Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Ekstraktion og oprensning af FAHD1-protein fra svinenyre og muselever

Published: February 18, 2022 doi: 10.3791/63333
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Research Institute for Biomedical Aging Research, University of Innsbruck

Summary

Denne protokol beskriver, hvordan man ekstraherer fumarylacetoacetathydrolasedomæneholdigt protein 1 (FAHD1) fra svinenyre og muselever. De anførte metoder kan tilpasses andre proteiner af interesse og modificeres til andre væv.

Abstract

Fumarylacetoacetathydrolasedomæneholdigt protein 1 (FAHD1) er det første identificerede medlem af FAH-superfamilien i eukaryoter, der fungerer som oxaloacetatdecarboxylase i mitokondrier. Denne artikel præsenterer en række metoder til ekstraktion og oprensning af FAHD1 fra svinenyre og muselever. Omfattede metoder er ionisk udvekslingskromatografi med hurtig proteinvæskekromatografi (FPLC), præparativ og analytisk gelfiltrering med FPLC og proteomiske tilgange. Efter total proteinekstraktion blev ammoniumsulfatudfældning og ionisk udvekslingskromatografi undersøgt, og FAHD1 blev ekstraheret via en sekventiel strategi ved anvendelse af ionisk udveksling og størrelsesudelukkelseskromatografi. Denne repræsentative tilgang kan tilpasses andre proteiner af interesse (udtrykt i signifikante niveauer) og modificeres til andre væv. Oprenset protein fra væv kan understøtte udviklingen af antistoffer af høj kvalitet og/eller potente og specifikke farmakologiske hæmmere.

Introduction

Det eukaryote FAH-domæneholdige protein 1 (FAHD1) virker som bifunktionelt oxaloacetanat (OAA) decarboxylase (ODx)1 og acylpyruvathydrolase (ApH)2. Det er lokaliseret i mitokondrier2 og tilhører den brede FAH-superfamilie af enzymer 1,2,3,4,5,6. Mens dens ApH-aktivitet kun er af mindre relevans, er ODx-aktiviteten af FAHD1 involveret i reguleringen af TCA-cyklusfluxen 1,7,8,9. OAA er ikke kun nødvendig for den centrale citratsyntasereaktion i tricarboxylsyrecyklussen, men fungerer også som en konkurrencedygtig hæmmer af succinatdehydrogenase som en del af elektrontransportsystemet og som en kataplerotisk metabolit. Nedregulering af FAHD1-genekspression i humane navlestrengsendotelceller (HUVEC) resulterede i en signifikant reduktion i hastigheden af celleproliferation10 og signifikant hæmning af mitokondriemembranpotentiale forbundet med en samtidig skift til glykolyse. Arbejdsmodellen refererer til mitokondriel dysfunktion associeret ældning (MiDAS)11-lignende fænotype8, hvor mitokondrielle OAA-niveauer er tæt reguleret af FAHD1-aktivitet 1,8,9.

Rekombinant protein er lettere at opnå via ekspression og oprensning fra bakterier12 snarere end fra væv. Imidlertid kan et protein udtrykt i bakterier være forudindtaget af mulig mangel på post-translationelle modifikationer eller kan simpelthen være problematisk (dvs. på grund af plasmidtab, bakterielle stressresponser, forvrængede / uformede disulfidbindinger, ingen eller dårlig sekretion, proteinaggregering, proteolytisk spaltning osv.). Til visse anvendelser skal protein udtages fra cellelysat eller væv for at inkludere sådanne ændringer og/eller for at udelukke mulige artefakter. Oprenset protein fra væv understøtter udviklingen af antistoffer af høj kvalitet og/eller potente og specifikke farmakologiske hæmmere for udvalgte enzymer, f.eks. for FAHD113.

