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Bioengineering

फ्लोरोसेंट प्रोटीन में प्रोलाइन एनालॉग्स द्वारा प्रोलाइन के अवशेष-विशिष्ट विनिमय: बैकबोन की "आणविक सर्जरी" तह और स्थिरता को कैसे प्रभावित करती है

Published: February 3, 2022 doi: 10.3791/63320
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,2, 1
1Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin, 2Department of Chemistry, University of Manitoba, 3Institute of Physics, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

Summary

शास्त्रीय साइट-निर्देशित म्यूटाजेनेसिस की सीमाओं को दूर करने के लिए, विशिष्ट संशोधनों के साथ प्रोलाइन एनालॉग्स को कई फ्लोरोसेंट प्रोटीन में शामिल किया गया था। हम दिखाते हैं कि फ्लोरीन द्वारा हाइड्रोजन का प्रतिस्थापन या प्रोलाइन अवशेषों ("आणविक सर्जरी") में डबल बॉन्ड द्वारा एकल का प्रतिस्थापन मौलिक प्रोटीन गुणों को कैसे प्रभावित करता है, जिसमें प्रकाश के साथ उनकी तह और बातचीत शामिल है।

Abstract

शेष 19 विहित अमीनो एसिड में से किसी एक द्वारा पारंपरिक साइट-निर्देशित म्यूटाजेनेसिस द्वारा प्रोटीन में प्रोलाइन (प्रो) अवशेषों का प्रतिस्थापन अक्सर प्रोटीन तह के लिए हानिकारक होता है और विशेष रूप से, हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन और संबंधित वेरिएंट में क्रोमोफोर परिपक्वता। एक उचित विकल्प प्रोटीन के अनुवाद में हेरफेर करना है ताकि सभी प्रो अवशेषों को अवशेषों को विशेष रूप से एनालॉग्स द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सके, एक विधि जिसे चयनात्मक दबाव निगमन (एसपीआई) के रूप में जाना जाता है। अंतर्निहित रासायनिक संशोधनों का उपयोग एक प्रकार की "आणविक सर्जरी" के रूप में किया जा सकता है ताकि औसत दर्जे के परिवर्तनों को बारीकी से विच्छेदित किया जा सके या यहां तक कि तर्कसंगत रूप से विभिन्न प्रोटीन गुणों में हेरफेर किया जा सके। यहां, अध्ययन अपने अनुक्रम में 10-15 प्रोलाइनों के साथ हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के वर्णक्रमीय वेरिएंट के विशिष्ट β-बैरल संरचना के संगठन में प्रोलाइन्स की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एसपीआई विधि की उपयोगिता को दर्शाता है: बढ़ाया हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी), NowGFP, और KillerOrange। प्रो अवशेष व्यक्तिगत β-स्ट्रैंड के बीच वर्गों को जोड़ने में मौजूद होते हैं और बैरल पाड़ के समापन ढक्कन का गठन करते हैं, इस प्रकार पानी से क्रोमोफोर के इन्सुलेशन के लिए जिम्मेदार होते हैं, यानी, प्रतिदीप्ति गुण। (4R)-fluoroproline (R-Flp), (4 S)-fluoroproline (S-Flp), 4,4-difluoroproline (Dfp), और 3,4-dehydroproline (Dhp) के साथ चयनात्मक दबाव निगमन प्रयोगों को अभिव्यक्ति मेजबान के रूप में एक proline-auxotrophic E. coli तनाव का उपयोग करके किया गया था। हमने पाया कि एस-एफएलपी और डीएचपी के साथ फ्लोरोसेंट प्रोटीन सक्रिय हैं (यानी, फ्लोरोसेंट), जबकि अन्य दो एनालॉग्स (डीएफपी और आर-एफएलपी) ने बेकार, मिसफोल्डेड प्रोटीन का उत्पादन किया। यूवी-विस अवशोषण और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन प्रोफाइल के निरीक्षण ने प्रो एनालॉग्स वाले प्रोटीन में कुछ विशिष्ट परिवर्तन दिखाए। ईजीएफपी वेरिएंट में तह गतिज प्रोफाइल की परीक्षा ने एस-एफएलपी की उपस्थिति में एक त्वरित रीफोल्डिंग प्रक्रिया दिखाई, जबकि प्रक्रिया डीएचपी युक्त प्रोटीन में जंगली-प्रकार के समान थी। यह अध्ययन परमाणु स्तर ("आणविक सर्जरी") पर प्रोटीन अवशेषों के सूक्ष्म संशोधनों का उत्पादन करने के लिए एसपीआई विधि की क्षमता को दर्शाता है, जिसे ब्याज के अन्य प्रोटीनों के अध्ययन के लिए अपनाया जा सकता है। यह β-बैरल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के वर्ग में तह और स्पेक्ट्रोस्कोपिक गुणों पर करीबी रासायनिक एनालॉग्स के साथ प्रोलाइन प्रतिस्थापन के परिणामों को दर्शाता है।

Introduction

शास्त्रीय साइट-निर्देशित म्यूटाजेनेसिस डीएनए स्तर पर कोडोन हेरफेर द्वारा किसी भी मौजूदा जीन-एन्कोडेड प्रोटीन अनुक्रम के क्रमपरिवर्तन की अनुमति देता है। प्रोटीन तह और स्थिरता का अध्ययन करने के लिए, समान समकक्षों के साथ समान अमीनो एसिड को बदलना अक्सर वांछनीय होता है। हालांकि, पारंपरिक प्रोटीन म्यूटाजेनेसिस निश्चित रूप से सेरोनिकल अमीनो एसिड जैसे सेर / अला / साइस, थ्र / वैल, ग्लू / जीएलएन, एएसपी / एएसएन, टायर / पीएचई के बीच संरचनात्मक रूप से समान प्रतिस्थापन तक सीमित है, जो मानक आनुवंशिक कोड प्रदर्शनों की सूची में मौजूद हैं। दूसरी ओर, अन्य विहित अमीनो एसिड जैसे कि टीआरपी, मेट, हिज, या प्रो के लिए ऐसी कोई संभावना नहीं है, जो अक्सर प्रोटीन में आवश्यक संरचनात्मक और कार्यात्मक भूमिका निभातेहैं। प्रोटीन की अत्यधिक विशिष्ट आंतरिक वास्तुकला और उनकी तह प्रक्रिया के संदर्भ में इन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श दृष्टिकोण गैर-विघटनकारी आइसोस्टेरिक संशोधनों को उत्पन्न करना है। दरअसल, जब इन विहित अमीनो एसिड के आइसोस्टेरिक अमीनो एसिड एनालॉग्स, जिन्हें गैर-विहित अमीनो एसिड (एनसीएए) के रूप में भी जाना जाता है, को प्रोटीन में डाला जाता है, तो वे एकल परमाणुओं या परमाणु समूहों जैसे एच / एफ, सीएच 2 / एस / से /टे के स्तर पर भी सूक्ष्म परिवर्तनों की अनुमति देते हैं, जिसे "परमाणु उत्परिवर्तन" के रूप में जाना जाता है। इस तरह के "आणविक सर्जरी" परिवर्तित प्रोटीन का उत्पादन करते हैं जिनके गुण पूरी तरह से एकल परमाणुओं या परमाणुओं के समूहों के आदान-प्रदान से होते हैं, जो अनुकूल मामलों में विश्लेषण किया जा सकता है, और पता लगाए गए परिवर्तनों को तर्कसंगत बनाया जा सकता है। इस तरह, प्रोटीन तह और संरचना का अध्ययन करने के लिए प्रोटीन संश्लेषण का दायरा शास्त्रीय डीएनए म्यूटाजेनेसिस से परे तक बढ़ाया गया है। ध्यान दें कि साइट-निर्देशित म्यूटाजेनेसिस द्वारा उत्पन्न प्रोटीन को आमतौर पर "म्यूटेंट" के रूप में संदर्भित किया जाता है, जबकि प्रतिस्थापित विहित अमीनो एसिड वाले प्रोटीन को "वेरिएंट" 3, "एलोप्रोटीन" 4, या "प्रोटीन कॉन्जेनर्स" 5 के रूप में संदर्भित किया जाता है।

ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी), जिसे पहली बार समुद्री जीव एक्गोरिया विक्टोरिया में पहचाना गया था, पराबैंगनी-से-नीले प्रकाश 6,7 के संपर्क में आने पर उज्ज्वल हरे रंग की प्रतिदीप्ति प्रदर्शित करता है। आज, जीएफपी का उपयोग आमतौर पर फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के माध्यम से कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन स्थानीयकरण के नियमित दृश्य के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील लेबलिंग उपकरण के रूप में किया जाता है। जीएफपी विभिन्न बायोफिजिकल 8,9,10 और बायोमेडिकल 11,12 अध्ययनों के साथ-साथ प्रोटीन इंजीनियरिंग 13,14,15 में भी उपयोगी साबित हुआ है। जीएफपी संरचना के कठोर विश्लेषण ने विभिन्न स्थिरता और प्रतिदीप्ति मैक्सिमा16,17 की विशेषता वाले कई रूपों के निर्माण को सक्षम किया। सेल और आणविक जीव विज्ञान में उपयोग किए जाने वाले अधिकांश जीएफपी वेरिएंट समाधान और क्रिस्टल18 दोनों में मोनोमेरिक प्रोटीन हैं। उनका प्रमुख संरचनात्मक संगठन जीएफपी परिवार के सभी सदस्यों के लिए विशिष्ट है, जो उनके फाइलोजेनेटिक मूल से स्वतंत्र है, और इसमें 11 β-स्ट्रैंड होते हैं जो तथाकथित β-बैरल बनाते हैं, जबकि एक किंकीड α-हेलिक्स बैरल के केंद्र के माध्यम से चल रहा है और क्रोमोफोर (चित्रा 1 ए) को सहन करता है। क्रोमोफोर (चित्रा 1 बी) की ऑटोकैटेलिटिक परिपक्वता के लिए प्रोटीन के केंद्रीय स्थान पर इसके आसपास की साइड चेन की सटीक स्थिति की आवश्यकता होती है; इनमें से कई साइड चेन अन्य जीएफपी वेरिएंट19 में अत्यधिक संरक्षित हैं। जेलीफ़िश जैसे कि एक्गोरिया विक्टोरिया से अधिकांश फ्लोरोसेंट प्रोटीन में, हरे रंग के उत्सर्जक क्रोमोफोर में दो सुगंधित छल्ले होते हैं, जिनमें टायर 66 की फिनोल रिंग और इमिडाज़ोलिनोन की पांच-सदस्यीय हेटरोसाइक्लिक संरचना (चित्रा 1 बी) शामिल हैं। क्रोमोफोर, जब प्रोटीन मैट्रिक्स में ठीक से एम्बेडेड होता है, तो पूरे प्रोटीन की विशेषता प्रतिदीप्ति के लिए जिम्मेदार होता है। यह संरचना के केंद्र में स्थित है, जबकि बैरल संरचना इसे जलीय माध्यम20 से इन्सुलेट करती है। थोक पानी के लिए क्रोमोफोर के संपर्क में आने से प्रतिदीप्ति शमन होगा, यानी, प्रतिदीप्ति21 का नुकसान।

बैरल जैसी संरचना की उचित तह प्रतिदीप्ति शमन22 के खिलाफ क्रोमोफोर की रक्षा के लिए आवश्यक है। प्रोलाइन (प्रो) अवशेष जीएफपी23 के संरचनात्मक संगठन में एक विशेष भूमिका निभाते हैं। एक β-स्ट्रैंड का समर्थन करने में असमर्थ होने के कारण, वे प्रोटीन संरचना को बनाए रखने के लिए जिम्मेदार छोरों को जोड़ने का गठन करते हैं। आश्चर्य की बात नहीं है, 10-15 प्रोलाइन अवशेष Aequorea- और Anthoathecata-व्युत्पन्न GFPs दोनों में पाए जाते हैं; उनमें से कुछ फ्लोरोसेंट β-बैरल प्रोटीन के अन्य प्रकारों में अत्यधिक संरक्षित हैं। प्रोलाइन्स से उनकी अजीब ज्यामितीय विशेषताओं के कारण तह गुणों को गंभीर रूप से प्रभावित करने की उम्मीद की जाती है। उदाहरण के लिए, Aequorea-व्युत्पन्न GFPs में, दस प्रोलाइन अवशेषों (चित्रा 2A) में से, नौ रूप ट्रांस- और केवल एक सीआईएस-पेप्टाइड बॉन्ड (Pro89) बनाता है। Pro58 आवश्यक है, यानी, 19 विहित अमीनो एसिड के बाकी हिस्सों के साथ विनिमेय नहीं है। यह अवशेष Trp57 अवशेषों की सही स्थिति के लिए जिम्मेदार हो सकता है, जिसे क्रोमोफोर परिपक्वता और समग्र GFP तह24 के लिए महत्वपूर्ण बताया गया है। तीन प्रोलाइन अवशेषों (Pro54, Pro56, Pro58) और Trp57 के साथ टुकड़ा PVPWP चित्रा 1A से GFP संरचना में "निचले ढक्कन" का आवश्यक हिस्सा है। PVPWP संरचनात्मक आकृति कई प्रोटीनों जैसे साइटोक्रोम और यूकेरियोटिक वोल्टेज-सक्रिय पोटेशियमचैनलों में पाई जाती है। 75 और 89 पदों पर प्रोलाइन-टू-अलैनिन प्रतिस्थापन भी प्रोटीन अभिव्यक्ति और तह के लिए हानिकारक हैं और क्रोमोफोर परिपक्वता को समाप्त करते हैं। Pro75 और Pro89 क्रोमोफोर (चित्रा 1A) को दफन करने वाले "ऊपरी ढक्कन" का हिस्सा हैं और 11-फंसे हुए β-बैरल फ्लोरोसेंट प्रोटीन23 में संरक्षित हैं। ये दो "ढक्कन" क्रोमोफोर को जलीय विलायक से बाहर रखा जाता है, भले ही स्थिर तृतीयक संरचना आंशिक रूपसे टूट गई हो। इस तरह की एक विशिष्ट आणविक वास्तुकला फ्लोरोफोर को टकराव (गतिशील) प्रतिदीप्ति शमन से बचाती है, उदाहरण के लिए, पानी, ऑक्सीजन, या अन्य अलग-अलग लिगेंड द्वारा।

