Summary
מאמר זה מתאר את הייצור וההפעלה של שבבי אקוסטופורטי מיקרופלואידיים באמצעות טכניקת האקוסטופורזיס המיקרופלואידית ומיקרובים שעברו שינוי אפטאמר שיכולים לשמש לבידוד מהיר ויעיל של חיידקים גראם-שליליים ממדיום.
Abstract
מאמר זה מתאר את הייצור וההפעלה של שבבי אקוסטופורטי מיקרופלואידיים באמצעות טכניקת אקוסטופורזיס מיקרופלואידית ומיקרובים שעברו שינוי אפטמר שיכולים לשמש לבידוד מהיר ויעיל של חיידקים גראם-שליליים ממדיום. שיטה זו משפרת את יעילות ההפרדה באמצעות שילוב של מיקרו-ערוצים ארוכים ומרובעים. במערכת זו, המדגם והמאגר מוזרקים ליציאת הכניסה באמצעות בקר זרימה. עבור מרכוז חרוזים והפרדת דגימות, כוח AC מוחל על המתמר הפיאזואלקטרי באמצעות מחולל פונקציות עם מגבר כוח כדי ליצור כוח קרינה אקוסטית במיקרו-ערוץ. בכניסה ובשקע יש תעלה דו-פרצופית, המאפשרת הפרדה, טיהור וריכוז בו זמנית. למכשיר שיעור התאוששות של >98% וטוהר של 97.8% עד לריכוז מנה של פי 10. מחקר זה הדגים קצב התאוששות וטוהר גבוהים יותר מהשיטות הקיימות להפרדת חיידקים, מה שמרמז על כך שהמכשיר יכול להפריד חיידקים ביעילות.
Introduction
פלטפורמות מיקרופלואידיות מפותחות כדי לבודד חיידקים מדגימות רפואיות וסביבתיות, בנוסף לשיטות המבוססות על העברה דיאלקטרית, מגנטופורזיס, מיצוי חרוזים, סינון, מיקרופלואידיקה צנטריפוגלית ואפקטים אינרציאליים, וגלים אקוסטיים על פני השטח 1,2. הזיהוי של חיידקים פתוגניים נמשך באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR), אך בדרך כלל הואמייגע, מורכב וגוזל זמן רב 3,4. מערכות אקוסטופורזיס מיקרופלואידיות הן חלופה לטיפול בכך באמצעות תפוקה סבירה ובידוד תאים ללא מגע 5,6,7. Acoustophoresis היא טכנולוגיה המפרידה או מרכזת חרוזים באמצעות תופעה של תנועת חומר דרך גל קול. כאשר גלי קול נכנסים למיקרו-ערוץ, הם ממוינים לפי הגודל, הצפיפות וכו' של החרוזים, וניתן להפריד את התאים לפי התכונות הביוכימיות והחשמליות של מדיום התלייה 7,8. בהתאם לכך, מחקרים אקוסטופורטיים רבים נערכו באופן פעיל 9,10,11, ולאחרונה, סימולציות נומריות תלת-ממדיות של תנועה אקוסטופורטית המושרה על ידי זרימה אקוסטית מונחית גבולות במיקרופלואידיקה של גלים אקוסטיים במשטח עמידה, הוצגו 12.
מחקרים בתחומים שונים בוחנים כיצד להחליף נוגדנים 2,3. אפטמר הוא חומר מטרה בעל סלקטיביות וספציפיות גבוהות, ומחקרים רבים נערכים 2,9,10,13. לאפטמרים יש יתרונות של גודל קטן, יציבות ביולוגית מצוינת, עלות נמוכה ויכולת שכפול גבוהה בהשוואה לנוגדנים והם נחקרים ביישומים אבחוניים וטיפוליים 2,3,14.
במאמר זה מתואר פרוטוקול בטכנולוגיית אקוסטופורזיס מיקרופלואידית שניתן להשתמש בו להפרדה מהירה ויעילה של חיידקים גראם-שליליים (GN) ממדיום באמצעות מיקרובים שעברו שינוי אפטמר. מערכת זו מייצרת גל עמידה אקוסטי דו-ממדי (2D) באמצעות הפעלה פיאזואלקטרית יחידה על ידי גירוי בו-זמני של שתי תהודות אורתוגונליות בתוך מיקרו-ערוץ מלבני ארוך כדי ליישר ולמקד מיקרובים המחוברים לאפטמר בנקודות הצומת והאנטי-צומת ליעילות הפרדה 2,11,15,16 . בכניסה ובשקע יש תעלה דו-פרצופית, המאפשרת הפרדה, טיהור וריכוז בו זמנית.
