или нескольких ишемических ногтей (баллы Фабера 1-5) до гангренозных пальцев (оценки Фабера 6-10) и частичной или полной атрофии стопы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Вскрытие животных и настройка оборудования для перфузии DiI и установка ноги мыши для визуализации. (A) Анатомическая фотография анатомии мышей во время перфузии DiI. Брюшная и грудная полости вскрываются, грудина отражается, а ребра разрезаются по обе стороны грудины. Игла бабочки весом 25 г, соединенная с запорным краном, вставляется в левый желудочек. (B) Три 3-полосных запорных крана соединены последовательно. Три шприца по 10 мл заполнены фиксатором, DiI и PBS и подключены к запорному крану. Игла бабочки 25 G соединена с выходным отверстием проксимального запорного крана. (C) Установка обтянутой кожей ножки между двумя предметными стеклами микроскопа со сложенной пенопластовой биопсийной прокладкой и связующим зажимом на каждом конце для сжатия слайдов вместе. (D) Альтернативный вид обтянутой кожей ноги, сжатой между слайдами микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные 5-кратные изображения, полученные с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии подножки мыши после перфузии DiI с количественной плотностью сосуда, выраженной в процентах от ROI. (A) Нормальная сосудистая подушечка для ног. (B) Сосудистая подушечка стопы через 5 дней после свертывания бедренной артерии и вены показывает сильно сниженную перфузию с минимальным помутнением сосудов. (C) Сосудистая подушечка ноги через 20 дней после коагуляции бедренной артерии и вены демонстрирует некоторое восстановление дистального потока к плюсневым и цифровым артериям. (D) Изображение дополнительной подушечки для ног мыши, полученное через 20 дней после коагуляции бедренной артерии и вены, показывающее минимальное увеличение сосудов по сравнению с микрососудистым помутнением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Увеличенные изображения сосудистой подушечки подножки. (A) 5-кратные и 20-кратные изображения сосудистой системы контрольной подножки, демонстрирующие интактную перфузию через плюсневые и цифровые артерии. (B) 5-кратные и 20-кратные изображения подушечки ноги с перевязанного заднего сгибания через 20 дней после операции, показывающие снижение перфузии через более крупные ветви плюсневых артерий, но развитие обширной плюшевой капиллярной сети. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Видео 1: Анимация 3D-рендеринга поверхности сосудистой системы подножки. Видео, отображающее рендеринг поверхности сосудистой подушечки, иллюстрирует 3D-разрешение, достижимое с помощью описанного протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Дополнительный рисунок 1: Этапы визуализации поверхности перфузионных изображений DiI. (A) Оригинальное перфузионное изображение DiI, импортированное в программное обеспечение для анализа и обработки изображений. (B) Визуализация поверхности, наложенная на перфузионное изображение DiI во время установки пороговой интенсивности. (C) Окончательная 3D-визуализация поверхности изображения перфузионной микроскопии DiI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В то время как ишемия задних конечностей мышей является наиболее широко используемой доклинической моделью для изучения неоваскуляризации при PAD и CLTI, существуют значительные различия в тяжести и восстановлении ишемии в зависимости от конкретного используемого штамма мыши, а также места, количества и метода артериального разрушения. Комбинация перевязки бедренной артерии и введения IP L-NAME может надежно индуцировать гангрену задних конечностей у мышей FVB11. Такое же лечение приводит к ишемии задних конечностей без потери тканей у мышей C57BL/6, тогда как у мышей BALB/c аутоампутация стопы или ноги может быть вызвана только перевязкой бедренной артерии. Таким образом, вышеописанная методика коагуляции бедренной артерии с одновременным введением L-NAME у мышей FVB, которые имеют промежуточный ответ на оскорбление ишемии, обеспечивает уникальную и воспроизводимую модель гангрены стопной подушечки, сродни той, которая наблюдается при наиболее тяжелом проявлении заболеваний, приводящих к ХЛМ. Степень потери тканей, наблюдаемая с помощью этой модели, может варьироваться от нескольких ишемических ногтей до нескольких гангренозных пальцев, но редко прогрессирует до аутоампутации стопы или ноги, что позволяет продольно оценить реперфузию и функцию конечностей. В отличие от мышей BALB / c, у которых начало гангрены является быстрым с аутоампутацией конечностей, обычно происходящей менее чем за одну неделю, в этой модели гангрены мышей FVB наблюдается отсроченное начало потери тканей. Свертывание бедренной артерии остро ограничивает приток крови к задним конечностям. Тем не менее, накопление окислительного стресса из-за введения L-NAME в послеоперационные дни 0-3 происходит более постепенно, с пиковыми атрофическими изменениями, наблюдаемыми между 7-14 днями. Таким образом, эта модель предлагает улучшенное терапевтическое окно для оценки влияния конкретного вмешательства на грубый внешний вид тканей и спасение потери тканей в дополнение к количественной оценке реперфузии и оценке функции конечностей.