जीएफपी संरचना के आणविक इंजीनियरिंग करने के लिए, किसी को प्रोटीन की प्राथमिक संरचना में अमीनो एसिड प्रतिस्थापन पेश करना चाहिए। जीएफपी पर कई उत्परिवर्तन किए गए हैं, जो उन्नत स्थिरता, तेज और विश्वसनीय तह, और चर प्रतिदीप्ति गुणों के साथ वेरिएंट प्रदान करतेहैं। फिर भी, ज्यादातर मामलों में, प्रोलाइन अवशेषों के उत्परिवर्तन को इस तथ्य के कारण एक जोखिम भरा दृष्टिकोण माना जाता है कि शेष 19 विहित अमीनो एसिड में से कोई भी प्रोलाइन अवशेष27 के संरचनात्मक प्रोफ़ाइल को ठीक से बहाल नहीं कर सकता है। इस प्रकार, एक वैकल्पिक दृष्टिकोण विकसित किया गया है, जिसमें प्रोलाइन अवशेषों को अन्य प्रोलाइन-आधारित संरचनाओं के साथ बदल दिया जाता है, जिसे प्रोलाइन एनालॉग्स28 के रूप में डब किया जाता है। अपनी अद्वितीय चक्रीय रासायनिक संरचना के कारण, प्रोलाइन दो विशेषता संरचनात्मक संक्रमण (चित्रा 1 सी) प्रदर्शित करता है: 1) प्रोलाइन रिंग प्यूकरिंग, रीढ़ की हड्डी के संगठन को शामिल करने वाली एक तेज प्रक्रिया, जो मुख्य रूप से मरोड़ कोण φ को प्रभावित करती है, और 2) पेप्टाइड बॉन्ड सीआईएस / ट्रांस आइसोमेराइजेशन, एक धीमी प्रक्रिया जो ω मरोड़ कोणों के माध्यम से रीढ़ की हड्डी तह को प्रभावित करती है। अपनी धीमी प्रकृति के कारण, बाद का संक्रमण आमतौर पर पूरे प्रोटीन की तह प्रक्रिया में दर-सीमित चरणों के लिए जिम्मेदार होता है। यह पहले दिखाया गया है कि पेप्टाइड बॉन्ड सीआईएस / ट्रांस आइसोमेराइजेशन कुछ प्रोलाइन अवशेषों के आसपास जीएफपी वेरिएंट की तह में धीमी गति से कदम उठाता है। उदाहरण के लिए, Pro89 पर सीआईएस-पेप्टाइड बॉन्ड के गठन में तह की प्रक्रिया में धीमा कदम है क्योंकि यह ट्रांस से सीआईएस29 तक बॉन्ड संक्रमण पर निर्भर करता है। Pro89 को ऑल-ट्रांस पेप्टाइड लूप के साथ बदलने के बाद एक तेज़ रीफ़ोल्डिंग प्राप्त की जा सकती है, यानी, एक सीआईएस-टू-ट्रांस आइसोमेराइजेशन इवेंट30 को समाप्त करके। सीआईएस / ट्रांस आइसोमेराइजेशन के अलावा, पुकर संक्रमण भी बैकबोन संगठन और प्रोटीन इंटीरियर27,31 के भीतर पैकिंग के कारण प्रोटीन तह में गहरा परिवर्तन उत्पन्न कर सकते हैं।

रासायनिक संशोधनों के परिणामस्वरूप प्रोलाइन अवशेषों के आंतरिक संरचनात्मक संक्रमणों में परिवर्तन होता है, जिससे प्रोटीन की गुना करने की क्षमता प्रभावित होती है। कुछ प्रोलाइन एनालॉग्स प्रोटीन में प्रोलाइन प्रतिस्थापन के लिए विशेष रूप से आकर्षक उम्मीदवार हैं क्योंकि वे तह गुणों के हेरफेर और अध्ययन की अनुमति देते हैं। उदाहरण के लिए, (4R)-fluoroproline (R-Flp), (4S)-fluoroproline (S-Flp), 4,4-difluoroproline (Dfp), और 3,4-dehydroproline (Dhp) चार एनालॉग (चित्रा 1D) हैं जो आणविक आयतन और ध्रुवीयता32 दोनों के संदर्भ में प्रोलाइन से न्यूनतम रूप से भिन्न होते हैं। उसी समय, प्रत्येक एनालॉग एक अलग रिंग पुकरिंग प्रदर्शित करता है: एस-एफएलपी सी4-एंडो पुकर को स्थिर करता है, आर-एफएलपी सी4-एक्सो पुकर को स्थिर करता है, डीएफपी कोई स्पष्ट प्यूकर वरीयता प्रदर्शित नहीं करता है, जबकि डीएचपी पुकरिंग (चित्रा 1 डी) 33 को समाप्त कर देता है। प्रोटीन संरचना में इन एनालॉग्स का उपयोग करके, कोई भी प्रोलाइन अवशेषों के संरचनात्मक संक्रमण के साथ हेरफेर कर सकता है, और इसके साथ, परिणामी जीएफपी वेरिएंट के गुणों को प्रभावित करता है।

इस काम में, हम चयनात्मक दबाव निगमन विधि (एसपीआई, चित्रा 3) 34 का उपयोग करके जीएफपी वेरिएंट की संरचना में प्रोलाइन एनालॉग्स (चित्रा 1 डी) के नामित सेट को शामिल करने के लिए तैयार हैं। उनके निकटतम isostructural analogs के साथ अमीनो एसिड अवशेषों का प्रतिस्थापन प्रोटीन डिजाइन35,36 में एक लागू biotechnological अवधारणा है। इस प्रकार, एक मॉडल प्रोटीन में प्रोलाइन एनालॉग्स के प्रभाव प्रोटीन इंजीनियरिंग37 में उपकरण के रूप में सेवा करने की उनकी क्षमता को दर्शाते हैं। वांछित एनालॉग्स वाले प्रोटीन का उत्पादन संशोधित ई कोलाई उपभेदों में किया गया था जो प्रोलाइन (प्रोलाइन-ऑक्सोट्रॉफी) का उत्पादन करने में सक्षम नहीं हैं। इस प्रकार, उन्हें प्रोटीन जैवसंश्लेषण38 की प्रक्रिया में सब्सट्रेट के प्रतिस्थापन को स्वीकार करने के लिए मजबूर किया जा सकता है। प्रोलाइन का यह वैश्विक प्रतिस्थापन अंतर्जात aminoacyl-tRNA सिंथेटेस39 के प्राकृतिक सब्सट्रेट लचीलेपन द्वारा सक्षम है, महत्वपूर्ण एंजाइम उपयुक्त अमीनो एसिड40 के साथ tRNA के esterification को उत्प्रेरित करते हैं। सामान्य तौर पर, जैसा कि चित्रा 3 में उल्लिखित है, सेलुलर विकास एक परिभाषित माध्यम में किया जाता है जब तक कि मध्य-लॉगरिदमिक विकास चरण तक नहीं पहुंच जाता है। अगले चरण में, प्रतिस्थापित किए जाने वाले अमीनो एसिड को किण्वन के दौरान अभिव्यक्ति प्रणाली से इंट्रासेल्युलर रूप से समाप्त कर दिया जाता है और बाद में वांछित एनालॉग या एनसीएए द्वारा आदान-प्रदान किया जाता है। लक्ष्य प्रोटीन अभिव्यक्ति तब अवशेष-विशिष्ट गैर-विहित अमीनो एसिड निगमन के लिए प्रेरित होती है। इसके एनालॉग के साथ संज्ञानात्मक अमीनो एसिड का प्रतिस्थापन एक proteome-व्यापक तरीके से होता है। यद्यपि इस दुष्प्रभाव का मेजबान तनाव के विकास पर नकारात्मक प्रभाव पड़ सकता है, लक्ष्य प्रोटीन उत्पादन की गुणवत्ता ज्यादातर प्रभावित नहीं होती है, क्योंकि पुनः संयोजक अभिव्यक्ति में, सेलुलर संसाधनों को मुख्य रूप से लक्ष्य प्रोटीन41,42 के उत्पादन के लिए निर्देशित किया जाता है। इसलिए, एक कसकर विनियमित, inducible अभिव्यक्ति प्रणाली और मजबूत प्रमोटर उच्च निगमन दक्षता43 के लिए महत्वपूर्ण हैं। हमारा दृष्टिकोण कई अवशेषों पर आधारित है- कोडोन (सेंस कोडोन रीअसाइनमेंट) के जवाब में एनसीएए के विशिष्ट निगमन, जिससे लक्ष्य जीन के भीतर, प्रो एनालॉग सम्मिलन के लिए पदों की संख्या को साइट-निर्देशित म्यूटाजेनेसिस44 के माध्यम से हेरफेर किया जा सकता है। रोगाणुरोधी गुणों के साथ पुनः संयोजक पेप्टाइड्स की तैयारी पर हमारी पिछली रिपोर्ट में एक समान दृष्टिकोण लागू किया गया था45। इस काम में, हमने एसपीआई विधि को लागू किया है, जो सभी प्रोलाइन अवशेषों को संबंधित एनालॉग्स द्वारा प्रतिस्थापित करने की अनुमति देता है, ताकि विहित अमीनो एसिड प्रदर्शनों की सूची के साथ संश्लेषित प्रोटीन में मौजूद प्रोटीन में मौजूद नहीं होने वाले विशिष्ट भौतिक-रासायनिक गुणों के पास प्रोटीन उत्पन्न करने की उम्मीद की जा सके। परिणामी वेरिएंट के तह और प्रतिदीप्ति प्रोफ़ाइल की विशेषता से, हम जीएफपी के रूपों में परमाणु प्रतिस्थापन के प्रभावों को प्रदर्शित करने का लक्ष्य रखते हैं।

Protocol

1. सक्षम प्रो-auxotrophic ई कोलाई कोशिकाओं में अभिव्यक्ति plasmids का परिचय

  1. प्रत्येक नमूना प्लास्मिड, pQE-80L H6-EGFP, pQE-80L H6-NowGFP, और pQE-80L H6-KillerOrange के 1 ng को मिलाएं, जिसमें प्रो-ऑक्सोट्रोफिक ई कोलाई K12- व्युत्पन्न तनाव JM83 (Addgene #50348, या ATCC #35607) के रासायनिक रूप से सक्षम या इलेक्ट्रोकंपिटेंट कोशिकाओं के 50 μLके साथ, गर्मी सदमे की विधि के अनुसार परिवर्तन के लिए। ४७ ।
    नोट: अभिव्यक्ति वेक्टर pQE-80L EGFP-H6 एक C-terminally 6xHis-टैग किए गए एन्हांस्ड ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP), अभिव्यक्ति वैक्टर pQE-80L H 6-NowGFP और pQE-80L H6-KillerOrange एक N-terminally 6xHis-tagged NowGFP48 या एक N-terminally 6xHis-tagged KillerOrange49 को एन्कोड करता है, क्रमशः, प्रत्येक pQE-80L में। सभी लक्ष्य जीन एक जीवाणु T5 प्रमोटर लाख ऑपरेटर द्वारा विनियमित के नियंत्रण में हैं। एम्पीसिलीन प्रतिरोध का उपयोग चयन मार्कर के रूप में किया गया था और कर्नलई 1 प्रतिकृति की उत्पत्ति के रूप में। pQE-80L प्लास्मिड के बारे में अधिक जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें। वैकल्पिक प्रो-ऑक्सोट्रोफिक ई कोलाई उपभेदों K-12 और B से उत्पन्न होने वाले अभिव्यक्ति के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है और समान परिणाम प्राप्त करना चाहिए। एच6-टैग किए गए एकल प्रोटोनेटेड ([एम + एच]+) जंगली-प्रकार के प्रोटीन (क्रोमोफोर परिपक्वता के बाद) के परिकलित आणविक द्रव्यमान 27,745.33 दा (ईजीएफपी- एच6), 27,931.50 डा (एच 6-नोजीएफपी), और 27,606.09 डीए (एच6-किलरऑरंज) हैं। लक्ष्य प्रोटीन की प्राथमिक संरचनाओं को तालिका 1 में दिया गया है (उनका-टैग रेखांकित)। NowGFP के अपने-टैग अनुक्रम के भीतर ग्लूटामाइन (क्यू) की पहचान डीएनए अनुक्रमण द्वारा PLETNEv et al.51 से pQE-80L प्लास्मिड में Pletnev et al.51 से प्राप्त होने वाले NowGFP cDNA के उप-क्लोनिंग के बाद की गई थी। यह प्रोटीन शुद्धिकरण या फ्लोरोसेंट प्रोटीन के गुणों को बाधित नहीं करता है।
  2. 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर SOC माध्यम के 950 μL में कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करें।
  3. Luria Agar (LA) मध्यम प्लेटों (अनुपूरक सामग्री देखें) ग्लूकोज (10 g / L) और ampicillin (100 μg / mL) युक्त पर बरामद कोशिकाओं के 50 μL फैलाएं।
  4. ला मध्यम प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस रात भर या 30 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।

2. पुनः संयोजक जंगली प्रकार फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उत्पादन (कैनोनिकल प्रोलाइन harboring) और चयनात्मक दबाव निगमन (एसपीआई) के लिए प्रक्रिया proline analogs (S-Flp, R-Flp, Dfp, Dhp) के साथ फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए

