Visualización del tráfico dependiente de citoesqueletos de orgánulos que contienen lípidos en embriones de Drosophila

Summary

En el embrión temprano de Drosophila , muchos orgánulos son móviles. En principio, se pueden obtener imágenes en vivo a través de sondas fluorescentes específicas, pero la cáscara del huevo impide la aplicación directa al embrión. Este protocolo describe cómo introducir tales sondas a través de la microinyección, y luego analizar el movimiento de orgánulos a granel a través de la velocimetría de imagen de partículas.

Abstract

Los embriones tempranos de Drosophila son células grandes que contienen una amplia gama de orgánulos convencionales y específicos del embrión. Durante las primeras tres horas de embriogénesis, estos orgánulos experimentan movimientos dramáticos impulsados por la transmisión citoplasmática basada en actina y el tráfico impulsado por motores a lo largo de los microtúbulos. El desarrollo de una multitud de pequeñas sondas fluorescentes (FP) específicas de orgánulos permite visualizar una amplia gama de diferentes estructuras que contienen lípidos en cualquier genotipo, lo que permite obtener imágenes en vivo sin requerir un fluoróforo codificado genéticamente. Este protocolo muestra cómo inyectar colorantes vitales y sondas moleculares en embriones de Drosophila para monitorear el tráfico de orgánulos específicos mediante imágenes en vivo. Este enfoque se demuestra mediante el etiquetado de gotas lipídicas (LD) y siguiendo su movimiento a granel mediante velocimetría de imagen de partículas (PIV). Este protocolo proporciona una estrategia susceptible para el estudio de otros orgánulos, incluidos los lisosomas, las mitocondrias, las vesículas de yema y la sala de emergencias, y para rastrear el movimiento de los LD individuales a lo largo de los microtúbulos. El uso de tintes disponibles comercialmente trae los beneficios de la separación en las regiones violeta / azul y rojo lejano del espectro. Mediante el co-etiquetado multiplex de orgánulos y/o elementos citoesqueléticos a través de microinyección, todos los recursos genéticos en Drosophila están disponibles para estudios de tráfico sin la necesidad de introducir proteínas marcadas fluorescentemente. A diferencia de los fluoróforos codificados genéticamente, que tienen bajos rendimientos cuánticos y blanquean fácilmente, muchos de los colorantes disponibles permiten la captura rápida y simultánea de varios canales con altos rendimientos de fotones.

Introduction

Los colorantes vitales y las sondas moleculares son herramientas poderosas para obtener imágenes de estructuras celulares específicas y orgánulos en vivo. En el embrión de Drosophila, muchos orgánulos diferentes muestran una localización impulsada por el citoesqueleto 1,2,3,4, pero la aplicación de estas pequeñas moléculas es un desafío porque la cáscara del huevo es impermeable a muchas de ellas. Este protocolo describe un método para utilizar sondas fluorescentes (FP) en embriones vivos a través de microinyección con el fin de detectar el tráfico a gran escala de orgánulos. El procedimiento cubre la preparación de la solución inyectable, la recolección de óvulos y la preparación de embriones, la microinyección, las imágenes y el análisis de imágenes.

Los reordenamientos espaciales dramáticos de orgánulos son comunes en muchos ovocitos, óvulos y embriones animales, en parte debido al gran tamaño de estas células. En el embrión de Drosophila , por ejemplo, las gotas lipídicas (LD) y las vesículas de yema se mueven hacia el centro embrionario justo antes de la celularización⁵. Este movimiento depende de los microtúbulos y deja una región de ~ 40 μm alrededor de la periferia del embrión agotada de los dos orgánulos. Durante las primeras etapas de escisión, muchos orgánulos son transportados por flujos citoplasmáticos que son impulsados por contracciones basadas en actina-miosina en la superficie del embrión⁶. Aunque los embriones de muchas especies exhiben reordenamientos similares, el embrión de Drosophila es particularmente adecuado para seguir estos procesos por imágenes porque se desarrolla externamente a "temperatura ambiente" estándar del laboratorio, es relativamente transparente, lo suficientemente pequeño como para caber en la mayoría de las configuraciones de microscopio y puede manipularse utilizando poderosas herramientas genéticas.

Para algunos orgánulos, hay disponibles proteínas marcadas fluorescentemente que etiquetan específicamente estas estructuras. Por ejemplo, LSD-2 (también conocida como dPLIN2) es una proteína que en embriones se dirige específicamente a LDs⁷. Hay líneas de moscas disponibles que transportan transgenes inducibles que codifican una fusión entre green fluorescent Protein (GFP) y LSD-2⁸ o una trampa genética en la que se inserta proteína fluorescente amarilla (YFP) en la región codificante del gen endógeno LSD-2 ^9,10. Sin embargo, este enfoque tiene limitaciones, incluyendo que estas proteínas de fusión tienen bajos rendimientos cuánticos y tienden a blanquearse fácilmente. Además, el etiquetado de múltiples estructuras diferentes simultáneamente puede ser un desafío: para muchos orgánulos, solo un tipo de etiqueta fluorescente (a menudo GFP o mCherry) está disponible actualmente, por lo que la obtención de imágenes de dos orgánulos al mismo tiempo puede requerir nuevos transgenes o inserciones; además, incluso si hay etiquetas compatibles disponibles, introducirlas en una sola cepa puede requerir cruces que consumen mucho tiempo. También hace que el uso de los muchos recursos genéticos poderosos sea menos conveniente, por ejemplo, si dos marcadores de orgánulos, un controlador Gal4 y una construcción de ARNi inducible tienen que estar presentes en la misma madre.

En principio, estas limitaciones se pueden superar con el uso de PF, incluidos colorantes vitales (por ejemplo, LysoTracker para marcar lisosomas), sondas moleculares (por ejemplo, SiR-tubulina para etiquetar microtúbulos) y moléculas biológicas marcadas con fluorescencia (por ejemplo, C12 BODIPY para sondear el metabolismo de los ácidos grasos¹¹). Desde su uso en células cultivadas, generalmente están bien validadas como herramientas poderosas para sondear la biología celular. Los FP son versátiles, tienen propiedades fotográficas superiores y son compatibles con proteínas fluorescentes. Se pueden mezclar y aplicar múltiples tintes simultáneamente, a menudo con los beneficios de la separación en las áreas violeta / azul y rojo lejano del espectro y pequeños cambios de Stokes, evitando el sangrado del canal. Los pequeños cambios de Stokes permiten la captura simultánea de múltiples canales de imagen, lo que permite el seguimiento de varios orgánulos a la vez. Finalmente, también se pueden aplicar al etiquetado de orgánulos en los embriones de otras especies de Drosophila o incluso otros insectos donde no se pueden disponer de proteínas marcadas fluorescentemente.