Что касается хирургической техники, коагуляция или перевязка как бедренной артерии, так и вены является предпочтительной из-за относительной легкости этой операции по сравнению с изоляцией бедренной артерии. Хотя этот метод может привести к венозному тромбозу и недостаточности, он усугубляет ишемическое оскорбление и помогает более надежно вызывать гангренозные изменения. Кроме того, хроническая венозная недостаточность (ХВН) широко распространена среди населения в целом, причем 10-30% взрослых страдают. Последовательно, примерно 20% пациентов с PAD, особенно с тяжелой артериальной недостаточностью, также имеют коморбидный CVI21,22. Независимо от того, решит ли кто-то связать или коагулировать бедренную вену, критически важно поддерживать конкретный участок (участки) нарушения бедренной артерии постоянным в экспериментальных группах. Более близкие перевязки, такие как подвздошная артерия, приводят к окклюзии дополнительных нисходящих коллатералей и ограничивают возможность артериогенеза8,16. Тем не менее, ангиогенез в дистальной части конечности, особенно икроножной мышце, все равно должен быть запущен. У мышей FVB двойная перевязка или коагуляция бедренной артерии непосредственно вблизи боковой циркумфлексной бедренной артерии и проксимально к сафенопколлетной бифуркации более последовательно индуцирует гангрену, чем один сайт перевязки или коагуляции.
Следует отметить, что у пациентов с PAD и CLTI ишемия конечностей вызвана атеросклеротической обструкцией (хроническим процессом). Напротив, в мышиных моделях ишемия конечностей индуцируется хирургическим путем (острый процесс). Хотя эта модель гангрены задних конечностей FVB мыши имеет относительно более медленное начало гангрены с отсроченной пиковой тяжестью потери тканей, она напрямую не сопоставима с хроническим, прогрессирующим артериальным стенозом, характерным для PAD и CLTI. Другие группы разработали методы окклюзии подострой бедренной артерии с использованием амероидных констрикторов, состоящих из внешнего металлического рукава и внутреннего слоя влагопоглощающего материала, который постепенно саморасширяется. Было показано, что этот метод приводит к снижению экспрессии воспалительных маркеров, снижению восстановления кровотока через 4-5 недель и снижению мышечного некроза23,24. Помимо различий в остроте ишемии, доклинические модели с использованием молодых, здоровых животных также не могут воспроизвести факторы риска, такие как диабет, гипертония, ожирение, гиперлипидемия, курение и инфекция, которые способствуют серьезным неблагоприятным событиям в конечностях и бремени сосудистых заболеваний.
В большинстве исследований ишемии задних конечностей мышей восстановление притока крови к ишемической задней конечности обычно оценивается с помощью LDPI24,25. Этот метод является неинвазивным и повторяемым, но на него может влиять температура тела, использование анестетика, наличие волос и позиционирование задних конечностей26. Стандартизация этих процедур и использование нелигированной задней конечности в качестве внутреннего контроля может помочь смягчить любые изменения. В отличие от LDPI, микро-КТ и MRA обеспечивают анатомическую информацию высокого разрешения, 3D, но традиционно требуют инъекции контрастного вещества16. Рентгеновская микроангиография также является инвазивной и технически сложной16,27. Как и DiI, перфузия с помощью рентгеноконтрастных силиконовых литейных агентов позволяет проводить посмертную 3D-реконструкцию периферических сосудов28. Внутрисердечная или хвостовая инъекция флуоресцентного лектина также была описана для маркировки тканевой сосудистой системы29. После сбора интересующих тканей для количественной оценки плотности капилляров часто используется иммуногистохимическое окрашивание эндотелиально-специфическими маркерами (например, CD31, фактор фон Виллебранда).