Dette manuskript præsenterer en række metoder til ekstraktion og oprensning af FAHD1 fra svinenyre og muselever. De beskrevne metoder kræver hurtig proteinvæskekromatografi (FPLC), men bruger ellers almindeligt laboratorieudstyr. Alternative metoder kan findes andre steder 14,15,16,17. Efter total proteinekstraktion involverer den foreslåede protokol en testfase, hvor underprotokoller for ammoniumsulfatudfældning og ionbytningskromatografi diskuteres (figur 1). Efter at have defineret disse underprotokoller ekstraheres proteinet af interesse via en sekventiel strategi ved hjælp af ionisk udveksling og størrelsesudelukkelseskromatografi med FPLC. På grundlag af disse retningslinjer kan slutprotokollen tilpasses individuelt til andre proteiner af interesse.

Figure 1
Figur 1: Den overordnede strategi for denne protokol. Fra top til bund: Protein ekstraheres fra væv. Vævshomogenat fremstilles, centrifugeres og filtreres. For hvert par prøver af supernatant og pelletsafledte skal der udføres test for ammoniumsulfatudfældning og ionisk udvekslingskromatografi (FPLC) for at undersøge optimale betingelser. Efter fastlæggelse af disse underprotokoller kan proteinet ekstraheres via en sekventiel procedure for ammoniumsulfatudfældning, ionisk udvekslingskromatografi og repetitiv størrelseseksklusionskromatografi (FPLC) ved varierende pH- og saltkoncentrationer. Alle trin skal styres af western blot. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer. Svinenyre blev opnået frisk fra det lokale supermarked. Levervæv blev høstet fra C57BL6 vildtypemus opretholdt ved Institut for Biomedicinsk Aldringsforskning ved Innsbruck Universitet, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Østrig under tilsyn af Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr, omfattet af etisk tilladelse som projektleder udstedt i 2013 (BMWF-66.008/0007-II/3b/2013). Vedligeholdelse og brug af musene til projektet er omfattet af etisk tilladelse nr. 2020-0.242.978 fra 5. maj 2020, udstedt af det østrigske ministerium for uddannelse, videnskab og forskning (BMBWF).

1. Præparater

BEMÆRK: Før protokollen starter, skal der forberedes flere ting, dvs. proteinlysebufferen, råvævsprøven og et specifikt antistof ud over generelle kemikalier og materialer.

  1. 250 ml proteinlysebuffer forberedes pr. 100 g nettovægt af væv: 250 ml 1x PBS med 50 mM NaF, 1 mM PMSF, 2 μg/ml aprotinin og 1 mM aktiveret orthovanadat (se tabel 1). Opløsningen filtreres ved hjælp af en 0,22 μm sprøjtefilterenhed.
    BEMÆRK: Aktivering af orthovanadat er påkrævet før brug for at omdanne det til en mere potent hæmmer af protein tyrosinphosphataser18. Aktiveret orthovanadat kan fås fra kommercielle leverandører, men også udarbejdes som følger.
    1. Der fremstilles en 200 mM stamopløsning af (natrium)orthovanadat iddH20. Til fremstilling af 10 ml opløsning tilsættes 368 mg Na3VO4 til 9 ml vand og opløses under omrøring. Når det er opløst, fyldes volumenet til 10 ml med ddH2O.
      BEMÆRK: Start-pH-værdien i natriumortvanadatopløsningen kan variere med materialekilden, og pH-værdien skal justeres til 10 i en gentagen tilgang som følger.
    2. Afhængigt af opløsningens oprindelige pH justeres pH til 10 med NaOH eller HCI. Ved pH > 10 vil opløsningen have en gul farve. Kog opløsningen, indtil den bliver farveløs, afkøl den ned til stuetemperatur, og kontroller pH-værdien. Hvis pH er >10, tilsættes et lille volumen HCI for at justere pH til 10. På dette tidspunkt kan opløsningen blive gul igen.
    3. Gentag kogningen og afkølingen, indtil opløsningen forbliver farveløs, og pH stabiliseres ved 10 (ca. 5-7 gange). På dette tidspunkt resulterer tilsætning af HCI i et svagt udseende af gul farve i opløsningen. Opbevar aktiveret orthovanadat i 1 ml alikvoter ved -20 °C.
  2. Forbered rør med 2 ml lysisbuffer pr. Gram væv og læg dem på is.
    BEMÆRK: Denne protokol brugte otte 50 ml rør, hver fyldt med 30 ml lysisbuffer i alt for en svinenyre (ca. 100-150 g) og to rør hver fyldt med 40 ml lysisbuffer til 20 muselever (hver 1-2 g) i alt.
  3. Forbered vævet: disseker vævet på en forrenset glasplade anbragt på is i en polystyrenskumkasse. Skær vævsstykker på ca. 100 mg hver, der let kan overføres til respektive rør til efterfølgende lysis. Overfør vævsstykkerne til de forberedte rør (trin 1.2).
  4. Der fremstilles en mættet ammoniumsulfatopløsning: Opvarm 500 mlddH20til 70 °C, og under omrøring tilsættes ammoniumsulfatpulver gradvist (se materialetabellen), indtil der ikke er opløst mere ammoniumsulfat. Afkøl denne (over)mættede opløsning til stuetemperatur og opbevar den ved 4 °C natten over.