Sin embargo, la mayoría de estos FP no pueden atravesar la elaborada cáscara de huevo del embrión de Drosophila . Consta de cinco capas: tres capas coriónicas externas (corion) que evitan daños mecánicos más una capa cerosa que rodea la membrana vitelline que crea una barrera química¹². Para simplificar, la combinación de la capa cerosa y la membrana vitelina se denominará "membrana vitelina" a continuación. Para evitar la cáscara del huevo, este protocolo adapta un enfoque de microinyección embrionaria establecido para introducir FP en el embrión de Drosophila . El protocolo describe cómo monitorear el flujo citoplasmático de LD en embriones en etapa de escisión. Incluye la preparación de agujas de inyección y jaulas de recolección de huevos, el proceso de recolección de huevos y la extracción mecánica del corion. Repasa cómo microinyectar e obtener imágenes de los embriones y cómo analizar el flujo masivo de LD utilizando la velocimetría de imagen de partículas (PIV, adaptada de⁶). Proporciona consejos sobre la solución de problemas para garantizar la supervivencia del embrión y crear el mejor sistema para la obtención de imágenes. También se discute cómo se puede modificar el protocolo para obtener imágenes simultáneas de LD y microtúbulos o para aplicarlo al estudio de otros orgánulos, incluidos los lisosomas, las mitocondrias, las vesículas vitelinosas y el retículo endoplásmico (RE).

Protocol

1. Preparar los materiales necesarios

NOTA: Estos preparativos se realizan mejor con días o semanas de anticipación.

1. Preparar agujas de inyección.
   NOTA: Las agujas se pueden almacenar indefinidamente en un recipiente cubierto. Las agujas deben ser lo suficientemente finas como para entregar ~ 700 fL mientras que son lo suficientemente fuertes como para perforar la membrana vitellineina.
   1. Coloque un capilar en el soporte capilar en el extractor de agujas. Asegure el capilar con las tuercas de las alas. Alinea el centro del capilar con el elemento calefactor para que se generen dos agujas simétricas.
   2. Elija la configuración adecuada en el extractor de agujas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   3. Realice el control de calidad utilizando un endoscopio de disección.
      NOTA: Las puntas de las agujas deben ser lo más finas posible. Las puntas de aguja agrietadas, dentadas o de gran diámetro se descartan.
   4. Prepare lotes de 10 agujas (5 capilares) a la vez.
   5. Coloque una masilla deformable, que se ha enrollado en un cilindro, en el centro del fondo de un recipiente con tapa. Presione cuidadosamente las agujas en la masilla de tal manera que las sostenga horizontalmente con las puntas de la aguja suspendidas de forma segura en el aire para evitar daños. Cubra con la tapa y guarde hasta su uso.
2. Prepare platos de recolección de huevos. Conservar a 4 °C.
   NOTA: Las placas de recolección de huevos son pequeñas placas de agar complementadas con jugo de fruta para fomentar la puesta de huevos. Cómo prepararlos se describe en muchos protocolos, incluidos¹³.
3. Preparar pegamento de heptano.
   NOTA: Este pegamento se extrae de la cinta de doble cara y se utiliza para unir de forma segura los embriones a un capa. Evita que el embrión flote fuera de foco durante la inyección y las imágenes. El pegamento se puede preparar con días o semanas de anticipación.
   1. Coloque una cinta adhesiva de doble cara a un tamaño más grande que una pelota de golf y colóquela en el fondo de un recipiente de vidrio de ~ 50 ml con una tapa herméticamente sellada. Empaque la cinta con fuerza para que haya suficiente adhesivo presente.
   2. En una campana extractora, llene el recipiente de vidrio con heptano para cubrir toda la cinta. Mantenga el recipiente bien cerrado cuando no esté en uso.
      PRECAUCIÓN: El heptano es inflamable como líquido y vapor. Puede causar irritación de los ojos, la piel y las vías respiratorias. Los vapores respiratorios pueden causar somnolencia, mareos y daño pulmonar. Mantenga el heptano alejado de las fuentes de ignición y guárdelo en un área bien ventilada destinada a inflamables y lejos de sustancias incompatibles.
   3. Deje que el pegamento de heptano repose durante la noche o más tiempo. Para obtener los mejores resultados, coloque el recipiente en un agitador u otro agitador durante la noche para ayudar a disolver el adhesivo.
      NOTA: La cinta en sí permanecerá, pero el adhesivo se disolverá en el heptano. En el paso 5.1.2, el pegamento se aplica a un cobertor; el heptano se evapora, dejando atrás el pegamento.
   4. Pruebe la preparación del pegamento de heptano colocando una gota de él en un portaobjetos de vidrio y asegurándose de que quede un residuo pegajoso una vez que el heptano se haya evaporado. Si el residuo adhesivo no es visible después, agregue más cinta adhesiva al recipiente de vidrio y repita el paso anterior.
      NOTA: Una vez preparado, el pegamento se puede utilizar durante meses o incluso años.
4. Preparar una solución madre BODIPY493/503 de 1 mg/ml (3,8 mM) diluyendo la preparación obtenida comercialmente en DMSO anhidro puro. Manténgalo cubierto para protegerlo de la luz y el agua. Conservar indefinidamente a -20 °C o a corto plazo a 4 °C.

2. Prepara jaulas de recolección de huevos

NOTA: Haga esto al menos un día (preferiblemente 2 o 3 días) antes de la(s) inyección(es) planificada(s).

1. Preparar pasta de levadura.
   NOTA: La pasta de levadura complementa la proteína y otros nutrientes vitales que no se proporcionan en las placas de jugo de manzana. Promueve la producción y puesta de huevos.
   1. Agregue 2-10 g de levadura de panadería seca y luego 1 ml de agua del grifo a un vaso de precipitados pequeño. Mezclar con una espátula.
   2. Siga agregando agua del grifo en incrementos de 1 ml hasta que se alcance la consistencia deseada similar a la pasta de dientes.
   3. Cubra la mezcla y guárdela a 4 °C.
2. Instale jaulas de moscas para la recolección de huevos.
   NOTA: Se requieren moscas macho y hembra del genotipo deseado: 10-50 hembras menores de 2 semanas de edad y un número similar de machos. Hay varias opciones diferentes para jaulas de moscas disponibles, incluidas las opciones caseras^14,13. Es importante que el tamaño de las placas de jugo de manzana coincida con el tamaño de las jaulas de moscas.
   1. Coloque una pequeña mancha de pasta de levadura en un plato de jugo de manzana. Manténgalo cubierto y déjelo llegar a temperatura ambiente porque las moscas no pondrán huevos en el plato si hace demasiado frío.
   2. Transfiera las moscas a una jaula de recolección de embriones, selle con el plato de jugo de manzana con levadura y asegure el plato a la jaula de recolección de embriones.
   3. Permita que las moscas recién transferidas se aclimaten a la jaula durante 1-2 días, reemplazando el plato por uno fresco al día. Si toda la levadura se ha comido al día siguiente, aumente la cantidad de pasta de levadura para futuras colecciones.
      NOTA: Este es un paso importante para aumentar el rendimiento de los huevos a medida que las hembras bien alimentadas ponen más huevos.