פרוטוקול זה יכול להיות מועיל בתחום של אבחון מוקדם של מחלות זיהומיות חיידקיות, כמו גם תגובה מהירה, סלקטיבית ורגישה לזיהומים חיידקיים פתוגניים באמצעות ניטור מים בזמן אמת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תכנון שבבי אקוסטופורזיס מיקרופלואידי
הערה: איור 1 מראה סכמטיות של הפרדה ואיסוף של מיקרובי מטרה ממיקרו-ערוצים על-ידי אקוסטופורזיס. שבב האקוסטופורזיס המיקרופלואידי מתוכנן עם תוכנית CAD.
- תכנן שבב אקוסטופורזיס מיקרופלואידי המשתמש בתערובת של חרוזים שעברו שינוי אפטאמר וחרוזים פוליסטירן מצופים סטרפטאבידין (PS) המתאימים לגודל החיידקים כדי לחקור את ביצועי ההפרדה של המכשיר.
- תכננו שבב אקוסטופורזיס מיקרופלואידי שאוסף חרוזי PS בשקע המטרה ומשליך את השאר דרך השקע לאחר הזרקת תערובת דגימת PS לכניסת הדגימה (ראו איור 2 וטבלה 1).
הערה: למטרה זו, השבב האקוסטופלואידי מתוכנן להיות מורכב משני פתחים להזרקת דגימות ומאגר, ערוץ ראשי עם מתמר פיאזואלקטרי מחובר (PZT) כדי לאפשר ליישר את המיקרובים באופן מרכזי, ושני שקעים שדרכם נאספות דגימות ופסולת משוחררת (איור 3A) - תכננו שבב אקוסטופורזיס מיקרופלואידי שבו מיקרובים, חיץ, חיידקים ואפטמרים עוברים דרך התעלה הראשית, כאשר המיקרובים מיושרים באופן מרכזי באמצעות אקוסטופורזיס בתוך השבב המושרה על-ידי ה-PZT (איור 3B,C)
2. ייצור שבבי אקוסטופורזיס מיקרופלואידי
הערה: הרכיבו ארבע שכבות בסדר הבא: שכבת זכוכית-סיליקון בורוסיליקט, שכבת סיליקון, שכבת זכוכית בורוסיליקט ושכבת PZT, כפי שמוצג באיור 3A,B.
- הכן זכוכית בורוסיליקט (השכבה העליונה ביותר) עם חורים בקוטר 2 מ"מ על ידי התזת חול17 בכניסה ובשקע לחיבור צינורות polyetheretherketone (PEEK). זכוכית בורוסיליקט מודד 20 × 80 × 0.5 מ"מ3.
- הכינו שכבת תעלת סיליקון בעובי 200 מיקרומטר עם מיקרו-ערוץ עם שטח חתך של 0.2 × 0.2 מ"מ2 שנוצר באמצעות פוטורסיסט ותבנית סיליקון המתקבלת באמצעות תחריט יונים תגובתי עמוק (RIE)18. קדחו חורים בקוטר 1 מ"מ לתעלות כניסת הדגימה והמאגר ותעלות האיסוף ויציאת הפסולת במהלך תחריט יונים תגובתי.
הערה: כאן, תחריט יונים משתמש בתהליך RIE כדי ליצור מיקרו-ערוצים. פוטורסיסט הוחל בצורת תעלה על פרוסת סיליקון לשכבת תעלת הסיליקון. פרוסת הסיליקון המצופה PR נחרטה בפלזמה שנוצרה על ידי מריחת 13.56 מגה-הרץ על פלואור18. - הכינו שבב עם השכבות שמעל ומתחת לשכבת הסיליקון (20 × 80 × 0.5 מ"מ 3) שהוכנו בשלב 2.2 (20 × 80 × 0.5 מ"מ3) שהודבקו לזכוכית הבורוסיליקט בשלב 2.1 ושכבת זכוכית בורוסיליקט שלישית באמצעות אנודיזציה ב-1,000 וולט ו-400 מעלות צלזיוס19.
- חברו PZT (20 × 40 מ"מ2) לשכבת הזכוכית הבורוסיליקטית לאורך התעלה המיקרופלואידית באמצעות דבק ציאנואקרילט (10 μL או פחות).