2. Samlet proteinekstraktion

BEMÆRK Efter forberedelse af prøven i koldproteinlysebuffer (se trin 1.3), homogeniser vævet så godt som muligt via sonikering ved hjælp af en ultralydssonde eller ved hjælp af en elektrisk homogenisator som følger.

  1. Homogenisering af væv
    1. I tilfælde af en svinenyre sonikere suspensionen fortrinsvis af en ultralydssonde, mens prøven holdes på is (10 cyklusser på 15 s puls, med intervaller på 30 s mellem impulserne for at afkøle prøven på is, ved medium amplitude med 50% arbejdscyklus).
    2. I tilfælde af museorganer homogeniseres suspensionen ved hjælp af en elektrisk homogenisator (startende med en lav kraft og langsomt accelererende til medium kraft), mens prøven holdes på is. Vask regelmæssigt den elektriske homogenisator i PBS for at fjerne organisk materiale, der tilstopper enheden.
    3. Tag 20 μL ud af prøverne og kontroller under mikroskopet, om cellerne i det homogeniserede væv er korrekt ødelagt; Ellers gentag homogeniseringen.
  2. Centrifugering af rørene i en bordpladecentrifuge ved 10.000 x g i 30 minutter ved 4 °C.
    BEMÆRK: Eventuelt centrifugeres supernatanten en anden gang ved 20.000 x g i 30 minutter ved 4 °C for at eliminere små brøkdele af den oprindelige pellet, der kan være blevet overført. Dette vil forenkle den efterfølgende filtrering i trin 2.3.
  3. Saml supernatanten i et frisk rør og læg det på is. Filtrer sekventielt supernatanten ved hjælp af 0,45 μm og 0,22 μm sprøjtefilterenheder. Supernatanten aliciterers i 10 ml batcher og fryses ved -20 °C til kortvarig opbevaring eller ved -80 °C til længere opbevaring.
    BEMÆRK: Forfiltrering med 0,45 μm fjerner størstedelen af partiklerne, før et andet filtreringstrin med 0,22 μm fjerner de finere partikler. Brug af 0,22 μm filteret direkte kan medføre risiko for tilstopning af filtrene.
  4. Der udredes en prøve på 50 μL til SDS-PAGE/western blot-analyse ved at tilsætte 10 μL 5x SDS-prøvebuffer (se tabel 1) til 40 μL af supernatanten og derefter koge ved 95 °C i 10 minutter.
    1. Eventuelt skal du genbruge ca. 100 μL pellet opnået i trin 2.2 i 900 μLddH20og forberede en prøve til SDS-PAGE/western blot-analyse som beskrevet ovenfor.
      BEMÆRK: Inkludering af pelletsafledte prøver i western blot-analysen ud over den positive kontrol vil indikere, om ekspressionen af proteinet er lav, eller antistoffet er problematisk.