3. El día de la inyección, prepare la solución inyectable y cárguela en la aguja

1. Utilice la solución madre de BODIPY 493/503 (3,8 mM en DMSO) como solución inyectable.
2. Cargue una sola aguja con 1 μL de la solución inyectable utilizando puntas de carga de aguja.
   NOTA: Esfuércese por llevar el líquido hasta la punta sin atrapar burbujas de aire. Prepárese para reemplazar rápidamente la aguja cargada en caso de rotura accidental.
   1. Conecte una punta de carga a una micropipeta y extraiga 1 μL de la solución inyectable en la punta. Con guantes, sostenga la aguja en una mano con la punta apuntando hacia afuera para minimizar el riesgo de rotura.
   2. Inserte con cuidado la punta de carga en la aguja y presiónela cerca de la punta de la aguja. Dispense el líquido cerca de la punta de la aguja. Después de retirar la pipeta, sostenga la aguja verticalmente con la punta hacia abajo hasta que el líquido fluya hacia la punta.
3. Guarde las agujas cargadas en un recipiente separado con masilla como se indica arriba (véase el paso 1.1.5).
   NOTA: Las agujas deben prepararse con anticipación (hasta varias horas) de la inyección, pero no deben usarse después de más de un día.
4. Mantenga las agujas fuera de la luz ambiental para evitar el blanqueamiento de los tintes. Cubra el recipiente de almacenamiento con papel de aluminio sin dañar las puntas de la aguja. Asegúrese de que toda la luz esté oscurecida.

4. Recolección de embriones para inyección

NOTA: El momento de la recolección depende de la etapa de los embriones en la que se debe realizar la inyección. Con el esquema de tiempo a continuación, los embriones en el momento de la preparación para la inyección tendrán una edad de 0-90 minutos, lo que corresponde a las etapas de escisión¹⁵.

1. El día de la inyección, prepare platos de jugo de manzana con levadura, como en el paso 2.2.1. Si se planean N rondas de inyecciones, prepare N + 2 placas. Mantenga estas placas a temperatura ambiente.
   NOTA: Además de las placas N para recolectar embriones para inyección, se necesita una placa como placa de pre-recolección y otra para alimentar a las moscas en la jaula una vez que se completen las colecciones.
2. Reemplace la placa en la jaula con una placa de levadura fresca (placa de pre-recolección) y déjela en la jaula durante 1-2 h.
3. Reemplace la placa en la jaula con una placa fresca (placa de recolección). Deseche la placa de pre-recolección, ya que contendrá embriones más viejos de lo deseado. Luego, deje que las moscas pongan huevos durante 1,5 h.
   NOTA: Como las moscas bien alimentadas suelen poner sus huevos poco después de que los huevos hayan sido fertilizados, un tiempo de recolección de 1,5 h asegura que al final de la recolección, la mayoría de los embriones en el plato tienen de 0 a 90 minutos de edad, es decir, están en etapas de escisión. Las moscas hembra que no han sido alimentadas con levadura fresca desde el día anterior tenderán a retener los huevos fertilizados durante un período de tiempo indeterminado antes de la puesta. Por lo tanto, la placa previa a la recolección puede tener embriones que fueron fertilizados antes del inicio de la recolección y, por lo tanto, tienen más de 60 minutos, a veces mucho más viejos.
4. Reemplace el plato en la jaula con un plato de levadura fresca. Cubra el plato de recolección para que las moscas callejeras no pongan huevos en ellas.

5. Preparar embriones para la microinyección

1. Ensamblar los materiales necesarios.
   1. Coloque un trozo de cinta adhesiva de doble cara a un portaobjetos de vidrio. Evite tocar la cinta con los dedos, ya que eso reduce su pegajosidad.
      NOTA: Esta diapositiva se utilizará para extraer el corion y no para obtener imágenes.
   2. Usando una pipeta de transferencia o una micropipeta (p200 o p1000), coloque una pequeña gota (200 μL o menos) de pegamento de heptano aproximadamente en el centro de un cobertor rectangular (60 x 25 mm). Deje que el heptano se evapore (esto toma menos de un minuto).
      NOTA: Este cubrebocas se utilizará para montar los embriones para inyección e imágenes. Las dimensiones se eligen para encajar en un soporte de metal ajustable en el microscopio confocal.
   3. Ensamble una cámara de desecación, una cámara sellada (por ejemplo, una caja de sándwich Tupperware) que contenga cuentas de desecación. Solo use perlas de desecación que no se hayan hidratado.
      NOTA: Para garantizar que los embriones tomen la solución inyectable, el embrión debe desecarse ligeramente para reducir la presión interna. Esto se hace colocando el cubrehojas con los embriones decorolinados y expuestos al aire en la cámara de desecación.
2. Retire mecánicamente el corion.
   1. Cubra la placa embrionaria adecuadamente envejecida con una capa delgada de aceite de halocarbono 27 para que la cáscara del huevo sea transparente.
      NOTA: Los embriones se vuelven translúcidos en decenas de segundos¹⁵. Si este paso no ocurre de manera eficiente, las placas de jugo de manzana pueden estar demasiado húmedas y deben secarse antes de su uso.
   2. Vea la placa bajo un endoscopio de disección con transiluminación (es decir, la luz que atraviesa la placa hacia los oculares) para confirmar la etapa de los embriones.
   3. Seleccionar embriones en etapas de escisión.
      NOTA: Los embriones en etapa de escisión son completamente opacos; las etapas posteriores del blastodermo pueden ser reconocidas por una banda de citoplasma transparente alrededor del centro opaco¹⁵. Una buena introducción sobre cómo reconocer varias etapas embrionarias está disponible en el sitio web (dado en la referencia¹⁶) mantenido por la Sociedad de Biología del Desarrollo.
   4. Usando pinzas finas, tome un embrión de la etapa deseada por sus apéndices dorsales y transfiéralo al portaobjetos de vidrio preparado cubierto con un trozo de cinta de doble cara. Coloque el embrión en la cinta. Minimizar la transferencia de aceite.
   5. Tan suavemente como sea posible, enrolle el embrión a través de la superficie de la cinta empujando suavemente el embrión con el lado de la punta de las pinzas. No pinche el embrión directamente con las puntas afiladas de las pinzas.
      NOTA: Si la fuerza aplicada es demasiado baja, el embrión no rodará. Si es demasiado alto, estallará. Encontrar la fuerza intermedia adecuada requiere experiencia y, por lo tanto, este paso debe practicarse de antemano.
   6. Continúe enrollando el embrión hasta que el corion se adhiera transitoriamente a la cinta y se agriete.
   7. Una vez que el corion se agrieta, siga rodando para separar el embrión (todavía dentro de la membrana vitelline) del corion ya que el corion permanece pegado a la cinta.
   8. Confirme que el corion se elimina por completo observando la pérdida de los apéndices dorsales del embrión.
   9. Vuelva a enrollar el embrión sobre el corion, que es menos adhesivo que la cinta. Frote suavemente el embrión con las pinzas hasta que se adhiera a las pinzas para su transferencia.
   10. Transfiera el embrión a la funda con el pegamento de heptano y póngalo en contacto con el pegamento, que generalmente lo separa de las pinzas.
   11. Ajuste la orientación del embrión en el cubrehojas.
       1. Incruste la superficie lateral del embrión en el pegamento.
          NOTA: La superficie del embrión incrustada en el pegamento es la que se fotografiará. Incrustar la superficie lateral es lo más simple, pero esto se puede ajustar dependiendo de la preferencia personal o la pregunta biológica a responder.
       2. Orientar el eje largo del embrión perpendicular al eje largo de la cubierta.
       3. Si el embrión no se encuentra en la orientación preferida, limpie las pinzas para eliminar cualquier aceite que pueda separar el embrión del pegamento. Luego, intente suavemente colocar el embrión en su posición.
   12. Prepare el número deseado de embriones para inyección de la manera descrita anteriormente.
       NOTA: A medida que pasa el tiempo después de la extracción del corion, el aire ambiente comenzará a desecar los embriones y, por lo tanto, el efecto del paso 5.3 será desigual para los embriones en el cobertor, que fueron descorados en diferentes momentos. Por lo general, 1-3 embriones son los más manejables.
3. Desecar embriones.
   1. Coloque el cubrehojas con embriones en la cámara de desecación preparada y séllelo.
   2. Deje que los embriones se desecan durante 5-12 min.
      NOTA: El momento de este paso depende de la temperatura ambiente y la humedad y, por lo tanto, debe determinarse empíricamente.
   3. Retire el trozo de cubierta de la cámara y coloque una gota de halocarbon oil 700 sobre él, cubriendo completamente los embriones, para evitar una mayor desecación.
   4. Inspeccione los embriones en un endoscopio de disección para juzgar la desecación adecuada.
   5. Si los embriones están ligeramente arrugados, pero no desinflados, proceda a la microinyección (paso 6).
   6. Si los embriones no están suficientemente o demasiado desecados, vuelva al paso 5.2 y prepare un nuevo lote de embriones ya que el Halocarbon Oil 700 no se puede eliminar. Si los embriones estaban demasiado desecados, acorte el tiempo de desecación para el siguiente lote de embriones en 3 minutos; si estaban subdesecados, aumente el tiempo de desecación en 3 min.

