Summary
Laktik asit bakteri (LAB) kültürlerinin kalite kontrol değerlendirmesi, fermantasyon prosedürleri için LAB suşlarının yaşayabilirliğini ve işlevselliğini arttırmanın etkili bir yolu olarak doğrulanmıştır. Bu iddiayı desteklemek için, LAB kültürlerinin fermantasyon ve biyoişleme prosedürleri için nasıl aktive edildiğini ve yetiştirildiğini açıklayan bir protokol geliştirdik.
Abstract
Laktik asit bakterileri (LAB), yoğurt ve peynir gibi fermente süt ürünlerinin üretiminde önemli ölçüde kullanılan temel süt başlangıç kültürleridir. LAB ağırlıklı olarak fermantasyonun önemli bir son ürünü olarak laktik asit üretir ve fermente gıda ürünlerinin organoleptik özelliklerini veren önemli metabolitleri sentezler. LAB, yeterli beslenme gereksinimleri yerine getirildiğinde birçok ortamda gelişen titiz bakterilerdir. Gıda ve süt ürünleri endüstrisindeki fermantasyon uygulamaları için üstün LAB süt ürünleri başlangıç kültürlerine olan talep, tüm biyo-işleme operasyonları için uygulanabilir ve aktif kültürler sağlama ihtiyacını doğurmuştur. Bu nedenle, LAB kültürlerinin laboratuvarda ve süt ürünleri işleme ortamlarında yaşayabilirliğini ve gelişmiş işlevselliğini sağlamak için standart bir protokolün geliştirilmesi çok önemlidir. Zayıf, stresli ve yaralı LAB kültür hücrelerinin canlandırılmasıyla ilgili endişelerin ele alınmasında, iyileşmek, hücre yenilenmesini arttırmak ve LAB suşlarının metabolik işlevselliğini iyileştirmek için göze çarpan adımları canlı bir şekilde özetleyen bir protokol çok önemlidir. LAB başlangıç kültürleri için kültür saflığının, işlevselliğinin ve uygulanabilirliğinin korunması da aynı şekilde kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, benzersiz bir protokol kılavuzuna bağlılık, fermantasyon ve biyoteknoloji proseslerine adanmış birçok LAB suşu için fermantasyon performansının teşvik edilmesine neden olacaktır. Sonuç olarak, Kuzey Carolina Tarım ve Teknik Eyalet Üniversitesi'ndeki Gıda Mikrobiyolojisi ve Biyoteknoloji Laboratuvarı, fermantasyon araştırması için kullanılan son derece işlevsel ve uygulanabilir LAB kültür suşları ile sonuçlanan seçilmiş LAB suşlarının aktivasyonu ve kalite kontrolü için standart bir protokol geliştirmiştir. Bunun gibi bir protokolün süt ürünleri ve gıda endüstrisinde kullanılmak üzere uyarlanması ve önerilmesi, birçok uygulama için LAB'ın uygulanabilirliğini ve işlevselliğini sağlamaya yardımcı olacaktır.
Introduction
Laktik asit bakterileri (LAB), endüstriyel potansiyele sahip benzersiz çeşitlilikte bir bakteri grubudur. Lactobacillus delbreuckii subsp. bulgaricus ve Streptococcus thermophilus'a ait suşlar çoğunlukla yoğurt1 gibi fermente süt ürünleri için süt başlangıç kültürleri olarak kullanılır. Seçilen LAB suşları, dozajlar yeterince uygulandığında insanlara sağlık yararları sağladıkları için probiyotikler olarak da sınıflandırılır2. Laktik asit bakterileri aynı zamanda gram-pozitif, spor oluşturmayan, solunum yapmayan ancak aerotoleranslı mikroorganizmalardır ve genellikle laktik asidin anahtar fermantasyon ürünü olarak üretilmesi ile karakterize edilir. LAB ayrıca esansiyel metabolitleri, örneğin organik asitleri, bakteriyosinleri ve gıda kaynaklı patojenlerin geniş bir spektrumunu inhibe edebilen diğer antimikrobiyal bileşikleri3 sentezler4. Karbonhidrat katabolizmasının önemli bir son ürünü ve LAB fermantasyonunun bir yan ürünü olan laktik asit, antimikrobiyal özelliklere sahip ve gıda biyopkoruma uygulamaları için potansiyel olarak yararlı olan organik bir metabolittir 3,5,6. Ayrıca, LAB tarafından üretilen organik asitler, gıdaların lezzetini, dokusunu ve aromasını verir, böylece sonuç olarak genel organoleptik özelliklerini arttırır 5,6. LAB'ın farklı beslenme gereksinimleri, her yerde bulunan doğaları ile birleştiğinde, sonuçta bakterilerin süt bazlı gıdalar, fermente gıdalar, sebzeler ve insan bağırsağında olduğu gibi farklı ortamlarda kolayca gelişmesini sağlar7.