הערה: יש למרוח את הדבק כשכבה דקה מאוד בתעלה באמצעות צמר גפן כדי למזער כל שינוי בגובה. איור 3C הוא תמונה של המכשיר.
3. זני חיידקים ותרבית
הערה: עיין בטבלה 2 כדי לבחור ולדגור על חיידקי GN וחיידקי גראם-חיוביים (GP) לניסויים. עבור שיטת התרבות, עיין בשלבים 3.1-3.4. כל החיידקים צריכים להיות דגירה בתנאים אירוביים עד ספיגה של 0.4 ב 600 ננומטר (OD600) מתקבל.
- עבור חיידקי GN כגון Escherichia coli DH5α, Escherichia coli KCTC2571, Sphingomonas insulae, וחיידקי Pseudomonas pictorum ו- GP כגון סטפילוקוקוס אפידרמידיס וסטפילוקוקוס פסטורי, דגירה בבינוני לוריא-ברטני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-220 סל"ד למשך 16 שעות.
- עבור אנטרובקטר (GN) ובצילוס מגטריום (GP; KCTC 1021), דגירה בציר מזין בינוני ב-37 מעלות צלזיוס ו-220 סל"ד למשך 16 שעות.
- עבור אנטרוקוקוס תאילנדיקוס (GP), דגירה בדה מאן, רוגוסה ושארפ (MRS) בינונית ב-37 מעלות צלזיוס ו-220 סל"ד למשך 16 שעות.
- עבור ליסטריה אפורי (GP), דגירה בעירוי לב במוח בינונית ב-37 מעלות צלזיוס ו-220 סל"ד למשך 16 שעות.
- צנטריפוגה (9056 x גרם) החיידקים בתרבית למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר (RT), ולאחר מכן יש לשטוף פעמיים עם חיץ מלח 1x עם אגירת פוספט (PBS).
- הכן את חיידקי ה-GN וה-GP שנבחרו לניתוח על-ידי השעיה חוזרת במאגר PBS.
4. מיקרובים ואימוביליזציה של אפטמר על מיקרובים
- יש להשעות את תערובת החיידקים המצופים בסטרפטווידין (10 מיקרומטר) (טבלת חומרים) לפני השימוש (לערבב באמצעות מערבולת במשך 20 שניות).
- הכינו את האפטמר על ידי דנטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות ולאחר מכן התפוררות מחדש ב-0 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
- העבירו 250 מיקרו-ליטר מתערובת החיידקים המצופים בסטרפטווידין לצינור של 1.5 מ"ל ושטפו עם חיץ Tris-HCl (50 mM Tris, pH 7.4, 1 mM MgCl2, 5 mM KCL, 100 mM NaCl) ב-RT. לאחר מכן להוסיף 100 μL של biotinylated DNA aptamer לצינור.
- דגרו את התערובת ב-RT למשך 30 דקות תוך כדי סיבוב (25 סל"ד).
- לאחר צנטריפוגה (9056 x גרם), יש לשטוף את הצינור פעמיים עם 200 μL של חיץ Tris-HCl ב-RT.
- יש להוסיף 10 μL של BSA (100 מ"ג/מ"ל) לצינור הדגימה שנשטף ולדגור במשך 30 דקות ב-RT עם סיבוב (25 סל"ד).
- לבסוף, שטפו את המיקרובים שעברו שינוי אפטמר פעמיים על ידי צנטריפוגה (9056 x גרם) במאגר Tris-HCl ב-RT.
5. התקנה והפעלה של אקוסטופורזיס
- חברו את צינורות PEEK לשני המפרצים להזרקת שתי דגימות וחיץ ולשני השקעים לאיסוף ופריקה של פסולת (איור 4).
- מלאו ידנית את תעלת האקוסטופורזיס המיקרופלואידית במים שעברו דה-מינרליזציה ללא בועות באמצעות מזרק של 10 מ"ל.
- הכן בקר לחץ מדויק עם שני ערוצי יציאה או יותר כדי לשלוט בזרימת הנוזל. לאחר מכן, חצי למלא את הבקבוקונים עם מדגם ומאגר עם שני חורים בכובעים שלהם, בהתאמה, ולהתחבר לכניסת השבב.