6. Microinyectar embriones

NOTA: Asegúrese de que la configuración de microinyección incluya un microscopio invertido, un micromanipulador para sostener y posicionar la aguja de inyección y un microinyector comercial para entregar volúmenes controlados.

1. Encienda el microinyector e introduzca los ajustes preferidos.
   NOTA: Para este protocolo, se recomienda utilizar la salida de movimiento lineal y la configuración rápida, pero muchos otros funcionarán. El operador debe determinar la preferencia personal.
2. Cargue la aguja en el micromanipulador. Para evitar que la aguja se dañe mientras se carga el cubrehojas que contiene los embriones, muévala fuera del camino a una posición segura.
3. Coloque el cubrehojas en el escenario, con embriones en la parte superior, hacia la aguja. Luego, mueva cuidadosamente la aguja de nuevo a su posición para la inyección, con su punta aún muy por encima del escenario.
4. Coloque el objetivo 4x en el camino de la luz. Usando la perilla de enfoque en el microscopio, enfoca los embriones.
   NOTA: Este será el plano focal utilizado para la inyección y se ajustará solo mínimamente en el futuro.
5. Usando los controles de etapa, mueva los embriones horizontalmente hacia el centro del campo de visión.
   1. Aléjese de los embriones, manteniéndolos en el borde del campo de visión, en preparación para bajar la aguja. Permanezca en el mismo plano focal para asegurarse de que la aguja se baje a la posición correcta.
6. Baje la punta de la aguja en el plano focal correcto y asegúrese de que sea visible en el campo de visión junto con los embriones.
   1. Usando los controles del micromanipulador y mirando desde arriba (aún no a través de los oculares), deje caer lentamente la punta de la aguja en el aceite, apuntando al área donde apunta el objetivo. Como el aceite es bastante viscoso, vaya despacio para evitar dañar la aguja.
   2. Una vez que la aguja sea visible a través de los oculares, continúe usando los controles del micromanipulador hasta que la punta de la aguja esté enfocada y en el centro del campo de visión.
   3. Al mover el escenario, lleve los embriones de vuelta al centro del campo de visión. Use el control de etapa, los controles de micromanipulador y la perilla de enfoque para ajustar la posición del embrión y la punta de la aguja entre sí mientras ambos están enfocados. Trate de realizar las inyecciones lo más cerca posible de la cubierta.
7. Realizar el control de calidad de la aguja.
   1. Para asegurarse de que la aguja es funcional, dispense parte de la solución de inyección en el Halocarbon Oil 700 que rodea al embrión, visible como una burbuja en el aceite.
   2. Si no sale nada de la aguja, aumente gradualmente la presión en el inyector. Si esto no funciona, obtenga una aguja nueva.
8. Inyecte el embrión.
   NOTA: Los volúmenes de inyección aceptables oscilan entre ~ 0.06-1 pL. El límite inferior está establecido por lo que se puede visualizar entrando en el embrión. El límite superior está establecido por el traumatismo que la inyección ejerce sobre el embrión.
   1. Inyecte a lo largo de los bordes laterales del embrión, ya que este es el menos invasivo.
   2. Usando los controles de etapa, mueva el embrión hacia la punta de la aguja hasta que este último perfore suavemente el embrión y entre en él.
   3. Al mismo tiempo, inicie el flujo de la solución de inyección y observe la aparición de un punto claro transitorio en el sitio de la punta de la aguja, lo que indica una transferencia exitosa de líquido al embrión.
   4. Monitorear el embrión. Si el embrión resiste la aguja y se rompe (el citoplasma sale a chorros) al entrar, vuelva al paso 5 y aumente el tiempo de desecación. Si el embrión está plano contra la cubierta y aparece flácido durante la inyección, vuelva al paso 5 y acorte el tiempo de desecación.
   5. Si no entró ningún tinte en el embrión, confirme que el tinte aún puede fluir libremente desde la aguja como en el paso 6.7. Si el tinte no fluye, reemplace la aguja. Si el tinte fluye, inyecte un nuevo embrión y comience a liberar el tinte justo antes de que la aguja perfore el embrión.
      NOTA: No se recomiendan inyecciones repetidas del mismo embrión, ya que rompe la herida / sitio de inyección anterior.
9. Repetir hasta que se inyecten todos los embriones.

7. Imagen embriones

NOTA: Este protocolo utiliza un microscopio confocal de barrido láser.

1. Coloque el cubrehojas en el soporte metálico en el microscopio confocal para que los embriones se tomen imágenes directamente desde abajo a través del capó; por encima de la cubierta, solo hay aceite y ninguna otra barrera.
2. Como paso de control de calidad, primero tome la imagen utilizando la función de epifluorescencia en el microscopio confocal, con un objetivo 40x. Asegúrese de que el fluoróforo sea visible en el embrión antes de continuar.
3. Si el plano de imagen deseado es diferente del sitio de inyección, deje suficiente tiempo para que el tinte se difunda al área objetivo.
   NOTA: Para BOPIPY 493/503, este tiempo suele oscilar entre 30 y 60 min. Como el tiempo de difusión depende en gran medida del tinte, otros tintes pueden requerir la optimización del sitio de inyección y el tiempo de espera.
4. Utilice diferentes objetivos para obtener imágenes a diferentes escalas. Utilice un objetivo 40x para obtener imágenes de todo el embrión y un objetivo 63x para obtener imágenes de subsecciones para escalas más pequeñas.
5. Para obtener imágenes en vivo durante las etapas sincitiales antes de la celularización, use las siguientes condiciones para comenzar: tamaño de imagen de 512 x 512 píxeles, promedio de línea de 3, velocidad de fotogramas de 0.1 cuadros por segundo (es decir, 1 cuadro adquirido cada 10 s). Ajuste las condiciones de acuerdo con las capacidades del microscopio empleado.
   NOTA: Estas condiciones permiten adquirir ~ 500 + imágenes de BOPIPY 493/503 y capturar la mayor parte del movimiento.