По сравнению с методами, упомянутыми выше, перфузия DiI дает несколько преимуществ. Во-первых, необходимые реагенты и материалы относительно недороги, при условии доступа к конфокальному лазерному сканирующему микроскопу. Этот метод позволяет проводить 3D-реконструкцию сосудистой системы, которая может быть количественно определена с помощью программного обеспечения для анализа изображений. В то время как этот протокол фокусируется на сосудистой системе подножки, цельная визуализация других тканей задних конечностей мышей, особенно икроножных и аддукторных мышц, также возможна и актуальна для исследований ангиогенеза и артериогенеза19 . Этот метод может быть модифицирован для более крупных животных моделей, включая крыс и кроликов, путем увеличения объема перфузионных растворов. Тем не менее, ограничения визуализации в отношении размера ткани описаны ниже.
Критические части перфузии DiI следующие. Пузырьки воздуха в аппарате могут закрывать мелкие сосуды и препятствовать распределению DiI по всей сосудистой системе, тем самым влияя на результаты визуализации. Таким образом, необходимо позаботиться об удалении любых пузырьков воздуха в аппарате запорного крана и трубке перед перфузией. Фильтрация всех растворов, кроме DiI, через верхний фильтр для бутылок толщиной 0,22 мкм также рекомендуется для удаления любых микрочастиц. Во время внутрисердечной перфузии тщательно контролируйте легкие. Если они становятся увеличенными и приобретают розовый цвет, это признак того, что игла бабочки проникла в правый желудочек и нуждается в небольшом втягивании.
Важным ограничением перфузии DiI является терминальный характер процедуры, который не допускает повторных измерений. Поскольку плохие результаты перфузии могут отражать лежащую в основе артериальную недостаточность или техническую ошибку, рекомендуется сбор и визуализация нелигированного заднего конечного сустава в качестве внутреннего контроля. Что касается визуализации, оптимальная толщина ткани для лазерного проникновения составляет ~ 1 мм после сжатия. Следовательно, более крупные ткани требуют секционирования на более мелкие части, которые будут установлены на слайдах и размещены на ступени микроскопа и пропорционально более длительного времени получения изображения.
Таким образом, этот протокол описывает уникальную доклиническую модель для изучения PAD и CLTI. В частности, коагуляция бедренной артерии и вены при одновременном введении L-NAME, ингибитора NOS, надежно индуцирует потерю тканей в подушечках ног мышей FVB. Посмертная, внутрисердечная перфузия DiI затем используется для флуоресцентной маркировки сосудистой системы. Последующая цельномонтная визуализация собранных стоп с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии позволяет проводить 3D-реконструкцию сосудистой системы подножки с высоким разрешением и визуализацию артериальных и капиллярных сетей, что дополняет традиционные средства оценки реперфузии в моделях ишемии задних конечностей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами Z-J L и OC V от Национальных институтов здравоохранения [R01HL149452 и VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. Мы также благодарим Центр микроскопии и визуализации Проекта Майами по лечению паралича в Медицинской школе Университета Майами за предоставление доступа к их программному обеспечению для анализа и обработки изображений.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binder clips (small) | Office supply store | ||
| Buprenorphine (sustained-release) | |||
| Butterfly needle (25 G with Luer-Lok) | VWR | 10148-584 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5 | |
| DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D282 | |
| Electrocautery device | Gemini Cautery System | 5917 | |
| Ethanol (100%) | VWR | 89370-084 | |
| Fiji (ImageJ) software | NIH | Used version 2.1.0. Free download, no license required. | |
| Foam biopsy pads | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
| Formalin (neutral buffered, 10%) | VWR | 89370-094 | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 001800 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HCl (1 M) | Sigma-Aldrich | 13-1700 | |
| Imaris software | Oxford Instruments | Used version 9.6.0. | |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-04 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Ketamine | |||
| L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride) | Sigma-Aldrich | N5751 | |
| Laser Doppler perfusion imager | MoorLDI | moorLDI2-HIR | Used moorLDI V5 software. |
| Microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | VWR | 48311-703 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8263 | |
| Needles (27 G) | BD | 305109 | |
| Povidone-iodine swabstick (10%) | Medline | MDS093901ZZ | |
| Surgical instruments | Roboz Surgical | Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended. | |
| Suture (5-0 absorbable) | DemeTECH | G275017B0P | |
| Syringes (10 mL) | BD | 305482 | |
| Three-way stopcocks | Cole-Parmer | 19406-49 | |
| Vascular Analysis Plugin | Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015). | ||
| Xylazine |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139 (2020).