Yoğurt üretimi ve çok çeşitli süt ürünleri uygulamaları için LAB'den başlangıç kültürlerine artan bir talep vardır8,9, bu nedenle LAB suşlarının yetiştirilmesinde ve hem liyofilize hem de izole suşların aktivasyonunda kritik dikkat ve yerleşik bilimsel tekniklere uyulmalıdır, çünkü bu aktivite gelişmiş fermantasyon performansı için hayati öneme sahiptir. Bu nedenle, Gıda Mikrobiyolojisi ve Biyoteknoloji laboratuvarı, fermente süt ürünlerinden ve yoğurt üretimi için kullanılan endüstriyel başlangıç kültürlerinden izole edilen LAB suşlarının aktivasyonu, üstün büyümesi ve fermantasyon karakteristiğine yönelik uygun teknoloji geliştirmede aktif olarak yer almaktadır. Ayrıca, endüstriyel olarak üretilen LAB kültür suşlarının dondurarak kurutma ve dondurulmuş depolama gibi koruyucu faaliyetlere maruz kalmaları, hücre stresine ve yaralanmasına neden olmaları, maruz kaldıkları soğuk şok işlemi sonucunda10. İzole gıda ürünlerinden veya dondurularak kurutulmuş ürünlerden elde edilen LAB suşlarının canlılık zorluklarını sınırlamak ve işlevselliğini geliştirmekte, fermentatif karakteristiklerini arttırmak için bu kültürleri bir kalite kontrol biçimi olarak uygun şekilde aktive etmek önemlidir8. Bu çalışmada amaç, L. delbrueckii subsp. bulgaricus kültür suşlarının aktivasyonu ve büyümesi için nihayetinde uygulanabilir LAB büyümesini teşvik eden ve aynı zamanda fermantasyon performansını ve LAB suşlarının metabolik işlevselliğini artıran bir kurum içi kalite kontrol protokolü geliştirmekti. Bu protokol nihayetinde fermantasyon araştırması için diğer LAB suşlarının yetiştirilmesinin yanı sıra endüstriyel amaçlar veya biyoişleme operasyonları için (optimum büyüme ortamı ve uygun kültürleme koşulları kullanılarak) uyarlanabilir. Bu nedenle, bu LAB aktivasyonu ve kalite kontrol protokolü, küresel süt ürünleri ve gıda endüstrisindeki çeşitli uygulamalar için üstün uygulanabilir süt ürünleri başlangıç kültürlerinin elde edilmesini ve potansiyel olarak işlevsel olmasını sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Genel gereç ve yöntemler
- Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus'un kaynağı
- L. bulgaricus suşlarını güvenilir kaynaklardan elde edin.
NOT: Bu çalışmada kalite kontrol çalışmasında toplam beş (5) L. bulgaricus suşu kullanılmıştır (Tablo 1). Fermente süt ürünlerinin endüstriyel üretimi için iki dondurularak kurutulmuş L. bulgaricus suşu, Bulgaristan'ın Plovdiv kentindeki Gıda Teknolojileri Üniversitesi Biyoteknoloji Bölümü Dr. Albert Krastanov tarafından sağlanmıştır. ABD pazarında bulunan ticari yoğurt ürünlerinden izole edilen iki suş, Kuzey Carolina A & T Eyalet Üniversitesi'ndeki Gıda Mikrobiyolojisi ve Biyoteknoloji laboratuvarının -80 ° C stoğundan elde edildi ve bir dondurularak kurutulmuş suş bir satıcı C tarafından tedarik edildi. Tüm LAB suşları daha fazla kullanıma kadar -80 ° C'de tutuldu. Kuzey Carolina A & T Eyalet Üniversitesi'ndeki Gıda Mikrobiyolojisi ve Biyoteknoloji laboratuvarının -80 °C stokundan elde edilen başka bir bakteri suşu (Limosilactobacillus reuteri) da değerlendirildi.
- L. bulgaricus suşlarını güvenilir kaynaklardan elde edin.
- Standart L. MRS fermantasyon suyu ortamı
- 55 g MRS ve 0.5 g L-Sistein 1 L deiyonize suda (DW) tamamen çözerek deMan, Rogosa Sharpe (MRS) ortamını hazırlayın.