8. Analice el flujo LD utilizando primero FIJI para preparar una serie temporal de imágenes, y luego python para el análisis PIV

1. Optimice la adquisición de imágenes.
   1. Realice inyecciones del tinte deseado en la etapa apropiada. Repita este paso hasta que la variación diaria sea insignificante.
   2. Optimice la configuración de adquisición de imágenes, incluida la ampliación, el zoom, la resolución y la velocidad de fotogramas.
      NOTA: Existe una compensación entre las imágenes de alta calidad (resolución + promedio de línea) y la velocidad de adquisición (velocidad de fotogramas).
2. Preparar datos en FIJI.
   1. Adquirir una serie temporal de alta calidad para ser analizada.
   2. Abra un fotograma de la serie temporal para generar una máscara con FIJI. Duplica la imagen. Convierta el tipo de la imagen a 8 bits.
   3. Defina el límite del embrión utilizando la herramienta Polygon o Freehand Selection. Utilice Borrar exterior para establecer los valores de píxeles fuera de la selección en 0. Borrar y, a continuación , invertir dentro de la selección para establecer el valor de los píxeles dentro de la selección en el valor máximo (255).
   4. Anule la selección y, a continuación, utilice el comando Histograma para asegurarse de que solo estén presentes los valores de píxeles de 0 y 255.
   5. Guarde esta nueva máscara de imagen para la serie temporal específica.
   6. Abra la serie temporal de interés. Elija qué diez fotogramas capturan mejor el tiempo de interés, por ejemplo, el ciclo nuclear 9 al inicio de la contracción cortical. Duplica los diez fotogramas de interés, formando un substack.
   7. Utilice la función Pila a imágenes para generar 10 imágenes para analizar con PIV.
   8. Guarde los archivos individuales de una manera que conserve su orden (SeriesX_1, SeriesX_2, SeriesX_3 ...).
3. Utilice la máscara preparada y los fotogramas individuales para el análisis de PIV, empleando el script de Python de ejemplo proporcionado (datos suplementarios) o un script personalizado generado por el usuario.
   NOTA: El script proporcionado se basa en la aplicación python de OpenPIV¹⁷. Emite distancia en píxeles que se pueden convertir utilizando el ancho de píxeles y la velocidad de fotogramas para generar velocidades o velocidades.
4. Genere réplicas completando los pasos anteriores para embriones adicionales y compilando los valores de salida.

Representative Results

Después de la inyección, el tinte se localizará solo en el sitio donde se insertó la punta de la aguja. El tinte se difundirá lejos del sitio de inyección dependiendo de sus características difusivas. La Figura 1 muestra la inyección de BODIPY 493/503, poco después de la inyección (panel A) y 24 minutos después (panel B). Después de 24 minutos, el tinte ha llegado aproximadamente al punto medio del eje largo del embrión.

El análisis de la motilidad de los orgánulos se puede lograr a través de inyecciones de tinte e imágenes de lapso de tiempo. En la Figura 2, un embrión fue co-inyectado con BODIPY 493/503 (Figura 2A) y LysoTracker Red (Figura 2B) y fotografiado usando excitación láser a 488 y 596 nm, respectivamente. Este embrión fue fotografiado por lapso de tiempo (un fotograma cada 30 s durante 30 min, 5 min analizados). La serie temporal se ejecutó a través del análisis PIV, cuya salida se muestra a través de racionalizaciones en la Figura 2A, B. Tenga en cuenta que las líneas aerodinámicas no representan la trayectoria de partículas individuales, pero el flujo citoplasmático se infiere del análisis de todas las partículas en esa región del citoplasma. A través del etiquetado de dos estructuras celulares independientes (LD y orgánulos ácidos), el análisis PIV encuentra flujos similares, con ambas etiquetas convergiendo en la región central del embrión donde el citoplasma fluye hacia el interior del embrión⁶.

Los FP actualmente disponibles permiten el etiquetado de muchos otros orgánulos y estructuras celulares. La Figura 3 muestra el etiquetado de la sala de emergencias a través del rastreador de emergencias Verde. El rastreador de emergencias proporciona una buena resolución de la envoltura nuclear, lo que permite la visualización de las principales etapas del ciclo celular. El rastreador ER Green se visualiza utilizando una excitación de 488 nm.

El etiquetado de las mitocondrias es complicado, ya que la mayoría de los tintes probados parecen estar atrapados en la primera mitocondria en la que ingresan. Por otro lado, no se detectó ningún signo de toxicidad del colorante, lo que permite seguir las mitocondrias marcadas a través de la celularización y el ciclo nuclear ectodérmico 15. La Figura 4 muestra una célula ectodérmica varias horas después de la inyección con Mitoview 633 (longitud de onda de excitación 633 nm).

BODIPY, Lysotracker y LipidSpot son robustos y se pueden usar para adquirir ~ 500 + imágenes a 512 x 512, promedio de línea 3, velocidades de fotogramas de 1 / s a 0.1 / s. ER tracker Green, SiR-tubulina y los tintes mitocondriales mencionados son menos robustos y producen ~ 50-200 imágenes en las mismas condiciones.

Comenzando en las etapas de blastodermo, los LD se mueven bidireccionalmente a lo largo de los microtúbulos, impulsados por los motores de polaridad opuesta kinesina-1 y dineína citoplasmática⁵. Este movimiento se puede visualizar mediante el co-etiquetado de LD y microtúbulos mediante la inyección de BODIPY 493/503 y SiR-Tubulina (Figura 5). Como los LD con frecuencia invierten su dirección de movimiento (a medida que cambian entre la quinesina-1 y la dineína citoplasmática), las velocidades de fotogramas más altas durante la adquisición capturan mejor los detalles críticos de la motilidad de la LD.

Las imágenes en vivo de vesículas de yema autofluorescentes son posibles sin ninguna forma de inyección de tinte (Figura 6). Sin embargo, la autofluorescencia es tenue y el láser de excitación es fototóxico. Por lo tanto, las imágenes en vivo de la yema autofluorescente tienen una mala relación señal-ruido en relación con la inyección de tinte.