הערה: ניתן להחליף בקר לחץ מדויק עם שני ערוצי יציאה או יותר בבקרי לחץ מדויקים מרובים. בכניסת החיץ, חוצץ המסוגל ליצור זרימה למינרית המונעת מהדגימה לנוע למרכז במהלך הזרקת הדגימה מוזרק דרך בקר זרימה. - לאחר הכנת המכשיר, הזרקת הדגימה והמאגר על ידי הפעלת לחץ של 2 kPa על כניסת הדגימה ו- 4 kPa לכניסת החיץ באמצעות התקן בקרת הלחץ המדויק.
הערה: בשלב זה, עבור זרימה למינרית חלקה, לחץ ההזרקה של המאגר צריך להיות גבוה יותר מלחץ ההזרקה של הדגימה. הזרימה נשלטת על ידי בקר זרימה המקובע לאספירטור המחובר לערוץ הכניסה. - התמקדו בחרוז כדי להעביר אותו למרכז התעלה המיקרופלואידית באמצעות ה-PZT תוך כדי בדיקה דרך המיקרוסקופ.
הערה: ככל שהחרוז גדול יותר, כך ההשפעה על צורת הגל גדולה יותר, כך שקל יותר ליישר אותו עם נקודת הצומת. מחולל פונקציות עם מגבר מחיל כוח על PZT כדי ליצור גל סינוס במיקרו-ערוץ. מכיוון שהחלקים העליונים והתחתונים של המיקרו-ערוץ עשויים מזכוכית, גל הסינוס שנוצר מוחזר ויוצר נקודת צומת7. - צור תדר תהודה של 3.66 MHz באמצעות מחולל פונקציות חד-ערוצי והגבר אות טיפוסי ב-16 dB (בערך פי תשעה) באמצעות מגבר הספק (איור 4).
הערה: תדר התהודה של המפעיל חייב להתאים לגודל הערוץ; מכיוון שהערוץ מרובע, ה-PZT פועל בתדר מדויק כדי ליצור צומת יחיד. - שימו לב לתהליכי ההפרדה וההעשרה על השבב האקוסטופלואידי עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומצלמה במהירות גבוהה הפועלת בקצב של 1,200 פריימים לשנייה.
- לכמת ולנתח את נוכחותם או היעדרם של חיידקי GN וחיידקי GP על ידי בדיקת התמונות שצולמו במצלמת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי של החרוזים והחיידקים הקשורים לחיידקים המוזרמים דרך דגימות האיסוף ושקעי הפסולת.
הערה: מיקרובים עם מאגר, חיידקים ואפטמרים עוברים דרך התעלה הראשית, והמיקרובים מיושרים באופן מרכזי באמצעות אקוסטופורזיס בתוך השבב המושרה על-ידי ה-PZT. לבסוף, מיקרובים שיש להם חיידקי GN קשורים נאספים בשקע האיסוף, והחיידקים שלא נאספו משוחררים דרך שקע הפסולת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 5 מציג את התמונה של זרימת חרוזים כפונקציה של מתח PZT (OFF, 0.1 V, 0.5 V, 5 V). במקרה של שבב acoustophoretic שהוצג במחקר זה, אושר כי ככל שהמתח של PZT גדל, הריכוז המרכזי של חרוזים בגודל 10 מיקרומטר גדל. רוב החרוזים בגודל 10 מיקרומטר התרכזו במרכז ב-5 וולט של מתח ה-PZT. באמצעות תוצאה זו, תדר תהודה של 3.66 MHz נוצר במחולל פונקציות ערוץ יחיד, ואות כללי הוגבר על ידי 16 dB (כ 9 פעמים) באמצעות מגבר כוח.
טבלה 3 מראה כי תערובת המיקרובים של 1 מיקרומטר (גודל התא) ו-10 מיקרומטר (חרוז מחובר אפטמר) הוזרקה לשבב הנוזל האקוסטי ששימש במחקר זה, וביצועי הפרדת השבבים בהתאם לקצב זרימת השקע (400, 450 ו-475 μL/min) הם תוצאה של ההערכה. שיעור ההתאוששות הוא היחס בין מספר החרוזים שנאספו בשקע למספר הכולל של חרוזים מוזרקים עבור חרוזים בגודל 10 מיקרומטר, שהיו 98% ± 2.2%, 98% ± 2.5%, ו 90% ± 9.8%, בהתאמה. טוהר הוא היחס בין מספר החרוזים בגודל 10 מיקרומטר למספר החרוזים הכולל שנאספו, שהיו 97.1% ± 3.6%, 97.6% ± 2.4% ו-99.4% ±-0.6%, בהתאמה. זה מראה כי המכשיר יש יעילות הפרדה גבוהה עבור חרוזים עם גודל של 10 μm.