- Hazırlanan MRS çözeltisinin sırasıyla 7 mL ve 2 mL'sini test tüplerine dağıtın, 15 dakika boyunca 121 ° C'de otoklav yapın ve ardından oda sıcaklığında (RT) soğutun.
- MRS agar ortamı
- 1 L DW'de 55 g MRS ve 0.5 g L-Sistein tamamen çözerek MRS agar ortamını hazırlayın. Agar tozu (15 g) ekleyin, agar ortamını 15 dakika boyunca 121 ° C'de sterilize edin ve ardından bir su banyosunda soğutun.
- Taze hazırlanmış tüm ortamları steril Petri kaplarına dökün ve daha fazla ihtiyaç duyulana kadar 4 ° C'de saklayın.
- Modifiye güçlendirilmiş klostridiyal orta-piruvat (mRCM-PYR)
- Oyeniran ve ark.13 ve Nwamaioha ve İbrahim18'e göre, 10 g pepton #3, 10 g sığır eti özü, 5 g maya özü, 5 g sodyum klorür, 3 g sodyum asetat, 2 g potasyum fosfat dibazik çözerek L. bulgaricus'un seçiciliği ve doğru sayımı için güçlendirilmiş bir klostridiyal ortamı optimize edin, 0.1 g urasil, 0.25 g kalsiyum klorür, 5 g dekstroz, 5 g fruktoz, 10 g maltoz, 2 g sodyum piruvat,% 0.2 Ara 80 ve 1 L DW'de 0.5 g L- Sistein.
- % 0.008 anilin mavisi ve 15 g agar ilavesinden önce 6 N HCl kullanarak çözeltinin nihai pH'ını (6.0 ± 0.2) ayarlayın. Ortamı 15 dakika boyunca 121 ° C'de otoklav yapın, bir su banyosunda soğutun ve steril Petri kaplarına dökün. Taze hazırlanmış tüm ortamları steril Petri kaplarında 4 °C'de ihtiyaç duyulana kadar saklayın.
- LAB kültürlerinin gliserol stoğu
- Aynı DW hacminde% 100 gliserol seyrelterek gliserol stoklarını (% 50 gliserol) hazırlayın ve kuru bir sterilizasyon döngüsü kullanarak 30 dakika boyunca 100 ° C'de sterilize edin. Gliserol stoklarını RT'ye soğutun ve daha fazla kullanım için aseptik olarak saklayın.
- Gece kültürlerinden bakteri büyümesi (geliştirilen QC protokolü kullanılarak elde edilen tek bir L. bulgaricus kolonisi) kullanın.
- Pipet, gece kültürlerinin 500 μL'sini 2 mL'lik bir santrifüj tüpünde %50 gliserol haline getirin ve nazikçe karıştırın. LAB kültürlerini içeren gliserol stoğunu dondurun ve ihtiyaç duyulana kadar -80 ° C'lik ultra düşük bir sıcaklıkta saklayın.
NOT: LAB kültürlerinin kalite kontrolü ve aktivasyonu için protokolün grafik şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.
| Hayır | Ürün Kodu | Örnek | Kaynak | Bakteriyel Bileşim etiketli1 |
| 1 | S9 Serisi | Saf Endüstriyel Gerinim | Bulgaristan | Lb. bulgaricus |
| 2 | LB6 Serisi | Saf Endüstriyel Gerinim | Bulgaristan | Lb. bulgaricus, |
| 3 | ATCC 11842 · | Saf Endüstriyel Gerinim | cesaret | Lb. bulgaricus |
| 4 | Küçük karga | Yoğurt | ABD | Lb. bulgaricus, diğer canlı kültür |
| 5 | E22 Serisi | Yoğurt | ABD | Lb. bulgaricus, diğer canlı kültür |
| 6 | Arjantin | Yoğurt | ABD | Limosilactobacillus reuteri |
| 1lb. = Lactobacillus | ||||
Tablo 1: Probiyotik suşlar. Tablo, bu çalışmada kullanılan probiyotik suşları listeler.
2. LAB kültürlerinin aktivasyonu ve kalite kontrolü için protokol
- LAB suşlarının hazırlanmış gliserol stoğunu (2 mL santrifüj tüplerinde) -80 °C ultra düşük dondurucudan alın ve kullanmadan önce çözülmelerine izin vermeyin.
- Santrifüj tüplerinin açıklığını% 70 alkolle temizleyin ve dezenfekte edin ve kullanmadan önce hafifçe vorteks.
- Santrifüj tüplerinden taze 2 mL MRS test tüplerine stok LAB kültürünün yaklaşık 250 μL (0,25 mL) pipeti.
- Yavaşça vorteks, test tüplerini parafilm haline getirin ve 12-16 saat boyunca 42 ° C'de gece boyunca anaerobik olarak inkübe edin.