Figura 1: Difusión de BODIPY 493/503 a través del embrión. El tinte se inyectó a lo largo del borde lateral hacia el extremo anterior (arriba a la derecha) y se difunde desde este sitio de inyección en el embrión, etiquetando los LD. (A) El tinte se ha difundido a través de porciones del embrión adyacentes al sitio de inyección. (B) Aproximadamente 24 min/2 ciclos nucleares más tarde, el tinte se ha difundido más allá del punto medio del embrión. Barra de escala: 100 μm. Se adquirió un marco de 1024 x 1024 (promedio de línea 4) cada 30 s. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Velocimetría de imagen de partículas (PIV) para LD y orgánulos ácidos. Se inyectó un embrión con BODIPY 493/503 y LysoTracker Red. (A) Canal BODIPY. (B) Canal rojo de LysoTracker. (A',B') Optimice los diagramas generados por el análisis PIV de los dos canales generados a partir de 10 fotogramas secuenciales, incluidos los que se muestran en A y B. A' corresponde al flujo de LD, y B' corresponde al flujo de orgánulos ácidos. Tenga en cuenta que tanto A' como B' muestran una confluencia a la izquierda del centro donde el contenido embrionario fluye fuera del plano de visión, hacia el centro del embrión. Además, tenga en cuenta que BODIPY ha difundido más que LysoTracker ya que los diferentes tintes tienen diferentes propiedades difusivas. Barra de escala: 100 μm. Se adquirió un marco de 1024 x 1024 (promedio de línea 4) cada 30 s. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: El rastreador ER etiqueta las divisiones nucleares sincitiales. Un embrión de blastodermo sincitial fue microinyectado con rastreador ER y una parte de su superficie fue fotografiada con el tiempo. (A) Montaje del husillo durante una división nuclear. B) Abscisión de la envoltura nuclear durante la misma división. C) Interfase posterior. (D) El inicio de la siguiente división está indicado por la apariencia del centrosoma (aparición de regiones circulares libres de ER, marcadas por puntas de flecha). Tenga en cuenta el blanqueamiento gradual del tinte. Longitud de onda de excitación: 488 nm. Barra de escala: 5 μm. A: fotograma inicial, B: 3 min transcurridos, C: 10 min transcurridos, D: 13 min transcurridos. Se adquirió un marco de 1024 x 1024 (promedio de línea 4) cada 30 s. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Etiquetado Mitoview 633 de mitocondrias. Se inyectó un embrión con Mitoview 633 durante la etapa de blastodermo sincitial y se tomaron imágenes 4 h después, después de la celularización. La imagen muestra una célula neuroectodérmica de un embrión en extensión de banda germinal. Barra de escala: 5 μm. Se adquirió un marco de 1024 x 1024 (promedio de línea 4) cada 30 s. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Co-etiquetado de LD y microtúbulos. Se inyectó un embrión celularizante con una mezcla de BODIPY 493/503 (amarillo A, B, C) y SiR Tubulina (magenta A', B', C'). A'', B'', C'' muestran los canales fusionados. Los paneles A, A', y A'' muestran el marco inicial, los paneles B, B' y B'' muestran el marco después de 5 s, y los paneles C, C' y C'' muestran el marco después de 10 s. Barra de escala: 5 μm. Se adquirió un marco de 512 x 512 (promedio de línea 3) cada 2.5 s. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Imagen de la autofluorescencia de la vesícula vitelinosa durante las etapas de escisión sincitial. (A) Al inicio de la adquisición. (B) Después de 8 min. (C) Después de 16 min. Longitud de onda de excitación: 405 nm. Se utilizó una baja intensidad de excitación para mantener vivo al embrión. Barra de escala: 100 μm. Se adquirió un marco de 1024 x 1024 (promedio de línea 4) cada 30 s. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El embrión de Drosophila es un modelo poderoso y conveniente para estudiar cuestiones fundamentales en biología celular y de organismos. Su relativa simplicidad, genética poderosa y tamaño pequeño lo convierten en un excelente sistema para obtener imágenes tanto de los procesos celulares como del desarrollo. Aquí, se adapta un protocolo de microinyección estándar para permitir el uso de FP en embriones. Este enfoque permite obtener imágenes fluorescentes de estructuras celulares específicas sin la necesidad de fluoróforos codificados genéticamente, lo que abre muchos antecedentes genéticos a las imágenes. La combinación de múltiples colorantes más proteínas marcadas fluorescentemente estratégicamente elegidas puede abrir imágenes en vivo multicanal que abarcan todo el espectro de luz visible.

Pasos críticos en el protocolo:
Este protocolo utiliza BODIPY 493/503 para etiquetar los LD. Este enfoque se puede adaptar fácilmente para marcar otras estructuras celulares. Para el análisis posterior de la imagen, uno de los factores más importantes es la relación señal-ruido, es decir, el brillo del tinte en comparación con la señal de fondo. Se han obtenido imágenes exitosas de lisosomas (LysoTracker Red, 1 mM), así como de mitocondrias (Mitoview 633, 200 μM), el ER (ER tracker Green, 10 μM) y microtúbulos (SiR tubulina, 200 nM en DMSO), como se muestra en la Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5. Además, las vesículas vitelinosas son autofluorescentes y emiten luz azul tras la excitación UV (imagen que utiliza 405 nm como longitud de onda de excitación (Figura 6)). Para otros colorantes, apunte a que la concentración de colorante sea 100-1,000x de lo que se necesitaría para teñir células cultivadas vivas; esto es similar a la concentración de una solución madre que se diluiría en medios de cultivo celular. Como este protocolo requiere una inyección de 100 fL y el embrión de Drosophila es de aproximadamente 9 nL en el volumen¹⁸, estas concentraciones de colorante promediarán una concentración embrionaria interna de menos de 1/100 de lo que está presente en el medio de cultivo celular. Temporalmente, la concentración local será mayor en el sitio de inyección, lo que es más relevante para los FP que no se difunden bien (es decir, colorantes mitocondriales y SiR-tubulina). Para estos FP, comience en las altas concentraciones recomendadas; si se observa una muerte inesperada, diluir sucesivamente dos veces hasta que se alcance un compromiso aceptable entre la supervivencia y la intensidad de la señal.

Al coinyectar múltiples colorantes, ambos colorantes deben estar en el mismo disolvente, o tanto los disolventes como los colorantes deben ser compatibles con la mezcla (no se recomiendan concentraciones de alcohol superiores a ~ 10%).

La calidad de las agujas es esencial para el éxito de este procedimiento, ya que la punta debe ser lo más fina posible. De lo contrario, el daño de la herida de inyección puede comprometer el desarrollo posterior del embrión. Como los tiradores de agujas comerciales difieren, es importante seguir las sugerencias del fabricante y probar múltiples parámetros de tracción hasta que se logre la forma deseada. Es fundamental realizar el paso de control de calidad 1.1.3, ya que trabajar con una punta de aguja agrietada, dentada o de gran diámetro hará que la inyección exitosa sea más difícil o incluso imposible.

El embrión debe desecarse parcialmente para que se puedan agregar volúmenes adicionales de líquido durante la inyección. Si el embrión está subdesecado, la aguja no entrará fácilmente y el citoplasma saldrá a chorros a medida que la aguja penetre o cuando se inyecte la solución. Si el embrión está sobredesecado, se verá desinflado y no se desarrollará adecuadamente. El tiempo exacto de secado depende de las condiciones locales, por ejemplo, la humedad del aire, y puede cambiar de un día a otro. Tiene que determinarse empíricamente para cada sesión.