- Duff, S., Mafilios, M. S., Bhounsule, P., Hasegawa, J. T. The burden of critical limb ischemia: A review of recent literature. Vascular Health and Risk Management. 15, 187-208 (2019).
- Mills, J. L., et al. The society for vascular surgery lower extremity threatened limb classification system: Risk stratification based on Wound, Ischemia, and foot Infection (WIfI). Journal of Vascular Surgery. 59 (1), 220-234 (2014).
- Conte, M. S., et al. Global vascular guidelines on the management of chronic limb-threatening ischemia. Journal of Vascular Surgery. 69 (6), (2019).
- Yeager, R. A. Relationship of hemodialysis access to finger gangrene in patients with end-stage renal disease. Journal of Vascular Surgery. 36 (2), 245-249 (2002).
- Al Wahbi, A. Autoamputation of diabetic toe with dry gangrene: A myth or a fact. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 11, 255-264 (2018).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (23), e1035 (2009).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains. Physiological Genomics. 30 (2), 179-191 (2007).
- Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).
- Parikh, P. P., et al. A Reliable Mouse Model of Hind limb Gangrene. Annals of Vascular Surgery. 48, 222-232 (2018).
- Kopincová, J., Púzserová, A., Bernátová, I. L-NAME in the cardiovascular system - nitric oxide synthase activator. Pharmacological Reports. 64 (3), 511-520 (2012).
- Soiza, R. L., Donaldson, A. I. C., Myint, P. K. Pathophysiology of chronic peripheral ischemia: new perspectives. Therapeutic Advances in Chronic Disease. 11, 1-15 (2020).
- McDermott, M. M., et al. Skeletal muscle pathology in peripheral artery disease a brief review. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (11), 2577-2585 (2020).
- Usui, M., et al. Pathogenic role of oxidative stress in vascular angiotensin-converting enzyme activation in long-term blockade of nitric oxide synthesis in rats. Hypertension. 34 (4), 546-551 (1999).
- Aref, Z., de Vries, M. R., Quax, P. H. A. Variations in surgical procedures for inducing hind limb ischemia in mice and the impact of these variations on neovascularization assessment. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 1-14 (2019).
- Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: Versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333-341 (1989).
- Boden, J., et al. Whole-mount imaging of the mouse hindlimb vasculature using the lipophilic carbocyanine dye DiI. BioTechniques. 53 (1), 3-6 (2012).
- Elfarnawany, M. H. Signal processing methods for quantitative power doppler microvascular angiography. Electronic Thesis and Dissertation Repository. , 3106 (2015).
- Matic, M., Matic, A., Djuran, V., Gajinov, Z., Prcic, S., Golusin, Z. Frequency of peripheral arterial disease in patients with chronic venous insufficiency. Iranian Red Crescent Medical Journal. 18 (1), 1-6 (2016).
- Ammermann, F., et al. Concomitant chronic venous insufficiency in patients with peripheral artery disease: Insights from MR angiography. European Radiology. 30 (7), 3908-3914 (2020).
- Yang, Y., et al. Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral artery occlusion are distinct in the mouse. Journal of Vascular Surgery. 48 (6), 1546-1558 (2008).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (112), e54166 (2016).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-432 (2018).
- Greco, A., et al. Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion. Sensors. 13 (1), 500-515 (2013).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: Functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS ONE. 8 (12), 84047 (2013).
- Hlushchuk, R., Haberthür, D., Djonov, V. Ex vivo microangioCT: Advances in microvascular imaging. Vascular Pharmacology. 112, 2-7 (2019).
- Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
- Lee, J. J., et al. Systematic interrogation of angiogenesis in the ischemic mouse hind limb: Vulnerabilities and quality assurance. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40, 2454-2467 (2020).