  1. प्रो-ऑक्सोट्रोफिक ई कोलाई K12-व्युत्पन्न तनाव JM83 की रातोंरात संस्कृति pQE-80L EGFP- H6, pQE-80L H 6-NowGFP, और pQE-80L H 6-KillerOrange
    1. एक बाँझ पिपेट टिप या इनोक्यूलेशन लूप का उपयोग एक ला माध्यम प्लेट से एक एकल कॉलोनी का चयन करने के लिए करें और लाइसोजेनी शोरबा (एलबी) माध्यम के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें ( पूरक सामग्री देखें; 10 ग्राम / एल ग्लूकोज, 100 μg / एमएल एम्पीसिलिन युक्त) एक बाँझ 14 एमएल पॉलीस्टीरीन संस्कृति ट्यूब में।
      नोट: ताजा रूपांतरित कालोनियों को टीका लगाने के लिए अनुशंसित किया जाता है। 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत एलए मध्यम प्लेटों (चरण 2.2 से) पर कोशिकाओं का उपयोग कुछ दिनों के भीतर किया जाना चाहिए।
    2. 200-250 आरपीएम पर एक कक्षीय शेकर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेल संस्कृति विकसित करें।
  2. पुनः संयोजक EGFP का उत्पादन- एच6, H6-NowGFP और एच6देशी प्रोलाइन और प्रोलाइन एनालॉग्स के साथ इसी प्रोटीन वेरिएंट के साथ -KillerOrange
    1. ताजा NMM माध्यम के 200 mL का टीकाकरण (7.5 mM (NH4)2SO4, 50 mM K2HPO4 और22mM KH 2 PO4, 8.5 mM NaCl, 1 mM MgSO4, 20 mM D-glucose, 1 μg/mL FeCl2, 1 μg/mL CaCl2, 10 μg/mL थायमिन, 10 μg/mL बायोटिन, 0.01 μg/mL बायोटिन, 0.01 ZnCl2, MnCl2, (NH4)2MoO4), pH ~ 7.2) सभी विहित एल-अमीनो एसिड (50 मिलीग्राम / एल) के साथ; अनुपूरक सामग्री देखें) एक 2-एल Erlenmeyer फ्लास्क में रात भर की संस्कृति के 2 mL के साथ 100 μg / mL ampicillin के साथ पूरक।
      नोट: प्रोटीन के प्रकार के आधार पर, वैकल्पिक खेती मीडिया जैसे MOPS मध्यम52, ग्लूकोज-खनिज लवण माध्यम 53, डेविस न्यूनतम माध्यम54, M9 न्यूनतम माध्यम55, या GMML56 प्रोटीन उपज को अनुकूलित करने के लिए परीक्षण किया जा सकता है।
    2. ~ 3 ज 30 मिनट के लिए 220 आरपीएम पर एक कक्षीय शेकर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    3. हर 30 मिनट में एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में600 एनएम (ओडी 600) पर ऑप्टिकल घनत्व को मापें जब तक कि ~ 0.7 के ओडी600 मान तक नहीं पहुंच जाता है।
      नोट: एक spectrophotometer में OD600 निर्धारण के लिए, cuvette 1 सेमी की एक पथ लंबाई होनी चाहिए। संबंधित खेती माध्यम का उपयोग संदर्भ ("शून्य") माप के लिए किया जाता है। ~ 0.7 के OD600 मान तक पहुंचने तक इनक्यूबेशन समय संस्कृति की मात्रा पर निर्भर हो सकता है। 3 घंटे 30 मिनट एक अनुमानित मान है। प्रोटोकॉल उप-चरणों की भिन्नता में 2.2.1-2.2.3., उप-चरण 2.1.2 से संस्कृति। ताजा NMMΠPro माध्यम ( अनुपूरक सामग्री देखें) को प्रोलाइन की सीमित सांद्रता (उदाहरण के लिए, 50 मिलीग्राम / एल के बजाय 5 मिलीग्राम / एल) के साथ पूरक करने के लिए उपयोग किया जाता है, और कोशिकाओं को 220 आरपीएम पर एक कक्षीय शेकर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रातभर उगाया जाता है। अगले दिन, OD600 निर्धारण हर 30 मिनट में किया जाता है जब तक कि माप के बीच अंतर 0.05 से कम न हो। अधिकतम OD600 मान लगभग 1 (± 0.3) होना चाहिए। प्रारंभिक, सीमित प्रोलाइन एकाग्रता को अभिव्यक्ति तनाव और खेती के माध्यम के आधार पर समायोजित किया जा सकता है (चर्चा देखें)।
    4. 3,000 x g और 4 °C पर 10 मिनट के लिए सेल निलंबन नीचे स्पिन।
    5. धीरे से बर्बाद में supernatant decant.
    6. धोने का चरण: 50 मिलीलीटर बर्फ-ठंडे NMMΠAA (बिना किसी अमीनो एसिड के, अनुपूरक सामग्री देखें) या NMMΠPro (प्रोलाइन के बिना, अनुपूरक सामग्री देखें) माध्यम में कोशिकाओं को सावधानीपूर्वक पिपेटिंग द्वारा पुन: निलंबित करें।
      नोट: इस धोने के चरण के लिए, दो बताए गए बफ़र्स में से किसी एक का उपयोग किया जा सकता है, क्योंकि इनक्यूबेशन माध्यम में अवशिष्ट प्रोलाइन से छुटकारा पाना केवल महत्वपूर्ण है।
    7. 10 मिनट के लिए 3,000 x g पर एक सेंट्रीफ्यूज में 4 °C पर अवसादन द्वारा माध्यम से कोशिकाओं को अलग करें।
    8. धीरे से बर्बाद में supernatant decant.
    9. धीरे से पिपेट ऊपर और नीचे NMMΠPro माध्यम के 200 mL में सेल गोली resuspend करने के लिए एक 2-L Erlenmeyer फ्लास्क में 100 μg / mL एम्पीसिलिन के साथ पूरक।
      नोट: परिणामी सेल निलंबन को प्रो या प्रोलाइन एनालॉग्स की उपस्थिति में प्रोटीन अभिव्यक्ति की तुलना करने के लिए समान शुरुआती संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए समान मात्रा के कई नमूनों में विभाजित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, 100 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क में 4 x 50 एमएल में अलगाव)।
    10. प्रो की पूरी कमी के लिए 220 आरपीएम पर एक कक्षीय शेकर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट:: यह चरण कक्षों से प्रो को पूरी तरह से समाप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है।
    11. सेल निलंबन में 1 mM अंतिम एकाग्रता को समायोजित करने के लिए 50 mM स्टॉक समाधान से या तो L-proline या R-Flp, S-Flp, Dfp, और Dhp की एक उपयुक्त मात्रा जोड़ें।
      नोट: एक सामान्य नियम के रूप में, प्रो या प्रोलाइन डेरिवेटिव के ताजा 50 mM स्टॉक समाधान हमेशा उपयोग करने से पहले तैयार किए जाने चाहिए। केवल अगर एक जलीय समाधान में विशेष विहित या गैर-विहित अमीनो एसिड का हाइड्रोलिसिस एक चिंता का विषय नहीं है, तो जमे हुए स्टॉक का भी उपयोग किया जा सकता है।
    12. लक्ष्य प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए 1 एम स्टॉक समाधान से 0.5 mM IPTG जोड़ें।
    13. 220 आरपीएम पर एक कक्षीय शेकर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर (12 ज) लक्ष्य प्रोटीन को व्यक्त करें।
    14. अगले दिन OD600 को मापें।
      नोट: OD600 निर्धारण प्रोटीन अभिव्यक्ति के बाद कोशिकाओं की मात्रा को मापने के लिए किया जाता है। धोने के चरण 2.2.3 से पहले मापे गए मूल्य की तुलना में एक कम ओडी600 मूल्य आपूर्ति किए गए अमीनो एसिड की साइटोटॉक्सिसिटी को इंगित करता है। इस मामले में, प्रक्रिया को आपूर्ति किए गए अमीनो एसिड की एकाग्रता के साथ दोहराया जाना चाहिए (0.1 mM तक नीचे)।
    15. सेंट्रीफ्यूज और 10 मिनट के लिए 5,000 x g और 4 °C पर जीवाणु कोशिकाओं को इकट्ठा करते हैं और supernatant को कचरे में decant करते हैं।
    16. धोने का चरण: बाध्यकारी बफर (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM DTT) के 50 mL में सावधानीपूर्वक pipetting द्वारा कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर दिया गया, जिसमें 10% ग्लिसरॉल होता है और सेल निलंबन को 50 mL शंक्वाकार पॉलीस्टीरीन ट्यूब में स्थानांतरित किया जाता है।
    17. सेंट्रीफ्यूज और 10 मिनट के लिए 5,000 x g और 4 °C पर जीवाणु कोशिकाओं को इकट्ठा करते हैं और supernatant को कचरे में decant करते हैं।
    18. सेल पैलेट को 50 मिलीलीटर शंक्वाकार पॉलीस्टीरीन ट्यूब में -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि आगे का उपयोग न हो (प्रोटीन शुद्धिकरण, नीचे देखें)।

3. immobilized धातु आयन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी (IMAC) द्वारा प्रोटीन के नमूनों की शुद्धिकरण प्रक्रिया

  1. बैक्टीरियल सेल लाइसिस
    नोट: लक्ष्य प्रोटीन के क्षरण को रोकने के लिए बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर सेल लाइसिस के सभी चरणों का प्रदर्शन करें।
    1. 10-20 मिनट के लिए एक 50 मिली शंक्वाकार polystyrene ट्यूब में बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरियल सेल गोली पिघलना।
    2. बर्फ-ठंडे बाध्यकारी बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ें ( अनुपूरक सामग्री देखें) और सेल गोली को फिर से निलंबित करने के लिए धीरे-धीरे पिपेट ऊपर और नीचे।
    3. 50 mg/mL लाइसोजाइम का 100 μL, 1 mg/mL DNase I का 100 μL, 1 mg/mL RNase A का 100 μL, 1 M MgCl2 का 30 μL जोड़ें। ध्यान से सेल निलंबन को पांच बार उलटें, और बंद ट्यूब को बर्फ पर या 60 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
      नोट: लाइसोजाइम जीवाणु कोशिका की दीवार को बाधित करके रासायनिक सेल लाइसिस को प्रेरित करता है।
    4. एक अल्ट्रासाउंड homogenizer का उपयोग कर सेल व्यवधान के लिए नमूना sonicate (उदाहरण के लिए, एक बर्फ के पानी के मिश्रण पर एक 50 mL polystyrene ट्यूब में 3 मिनट के लिए 3 बार, पल्स 2 s /
      नोट: वैकल्पिक रूप से, अन्य सेल व्यवधान विधियों का उपयोग किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, 14,000 साई पर 20 चक्रों में उच्च दबाव समरूपता। यदि आवश्यक हो, तो न्यूनतम साधन मात्रा तक पहुंचने के लिए एक बाध्यकारी बफर ( अनुपूरक सामग्री देखें) का उपयोग करके पतला करें। इसके अलावा, प्रोटीन निष्कर्षण अभिकर्मकों का उपयोग सेल व्यवधान के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।
    5. 18,000 x g, 4 °C पर 60 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
    6. substep 3.1.9 के लिए तरल मात्रा को नोट करें। और एक ताजा 50 mL polystyrene ट्यूब में supernatant डालो.
    7. 0.45 μm ताकना व्यास के साथ एक झिल्ली फिल्टर का उपयोग कर supernatant साफ़ करें।
    8. SDS-PAGE के लिए "lysate" का एक नमूना लें (नीचे अनुभाग 4 देखें); यह "घुलनशील प्रोटीन अंश" से मेल खाती है, जो सबस्टेप 3.1.6 से supernatant है।
    9. substep 3.1.6 में निर्धारित के रूप में ddH2O का एक समान वॉल्यूम जोड़ें। बाद के एसडीएस-पेज विश्लेषण के लिए नमूनों के समान कमजोर पड़ने को बनाए रखने के लिए सेल मलबे को फिर से निलंबित करने के लिए।
    10. एसडीएस-पेज के लिए "गोली" का एक नमूना लें (नीचे अनुभाग 4 देखें); यह "अघुलनशील प्रोटीन अंश" से मेल खाती है, सेल मलबे 3.1.9 substep से निलंबन.
  2. Immobilized धातु आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी (IMAC) शुद्धिकरण
    नोट: लक्ष्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन का शुद्धिकरण 4 डिग्री सेल्सियस या कमरे के तापमान (आरटी) पर किया जा सकता है। उत्तरार्द्ध विकल्प के लिए, एक गर्म कॉलम में प्लेसमेंट पर ठंडे समाधान में फंसी हवा के वाष्पीकरण के कारण हवा के बुलबुले के गठन को रोकने के लिए आरटी पर संतुलित करने के लिए लिसेट, कॉलम और सभी बफर की प्रतीक्षा करें।
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार 1 एमएल प्रीपैक्ड या स्व-पैक किए गए आईएमएसी एफपीएलसी (फास्ट प्रोटीन [या प्रदर्शन] तरल क्रोमैटोग्राफी) कॉलम का उपयोग करके नमूने को शुद्ध करें; अधिकतम स्तंभ दबाव को 0.3 MPa पर सेट करें, और प्रवाह दर को 1 mL/min पर सेट करें; स्तंभ संतुलन के लिए बाइंडिंग बफ़र ( अनुपूरक सामग्री देखें), धोने के चरण के लिए बफ़र ( अनुपूरक सामग्री देखें) और लक्ष्य प्रोटीन क्षालन के लिए क्षालन बफर ( अनुपूरक सामग्री देखें) का उपयोग करें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, एक स्वचालित FPLC प्रणाली एक रैखिक imidazole एकाग्रता ढाल (20-200 mM) चल रहे elution बफर के साथ लक्ष्य प्रोटीन elute करने के लिए लागू किया जा सकता है।
    2. ले लीजिए और फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ eluate अंश पूल (दृश्यमान हरे या नारंगी रंग द्वारा चुनें).
    3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक डायलिसिस झिल्ली (5,000-10,000 के आणविक वजन कटऑफ (MWCO) ) में पूल किए गए अंशों को स्थानांतरित करें और डायलिसिस बफर या एमएस बफर के खिलाफ कम से कम तीन बार डायलाइज़ करें ( अनुपूरक सामग्री देखें)। उदाहरण के लिए, प्रत्येक दौर में कम से कम 2 घंटे के लिए 100 मिलीलीटर बफर के खिलाफ तीन बार 1-एमएल नमूने का डायलिसिस करें। एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए, Budisa et al.34 देखें।
    4. PBS बफर में डायलिज़्ड क्षालन अंश का 1:100 गुना कमजोर पड़ने की तैयारी करें ( अनुपूरक सामग्री देखें)।
    5. एक यूवी-विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में पतले नमूनों के अवशोषण स्पेक्ट्रम को रिकॉर्ड करें।
    6. लैम्बर्ट-बीयर कानून के आधार पर प्रोटीन एकाग्रता की गणना निम्नानुसार करें, विशिष्ट तरंग दैर्ध्य पर ε दाढ़ विलुप्त होने के गुणांक के साहित्य मूल्यों का उपयोग करते हुए (ईजीएफपी के लिए 488 एनएम ε488 = 55,000 सेमी -1 · M-1, 493 nm पर NowGFP ε493 = 53,600 सेमी-1 · M-1, KillerOrange at 514 nm ε514 = 22,600 cm-1· एम -1):
      Equation 1 (लैम्बर्ट-बीयर कानून)
      cप्रोटीन = प्रोटीन सांद्रता [mg/mL]
      A = विशिष्ट तरंग दैर्ध्य पर अवशोषण
      ε = विशिष्ट तरंग दैर्ध्य पर दाढ़ विलुप्त होने का गुणांक [M-1·cm-1]
      d = cuvette पथ लंबाई, यहाँ 1 सेमी
      MW = प्रोटीन का आणविक भार [g/mol]
      संदर्भ ("शून्य") माप के लिए डायलिसिस बफ़र ( अनुपूरक सामग्री देखें) का उपयोग करें.
    7. SDS-PAGE के लिए "eluate" का एक नमूना लें (नीचे अनुभाग 4 देखें), Coomassie ब्रिलियंट ब्लू-दाग जैल के लिए अच्छी तरह से प्रति नमूना प्रोटीन के 1-10 μg लोड (पिछले चरण के अनुसार गणना की गई)।
      नोट: समायोजित SDS नमूना मात्रा लागू धुंधला विधि और डाई की संवेदनशीलता के आधार पर यदि Coomassie ब्रिलियंट ब्लू से अलग यौगिकों प्रोटीन बैंड धुंधला करने के लिए उपयोग किया जाता है.
    8. फ्रीज और डायलिसिस बफर में प्रोटीन के नमूने को स्टोर ( अनुपूरक सामग्री देखें) -80 डिग्री सेल्सियस पर।
      नोट: इस भंडारण की स्थिति के तहत, प्रोटीन नमूने कम से कम 6 महीने के लिए स्थिर होना चाहिए। वैकल्पिक प्रयोगशाला यूवी-विज़ और प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग लक्ष्य प्रोटीन के अवशोषण और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा की रिकॉर्डिंग के लिए किया जा सकता है। प्रतिदीप्ति उत्सर्जन माप के लिए निम्नलिखित उत्तेजना तरंग दैर्ध्य को लागू किया जा सकता है: 488 एनएम (ईजीएफपी), 493 एनएम (NowGFP), और 510 एनएम (किलरऑरंज)।