- 2 mL MRS test tüplerinden bir gecede yetiştirilen kültürlerden taze 7 mL MRS test tüplerine, girdaplara yaklaşık 500 μL (0,5 mL) alın ve 12-16 saat boyunca 42 ° C'de gece boyunca anaerobik olarak inkübe edin.
- UV görünür spektrofotometre ile 610 nm'de kültürlerin optik yoğunluğunu (OD) veya büyümesini ölçerek mikrobiyal büyümeyi değerlendirin ve 0,7 ile 0,9 arasında kabul edilebilir sonuçlar kaydedin.
- Gece kültürlerini 7 mL MRS tüplerinden MRS ve MRCM-PYR agar plakalarına çizin ve 42 ° C'de 72 saat boyunca anaerobik olarak inkübe edin.
- Agar plakalarından izole edilmiş kolonileri toplayın, taze 7 mL MRS test tüplerine, hafifçe vortekse aktarın ve 12-16 saat boyunca 42 ° C'de gece boyunca anaerobik olarak inkübe edin.
- İzole edilmiş suşları içeren agar plakalarını buzdolabında bir hafta boyunca 4 ° C'de saklayın.
- 610 nm'deki çizgili plakalardan izole edilen LAB kültürlerinin 7 mL MRS test tüplerinden OD'yi (0.7 ila 0.9 arasında) ölçün ve onaylayın ve bunları ilgili tüm deneyler için çalışma kültürleri olarak kullanın.
- 1:10 oranını elde etmek için 9 mL pepton suyu (fizyolojik bir tampon) kullanarak son 7 mL MRS test tüplerinden yetiştirilen LAB kültürlerinin on kat seyreltilmesini (seri olarak seyreltilmiş) gerçekleştirin.
- Son olarak, tüm fermantasyon deneyleri için uygun seri seyreltmelerden yaklaşık 250 μL (0.25 mL) alın.
- 2.12. adımdan itibaren suşlar (250 μL) içeren suyu taze 7 mL MRS suyuna aktararak ve 16 saat boyunca 42 ° C'de anaerobik olarak inkübe ederek aktive edin.
- LAB kültürlerinden canlı ve üstün hücre büyümesini sağlamak için 2.6-2.12 adımlarını tekrarlayarak devam edin.
NOT: Tüm L. bulgaricus suşları taze hazırlanmış MRS suyunda aktive edildi ve daha sonra 0.7 ila 0.9 arasında bir optik bakteri büyümesi yoğunluğuna (OD610 nm) ulaşmak için 16 saat boyunca 42 ° C'de anaerobik olarak inkübe edildi. Bakteriyel büyüme, 610 nm'de UV tarafından görülebilen bir spektrofotometre ile ölçüldü. Gece kültürlerinin pH değerleri, LAB fermantasyonunun organik bir son ürünü olan laktik asit üretiminin bir sonucu olarak 3.5 ila 5.3 aralığındaydı. Biyogüvenlik başlığında uygun hava akımı sirkülasyonu ve bunsen brülörün kullanımı sırasında yanıkların önlenmesi gibi güvenlik prosedürlerine uyulmuş ve gözlemlenmiştir.
Şekil 1: Laktik asit bakteri (LAB) kültürlerinin aktivasyonu için protokolün grafiksel şeması. Şema, LAB kültür suşlarının taşınması ve etkinleştirilmesi için gerekli ayrıntıları ve temel araçları sağlar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kalite kontrol protokolü ile yetiştirilen değerlendirilen LAB suşlarının hücre büyümesi, bu standart protokol olmadan yetiştirilen suşlardan anlamlı derecede farklıydı (P < 0.05). Hem L. bulgaricus hem de L. reuteri için QC protokolü çok alt kültürleme yaklaşımı kullandı (agar plakalarına çizgi çizmeden önce üç kez alt kültürleme), kontrol prosedürü ise diğer tüm koşullar sabit tutularak sadece bir kez alt kültürleme yapıldı. Koloni büyümesi de daha yüksekti ve bu standart QC protokolü kullanılarak yetiştirilen büyüme ortamı plakalarında iyi tanımlanmıştı. Bu, protokolün fermentatif et suyundaki hücre bölünmesi yoluyla gelişmiş LAB büyümesinin sağlanmasındaki etkinliğini doğruladı, bu nedenle LAB suşlarında gelişmiş hücre metabolizmasına yardımcı oldu. Gelişmiş kalite kontrol protokolü ile birlikte ve olmadan yetiştirilen iki suşun büyümesi Şekil 2'de gösterilmiştir. Suşlar, yoğun büyüme (OD610 nm'de 0.7-0.9) gözlemlendikten ve ölçüldükten sonra agar plakalarına çizildi. Plakalar 72 saat boyunca 42 ° C'de anaerobik olarak inkübe edildi, daha sonra çizgi çizgileri boyunca ayrı koloniler gözlendi. Başka bir çalışma (Şekil 3), TPY ortamında kültürlenen ve 37 ° C'de inkübe edilen Lactobacillus reuteri'nin büyümesi üzerindeki kalite kontrol protokolünün etkinliğini doğruladı; bu sayede QC protokol tekniği tarafından üretilen koloniler, tarihsel verilere dayanarak istikrarlı bir kararlı durum büyümesini (OD610 nm'de ortalama 0.9) doğruladı. Geliştirilen QC tekniğini kullanmayan çoklu alt kültürleme olmadan LAB aktivasyonunun bir kontrol yöntemi, L. reuteri'nin düzensiz bir büyüme paterni (OD610 nm'de 0.9-0.75) ile sonuçlandı.