La capacidad del embrión para sobrevivir después de la microinyección depende críticamente de la calidad de la aguja, la desecación adecuada y la limitación del volumen de inyección a menos de 1 pL (idealmente 100 fL). Mientras se optimicen estos parámetros, no se observa toxicidad significativa cuando los colorantes descritos se inyectan a las concentraciones recomendadas. Si los embriones sobreviven a los pasos de desecación e inyección, generalmente se desarrollan con éxito hasta la extensión de la banda germinal, una excepción son las sondas de microtúbulos y ER que causaron defectos de celularización a niveles altos (inyección de 100 fL de la concentración de stock de cada uno). Las pruebas no encontraron defectos obvios de desarrollo cuando se inyectaron DMSO, agua y mezclas de los dos a los volúmenes recomendados, con una tasa de supervivencia embrionaria a través de la extensión de la banda germinal de ~ 75% o más. Los volúmenes de inyección superiores a 1 pL causaron defectos y los embriones inyectados con ~ 4 volúmenes de pL se desarrollaron durante menos de 1 h. Por lo tanto, los volúmenes de inyección deben mantenerse bajos, lo que significa que las concentraciones de colorante deben ser altas.

En general, se recomiendan inyecciones a lo largo del borde lateral del embrión, ya que resultan en el menor daño. Sin embargo, es posible que sea necesario ajustar el lugar de inyección en función de las propiedades difusivas de los PF empleados. BODIPY 493/503 y LysoTracker se difunden más rápido en todo el embrión que Lipid Spot 610 (otro tinte para marcar los LD), mientras que SiR-Tubulin y Mitoview 633 nunca se difunden completamente a través del embrión (imágenes tan tarde como 7 h después de la inyección). Por lo tanto, la inyección en o cerca del sitio de interés puede ser necesaria. Al inyectar en las regiones anterior o posterior, se recomienda una aguja particularmente fina.

La adquisición de imágenes se basa en la microscopía confocal para seccionar ópticamente y resolver pequeños orgánulos y todos los componentes citoesqueléticos. Las técnicas que requieren el análisis de muchas imágenes (por ejemplo, STORM o PALM) no funcionarán porque el contenido embrionario está en movimiento y los fluoróforos no están optimizados para el fotomutamiento. La microscopía de epifluorescencia carece de la resolución lateral y axial para distinguir la mayoría de los orgánulos y las estructuras celulares más pequeñas. Por estas razones, se recomienda encarecidamente utilizar un microscopio confocal o emplear tecnología de láminas de luz.

La reproducibilidad del análisis de imágenes se basa en gran medida en datos de imágenes consistentes. Para tener la mayor probabilidad de éxito, se requiere la optimización de la técnica de inyección y la adquisición de imágenes. Establecer y practicar una técnica en la que el colorante (s) de interés, el sitio de inyección, la edad del embrión, el volumen de inyección y la configuración de adquisición sean consistentes generará los datos más sólidos para el análisis de imágenes.

Modificaciones y solución de problemas del método
Este protocolo demuestra un método para analizar el flujo a granel de LD en embriones en etapa de escisión utilizando velocimetría de imagen de partículas. El mismo enfoque se puede utilizar para otros orgánulos, otras etapas de desarrollo y otros métodos de análisis. Por ejemplo, la Figura 2 muestra el análisis de LD y orgánulos ácidos que fluyen en las etapas sincitiales de la embriogénesis, visualizados mediante la coinyección de BODIPY 493/503 y LysoTracker Red. Se han logrado imágenes más exitosas del movimiento de la DA en embriones hasta 7 h después de la fertilización; estos embriones retienen la herida de la inyección, pero son capaces de desarrollarse durante varias horas.

Los datos recopilados utilizando este protocolo se han utilizado para la velocimetría de imágenes de partículas, pero hay muchas otras técnicas de análisis disponibles. Por ejemplo, los programas de seguimiento de partículas como los que se encuentran en ImageJ, Imaris o el seguimiento manual se pueden utilizar para obtener velocidades y direccionales de estructuras en movimiento. Tenga en cuenta que la mayoría de estos programas de seguimiento están diseñados para trabajar con datos de sistemas de cultivo celular plano y no siempre se adaptan bien a estructuras 3D como el embrión de Drosophila . Además, para la generación de datos de seguimiento de partículas de la mejor calidad, se necesitarían imágenes de múltiples planos Z; esto debería ser factible si los tiempos de adquisición de la pila de imágenes son inferiores a ~ 2 s. Este punto de referencia debe ser alcanzable en discos giratorios confocales, láminas de luz de celosía y sistemas confocales de escaneo láser recientes. Sin embargo, la viabilidad del seguimiento de partículas para orgánulos abundantes como LD, mitocondrias y lisosomas es baja, ya que la cantidad de señal positiva en un campo de visión es demasiado alta para los métodos de seguimiento actuales. El seguimiento de estructuras menos abundantes como núcleos o vesículas vitelinos puede ser posible. PIV para el análisis de flujo funciona bien para LD y orgánulos ácidos en etapas de escisión porque ambos orgánulos se mueven libremente. Los orgánulos como los núcleos, el RE y las mitocondrias están atados a otras estructuras celulares y, por lo tanto, no se mueven libremente y no son adecuados para el análisis de software que asume el movimiento libre. El investigador debe elegir las técnicas que mejor se adapten al orgánulo de interés.

Durante las etapas de blastodermo sincitial y celular, los LD (así como algunos otros orgánulos) se mueven a lo largo de los microtúbulos orientados radialmente⁵. Por lo tanto, es posible encontrar vistas transversales (como en la Figura 5) donde los microtúbulos individuales están enfocados durante largas distancias, lo que permite el seguimiento de partículas en 2D. Dado que estos planos ópticos están profundamente dentro del embrión, la intensidad general de la señal disminuye y la relación señal-ruido se reduce.

Para el análisis de seguimiento, las imágenes lo más rápido posible pueden revelar detalles cruciales del movimiento y, por lo tanto, de la maquinaria móvil. Por ejemplo, el movimiento de gotas lipídicas es una mezcla de dos estados móviles, movimiento lento-corto (~200 nm/s; distancia media de viaje ~100 nm) y movimiento rápido-largo (~450 nm/s; distancia media de viaje ~1.000 nm)¹⁹; por lo tanto, si las imágenes se toman cada segundo o incluso con menos frecuencia, el estado lento-corto se vuelve indetectable. Sin embargo, las imágenes frecuentes también inducen el blanqueamiento de fluoróforos y la fototoxicidad. Las condiciones de imagen, por lo tanto, deben ajustarse en función de la pregunta exacta que se abordará.

Limitaciones del método
Dependiendo del colorante deseado, el método puede estar limitado por la compatibilidad entre la solubilidad del colorante y la toxicidad de la solución inyectable. Los alcoholes como el isopropanol y el etanol son difíciles de manejar dentro de una aguja debido a su menor viscosidad y parecen dañar los componentes celulares y matar al embrión.

El método tampoco es adecuado para visualizar los primeros pasos en la embriogénesis porque se necesitan más de 30 minutos para preparar los embriones para la inyección. A temperatura ambiente, los ciclos celulares iniciales del embrión duran solo ~ 10 minutos cada uno; por lo tanto, incluso si uno recogiera un óvulo recién fertilizado en el paso 5.2.3, los primeros ciclos celulares ya se completarían para cuando el embrión esté listo para la obtención de imágenes.

La iluminación con luz en el rango UV/azul es considerablemente más fototóxica que para longitudes de onda más largas. En tales condiciones (por ejemplo, seguir vesículas de yema autofluorescentes; Figura 6), uno tiene que limitar el tiempo de imagen (lo que lleva a series de tiempo más cortas) o usar una potencia láser más baja (lo que resulta en una relación señal-ruido reducida).