4. SDS-पृष्ठ नमूना तैयारी

  1. अनुभाग 3 से "एल्यूएट", "लिसेट" और "पैलेट" नमूनों के लिए280 एनएम (ए 280एनएम) पर अवशोषण ए निर्धारित करें। एक280nm = 2 को प्राप्त करने के लिए जांच मात्रा को समायोजित करें क्षालन बफर की एक उचित मात्रा जोड़कर (अंतिम जांच मात्रा कम से कम 80 μL होनी चाहिए)।
  2. 5x SDS लोडिंग डाई बफर के साथ 4: 1 (v / v) के अनुपात में नमूने को मिलाएं ( अनुपूरक सामग्री देखें) पिपेटिंग द्वारा, उदाहरण के लिए, 5x SDS लोडिंग बफर के 20 μL के साथ नमूने के 80 μL।
  3. प्रोटीन को डीनेचर करने के लिए पानी के स्नान या गर्मी ब्लॉक में 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एसडीएस नमूनों को उबालें।
  4. नमूनों को आरटी तक ठंडा करने की अनुमति दें और जेल पर लोड होने से पहले एक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज में 1 मिनट के लिए 13,000 x g पर जांच को स्पिन करें।
  5. Coomassie ब्रिलियंट ब्लू-दाग SDS-PAGE के लिए 5-10 μL का उपयोग करें। SDS-PAGE प्रक्रिया के विवरण के लिए,57 से परामर्श करें.
    नोट:: लागू धुंधला विधि और डाई की संवेदनशीलता के आधार पर SDS नमूना मात्रा समायोजित करें। एसडीएस-पेज के परिणाम को यह सुनिश्चित करने के लिए सावधानीपूर्वक जांचा जाना चाहिए कि नमूनों में वांछित प्रोटीन के अपेक्षित आणविक वजन के अनुरूप एक बैंड में कुल प्रोटीन का 95% से अधिक होता है। इसके लिए, कूमासी-दाग जेल की एक तस्वीर लें और डेन्सिटोमेट्री द्वारा लेन में अन्य सभी बैंड (यदि कोई हो) की तीव्रता के साथ वांछित आणविक भार के प्रोटीन बैंड की तीव्रता की तुलना करें। बैंड तीव्रता के घनत्वमितीय मूल्यांकन के लिए, सॉफ्टवेयर ImageJ का उपयोग58 किया जा सकता है। प्रयोगात्मक रूप से ब्याज के प्रोटीन में वांछित ncAAs के समावेश को साबित करने के लिए, उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) द्वारा बरकरार प्रोटीन द्रव्यमान विश्लेषण electrospray ionization समय-की-उड़ान मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-ESI-TOF-MS) के लिए युग्मित किया जाना चाहिए के रूप मेंवर्णित 59 (प्रोटोकॉल अनुभाग 5 और अनुकरणीय उपकरणों के लिए सामग्री की तालिका देखें)।

5. प्रोटीन वेरिएंट के प्रतिदीप्ति उत्सर्जन

  1. प्रक्रिया से पहले, यह सुनिश्चित करने के लिए कि नमूना शुद्धता >95% है, SDS-PAGE प्रयोग से परिणाम की जाँच करें (चरण 4.5 के बाद नोट देखें.)
  2. प्रत्येक शुद्ध प्रोटीन संस्करण के नमूनों को 0.3 μM की एकाग्रता में समायोजित करें, एक संदर्भ के रूप में उपयुक्त तरंग दैर्ध्य पर परिकलित अवशोषण मान लेते हुए (substep 3.2.5.)। सुनिश्चित करें कि अनुमानित अंतिम नमूना मात्रा 200 μL है।
  3. पतला नमूनों को आरटी पर 1 घंटे के लिए संतुलित होने दें।
  4. नमूनों को 1 सेमी क्वार्ट्ज क्यूवेट में स्थानांतरित करें और एक प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके नमूनों के प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रम को मापें ( सामग्री की तालिका देखें) निम्नलिखित उत्तेजना तरंग दैर्ध्य को लागू करते हुए: 488 एनएम (ईजीएफपी के लिए), 493 एनएम (NowGFP के लिए), 510 एनएम (किलरऑरेंज के लिए)।

6. विकृतीकरण और EGFP वेरिएंट के refolding

  1. प्रक्रिया से पहले, यह सुनिश्चित करने के लिए कि नमूना शुद्धता >95% है, SDS-PAGE प्रयोग से परिणाम की जाँच करें (चरण 4.5 के बाद नोट देखें.)
  2. प्रत्येक शुद्ध प्रोटीन संस्करण के लिए तैयार करें 300 μM की एकाग्रता पर 2 μL अंतिम मात्रा के दो नमूने (substeps 3.2.4-3.2.6 में प्रोटीन एकाग्रता निर्धारण देखें)।
  3. विकृतीकरण को प्रेरित करने के लिए प्रत्येक शुद्ध प्रोटीन संस्करण के 2 μL (8 M यूरिया और 5m DTT युक्त 1x PBS प्राप्त करने के लिए) 1.11x PBS बफर के 18 μL जोड़ें (अनुपूरक सामग्री देखें) जिसमें 8.89 M यूरिया और 5 mM DTT शामिल हैं।
    नोट:: चरण 6.4-6.6 के लिए, प्रत्येक नमूना अलग-अलग संसाधित करें।
  4. 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें।
  5. 1x PBS के 1980 μL जोड़कर 20 μL नमूनों को पतला करें ( अनुपूरक सामग्री देखें) जिसमें 5 mM DTT शामिल हैं, जो 0.3 μM अंतिम प्रोटीन एकाग्रता उत्पन्न करते हैं और तुरंत 1-सेमी क्वार्ट्ज क्यूवेट में नमूनों के 200 μL को स्थानांतरित करते हैं।
    नोट: यहां तेजी से काम करना बहुत महत्वपूर्ण है क्योंकि पुनरावृत्ति तुरंत शुरू होती है।
  6. क्वार्ट्ज क्यूवेट को एक उपयुक्त प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोमीटर में डालें ( सामग्री की तालिका देखें) और 30 मिनट से अधिक हर 3 s में एक प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम प्राप्त करके नमूनों में प्रोटीन रीफोल्डिंग की निगरानी करें। प्रत्येक प्रोटीन संस्करण के लिए, पहले नमूने के लिए 295 एनएम प्रतिदीप्ति उत्तेजना और दूसरे के लिए 488 एनएम प्रतिदीप्ति उत्तेजना का उपयोग करें।
  7. 1.5 mL माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में refolding नमूनों को स्थानांतरित करें, ढक्कन को बंद करें और EGFP वेरिएंट के पूर्ण refolding की अनुमति देने के लिए 24 घंटे के लिए अंधेरे में आरटी पर नमूनों को स्टोर करें।
  8. प्रतिदीप्ति वसूली के अस्थायी समापन बिंदु पर कब्जा करने के लिए पहले के रूप में एक ही उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग करके चरण 6.6 के अनुसार refolded प्रोटीन नमूनों के प्रतिदीप्ति उत्सर्जन को मापने।

Representative Results

अध्ययन की शुरुआत में, हमने माता-पिता जीएफपी आर्किटेक्चर को साझा करने वाले तीन अलग-अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन वेरिएंट का चयन किया। चयनित पहला प्रोटीन ईजीएफपी था, जो जेलीफ़िश Aequorea विक्टोरिया से मूल GFP से व्युत्पन्न एक इंजीनियर संस्करण है जिसमें Phe64Leu / Ser65Thr उत्परिवर्तन शामिल हैं। दूसरा चयनित प्रोटीन NowGFP51,60 था। यह पूर्ववर्ती फ्लोरोसेंट प्रोटीन के माध्यम से कई चरणों में म्यूटाजेनेसिस द्वारा व्युत्पन्न ए विक्टोरिया जीएफपी का एक संस्करण भी है। NowGFP में अपने तत्काल पूर्ववर्ती फ्लोरोसेंट प्रोटीन "Cerulean" 61 की तुलना में 18 उत्परिवर्तन होते हैं। बदले में, "सेरूलियन" प्रोटीन एन्हांस्ड सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईसीएफपी) 62,63 का एक व्युत्पन्न है, एक प्रोटीन जिसे पहले निर्देशित प्रयोगशाला विकास द्वारा चुना गया था और जिसमें ट्रिप्टोफैन-आधारित क्रोमोफोर होता है। दोनों, ईजीएफपी और नोजीएफपी का व्यापक रूप से सेल जीव विज्ञान और बायोफिजिकल अध्ययनों में उपयोग किया जाता है, और उनमें उनकी संरचनाओं में दस संरक्षित प्रोलाइन अवशेष होते हैं। इसके अलावा, नाउजीएफपी में स्थिति 230 पर एक ग्यारहवें प्रोलाइन अवशेष हैं, जो इस प्रोटीन वेरिएंट के व्यापक उत्परिवर्तन इतिहास के कारण दिखाई दिए। चुना गया तीसरा प्रोटीन KillerOrange फ्लोरोसेंट प्रोटीन64,65 था। यह हाइड्रोज़ोन जीनस एंथोथेकाटा से क्रोमोप्रोटीन anm2CP का व्युत्पन्न है। प्रोटीन अनुक्रम में 15 प्रोलाइन अवशेष होते हैं, और क्रोमोफोर एक टायरोसिन अवशेषों के बजाय ट्रिप्टोफैन पर आधारित होता है। सभी तीन चयनित प्रोटीनों (चित्रा 2) 51,65,66 के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन एक्स-रे संरचनाओं की सूचना दी गई है।