Şekil 2: L. bulgaricus suşlarının büyümesinin kolonyal morfolojisi, geliştirilen kalite kontrol protokolü ile birlikte ve olmadan yetiştirilmektedir. Suşlar üçlü olarak çizgilendirildi ve 72 saat boyunca 42 ° C'de anaerobik olarak inkübe edildi .
Şekil 3: L'nin davranışı. Standartlaştırılmış QC protokolünü ve geleneksel bakteri kültürü yöntemini kullanarak 37 ° C'de TPY ortamında büyümeden sonraki bir süre boyunca reuteri (P < 0.05). L. reuteri'nin büyümesi bir ay boyunca periyodik olarak izlendi ve standart QC protokolü ile kültür aktivasyonuna dayanan önceki yılların geçmiş verileriyle uyumlu hale getirildi. Hata çubukları, OD değerlerinin standart sapmasını gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kalite kontrol protokolü ile ve protokol kullanılmadan değerlendirilen tüm suşların sonuçları aynıydı ve bu nedenle sadece suşlarla (S9 ve LB6) bağlantılı sonuçlar sunuldu. Aktif LAB suşları, yüksek yoğunluklu hücre biyokütlesi ile karakterize edilen üstün hücre büyümesine sahipti, bu nedenle test tüpü11'de MRS fermentatif suyunun bulanık bir görünümüne neden oldu. Kültür aktivasyonundan sonra gözlenen hücre büyümesi, 42 ° C'lik bir anaerobik fermentatif sıcaklıkta 12 saat ile 16 saat arasında belirgindi. Ayrıca, bu protokole dayanarak aktive edilen LAB suşlarının, seri çizgileri boyunca görülebilen ayrık kolonilerle çoklu alt kültürleme prosedürü12'nin bir sonucu olarak koloni morfolojilerinin sürekli olarak dönüştürüldüğü doğrulanmıştır. Kontrol deneyi bu standart protokolü kullanmadı ve sadece bir kez alt kültürlendi; Bununla birlikte, fermentatif et suyunda da yoğun bulanıklık göstermedi, ancak büyüme hala OD610 nm'de kabul edilen 0.7-0.9 aralığında idi. Ayrıca, kontrol kültürlerinin agar plakaları üzerine dizilmesi ve standart prosedürle aynı koşullar altında anaerobik olarak inkübe edilmesinin, standart protokol13'te gözlemlenenlere kıyasla sadece daha küçük ve daha az koloni tasvir etmesi dikkat çekiciydi.