איור 6 מציג תמונות וגרף של מספרים הקשורים לחיידקים בכל חרוז. נתונים הנוגעים לפעולת שבב אקוסטופורזיס לגבי דגימות המטרה והפסולת נאספו בשקע ובכניסה, בהתאמה. כל הדגימות היו נתונות לדגימה של 10 μL בצינורות איסוף, ומספר החיידקים שנקשרו למיקרובים נצפה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. חיידקי GN רבים (למשל, E. קולי DH5α) קשורים לכל החרוזים, בעוד שכמה חיידקי GP (למשל, ליסטריה אפורי) קשורים לחלק מהחרוזים. המספרים של חיידקי GN ו-GP הקשורים לכל מיקרובאד שעבר שינוי אפטאמר (מתוך 25 חרוזים) נמדדו באמצעות מיקרוסקופ עם מצלמה במהירות גבוהה. כל חמשת חיידקי ה-GN נקשרו לחרוזים (4.96 ± 0.77 כל אחד), בעוד שבאופן משמעותי פחות חיידקי GP נקשרו לחומרים (0.08 ± 0.08 כל אחד) שנבדקו. עוצמת האות הייתה שונה באופן משמעותי בין חיידקי ה-GN וה-GP. נתונים אלה מאשרים כי מכשיר זה הצליח לבודד חיידקי GN.
איור 1: סכמת המיקרו-ערוצים, יישור מרכזי של מיקרובים באמצעות אקוסטופורזיס ואיסוף המטרות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: תמונת CAD של שבב האקוסטופורזיס המיקרופלואידי להפרדת חיידקי GN באמצעות חרוזי זיקה אפטמרים . (A) שכבת ערוץ סיליקון. (B) שכבת זכוכית עליונה. (לממדים של 1 עד 4, ראו טבלה 1). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: מבנה המיקרו-מכשיר של אקוסטופורזיס . (א) חלקת רצפה, (ב) תכנית חתך רוחב, ו-(ג) תצלום של המכשיר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: סכמות של המערכת האקוסטופלואידית המשמשת להפרדה ולאיסוף של תאים. פתרון הדגימה או החיץ מוזרק ליציאת הכניסה דרך בקר הזרימה. עבור מרכוז חרוזים והפרדת דגימות, כוח AC מוחל על PZT באמצעות מחולל פונקציות עם מגבר כוח כדי ליצור כוח קרינה אקוסטית במיקרו-ערוץ. דגימת המטרה המופרדת נאספת דרך צינור איסוף, ונוזל הפסולת הנותר משוחזר דרך שקע אחר. מודול מצלמה במהירות גבוהה משמש כדי לדמיין את ההפרדה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: תמונה של זרימת חרוזים כפונקציה של מתח PZT. (A) PZT כבוי, (B) PZT 0.1 V, (C) PZT 0.5 V, (D) PZT 5 V. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: מספרים של חיידקי GN (E. coli DH5α) ו-GP (ליסטריה אפורה) הקשורים למיקרובים שעברו שינוי אפתמר (n = 25 , שורת שגיאה = שגיאת תקן). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| מספר | מכשיר | רוחב (W) או קוטר (D) (μm) |
| 1 | כניסת כניסה ויציאה (סיליקון) | 1000 (ד) |
| 2 | תעלה מיקרופלואידית | 200 (ר) |
| 3 | ערוץ כניסה ויציאה | 400 (ר) |
| 4 | כניסה ויציאת שקע (זכוכית) | 1500 (ד) |
טבלה 1: ממדים של הפלטפורמה המיקרופלואידית הפנאומטית (1 עד 4 באיור 2).
| חיידקי GN | חיידקי GP |
| Escherichia coli (DH5α) | בצילוס מגטריום (KCTC 1021) |
| Enterobacter cloacae | סטפילוקוקוס אפידרמידיס |
| ספינגומונס אינסולה | ליסטריה אפורי |
| Escherichia coli KCTC 2571 | אנטרוקוקוס תאילנדיקוס |
| פסאודומונס פיקטורום | סטפילוקוקוס פסטורי |
טבלה 2: חיידקי ה-GN וה-GP שנחקרו.