पहले चरण में, प्रोलाइन एनालॉग्स (चित्रा 1 डी) को चयनात्मक दबाव निगमन (एसपीआई) द्वारा तीन मॉडल प्रोटीन (ईजीएफपी, नोजीएफपी, और किलरऑरेंज) के सभी प्रोलाइन पदों में शामिल किया गया था, प्रक्रिया की एक योजना चित्रा 3 में दी गई है। Instrumentally, proline-auxotrophic E. coli K12 स्ट्रेन JM8367 का उपयोग प्रोलाइन और एनालॉग्स (चित्रा 1 D) की उपस्थिति में प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए किया गया था, जो क्रमशः जंगली-प्रकार और संशोधित प्रोटीन उत्पन्न करता है। देशी प्रोटीन को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं से छर्रों और एस-एफएलपी और डीएचपी वाले वेरिएंट में बरकरार क्रोमोफोर के कारण विशिष्ट उज्ज्वल रंग था, जबकि आर-एफएलपी और डीएफपी वाले वेरिएंट रंगहीन रहे, जो शामिल निकायों में सामने आए प्रोटीन के मिसफोल्डिंग और जमाव को दर्शाते हैं (चित्रा 4 ए)। व्यक्त किए गए नमूनों के एसडीएस-पेज विश्लेषण ने अघुलनशील आर-एफएलपी-युक्त प्रोटीन (चित्रा 4 बी-डी) की उपस्थिति को सत्यापित किया, जिसने आगे की जांच को रोक दिया। यद्यपि यह वर्तमान अध्ययन के दायरे से परे है, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रोटीन घुलनशीलता और मिसफोल्डिंग मुद्दों को इन विट्रो रीफोल्डिंग प्रक्रियाओं68 द्वारा कुछ हद तक कम किया जा सकता है। इसके विपरीत, देशी प्रोटीन के साथ-साथ एस-एफएलपी- और डीएचपी-असर वेरिएंट मुख्य रूप से घुलनशील अंशों (चित्रा 4 बी-डी) में पाए गए थे। जंगली-प्रकार, साथ ही साथ एस-एफएलपी- और डीएचपी-युक्त वेरिएंट, को आगे अलग किया जा सकता है और प्रतिदीप्ति अध्ययनों में विशेषता हो सकती है। घुलनशील प्रोटीन को स्थिर धातु आयन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी (आईएमएसी) द्वारा शुद्ध किया गया था, जो ईजीएफपी के लिए 20-30 मिलीग्राम / एल संस्कृति की मात्रा, NowGFP और KillerOrange के लिए 60-80 मिलीग्राम की उपज देता था, जिसकी जंगली-प्रकार और संशोधित प्रोटीन के लिए पैदावार बहुत समान थी। तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) -युग्मित विश्लेषण ने इस फैशन में प्राप्त आइसोलेट्स की अपेक्षित पहचान और शुद्धता की पुष्टि की (चित्रा 5)। द्रव्यमान स्पेक्ट्रा में, एस-एफएलपी के साथ प्रत्येक प्रोलाइन प्रतिस्थापन ने अनुक्रम में प्रत्येक प्रोलाइन अवशेषों के प्रति एक +18 डीए शिफ्ट का उत्पादन किया, जबकि प्रोलाइन-टू-डीएचपी प्रतिस्थापन के लिए, शिफ्ट प्रति अवशेष -2 डीए था।

अगले चरण में, प्रकाश अवशोषण और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा को माता-पिता फ्लोरोसेंट प्रोटीन (चित्रा 6) के स्पेक्ट्रोस्कोपिक गुणों पर गैर-विहित प्रोलाइन एनालॉग्स निगमन के संभावित प्रभावों का विश्लेषण करने के लिए दर्ज किया गया था। यूवी-विस अवशोषण स्पेक्ट्रा ने सुगंधित अवशेषों, टायरोसिन और ट्रिप्टोफैन के लिए 280 एनएम विशेषता के आसपास एक विशिष्ट बैंड दिखाया, जबकि क्रोमोफोर अवशोषण ईजीएफपी के लिए 488 एनएम पर पाया गया था, और नोजीएफपी (चित्रा 6 ए, बी) के लिए 493 एनएम। KillerOrange में, क्रोमोफोर अवशोषण क्षेत्र में दो बैंड (चित्रा 6 C) शामिल थे, जो जटिल क्रोमोफोर के दो संभावित कॉन्फ़िगरेशनल और चार्ज राज्यों के अनुरूप हैं। 510 एनएम के आसपास बैंड को उस स्थिति के रूप में जाना जाता है जहां से प्रतिदीप्ति उच्च क्वांटम उपज 49,65 के साथ होती है। प्रोलाइन प्रतिस्थापन वेरिएंट में, निम्नलिखित देखा गया था: डीएचपी के निगमन ने ईजीएफपी और नोजीएफपी के अवशोषण स्पेक्ट्रा को नहीं बदला, जबकि एस-एफएलपी ने एक बढ़ाया यूवी अवशोषण का उत्पादन किया। उत्तरार्द्ध को ट्रिप्टोफैन अवशेषों माइक्रोएन्वायरमेंट में प्रेरित अंतर द्वारा समझाया जा सकता है, विशेष रूप से PVPWP आकृति (चित्रा 6A, B) 69 में तीन S-Flp के बीच सैंडविच किए गए Trp57। एक उच्च यूवी अवशोषण के लिए एक अधिक तुच्छ स्पष्टीकरण, हालांकि, अनुचित रूप से मुड़े हुए प्रोटीन के बढ़े हुए अंश से स्टेम हो सकता है। चूंकि प्रोटीन की एकाग्रता का मूल्यांकन अवशोषण विशेषताओं के परिमाणीकरण द्वारा किया गया था, इसलिए अनुचित रूप से परिपक्व क्रोमोफोर के साथ एक प्रोटीन की उपस्थिति अवशोषण को बढ़ा सकती है, जबकि इस अंश को समग्र एकाग्रता (चित्रा 6 ए, बी) में नहीं गिना जाता है। इस परिकल्पना का समर्थन करते हुए, हमने देखा कि एस-एफएलपी-युक्त ईजीएफपी ने मूल प्रोटीन (तालिका 2) 70 में उच्च मूल्य (1.57) की तुलना में क्रोमोफोर बनाम संयुक्त ट्रिप्टोफैन और टायरोसिन अवशोषण (ε (सीआरओ) / ε (टायर + टीआरपी) = 0.96) के स्पष्ट रूप से कम अनुपात का प्रदर्शन किया। एस-एफएलपी-युक्त ईजीएफपी में एक गैर-फ्लोरोसेंट अंश की उपस्थिति प्रोटीन गुणों के आगे के विश्लेषण में एक महत्वपूर्ण योगदान कारक होगी। S-Flp युक्त KillerOrange संस्करण में, क्रोमोफोर बैंड में लाल-शिफ्ट के साथ एक बढ़ाया अवशोषण देखा गया था। इस तथ्य ने संकेत दिया कि क्रोमोफोर गठन ने एक बड़े प्रतिदीप्ति क्वांटम उपज (चित्रा 6 सी) के साथ एक कॉन्फ़िगरेशन का पक्ष लिया।

इसके बाद, हमने संबंधित अधिकतम अवशोषण तरंग दैर्ध्य पर उत्तेजना पर दर्ज प्रोटीन के प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा का विश्लेषण किया। परिणामों से पता चलता है कि स्पेक्ट्रा अनिवार्य रूप से प्रोलाइन और प्रतिस्थापन, एस-एफएलपी और डीएचपी वाले फ्लोरोसेंट प्रोटीन वेरिएंट की जांच के लिए समान रहा। इस परिणाम का तात्पर्य है कि एनालॉग्स ने किसी भी मामले में क्रोमोफोर के रासायनिक वातावरण को नहीं बदला (चित्रा 6 जी-आई)। इस तथ्य के बावजूद, 295 एनएम पर उत्तेजना पर दर्ज किलरऑरेंज के प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा में चिह्नित अंतर देखे गए थे, इसलिए ट्रिप्टोफैन उत्तेजना पर। यह प्रयोग प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) या प्रत्यक्ष एक्सीटोनिक युग्मन को ट्रैक करता है जो ट्रिप्टोफैन साइड चेन और परिपक्व क्रोमोफोर के बीच होता है क्योंकि दोनों 25 Å से अधिक की छोटी दूरी पर स्थित हैं। ईजीएफपी और नोओजीएफपी वेरिएंट के लिए, जब उत्सर्जन स्पेक्ट्रा को 295 एनएम उत्तेजना का उपयोग करके मापा गया था, तो एक मजबूत क्रोमोफोर उत्सर्जन शायद ही किसी भी ट्रिप्टोफैन उत्सर्जन (चित्रा 6 डी, ई) के साथ देखा गया था। हालांकि, एस-एफएलपी वाले वेरिएंट ने थोड़ा बड़ा ट्रिप्टोफैन-विशिष्ट उत्सर्जन प्रदर्शित किया। इस अवलोकन को उजागर एपोप्रोटीन के एक अनगिनत योगदान से जोड़ा जा सकता है जिसमें ट्रिप्टोफैन होते हैं लेकिन परिपक्व क्रोमोफोर नहीं। KillerOrange में काफी हद तक बढ़ी हुई ट्रिप्टोफैन-विशिष्ट उत्सर्जन देखा गया था, जो उत्तेजना ऊर्जा हस्तांतरण या एक्सीटोनिक युग्मन के अपेक्षित तंत्र के माध्यम से प्रतिदीप्ति शमन की कमी का संकेत देता है। प्रोलाइन और एस-एफएलपी युक्त प्रोटीन वेरिएंट ने उच्च क्वांटम उपज की पसंदीदा लाल-स्थानांतरित प्रतिदीप्ति विशेषता के साथ तुलनीय ट्रिप्टोफैन उत्सर्जन का प्रदर्शन किया। इसके विपरीत, जिस संस्करण में डीएचपी शामिल था, उसने क्रोमोफोर प्रतिदीप्ति तीव्रता में भारी कमी दिखाई, संभवतः मामूली संरचनात्मक प्रभावों (चित्रा 6 एफ) के कारण।

इसके बाद, हमने प्रोटीन के तह गुणों की तुलना एक खुलासा / पुनरावृत्ति प्रयोग करके की। प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा को तह की गई स्थिति (प्रोटोकॉल अनुभाग 5) में दर्ज किया गया था, रासायनिक विकृतीकरण के बाद और बाद में, 24 घंटे (प्रोटोकॉल अनुभाग 6) की अवधि में निगरानी की गई रीफोल्डिंग की प्रक्रिया में। स्पेक्ट्रा को प्रासंगिक तरंग दैर्ध्य, 295 एनएम, और क्रोमोफोर्स के अवशोषण स्पेक्ट्रा के मैक्सिमा पर उत्तेजना पर दर्ज किया गया था, जबकि परिणामी प्रतिदीप्ति को प्रत्येक प्रोटीन के लिए अधिकतम मूल्य के लिए सामान्यीकृत के रूप में प्रस्तुत किया जाता है (चित्रा 7)। प्रोटोकॉल के अंत में, हमने देखा कि ईजीएफपी वेरिएंट फिर से जुड़ सकते हैं, जबकि NowGFP और KillerOrange वेरिएंट - एक बार विकृत होने के बाद - खुला रहा (डेटा नहीं दिखाया गया)। इस प्रकार, मूल प्रतिदीप्ति प्रोटीन की रीफोल्डिंग क्षमता काफी भिन्न होती है। ध्यान दें, KillerOrange को हाइड्रोज़ोन क्रोमोप्रोटीन वेरिएंट किलरड65,71 से शुरू होने वाले एक फोटोसेंसिटाइज़र के रूप में विकसित किया गया है, और इसकी रीफोल्डिंग आमतौर पर मजबूत β-बैरल संरचना के बावजूद पीछे रहती है। हमारे प्रयोगों में, हमने पाया कि जंगली-प्रकार के ईजीएफपी क्रोमोफोर प्रतिदीप्ति केवल आंशिक रूप से ठीक हो गए, हालांकि ट्रिप्टोफैन-विशिष्ट प्रतिदीप्ति पुनः संतृप्ति के बाद बड़ा था (चित्रा 7 ए, डी)। अनिवार्य रूप से इसी तरह का व्यवहार Dhp युक्त संस्करण में देखा गया था (चित्रा 7C, F)। एस-एफएलपी-युक्त ईजीएफपी में, एक समान परिणाम देखा गया था जब उत्तेजना 295 एनएम (चित्रा 7 बी) के ट्रिप्टोफैन-विशिष्ट तरंग दैर्ध्य पर की गई थी। आश्चर्यजनक रूप से, प्रतिदीप्ति एक बहुत अधिक विस्तार के लिए बरामद जब क्रोमोफोर 488 एनएम (चित्रा 7 ई) पर उत्साहित था। ऐसा लगता है कि एस-एफएलपी अन्य दो वेरिएंट की तुलना में रीफोल्डिंग की बेहतर उपज को प्रेरित करता है। हालांकि, अज्ञात आणविक इंटरैक्शन के कारण 295 एनएम उत्तेजना का उपयोग करते समय यह लाभकारी प्रभाव नहीं देखा गया था।

इसके बाद, ट्रिप्टोफैन, और क्रोमोफोर दोनों के प्रतिदीप्ति को अलग-अलग रिकॉर्ड करके रीफोल्डिंग वेग की निगरानी की गई थी, जबकि प्रक्रिया का समापन बिंदु पुनरावृत्ति की शुरुआत के बाद 24 घंटे में निर्धारित किया गया था। केवल ईजीएफपी वेरिएंट ने अपेक्षाकृत तेजी से रीफोल्डिंग कैनेटीक्स दिखाया जिसका विश्वसनीय रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है, जबकि विकृत नोजीएफपी और किलरऑरेंज वेरिएंट में से कोई भी एक मूल्य पर ठीक नहीं हो सकता है जो आगे मात्रात्मक माप को सक्षम करता है। ईजीएफपी में, क्रोमोफोर उत्सर्जन (1,500 सेकंड में पूरा) की वसूली की तुलना में ट्रिप्टोफैन उत्सर्जन वसूली दो बार तेज (750 सेकंड में पूरी) थी, जो अंतर्निहित प्रक्रियाओं की जटिलता को दर्शाती है (चित्रा 8)। दोनों उत्तेजना तरंग दैर्ध्य पर, साहित्य डेटा25 के साथ समझौते में, एस-एफएलपी की उपस्थिति से रीफोल्डिंग दर को बढ़ाया गया था। उसी समय, डीएचपी-युक्त संस्करण ने जंगली-प्रकार के समान एक रीफोल्डिंग प्रोफ़ाइल दिखाया।