Bu, LAB hücrelerinin zayıf ve canlı olmayan özelliklerine bağlanabilir. Sonuç olarak, alt kültürleme kavramı LAB suşları birçok kez ve agar plakaları üzerinde çizgilenme, böylece hücre bölünmesi ve bakterilerde genetik madde değişimi yoluyla yeni hücrelerin üretilmesiyle sonuçlanır. Bu, hücresel ve metabolik işlevselliği arttırır ve fermantasyon işlemleri sırasında hücrelerin büyümesini teşvik eder14. Ek olarak, stresli ve yaralı LAB hücreleri, tam hücre ve metabolik işlevselliği kolayca adapte etmelerini ve yeniden kazanmalarını sağlayan büyüme koşullarının (beslenme gereksinimleri, pH ve sıcaklık) istikrarlı durumuna bağlı olarak da geri kazanılır6. Dahası, bu protokole sıkı sıkıya bağlı kalmak, hücre kültürlerinin kontaminasyonunu büyük ölçüde sınırlar, böylece fermantasyon amacıyla sadece saf ve üstün hücre kolonilerinin izole edilmesini sağlar. Bu nedenle, LAB hücre kültürlerinin agar plakalarından tekrar tekrar çizilmesi ve geri kazanılması, LAB fermantasyon operasyonları gibi metabolik aktiviteler için çok uygun olan gelişmiş bir hücre duvarı sağlamıştır15. Ayrıca, geliştirilen kalite kontrol protokolüne dayanan L. reuteri'nin büyümesi üzerine yapılan çalışma (Şekil 3), LAB'ın koloniden kültüre yöntemiyle alt kültürlenmesinin, doğrudan kültürden kültüre (geleneksel yöntem) alt kültürlemeye kıyasla bir süre boyunca optimum büyüme aralığında (0.9-1.0 OD 610 nm) istikrarlı bir istikrarlı büyüme sağladığını doğrulamaktadır. . QC protokolünün, zamanla, 0.1'lik bir standart sapmaya (SD) sahip olan kararlı bir bakteri büyüme paterni verdiği de açıktı. Bununla birlikte, L. reuteri'nin düzensiz büyümesi, bakteri hücrelerinin düzensiz büyümesi nedeniyle SD'sinin 0.1'den büyük olmasına sahipti. Bu düzensiz büyüme paterni, daha önce de belirtildiği gibi, zayıf ve yaralı hücrelere atfedildi; böylece fermantasyon döneminde hücrelerin metabolik işlevselliği azalmıştır14. Mevcut çalışma aynı zamanda Ahmed ve ark.16 tarafından bir önceki çalışma ile de doğrulanmıştır; bu nedenle, çalışmalarında L. reuteri, 37 ° C'de 8 hafta boyunca triptikaz pepton maya ekstresi (TPY) agar ortamında çoğaltılmıştır. L. reuteri'nin istikrarlı büyümesi için katkıda bulunan bir faktör, çalışma döneminde birkaç alt kültürleme faaliyetinden sonra bile yeni ve üstün derecede aktif kültürler üreten hücre yetiştirme yöntemine ve kalite kontrol tekniğine bağlanmıştır.
Bu protokoldeki kritik adımlar, her zaman yeni ve bir günden daha eski fermentatif kültürlerin kullanılmasını ve fermantasyonun başlamasından önce her zaman fermentatif et suyu veya büyüme ortamının yeni hazırlanmış olmasını ve ortamın gücü ve gücü uzun bir depolama süresi boyunca azaldıkça depolanmış büyüme ortamının kullanılmamasını içerir. -80 °C veya -20 °C'den stok kültürlerin kullanılması durumunda, kültürler aseptik olarak ele alınmalıdır. Ayrıca, dondurucudan gelen soğuk şoku nedeniyle stok kültürlerinin zayıf olduğu gözlenirse, aşağıdaki gibi resüsitasyon gereklidir. Stok kültürlerinin sadece düşük konsantrasyonları (yaklaşık 100 μL), yaklaşık 16 saat17 saat boyunca son anaerobik inkübasyon için yaklaşık 5-6 mL'lik ilave MRS eklenmeden önce, yaklaşık 6 saat boyunca anaerobik inkübasyon için yaklaşık 2 mL'lik takviyeli fermentatif et suyuna (MRS) aşılanmalıdır. Liyofilize veya dondurularak kurutulmuş kültürlerin kullanılması durumunda, dondurularak kurutulmuş kültürlerin 3 mL yağsız sıvı sütte geri kazanılması ve MRS gibi takviyeli fermentatif et suyunda aşılamadan önce yaklaşık 4-5 saat boyunca anaerobik olarak inkübe edilmesi şiddetle tavsiye edilir. Bu süreçler, LAB hücresinin her zaman yaşayabilirliğini sağlamada anahtardır13.
Bir diğer kritik adım, fermentatif kültürlerin hücre büyümesinin her zaman OD610nm'de olan 0.7-0.9 büyüme aralığında olmasını sağlamaktır. Bu, büyüme aralığının bakteriyel büyüme eğrisinin uygun log veya üstel fazı olarak önerildiği için önemlidir17. 1'in üzerindeki herhangi bir optik yoğunluk (OD) değeri, fermentatif kültürlerin çoğu ölü hücre ve fermentatif ortamda ağırlıklı olarak bulunan toksik hücresel atık birikimi ile ölüm evresine ulaştığını doğruladığı için yanlıştır. 1'in üzerinde bir OD değerine ulaşılması durumunda (OD 610nm > 1)., kültürlerin 1'in altındaki bir OD değerine ulaşana kadar 2 veya 3 kat veya daha fazla seyreltilmesi önerilir (OD610nm < 1)18. Bir başka endişe noktası, çizgili plakaları fermentatif kültürlerle uygun şekilde anaerobik olarak inkübe etmektir. Çoğu LAB fakültatif anaeroblar olmasına rağmen, oksijen varlığında artmış büyüme sınırlıdır; bu nedenle, verimli büyümeyi teşvik etmek için anaerobik koşulların tercih edilmesi gerekmektedir. 42 ° C'de inkübasyon süresi boyunca CO2 üretebilecek bir CO2 odası veya doğaçlama bir kap kullanılması önerilir. Kuluçkalanmış plakalarda en iyi hücre büyümesi sonuçları için, optimum sonuçlar için 72 saat önerilir18.