| קצב זרימה בשקע wate (μL/min) | שיעור ההחלמה (%) | טוהר (%) |
| 400 (5x צנזורה נפחית) | 98 ± 2.2 | 97.1 ± 3.6 |
| 450 (10x כריתה נפחית) | 98 ± 2.5 | 97.6 ± 2.4 |
| 475 (20x קונצנטרציה נפחית) | 90 ± 9.8 | 99.4 ± 0.6 |
טבלה 3: קצב ההחלמה וטוהר ההפרדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פיתחנו מכשיר מיקרופלואידי לריחוף קולי ללכידה והעברה של חיידקי GN מדגימות תרבית במהירות גבוהה על בסיס שיטת ריצה רציפה בהתאם לגודלם ולסוגם, ומיקרובים שעברו שינוי אפטמר. המיקרו-ערוץ הארוך והמרובע מאפשר תכנון פשוט יותר ויעילות גבוהה יותר עבור אקוסטופורזיס דו-ממדי ממה שדווח בעבר 20,21,22,23,24,25,26. למכשיר שיעור התאוששות של >98% עד לריכוז מנה של פי 10. מחקר זה מראה שיעור התאוששות וטוהר גבוהים יותר מהשיטות הקיימות ללא תוויות 20,21,22,23,24 ושיטות חרוזי זיקה 25,26 להפרדת חיידקים. זה מצביע על כך שהמכשיר יכול להפריד חיידקים ביעילות. עם זאת, מכיוון שחרוזים של 10 מיקרומטר יכולים לזרום לתעלות הצדדיות, קצב ההתאוששות מצטמצם ל-90% בריכוז מינון של פי 20 בשל כוח המשיכה החזק הנובע מהשקע הסגור החוסם קרינה אקוסטית במבחן ביצועים. בעוד ששיעור ההתאוששות על השבב יכול להגיע ל -98%, מספר גורמים מפחיתים את קצב ההתאוששות, כגון משקעי החרוזים במשאף או סתימת הצינור המחבר את המשאף לשבב.
יש כמה נקודות מפתח הדרושות כדי לגרום לשבב האקוסטופורטי הזה ולגרום לו לעבוד. יש להשתמש בדבק המשמש לחיבור ה- PZT מעט ככל האפשר לדיוק הקורוגציה וה- PZT והמיקרו-ערוץ צריכים להיות מקבילים. שגיאות בשלב זה גורמות להעברת צורות גל שגויות דרך ה- PZT לשבב, המתבטאת באי-התאמה של חרוזים. כמו כן, היזהר בעת ההפעלה, כמו מספר גורמים יכולים להחמיר את קצב ההתאוששות, כגון שקיעה של חרוזים מן המזרק או חסימה של צינור החיבור עם שבבים מן המזרק.
מכשיר זה יכול לשמש לא רק לאיתור חיידקים חיים או סמנים ביולוגיים שמקורם בחיידקים בתחום האבחון המוקדם של מחלות זיהומיות חיידקיות, אלא ניתן גם להרחיבו לניטור זיהום מים, אשר יסייע בזיהוי טרור ביולוגי וזיהומים חיידקיים פתוגניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) במימון ממשלת קוריאה (משרד המדע והתקשוב). (לא. NRF-2021R1A2C1011380)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 µm polystyrene microbeads | Bang Laboratories | PS04001 | Cell size beads |
| 10 µm Streptavidin-coated microbeads | Bang Laboratories | CP01007 | Aptamer affinity beads |
| 4-inch Silicon Wafer/SU-8 mold | 4science | 29-03573-01 | Components of chip |
| Aptamer | Integrated DNA Technologies | GN3-6' | RNA for bacteria conjugation |
| Borosilicate glass | Schott | BOROFLOAT 33 | Components of chip |
| Centrifuge | Daihan | CF-10 | Wasing particles |
| Cyanoacrylate glue | 3M | AD100 | Attach PZT to microchip |
| Escherichia coli DH5α | KCTC | KCTC2571 | Target bacteria |
| Functional generator | GW Instek | AFG-2225 | Generate frequency |
| High-speed camera | Photron | FASTCAM Mini | Observation of separation |
| Hot plate | As one | HI-1000 | Heating plate for curing of liquid PDMS |
| KOVAX-SYRINGE 10 mL Syringe | Koreavaccine | 22G-10ML | Fill the microfluidic acoustophoresis channel with bubble-free demineralized water. |
| Liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| LB Broth Miller | BD Difco | 244620 | Cell culture (Luria-Bertani medium) |
| Microscope | Olympus Corp. | IX-81 | Observation of separation |
| PBS buffer | Capricorn scientific | PBS-1A | Wasing bacteria |
| PEEK Tubes | Saint-Gobain Ppl Corp. | AAD04103 | Inject or collect particles |
| Piezoelectric transducer | Fuji Ceramics | C-213 | Generate specific wave in channel |
| Power amplifier | Amplifier Research | 75A250A | Amplify frequency |
| Pressure controller/μflucon | AMED | AMED-μflucon | Control of air pressure/flow controller |
| Tris-HCl buffer | invitrogen | 15567027 | Wasing particles |
| Tube rotator | SeouLin Bioscience | SLRM-3 | Modifiying aptamer and bead |
References
- Wu, M., et al. Acoustofluidic separation of cells and particles. Microsystem & Nanoengineering. 5 (1), 1-18 (2019).