Figure 1
चित्रा 1: ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) संरचनात्मक पाड़, क्रोमोफोर बिल्डिंग, प्रोलाइन संरचनात्मक संक्रमण और सिंथेटिक एनालॉग्स इस अध्ययन में उपयोग किए जाते हैं। (ए) जीएफपी की संरचना में β-स्ट्रैंड होते हैं जो लगभग सही बैरल बनाते हैं (यानी, 4.2 एनएम x 2.4 एनएम आयामों के साथ एक "कैन") जो α-हेलिकल ढक्कन द्वारा दोनों सिरों पर कैप्ड होता है। 27 केडीए जीएफपी प्रोटीन एक तृतीयक संरचना दिखाता है जिसमें ग्यारह β-स्ट्रैंड, दो छोटे α-हेलिसेस और बीच में क्रोमोफोर शामिल हैं। आसन्न प्रोलाइनों की संरचनात्मक अवस्थाएं क्रोमोफोर गठन से जुड़ी हुई हैं। (बी) क्रोमोफोर की ऑटोकैटालिटिक परिपक्वता (संक्षेपण) अवशेष Ser65, Tyr66, और Gly67 पर होती है, और कई चरणों में आगे बढ़ती है: सबसे पहले, पॉलीपेप्टाइड रीढ़ में मरोड़ समायोजन Gly67 के एमाइड नाइट्रोजन की निकटता में Thr65 के कार्बोक्सिल कार्बन को लाने के लिए। फिर, एक heterocyclic imidazoline-5-एक अंगूठी प्रणाली का गठन ग्लाइसिन और बाद में निर्जलीकरण के एमाइड नाइट्रोजन द्वारा इस कार्बन परमाणु पर न्यूक्लियोफिलिक हमले पर होता है। अंत में, सिस्टम दिखाई देने वाली प्रतिदीप्ति प्राप्त करता है जब आणविक ऑक्सीजन द्वारा टायरोसिन अल्फा-बीटा कार्बन बॉन्ड का ऑक्सीकरण इमिडाज़ोलिन रिंग सिस्टम की संयुग्मित प्रणाली के विस्तार की ओर जाता है, अंत में टायरोसिन फिनाइल रिंग और इसके पैरा-ऑक्सीजन प्रतिस्थापन सहित। β-बैरल के केंद्र में परिणामी पैरा-हाइड्रॉक्सीबेंजाइलिडीन इमिडाज़ोलिनोन क्रोमोफोर पूरी तरह से थोक विलायक से अलग हो जाता है। (सी) कंकाल संरचना के सूत्र और ज्यामिति 1) प्रोलाइन रिंग (पकर्स) और 2) पूर्ववर्ती एमाइड बॉन्ड प्रोलाइन अवशेषों के मुख्य संरचनात्मक संक्रमण का प्रतिनिधित्व करता है। (डी) प्रोलाइन एनालॉग्स नामित प्रोलाइन रिंग पकर्स के साथ इस काम में उपयोग किए जाते हैं। यह आंकड़ा ChemDraw और Discovery Studio Visualizer का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था। GFP संरचना PDB संरचना प्रविष्टि 2Q6P से है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोसेंट प्रोटीन। पैनल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के तीन अलग-अलग रूपों की विशिष्ट β-बैरल संरचनाओं के रिबन प्रतिनिधित्व को दिखाते हैं: EGFP, NowGFP, और KillerOrange, रिबन रंग के साथ प्रत्येक संस्करण के प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के रंग का प्रतिनिधित्व करते हैं। प्रोलाइन अवशेषों (एक-अक्षर कोड) को छड़ें के रूप में हाइलाइट किया जाता है, और उपयुक्त पदों को एनोटेट किया जाता है। क्रोमोफोर को बोल्ड में प्रारंभिक अमीनो एसिड संरचना के साथ दिखाया गया है। सभी संरचना अभ्यावेदन निम्नलिखित पीडीबी संरचना प्रविष्टियों के आधार पर PyMol के साथ उत्पादित किए गए थे: EGFP के लिए 2Q6P, NowGFP के लिए 4RYS, KillerOrange के लिए 4ZFS। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: गैर-विहित प्रोलाइन एनालॉग्स के अवशेष-विशिष्ट निगमन के लिए एसपीआई विधि की फ्लो चार्ट प्रस्तुति। एक प्रोलाइन-ऑक्सोट्रोफिक एस्चेरिचिया कोलाई (ई कोलाई) मेजबान तनाव एक अभिव्यक्ति प्लास्मिड पर ब्याज के जीन को ले जाने के लिए सभी 20 विहित अमीनो एसिड के साथ एक परिभाषित न्यूनतम माध्यम में उगाया जाता है जब तक कि ~ 0.7 का ओडी600 तक नहीं पहुंच जाता है जिस पर सेल संस्कृति मध्य-लॉगरिदमिक विकास चरण में है। कोशिकाओं को काटा जाता है और ताजा न्यूनतम माध्यम में स्थानांतरित किया जाता है जिसमें 19 विहित अमीनो एसिड और एक प्रोलाइन एनालॉग होता है। एक प्रेरक के अलावा के बाद, प्रोटीन अभिव्यक्ति रात भर किया जाता है। अंत में, लक्ष्य प्रोटीन को सेल लाइसिस द्वारा अलग किया जाता है और आगे के विश्लेषण से पहले शुद्ध किया जाता है। प्रोटोकॉल की एक भिन्नता में, कोशिकाओं को 19 विहित अमीनो एसिड के साथ एक परिभाषित न्यूनतम माध्यम में उगाया जाता है, और प्रोलाइन को सीमित मात्रा में जोड़ा जाता है (उदाहरण के लिए, अन्य अमीनो एसिड की एकाग्रता का पांचवां हिस्सा)। इस उपाय से, कोशिकाएं लॉगरिदमिक विकास चरण से बाहर निकलने से पहले माध्यम में प्रोलाइन को समाप्त कर देती हैं, और फिर, बाद में, एनालॉग जोड़ा जाता है, और ब्याज उत्पादन का प्रोटीन प्रेरित होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: EGFP, NowGFP, और KillerOrange वेरिएंट की अभिव्यक्ति विश्लेषण। (ए) अभिव्यक्ति संस्कृति के 1 मिलीलीटर से सेल छर्रों, ओडी600 = 2 के लिए सामान्यीकृत। (बी) ईजीएफपी, ( सी ) NowGFP, और (डी) KillerOrange वेरिएंट के एसडीएस-पेज विश्लेषण। प्रत्येक फ्लोरोसेंट प्रोटीन डेरिवेट्स के घुलनशील (एस) और अघुलनशील अंश (आई) को 15% एक्रिलामाइड जेल पर लोड किया गया था, साथ ही घुलनशील प्रोटीन के आईएमएसी से अलग किए गए अंश (ई) भी थे। PageRuler Unstained Protein Ladder का उपयोग (M) द्वारा निरूपित लेन में एक मार्कर (M) के रूप में किया गया था। विशेष प्रोटीन के अपेक्षित क्षेत्रों को तैयार किया जाता है। प्रोलाइन पदों पर शामिल अमीनो एसिड प्रो, आर-एफएलपी, एस-एफएलपी, और डीएचपी (में (ए) फ्लोरोसेंट प्रोटीन वेरिएंट से सेल छर्रों में डीएचपी के बजाय डीएफपी को शामिल करते हुए दिखाए गए हैं)। जैल को 1% (डब्ल्यू / वी) कूमासी ब्रिलेंट ब्लू द्वारा दाग दिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: फ्लोरोसेंट प्रोटीन वेरिएंट का मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण। (ए) एच6-टैग किए गए ईजीएफपी (ब्लैक), एस-एफएलपी-ईजीएफपी (नारंगी), और डीएचपी-ईजीएफपी (सियान) के प्रतिनिधि डीकंवोल्वित ईएसआई-एमएस स्पेक्ट्रा को संख्याओं के रूप में प्रदान किए गए मुख्य द्रव्यमान चोटियों (डीए में) के स्थान के साथ। एच6-टैग किए गए प्रोटीन के परिकलित आणविक द्रव्यमान [एम + एच] + हैं: ईजीएफपी 27,745.33 दा के लिए (27,746,15 डीए मनाया गया); S-Flp-EGFP 27,925.33 Da के लिए (27,925.73 Da मनाया गया); Dhp-EGFP 27,725.33 Da के लिए (मनाया 27,726.01 Da). (बी) एच6-टैग किए गए NowGFP (काले), S-Flp-NowGFP (नारंगी), और Dhp-NowGFP (cyan) के प्रतिनिधि deconvoluted ESI-MS स्पेक्ट्रा संख्याओं के रूप में प्रदान की गई मुख्य द्रव्यमान चोटियों (Da में) के स्थान के साथ। एच6-टैग किए गए प्रोटीन के परिकलित द्रव्यमान हैं: NowGFP 27,931.50 Da के लिए (27,946.46 Da मनाया गया; ~ 16 Da का अंतर शायद प्रोटीन में एक मेथिओनिन के ऑक्सीकरण के कारण है); S-Flp-NowGFP 28,129.50 Da के लिए (मनाया 28,130.08 Da); Dhp-NowGFP 27,909.50 Da के लिए (मनाया 27,910.22 Da). (सी) एच6-टैग किए गए किलरऑरंज (ब्लैक), एस-एफएलपी-किलरऑरेंज (नारंगी), और डीएचपी-किलरऑरंज (सियान) के प्रतिनिधि डीकंवोल्व्ड ईएसआई-एमएस स्पेक्ट्रा को संख्याओं के रूप में प्रदान किए गए मुख्य द्रव्यमान चोटियों के स्थान के साथ (डीए में)। एच6-टैग किए गए प्रोटीन के परिकलित द्रव्यमान हैं: किलरऑरेंज 27,606.09 दा (27,605.91 डीए मनाया गया) के लिए; S-Flp-KillerOrange 27,876.09 Da के लिए (27,876.08 Da मनाया गया); Dhp-KillerOrange 27,576.09 Da के लिए (मनाया 27,575.93 Da). लगभग 1 Da के देखे गए और परिकलित आणविक द्रव्यमानों के बीच विचलन ESI-MS उपकरण की त्रुटि सीमा के भीतर हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: फ्लोरोसेंट प्रोटीन वेरिएंट के प्रकाश अवशोषण और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा। सामान्यीकृत यूवी-विज़ अवशोषण स्पेक्ट्रा ईजीएफपी के वेरिएंट (ए), नोजीएफपी के (बी) और किलरऑरेंज के (सी) के लिए दिखाए गए हैं। स्पेक्ट्रा को क्रोमोफोर अवशोषण (लगभग 500 एनएम) के अधिकतम तक सामान्यीकृत किया गया था। सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा को ईजीएफपी के वेरिएंट (डी, जी), नोजीएफपी के (ई, एच) और किलरऑरेंज के (एफ, आई) के दिखाए गए हैं। (डी, ई, एफ) में स्पेक्ट्रा को पराबैंगनी प्रकाश (295 एनएम) के साथ उत्तेजना पर मापा गया था, स्पेक्ट्रा के लिए (जी, एच, आई) 488 एनएम, 493 एनएम, और 510 एनएम प्रकाश का उपयोग क्रमशः उत्तेजना के लिए किया गया था, और स्पेक्ट्रा को क्रोमोफोर उत्सर्जन (लगभग 500 एनएम) के संबंधित मैक्सिमा में सामान्यीकृत किया गया था। प्रत्येक पैनल में, काले वक्र देशी प्रोलाइन के साथ फ्लोरोसेंट प्रोटीन संस्करण के स्पेक्ट्रा के अनुरूप होते हैं, नारंगी वक्र एस-एफएलपी-प्रतिस्थापित प्रोटीन के स्पेक्ट्रा को इंगित करते हैं, और नीले वक्र डीएचपी-प्रतिस्थापित प्रोटीन के अनुरूप होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: refolding प्रयोगों में EGFP वेरिएंट के प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा. मूल राज्य में फ्लोरोसेंट प्रोटीन वेरिएंट के 0.3 μM समाधानों के सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा और विकृतीकरण और refolding के बाद: स्पेक्ट्रा में (A, B,C) को पराबैंगनी प्रकाश (295 nm) ( A) के साथ उत्तेजना पर मापा गया था EGFP के लिए, (B) S-Flp-EGFP के लिए, और Dhp-EGFP के लिए (C)। (डी, ई, एफ) में स्पेक्ट्रा को ईएफजीपी के लिए हरी रोशनी (488 एनएम) (डी) के साथ उत्तेजना पर मापा गया था, एस-एफएलपी-ईजीएफपी के लिए (ई) और डीएचपी-ईजीएफपी के लिए (एफ) । देशी (काले वक्र) और refolded नमूनों के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा (हरे रंग EGFP से मेल खाती है, नारंगी S-Flp-EGFP के लिए और नीले से Dhp-EGFP, क्रमशः) प्रत्येक प्रोटीन संस्करण के उपयुक्त मूल राज्य के अधिकतम प्रतिदीप्ति के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: प्रतिदीप्ति के साथ EGFP वेरिएंट के प्रोटीन तह और क्रोमोफोर परिपक्वता की निगरानी। (ए) टीआरपी प्रतिदीप्ति के क्षेत्र में प्रतिदीप्ति उत्सर्जन (उत्सर्जन 330 एनएम पर सेट किया गया था) पराबैंगनी प्रकाश (295 एनएम) के साथ उत्तेजना पर दर्ज किया गया था। (बी) हरे रंग की रोशनी (488 एनएम) के साथ उत्तेजना पर क्रोमोफोर उत्सर्जन के क्षेत्र में प्रतिदीप्ति आयाम का विकास। समय-निर्भर प्रतिदीप्ति निशान को निगरानी अंतराल के अंत में पहुंचे प्रतिदीप्ति आयाम के अनुसार एकता (100%) के लिए सामान्यीकृत किया गया था। प्रत्येक पैनल में, काले वक्र देशी प्रोलाइन के साथ फ्लोरोसेंट प्रोटीन संस्करण के स्पेक्ट्रा के अनुरूप होते हैं, नारंगी वक्र एस-एफएलपी-प्रतिस्थापित प्रोटीन के स्पेक्ट्रा को इंगित करते हैं और नीले वक्र डीएचपी-प्रतिस्थापित प्रोटीन के अनुरूप होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