Bununla birlikte, bu standart prosedürün herhangi bir sınırlaması yoktur, çünkü adımlara sıkı sıkıya bağlı kalmak, fermentatif prosedürler için uygulanabilir ve saf LAB hücreleri sağlayacaktır. Bu standart protokolün önemi, özellikle fermentatif kültürler için probiyotik hücre canlılığını sağlamaya yönelik proaktif yaklaşımına dayanmaktadır. Kontaminasyonu ortadan kaldırmayı ve nihayetinde standart koşullar altında arzu edilen fermantasyon verimlerini üretebilecek güçlü ve yüksek oranda uygulanabilir kültürleri teşvik etmeyi amaçlayan bir kalite kontrol mekanizması olarak hizmet eder. Mevcut veya geleneksel yöntemlere atıfta bulunarak, bu standart protokol LAB hücre canlılığı zorluklarını ortadan kaldırır (soğuk şok ve zayıf büyüme ortamı nedeniyle), aynı zamanda saf ve uygulanabilir probiyotik kültürlere sahip olmanın ilk kez doğru konseptini sağlamayı, zamandan tasarruf etmeyi ve LAB kültürleriyle çalışırken üretkenliği teşvik etmeyi amaçlamaktadır.
Bu tekniğin gelecekteki uygulamaları muazzamdır, çünkü bu protokol hem araştırma laboratuvarlarında, süt ürünleri hem de gıda endüstrilerinde, biyoişleme, fermantasyon ve biyoteknoloji enstitülerinde kullanılabilir. Bu protokolün ek avantajı, basit doğasına dayanmaktadır ve bu nedenle laboratuvar ekipmanlarının sofistike kullanımını gerektirmez. Bu nedenle, bu protokol, öğrencilerin Bilim, Teknoloji, Mühendislik ve Matematik (STEM) ile ilgili alanlara olan ilgisini teşvik etmek ve geliştirmek için temel bir laboratuvar ortamına sahip liselerde gösterim veya pedagojik öğrenme için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu yayın NC hibe numarası ile mümkün olmuştur. X-267-5-12-170-1 Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü'nden (NIFA) ve kısmen NIZO Food Research BV, Hollanda, Jarrow Formulas, ABD ve Aile ve Tüketici Bilimleri Bölümü ve Kuzey Carolina Tarım ve Teknik Devlet Üniversitesi Tarım Araştırma İstasyonu (Greensboro, NC, ABD 27411) tarafından. Bu çalışma kısmen 1890 Kapasite Geliştirme Programı hibe no. (2020-38821-31113/proje katılım no. 021765) tarafından da desteklenmiştir. Bu çalışma Bulgaristan Eğitim ve Bilim Bakanlığı tarafından DCM # 577 / 17.08.2018 tarafından onaylanan 'Güçlü Bir Biyo-Ekonomi ve Yaşam Kalitesi için Sağlıklı Gıdalar' Ulusal Araştırma Programı kapsamında kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aniline Blue | Thermo Scientific | R21526 | 25 g |
| Beef extract | Research Products International | 50-197-7509 | 500 g |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | 500 g |
| Calcium Chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | 500 g |
| Dextrose Anhydrous | Fisher Scientific | BP350500 | 500 g |
| D-Fructose | ACROS Organics | AC161355000 | 500 g |
| Difco agar powder | Difco | DF0812-07-1 | 2 kg |
| TPY agar | Difco | 211921 | 500 g |
| Eppendorf microcentrifuge tube (Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock) | Fisher Scientific | 05-402-12 | 2 mL |
| Glycerol | Thermo Scientific | PI17904 | 500 mL |
| Infrared CO2 Incubator | Forma Scientific | ||
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 11842 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Bulgaria | S9 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Bulgaria | LB6 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | DAW | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | E22 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Biogai, Raleigh / Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | RD2 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| Maltose monohydrate | Fisher Scientific | M75-100 | 100 g |
| MRS broth | Neogen | 50-201-5691 | 5 kg |
| Peptone No. 3 | Hach | 50-199-6719 | 500 g |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Research Products International | 50-712-761 | 500 g |
| Sodium acetate trihydrate | Fisher Scientific | S220-1 | 1 kg |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | 1 kg |
| Sodium pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | 100 g |
| Test Tubes with Rubber-Lined Screw Caps | Fisher Scientific | FB70125150 | 25 x 150 mm |
| Tween 80 | Fisher Scientific | T164-500 | 500 mL |
| Ultra low freezer | So-Low | ||
| Uracil | ACROS Organics | AC157301000 | 100 g |
| UV- visible spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Evolution 201 | |
| Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | ||
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | 500 g |
| Ethanol | Fisher Scientific | T08204K7 | 4 L |
| Hydrochloric Acid (6N (Certified), Fisher Chemical) | Fisher Scientific | SA56-500 | 500 mL |
References
- Karakas-Sen, A., Karakas, E. Isolation, identification and technological properties of lactic acid bacteria from raw cow milk. Bioscience Journal. 34 (2), 385-399 (2018).