- Lee, S. W., et al. Aptamer affinity-bead mediated capture and displacement of Gram-negative bacteria using acoustophoresis. Micromachines. 10 (11), 770 (2019).
- Hirvonen, J. J., et al. One-step sample preparation of positive blood cultures for the direct detection of methicillin-sensitive and -resistant Staphylococcus aureus and methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci within one hour using the automated GenomEra CDXTM PCR system. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (10), 2835-2842 (2012).
- Swaminathan, B., Feng, P. Rapid detection of food-borne pathogenic bacteria. Annual Review of Microbiology. 48 (1), 401-426 (1994).
- Ding, X., et al. On-chip manipulation of single microparticles, cells, and organisms using surface acoustic waves. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (28), 11105-11109 (2012).
- Karthick, S., et al. Acoustic impedance-based size independent isolation of circulating tumor cells from blood using acoustophoresis. Lab on a Chip. 18 (24), 2802 (2018).
- Lenshof, A., et al. Acoustofluidics 8: Applications of acoustophoresis in continuous flow microsystems. Lab on a Chip. 12 (7), 1210-1223 (2012).
- Persson, J., et al. Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection. The FEBS journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).
- Klussmann, S. The aptamer handbook: Functional oligonucleotides and their applications. , John Wiley & Sons. Hoboken, New Jersey. (2006).
- Ellington, A., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Namnabat, M. S., et al. 3D numerical simulation of acoustophoretic motion induced by boundary-driven acoustic streaming in standing surface acoustic wave microfluidics. Scientific Reports. 11 (1), 11326 (2021).
- Nimjee, S. M., et al. Aptamer as therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 61-79 (2017).
- Zhang, Y., et al. Recent advances in aptamer discovery and application. Molecules. 24 (5), 941 (2019).
- Park, J. W., et al. Acousto-microfluidics for screening of ssDNA aptamer. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Persson, J., et al. Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection. The FEBS Journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).
- Van Toan, N., et al. An investigation of processes for glass micromachining. Micromachines. 7 (3), 51 (2016).
- Jansen, H., et al. A survey on the reactive ion etching of silicon in microtechnology. Journal of Micromechanics and Microengineering. 6 (1), 14 (1996).
- Hanneborg, A., et al. Silicon-to-silicon anodic bonding with a borosilicate glass layer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 1 (3), 139 (1991).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnology and bioengineering. 107 (2), 302-311 (2010).
- Wang, S., et al. Simple filter microchip for rapid separation of plasma and viruses from whole blood. International Journal of Nanomedicine. 7, 5019-5028 (2012).
- Ai, Y., et al. Separation of Escherichia coli bacteria from peripheral blood mononuclear cells using standing surface acoustic waves. Analytical Chemistry. 85 (19), 9126-9134 (2013).
- Ohlsson, P., et al. Acoustic impedance matched buffers enable separation of bacteria from blood cells at high cell concentrations. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Park, S., et al. Continuous dielectrophoretic bacterial separation and concentration from physiological media of high conductivity. Lab on a Chip. 11 (17), 2893-2900 (2011).
- Kim, U., Soh, H. T. Simultaneous sorting of multiple bacterial targets using integrated Dielectrophoretic-Magnetic Activated Cell Sorter. Lab on a Chip. 9 (16), 2313-2318 (2009).
- Cai, G., et al. A fluidic device for immunomagnetic separation of foodborne bacteria using self-assembled magnetic nanoparticle chains. Micromachines. 9 (12), 624 (2018).