Después de la celularización, los colorantes inyectados en un lugar específico tienden a difundirse mal, ya que deben atravesar muchas membranas celulares. Esto limita la región de observación en etapas posteriores del desarrollo.

La importancia del método con respecto a los métodos existentes/alternativos
El movimiento de los LD y otros orgánulos que contienen lípidos en embriones tempranos se puede visualizar con fluoróforos codificados genéticamente, técnicas sin etiquetas y mediante la introducción de FP. Esto último se puede lograr mediante la permeabilización de la membrana^{vitellineal 12} o el enfoque de microinyección discutido aquí.

Los fluoróforos codificados genéticamente son marcadores versátiles cuyos niveles suelen ser altamente reproducibles de embrión a embrión. Sin embargo, tienen rendimientos cuánticos más bajos y se blanquean más fácilmente que los FP. Por lo general, solo están disponibles en una o dos versiones etiquetadas (por ejemplo, GFP o mCherry), lo que limita la elección de qué estructuras se pueden visualizar simultáneamente. Los FP, por otro lado, a menudo existen en una gran variedad; por ejemplo, varios colorantes específicos de gotas lipídicas están disponibles con espectros de emisión desde Autodot en el espectro UV / azul hasta Lipidtox y LipidSpot 610 en el espectro rojo lejano. Los FP también se pueden aplicar directamente a cualquier cepa de interés y, por lo tanto, no requieren la construcción de la deformación para, por ejemplo, introducir el marcador de orgánulo deseado en una cepa mutante de interés. Esta ventaja es particularmente pronunciada cuando se van a etiquetar múltiples estructuras simultáneamente; en lugar de cruces que consumen mucho tiempo y abarcan varias generaciones, esto se puede lograr en un solo día mezclando los tintes relevantes e introduciéndolos al mismo tiempo. Finalmente, si los procesos celulares se van a sondear con inhibición farmacológica, se pueden introducir medicamentos y colorantes juntos.

Los métodos sin etiquetas son enfoques muy poderosos para detectar estructuras celulares específicas. Por ejemplo, los LD se pueden detectar específicamente en embriones tempranos mediante microscopía de tercera generación armónica²⁰ o mediante microscopía de pérdida Raman estimulada de femtosegundo²¹. Al igual que los FP, estos enfoques se pueden aplicar en cualquier fondo genético, y debido a que no causan blanqueamiento, potencialmente permiten una adquisición de imágenes más rápida. Sin embargo, generalmente se limitan a orgánulos específicos y, por lo tanto, no admiten por sí mismos imágenes multiplex; también requieren microscopios especializados.

Existen dos estrategias generales para introducir moléculas pequeñas en los embriones. Uno es el enfoque de microinyección empleado aquí; el otro es el tratamiento químico (terpeno) para permeabilizar la membrana vitelina. Este último enfoque¹² está menos involucrado que la microinyección, pero también es más variable de embrión a embrión. Además, después de la permeabilización, la protección proporcionada por la membrana vitelina se ve comprometida y el embrión propiamente dicho es accesible al medio externo, lo que hace que sea más difícil mantenerlo vivo. Es mucho menos probable que la microinyección descarrile el desarrollo embrionario que la permeabilización. Sin embargo, se recomienda la permeabilización si muchos embriones necesitan ser monitoreados simultáneamente, por ejemplo, con fines de detección de drogas. Para seguir el movimiento de las estructuras celulares y obtener series de imágenes reproducibles adecuadas para el análisis de imágenes, la microinyección es el método de elección.

Importancia y aplicaciones potenciales del método en áreas de investigación específicas
El embrión de Drosophila es un sistema modelo importante para el estudio de muchos procesos biológicos y de desarrollo celular ^1,5,6. El etiquetado de orgánulos con proteínas fluorescentes ha hecho importantes contribuciones a la comprensión de cómo se desarrolla el embrión temprano, cómo se trafican varios orgánulos y cómo dicho tráfico se modula desde el punto de vista del desarrollo y genéticamente. Sin embargo, su propensión a la lejía y los desafíos de generar cepas en las que múltiples orgánulos están etiquetados con diferentes colores limitan la aplicación de este enfoque. El uso de FP introducidos por microinyección resuelve muchos de estos desafíos e incluso se puede combinar con proteínas marcadas fluorescentemente. Esta técnica permite la obtención de imágenes de múltiples orgánulos, estructuras celulares y componentes citoesqueléticos en cualquier fondo genético. Como resultado, se pueden comparar varios genotipos a través de imágenes en vivo, lo que permite determinar el efecto de las mutaciones en el tráfico de múltiples orgánulos.

Este protocolo demuestra el enfoque de inyección de FP para embriones de Drosophila melanogaster, pero en principio, este enfoque se aplica a cualquier huevo de insecto para el que se hayan establecido técnicas de microinyección, incluidas otras especies de Drosophila, grillos²² y pulgones²³.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AUTODO	abcepta	SM1000a	Stains lipid droplets in violet/blue
BODIPY 493/503	ThermoFisher	D3922	Stains lipid droplets in green
Desiccant Beads –Desiccant-Anhydrous Indicating Drierite	W.A. Hammond Drierite Company	21001
Dissecting microscope SteREO DiscoveryV20 with transillumination base	Zeiss	4350030000000000
Double sided tape-Permanent Double-Sided Tape	Scotch (3M)	-	Sold by many vendors
ER-Tracker Green (BODIPY FL Glibenclamide)	ThermoFisher	E34251	Stains the ER/nuclear envelope
Femptotip II	Eppendorf	H129354N	Ready to use
Glass capillaries -Glass Thinw w/fil 1.0mm 4in	World Precision Instruments	TW100F-4	Must be pulled
Glass coverslip	-	-	Buy the appropriate refractive index for your objective lens
Glass slides -Double Frosted Microscope Slides precleaned	FisherBrand	12-550-343
Halocarbon oil 27	Sigma-Aldrich	H8773-100ML
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-50ML
Heptane greener alternative anhydrous, 99%	Sigma-Aldrich	246654-1L	Heptane is considered toxic by the USA's OSHA
Confocal microscope	Leica	Sp5	Many different types of confocal microscopes will work.
LipidSpot 610	Biotium	#70069	Stains lipid droplets in far red
LysoTracker Red	ThermoFisher	L7528	Stains lysosomes in red
MitoView 633	Biotium	#70055	Stains mitochondria
Needle loading pipette tips - 20uL microloader tips	Eppendorf	# 5242956.003
P-1000, Next Generation Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-1000	The settings used are heat-470, pull-70, velocity-60, delay-90, pressure-200, ramp-479 at 1x1. They refer to the intensity and length of the heating, the timing of pulling force and whether the force is applied linearly. Using these conditions, one capillary generates two usable needles with fine openings at the tip.
SiR-Tubulin	Cytosketon Inc	CY-SC014	Made by Spirochrome; Cytoskeleton Inc. is the North American distributor. Stains microtubules in far red
TransferMan	Eppendorf	5178 NK
ViaFluor 405	Biotium	#70064	Stains microtubules in violet/blue