- Martin, R., Langella, P. Emerging health concepts in the probiotics field: Streamlining the definitions. Frontiers in Microbiology. 10, 1047 (2019).
- Sadishkumar, V., Jeevaratnam, K. In vitro probiotic evaluation of potential antioxidant lactic acid bacteria isolated from idli batter fermented with Piper betle leaves. International Journal of Food Science & Technology. 52 (2), 329-340 (2017).
- Ayivi, R. D., et al. Lactic acid bacteria: Food safety and human health applications. Dairy. 1 (3), 202-232 (2020).
- Quinto, E. J., et al. Probiotic lactic acid bacteria: A review. Food and Nutrition Sciences. 5 (18), 1765-1775 (2014).
- Hayek, S. A., Gyawali, R., Aljaloud, S. O., Krastanov, A., Ibrahim, S. A. Cultivation media for lactic acid bacteria used in dairy products. Journal of Dairy Research. 86 (4), 490-502 (2019).
- Bintsis, T. Lactic acid bacteria as starter cultures: An update in their metabolism and genetics. Aims Microbiology. 4, 665-684 (2018).
- Shao, Y., Gao, S., Guo, H., Zhang, H. Influence of culture conditions and preconditioning on survival of Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus ND02 during lyophilization. Journal of Dairy Science. 97 (3), 1270-1280 (2014).
- Aryana, K. J., Olson, D. W. A 100-year review: Yogurt and other cultured dairy products. Journal of Dairy Science. 100 (12), 9987-10013 (2017).
- Kandil, S., El Soda, M. Influence of freezing and freeze-drying on intracellular enzymatic activity and autolytic properties of some lactic acid bacterial strains. Advances in Microbiology. 5 (6), 371-382 (2015).
- Malairuang, K., Krajang, M., Sukna, J., Rattanapradit, K., Chamsart, S. High cell density cultivation of Saccharomyces cerevisiae with intensive multiple sequential batches together with a novel technique of fed-batch at cell level (FBC). Processes. 8 (10), 1321 (2020).
- Jeanson, S., Floury, J., Gagnaire, V., Lortal, S., Thierry, A. Bacterial colonies in solid media and foods: A review on their growth and interactions with the micro-environment. Frontiers in Microbiology. 6, 1284 (2015).
- Oyeniran, A., et al. A modified reinforced clostridial medium for the isolation and enumeration of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus in a mixed culture. Journal of Dairy Science. 103, 5030-5042 (2020).
- Iguchi, A., et al. Effects of repeated subculturing and prolonged storage at room temperature of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157: H7 on pulsed-field gel electrophoresis profiles. Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 3079-3081 (2002).
- Hayek, S. A., Ibrahim, S. A. Current limitations and challenges with lactic acid bacteria: a review. Food and Nutrition Sciences. 4 (11), 73-87 (2013).
- Ahmed, S. A., Ibrahim, S. A., Kim, C., Shahbazi, A. Significance of bile salt tolerant Lactobacillus reuteri. Proceedings of the 2007 National Conference on Environmental Science and Technology. , Springr, NY. 17-23 (2009).
- Gyawali, R., et al. A comparative study of extraction techniques for maximum recovery of β-galactosidase from the yogurt bacterium Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Journal of Dairy Research. 87 (1), 123-126 (2020).
- Nwamaioha, N. O., Ibrahim, S. A. A selective medium for the enumeration and differentiation of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Journal of Dairy Science. 101 (6), 4953-4961 (2018).