बनाना अमीनो एसिड अनुक्रमों (6xHis टैग रेखांकित):
EGFP-H6 MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVP
WPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTR
AEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVN
FKIRHNIEDGSVQLADHYQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDH
MVLLEFVTAAGITLGMDELYKHHHHHHHHHHH
H6-NowGFP MRGSHHQHHHGSVSKGEKLFTGVVVVVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGK
MSLKFICTTGKLPVPWPTLKTTLTWGMQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGY
VQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGVDFKEDGNILGHKLEYN
AISGNANITADKQKNGIKAYFTIRHDVEDGSVLLADHYQNTPIGDGPVLLPD
NHYLSTQSKQSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGIPLGADELYK
H6-KillerOrange MRGSHHHHHHHHGSECGPALFQSDMTFKIFIDGEVNGQKFTIVADGSSKFPH
GDFNVHAVCETGKLPMSWKPICHLIQWGEPFFARYPDGISHFAQECFPEG
LSIDRTVRFENDGTMTSHHTYELSDTCVVSRITVNCDGFQPDGPIMRDQ
LVDILPSETHMFPHGPNAVRQLAFIGFTTADGGLMMGHLDSKMTFNGSR
AIEIPGPHFVTIITKQMRDTSDKRDHVCQREVAHAHSVPRITSAIGSDQDQD

तालिका 1: लक्ष्य प्रोटीन की प्राथमिक संरचनाएं। उनके-टैग प्रत्येक अनुक्रम में रेखांकित किए जाते हैं।

π [nm] ε [M-1·cm-1] (EGFP) ε [M-1·cm-1] (S-Flp-EGFP) ε [M-1·cm-1] (Dhp-EGFP)
488 (≡ CRO) 31,657 (± 1,341) 22,950 (± 290) 27,800 (± 542)
280 (≡ Tyr+Trp) 20,116 (± 172) 23,800 (± 715) 17,300 (± 554)
विलुप्त होने के गुणांक ε के लिए मान (एम -1 · सेमी -1 में) ज्ञात प्रोटीन सांद्रता का उपयोग करके उपयुक्त ईजीएफपी वेरिएंट के रिकॉर्ड किए गए यूवी-विज़ अवशोषण स्पेक्ट्रा से गणना की जाती है। 280 एनएम पर चयनित तरंग दैर्ध्य सुगंधित अवशेषों, टायरोसिन और ट्रिप्टोफैन के अधिकतम अवशोषण से मेल खाती है, और 488 एनएम क्रोमोफोर अवशोषण तरंग दैर्ध्य का प्रतिनिधित्व करता है।

तालिका 2: चयनित तरंग दैर्ध्य पर ईजीएफपी वेरिएंट के विलुप्त होने के गुणांक (ε)। विलुप्त होने के गुणांक ε (एम -1 · सेमी -1 में) के लिए मूल्यों की गणना ज्ञात प्रोटीन सांद्रता का उपयोग करके उपयुक्त ईजीएफपी वेरिएंट के रिकॉर्ड किए गए यूवी-विज़ अवशोषण स्पेक्ट्रा से की जाती है। 280 एनएम की चयनित तरंग दैर्ध्य सुगंधित अवशेषों, टायरोसिन और ट्रिप्टोफैन के अधिकतम अवशोषण से मेल खाती है, जबकि 488 एनएम अधिकतम क्रोमोफोर अवशोषण तरंग दैर्ध्य का प्रतिनिधित्व करती है।

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Discussion

प्रकृति में, प्रोटीन संरचनाओं और कार्यों के साथ जोड़तोड़ आमतौर पर उत्परिवर्तन के कारण होते हैं, यह घटना जो प्रोटीन अनुक्रम में कुछ पदों पर एक अमीनो एसिड पहचान के आदान-प्रदान की ओर ले जाती है। इस प्राकृतिक तंत्र को व्यापक रूप से म्यूटाजेनेसिस के रूप में प्रोटीन इंजीनियरिंग के लिए एक जैव-तकनीकी विधि के रूप में लागू किया जाता है, और यह प्रक्रिया में शामिल 20 विहित अमीनो एसिड के प्रदर्शनों की सूची पर निर्भर करता है। हालांकि, प्रोलाइन अवशेषों का आदान-प्रदान समस्याग्रस्त है। अपने विशेष बैकबोन समूह वास्तुकला के कारण, यह प्रतिस्थापन72 के लिए शेष 19 अवशेषों के साथ शायद ही विनिमेय है। उदाहरण के लिए, प्रोलाइन को आमतौर पर पॉलीपेप्टाइड अनुक्रमों में एक माध्यमिक संरचना ब्रेकर के रूप में जाना जाता है क्योंकि सबसे आम माध्यमिक संरचनाओं के साथ इसकी खराब संगतता, यानी, α-हेलिक्स और β-स्ट्रैंड। यह प्रोलाइन सुविधा आसानी से खो जाती है जब अवशेषों को आम प्रदर्शनों की सूची से एक और अमीनो एसिड में उत्परिवर्तित किया जाता है। इसके रासायनिक एनालॉग्स के साथ प्रोलाइन का प्रतिस्थापन एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान करता है, जो अपने विशिष्ट संरचनात्मक संक्रमणों पर पूर्वाग्रह लागू करते हुए या आणविक मात्रा और ध्रुवीयता के मॉडुलन का उत्पादन करते हुए माता-पिता प्रोलाइन अवशेषों की मूल रीढ़ की हड्डी की विशेषताओं को बनाए रखने में सक्षम बनाता है। उदाहरण के लिए, हाइड्रॉक्सी-, फ्लोरो-, एल्काइल-, डिहाइड्रोप्रोलाइन्स, चर अंगूठी आकार और अधिक वाली संरचनाओं जैसे एनालॉग संरचनाओं के साथ जीवाणु संस्कृतियों की आपूर्ति करना संभव है, इस प्रकार विशिष्ट प्रोलाइन अवशेष परिवर्तनों वाले प्रोटीन के उत्पादन की सुविधा प्रदान करता है।

इस अध्ययन में वर्णित चयनात्मक दबाव निगमन (एसपीआई) विधि एक वैश्विक, यानी, संबंधित रासायनिक एनालॉग्स के साथ लक्ष्य प्रोटीन में सभी प्रोलाइनों के अवशेष-विशिष्ट प्रतिस्थापन की अनुमति देती है। विधि का महत्व इस तथ्य से परिलक्षित होता है कि एसपीआई सामान्य म्यूटाजेनेसिस तकनीकों के लिए दुर्गम अनुक्रम परिवर्तन बनाने की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, यह एक लक्ष्य प्रोटीन के उत्पादन की अनुमति देता है जिसमें छोटे संरचनात्मक परिवर्तन होते हैं जो आमतौर पर एक या दो परमाणु प्रतिस्थापन / विलोपन / परिवर्धन से अधिक नहीं हो सकते हैं, जैसा कि इस अध्ययन में दिखाया गया है। इस तरह के प्रोटीन संशोधनों को "परमाणु उत्परिवर्तन" 73,74 कहा जाता है। जीएफपी जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन में, इस आणविक घुसपैठ का परिणाम तह, स्थानीय ध्रुवीयता, प्रोटीन पैकिंग, शामिल संरचनात्मक विशेषताओं की स्थिरता के वेग में देखा जा सकता है। अवशोषण और प्रतिदीप्ति गुणों में परिवर्तन अप्रत्यक्ष रूप से प्रोटीन तह और अवशेष माइक्रोएन्वायरमेंट पर प्रभाव के कारण उत्पादित होते हैं। एसपीआई द्वारा किए गए आणविक परिवर्तनों की सटीकता आमतौर पर अन्य विहित अवशेषों के लिए प्रोलाइन के उत्परिवर्तन की तुलना में बहुत अधिक होती है, उत्तरार्द्ध आमतौर पर प्रोटीन तह, उत्पादन और अलगाव के लिए हानिकारक होता है।

एक उत्पादन विधि के रूप में, एसपीआई दृष्टिकोण देशी अमीनो एसिड के रासायनिक एनालॉग्स की ओर एमिनोएसिल-टीआरएनए सिंथेटेज पॉकेट की सब्सट्रेट सहिष्णुता का उपयोग करता है। सिंथेटेज अमीनो एसिड संरचना की सही पहचान के लिए जिम्मेदार है, जबकि प्रोटीन में निगमन अनुवाद प्रक्रिया में डाउनस्ट्रीम होता है। Instrumentally, एसपीआई में प्रोटीन उत्पादन, अलगाव, और शुद्धिकरण किसी भी अन्य पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति तकनीकों के लिए विशिष्ट तरीके से किया जाता है; हालांकि, प्रोटोकॉल में कुछ परिवर्धन के साथ निम्नानुसार: प्रोलाइन, जो प्रतिस्थापन के लिए बाध्य है, किण्वन प्रक्रिया की शुरुआत में प्रदान किया जाता है, जैसे कि कोशिकाएं बढ़ सकती हैं और अपनी बरकरार सेलुलर मशीनरी विकसित कर सकती हैं। हालांकि, कोशिका संस्कृति को अधिकतम ऑप्टिकल घनत्व तक पहुंचने की अनुमति नहीं है, ताकि कोशिकाओं को लॉगरिदमिक चरण में प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए इष्टतम रखा जा सके। इस बिंदु पर एसपीआई विधि के दो प्रमुख रूप हैं। पहले एक में, प्रोलाइन की एकाग्रता को प्रारंभिक विकास माध्यम (एक रासायनिक रूप से परिभाषित माध्यम) में समायोजित किया जाता है जैसे कि प्रोलाइन की कमी किसी भी बाहरी घुसपैठ के बिना होती है। कोशिकाएं लॉगरिदमिक विकास चरण से बाहर निकलने से पहले माध्यम में प्रोलाइन को समाप्त कर देती हैं, और फिर, बाद में, एनालॉग जोड़ा जाता है, और ब्याज उत्पादन का प्रोटीन प्रेरित होता है। विधि के दूसरे संस्करण में, कोशिकाओं को उनके लॉगरिदमिक चरण के मध्य तक प्रोलाइन युक्त माध्यम में उगाया जाता है। इस बिंदु पर, कोशिकाओं को बाहर निकाला जाना चाहिए और शारीरिक रूप से किसी अन्य माध्यम में स्थानांतरित किया जाना चाहिए, जिसमें अब प्रोलाइन नहीं है, केवल एनालॉग, ब्याज के प्रोटीन के बाद के प्रेरण के साथ। दोनों संस्करणों में, एनालॉग और प्रोटीन प्रेरण अभिकर्मक पूर्व-विकसित कोशिकाओं को प्रदान किए जाते हैं। जंगली-प्रकार के प्रोटीन का अलगाव और शुद्धिकरण उसी तरह से किया जाता है जैसे कि वेरिएंट के लिए। सिद्धांत रूप में, प्रत्येक उपलब्ध प्रो-ऑक्सोट्रोफिक स्ट्रेन का उपयोग अभिव्यक्ति मेजबान के रूप में किया जा सकता है। फिर भी, सबसे उपयुक्त मेजबान की पहचान करने के लिए अभिव्यक्ति परीक्षण ों की सलाह दी जाती है। इसके अलावा, विभिन्न रासायनिक रूप से परिभाषित मीडिया के परीक्षणों का उपयोग प्रोटीन उपज को अनुकूलित करने के लिए किया जा सकता है।

रासायनिक एनालॉग्स के बारे में कुछ आवश्यकताएं हैं जिन्हें एसपीआई के लिए विचार करने की आवश्यकता है, जैसे कि घुलनशीलता और एकाग्रता। अमीनो एसिड की चयापचय उपलब्धता और अपटेक माध्यम में भंग अणुओं की संख्या पर निर्भर करता है। किसी विशेष यौगिक की घुलनशीलता बढ़ाने के लिए, थोड़ा अम्लीय या क्षारीय स्थितियों को चुना जा सकता है। चूंकि कृत्रिम अणु अपने सेल विषाक्तता के कारण विकास निरोधात्मक प्रभाव पैदा कर सकते हैं, इसलिए कोशिका तनाव से बचने के लिए एकाग्रता को कम से कम किया जाना चाहिए75।

एसपीआई की एक मामूली कमजोरी बड़ी संख्या में पदों के साथ निगमन दक्षता में कमी है जिसे आदान-प्रदान करने की आवश्यकता है। सिद्धांत रूप में, साइट-निर्देशित म्यूटाजेनेसिस द्वारा लक्ष्य बायोमोलेक्यूल के भीतर अमीनो एसिड आवृत्ति में कमी इस समस्या को हल कर सकती है। हालांकि, वांछित प्रोटीन के संरचनात्मक और कार्यात्मक गुण प्राथमिक संरचना को बदलने से प्रभावित हो सकते हैं।

जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, एसपीआई विहित अमीनो एसिड के अवशेष-विशिष्ट प्रतिस्थापन की अनुमति देता है। इसका तात्पर्य यह है कि गैर-विहित अमीनो एसिड को लक्ष्य प्रोटीन के भीतर विहित अमीनो एसिड की हर स्थिति में डाला जाता है, जिसमें संरक्षित अवशेष शामिल हैं जो प्रोटीन फ़ंक्शन या तह के लिए अपरिहार्य हैं। साइट-विशिष्ट निगमन के लिए वैकल्पिक विधियाँ इस मुद्दे को दूर करने की एकमात्र संभावनाहैं। पिछले कुछ दशकों में, ऑर्थोगोनल जोड़ी विधि विकसित की गई है जो पूर्वनिर्धारित साइटों पर संशोधित अवशेषों वाले प्रोटीन का उत्पादन कर सकती है। इस विधि के सबसे आम संशोधन को स्टॉप कोडोन दमन के रूप में जाना जाता है। यह विधि सिंथेटिक अमीनो एसिड76 के साइट-विशिष्ट निगमन के लिए समर्पित एक इंजीनियर ऑर्थोगोनल अनुवाद प्रणाली पर आधारित है। विभिन्न साइड-चेन संशोधनों के साथ 200 से अधिक अमीनो एसिड को इस दृष्टिकोण77 का उपयोग करके आज तक प्रोटीन में शामिल किया गया है। हालांकि, ये अनुवाद प्रणालियां अभी भी लक्ष्य प्रोटीन में प्रोलाइन एनालॉग्स के सम्मिलन के लिए उपयुक्त नहीं हैं। इसके अलावा, विधि के प्रदर्शन को मामूली अमीनो एसिड संशोधनों के मामले में कम माना जाता है क्योंकि एमिनोएसिल-टीआरएनए सिंथेटेस की कुछ पृष्ठभूमि संकीर्णता आमतौर पर इंजीनियर अनुवाद प्रणालियों में रहती है।

एसपीआई का उपयोग करके, हमने कई β-बैरल फ्लोरोसेंट प्रोटीन वेरिएंट का उत्पादन किया और इसके अप्राकृतिक एनालॉग्स के साथ प्रोलाइन के आदान-प्रदान के परिणामों का अध्ययन किया। आर-एफएलपी और डीएफपी के साथ प्रोलाइन प्रतिस्थापन के मामले में, अभिव्यक्ति मेजबान द्वारा एक बेकार प्रोटीन का उत्पादन किया गया था। प्रभाव संभवतः प्रोटीन misfolding द्वारा उत्पादित किया जाता है। उत्तरार्द्ध आर-एफएलपी द्वारा प्रचारित सी 4-एक्सो संरचना से उत्पन्न हो सकता है, जो मूल प्रोटीन संरचनाओं27 द्वारा प्रतिकूल है। Dfp के साथ, misfolding प्रोलाइन अवशेष27 पर ट्रांस-टू-सीआईएस पेप्टाइड बॉन्ड आइसोमेराइजेशन के कम वेग से उत्पादित होने की संभावना है। उत्तरार्द्ध को प्रोटीन तह के गतिज प्रोफ़ाइल में सीमित चरणों में से एक माना जाता है जो β-बैरल गठन और बाद में क्रोमोफोर परिपक्वता को प्रभावित करता है। दरअसल, दोनों अमीनो एसिड, आर-एफएलपी और डीएफपी के लिए, प्रोटीन उत्पादन के परिणामस्वरूप एक एकत्रित और अघुलनशील प्रोटीन हुआ। नतीजतन, क्रोमोफोर गठन नहीं हो सका, और प्रतिदीप्ति पूरी तरह से खो गई थी। एस-एफएलपी और डीएचपी के साथ, हालांकि, उचित प्रोटीन परिपक्वता देखी गई थी, जिसके परिणामस्वरूप प्रत्येक एनालॉग / प्रोटीन संयोजन के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन नमूने थे। प्रोटीन के अवशोषण और प्रतिदीप्ति विशेषताओं में कुछ मॉडुलन के बावजूद, ये काफी हद तक जंगली-प्रकार के प्रोटीन के समान बने रहे। एमिनो एसिड प्रतिस्थापन का प्रभाव refolding कैनेटीक्स अध्ययन में पता चला था। उत्तरार्द्ध ने S-Flp के साथ प्रतिस्थापन के मामले में तेजी से refolding दिखाया। मॉडल अध्ययनों से पता चला है कि यह अवशेष ट्रांस-टू-सीआईएस एमाइड रोटेशन वेग में कुछ सुधार उत्पन्न कर सकता है और सी 4-एंडो संरचना के गठन का कारण बन सकता है। इन दोनों कारकों के ईजीएफपी में इस अवशेषों के लाभकारी गतिज प्रभावों में योगदान करने की संभावना है। इसके विपरीत, डीएचपी ने मूल प्रोटीन के समान अधिकतम गतिज तह प्रोफाइल का उत्पादन किया। जांच किए गए फ्लोरोसेंट प्रोटीन में केवल परमाणु उत्परिवर्तन द्वारा उत्पादित परिणामों की विविधता लक्ष्य प्रोटीन गुणों को बदलने में एसपीआई उत्पादन विधि की क्षमता को दर्शाती है। एनालॉग्स के साथ प्रोलाइन प्रतिस्थापन द्वारा प्रेरित प्रोटीन परिवर्तनों का एंजाइमों78,79,80 और आयन चैनलों81,82 की इंजीनियरिंग में और अधिक प्रभाव पड़ता है, साथ ही साथ प्रोटीन स्थिरता के सामान्य इंजीनियरिंग में भी।

एसपीआई विधि की मूल सीमा प्रोलाइन के आदान-प्रदान में इसकी "सभी-या-कोई नहीं" मोड संबंधित एनालॉग्स के साथ रहती है। यह ठीक से चयन करने में सक्षम होने के लिए बहुत फायदेमंद होगा, जो प्रोलाइन अवशेषों को एनालॉग्स के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए, और कौन से लोगों को असंशोधित रहना चाहिए। हालांकि, वर्तमान में, ऐसी कोई तकनीक नहीं है जो माइक्रोबियल उत्पादन मेजबान का उपयोग करके इस तरह के परिष्कृत उत्पादन का प्रदर्शन कर सके। प्रोटीन का रासायनिक संश्लेषण83,84, साथ ही साथ सेल-मुक्त उत्पादन85,86, दो वैकल्पिक तरीके हैं जो स्थिति-विशिष्ट प्रोलाइन संशोधनों का उत्पादन कर सकते हैं। फिर भी, उनकी परिचालन जटिलता और कम उत्पादन पैदावार उन्हें जीवित कोशिकाओं में उत्पादन की तुलना में कम बनाती है। अब तक, एसपीआई परमाणु उत्परिवर्तन वाले जटिल प्रोटीन के उत्पादन के लिए सबसे अधिक परिचालन रूप से सरल और मजबूत दृष्टिकोण बना हुआ है। अप्राकृतिक अमीनो एसिड विकल्प पेश करके, विधि एक लक्षित तरीके से प्रोटीन सुविधाओं को संशोधित करने की अनुमति देती है, जैसा कि प्रोलाइन प्रतिस्थापन द्वारा उत्पन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन के तह और प्रकाश अवशोषण / उत्सर्जन में परिवर्तन द्वारा यहां उदाहरण दिया गया है।

Disclosures

लेखकों ने सभी और हितों के किसी भी संघर्ष का खुलासा किया है।

Acknowledgments

इस काम को जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (उत्कृष्टता का क्लस्टर "उत्प्रेरण में एकीकृत प्रणाली) द्वारा टीएफ और एनबी और संघीय शिक्षा और विज्ञान मंत्रालय (बीएमबीएफ कार्यक्रम "एचएसपी 2020", टीयू-डब्ल्यूएमआईएमआईपीस प्रोजेक्ट सिंटीयूबायो) द्वारा एफ-जेएस के लिए समर्थित किया गया था। और T.M.T.T.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile VWR HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642 LC-MS grade required
Acrylamide and bisacrylamide aqueous stock solution at a ratio of 37.5:1 (ROTIPHORESE Gel 30) Carl Roth 3029.1
Agar-agar Carl Roth 5210
Ammonium molybdate ((NH4)2MoO4) Sigma-Aldrich 277908
Ammonium peroxydisulphate (APS) Carl Roth 9592.2 ≥98 %, p.a., ACS grade required
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) Sigma-Aldrich A4418
Ampicillin sodium salt Carl Roth K029
Biotin Sigma-Aldrich B4501
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670
Coomassie Brillant Blue R 250 Carl Roth 3862
Copper sulfate (CuSO4) Carl Roth CP86.1
D-glucose Carl Roth 6780
1,2-Bis-(dimethylamino)-ethane, N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3 ≥99 %, p.a., for electrophoresis
1,4-dithiothreitol (DTT) Carl Roth 6908
Dichloromethane (DCM) Sigma-Aldrich 270997
di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4) Carl Roth P749.1
di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) Carl Roth X987
DNase I Sigma-Aldrich D5025
Dowex 50WX8-100 (hydrogen form) Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, U.S.A.) 10731181 cation exchange resin
Ethanol Carl Roth 9065.1
Formic acid VWR HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865 LC-MS grade required
Glacial acetic acid Carl Roth 3738.5 100 %, p. a.
Glycerol Carl Roth 3783
Imidazole Carl Roth X998
Hydrogen chlroide (HCl) Merck 295426
Iron(II) chloride (FeCl2) Sigma-Aldrich 380024
Isopropanol Carl Roth AE73.1
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I6758
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876
Magnesium chloride (MgCl2) Carl Roth KK36.1
Magnesium sulfate (MgSO4) Carl Roth 8283.2
Manganese chloride (MnCl2) Sigma-Aldrich 63535
β-mercaptoethanol Carl Roth 4227.3
PageRuler Unstained Protein Ladder Thermo Fisher Scientific 26614
Potassium chloride (KCl) Carl Roth 6781.3
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655
RNase A Carl Roth 7156
Sodium chloride (NaCl) Carl Roth P029
Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) Carl Roth T879
Sodium dodecyl sulphate (NaC12H25SO4) Carl Roth 0183
Thiamine Sigma-Aldrich T4625
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma-Aldrich T6508
Tris hydrochloride (Tris-HCl) Sigma-Aldrich 857645
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris) Carl Roth 5429
Tryptone Carl Roth 8952
Yeast extract Carl Roth 2363
Zinc chloride (ZnCl2) Sigma-Aldrich 229997
L-alanine Sigma-Aldrich A7627
L-arginine Sigma-Aldrich A5006
L-asparagine Sigma-Aldrich A8381
L-aspartic acid Sigma-Aldrich A0884
L-cysteine Sigma-Aldrich C7352
L-glutamic acid Sigma-Aldrich G2128
L-glutamine Sigma-Aldrich G3126
L-glycine Sigma-Aldrich G7126
L-histidine Sigma-Aldrich H8000
L-isoleucine Sigma-Aldrich I2752
L-leucine Sigma-Aldrich L8000
L-lysine Sigma-Aldrich L5501
L-methionine Sigma-Aldrich M9625
L-phenylalanine Sigma-Aldrich P2126
L-proline Sigma-Aldrich P0380
L-serine Sigma-Aldrich S4500
L-threonine Sigma-Aldrich T8625
L-tryptophan Sigma-Aldrich T0254
L-tyrosine Sigma-Aldrich T3754
L-valine Sigma-Aldrich V0500
(4S)-fluoroproline Bachem 4033274 Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression.
(4R)-fluoroproline Bachem 4033275 Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression
3,4-dehydroproline Bachem 4003545 Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression
4,4-difluoroproline Enamine EN400-17448 Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression
Conical polystyrene (Falcon) tubes, 15 mL Fisher Scientific 14-959-49B
Conical polystyrene (Falcon) tubes, 50 mL Fisher Scientific 14-432-22
Dialysis membrane, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000 Spectrum Medical Industries Spectra/Por MWCO 5000 dialysis membrane, 133198
Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) column 1 mL, Ni-NTA GE Healthcare HisTrap HP, 1 mL, 17-5247-01
Luer-Lock syringe, 5 mL Carl Roth EP96.1
Luer-Lock syringe, 20 mL Carl Roth T550.1
Luer-Lock syringe, 50 mL Carl Roth T552.1
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL Eppendorf 30120086
Petri dishes (polystyrene, sterile) Carl Roth TA19
pQE-80L plasmid vector Qiagen no longer available replaced by N-terminus pQE Vector set Cat No./ID: 32915
Pro-auxotrophic E. coli strain JM83 Addgene 50348 https://www.addgene.org/50348/
Pro-auxotrophic E. coli strain JM83 ATCC 35607
Round-bottom polystyrene tubes, 14 mL Fisher Scientific Corning Falcon, 14-959-1B
Syringe filter 0.45 µm with polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Carl Roth CCY1.1
High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) column for LC-ESI-TOF-MS Sigma-Aldrich Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC column, 3 µm particle size, 10 cm x 2.1 mm with conical 0.1 mL glass inserts, screw caps and septa
HPLC autosampler vials 1.5 mL Sigma-Aldrich Supelco 854165
Mass spectrometer for LC-ESI-TOF-MS Agilent Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF
Mass spectrometry data analysis software Agilent MassHunter Qualitative Analysis software v. B.06.00
Benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes Eppendorf 5427 R
Cooling centrifuge for 50 mL Falcon tubes Eppendorf 5810 R
Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system GE Healthcare ÄKTA pure 25 L
Fluorescence spectrometer Perkin Elmer LS 55
High pressure microfluidizer for bacterial cell disruption Microfluidics LM series with “Z” type chamber
Orbital shaker for bacterial cultivation Infors HT Minitron
Peristaltic pump for liquid chromatography (LC) GE Healthcare P-1
Ultrasonic homogenizer for bacterial cell disruption Omnilab Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182 with MS72 sonifier tip
UV-Vis spectrophotometer Biochrom ULTROSPEC 2100
UV-Vis/NIR spectrophotometer Perkin Elmer LAMBDA 950 UV/Vis/NIR

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References

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Thi To, T. M., Kubyshkin, V., Schmitt, F. J., Budisa, N., Friedrich, T. Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability. J. Vis. Exp. (180), e63320, doi:10.3791/63320 (2022).

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