3. SDS-PAGE og western blot analyse

BEMÆRK: Western blot-analyse er nødvendig for at kontrollere for proteinopløselighed. I det følgende beskrives en protokol til elektroblotting ved hjælp af et våd-/tankpletsystem (se tabel over materialer). En alternativ protokol for SDS-PAGE kan findes andetsteds19.

  1. Forbered en diskontinuerlig 12,5% polyacrylamid SDS-PAGE gel i henhold til producentens anvisninger (dvs. en stablingsgel oven på en opløsningsgel; se tabel 1). Kør de prøver, der tidligere blev forberedt under trin 2 (svarende til trin 4, 5 og 6; se nedenfor).
    1. Læg en proteinmarkørstige i den første brønd (se Tabel over materialer). Læg 5 ng hFAHD1 rekombinant protein (opnået fra bakterier12; se tabel 1) som en positiv kontrol i den anden brønd.
    2. Derefter indlæses 20 μL af den prøve, der skal analyseres, og alle de resterende brønde fyldes med 20 μL forberedt SDS-PAGE 1x prøvebuffer (dvs. 5x prøvebuffer fortyndet medddH20). Kør SDS-PAGE gelerne ved 125 V ved hjælp af den SDS-kørende buffer (se tabel 1).
  2. Når SDS-PAGE er afsluttet, skal du udføre en western blot-analyse og undersøge membranerne ved hjælp af det tilgængelige antistof hævet mod FAHD1 (se tabel 1).
    BEMÆRK: Da prøverne er taget fra råvævshomogenat, er kvaliteten af SDS-PAGE og western blot-analysen på dette tidspunkt normalt kompromitteret; Det er dog vigtigt at kontrollere, om proteinet, der skal ekstraheres, er opløseligt i supernatanten. Følgende protokol blev testet for svinenyre og forskellige museorganer, herunder lever, hjerte, hjerne og nyre.
    1. Forbered 10x western blot-overførselsbufferen (se tabel 1). Forbered 1x western blot transfer buffer (se tabel 1) og afkøl den til 4 °C.
    2. Aktivér en PVDF-membran i 2 minutter i methanol. Vask membranen i ddH2O i 2 min. Ligevægt membranen i 15 minutter i 1x western blot transfer buffer.
    3. Vask SDS-gelen med 1x PBS i 10 minutter, mens du ryster for at fjerne SDS-løbebufferen, og inkuber derefter gelen i 1x western blot transfer buffer i 10 min for ligevægt. Saml elektroblottingkassetten (dvs. kombiner den aktiverede PVDF-membran og geler) i henhold til producentens anvisninger.
    4. Kør pletten via elektroblotting ved 300 mA i 1 time i en polystyrenskumkasse fyldt med is eller i kølerummet (4 °C). Overfør PVDF-membranen til et 50 ml rør med den udsatte side vendt mod rørets inderside. Inkubere membranen i 20 ml western blot-blokerende buffer (se tabel 1) natten over ved 4 °C, mens du ruller på en rørrulle (se materialetabel).
    5. Den næste dag vaskes membranen i 5 minutter med 20 ml western blot vaskebuffer (PBS med 0,1% (v / v) Tween 20) i det samme rør, mens du ruller. Inkubere membranen i samme rør med det primære antistof2 (rettet mod FAHD1; se tabel 1) fortyndet 1:500 i western blot blokerende buffer i 1 time ved stuetemperatur under rulning.
    6. Vask membranen i det samme rør tre gange i 10 minutter hver med 20 ml western blot vaskebuffer under rullning. Inkubere membranen i 30 minutter ved stuetemperatur med HRP-konjugeret sekundært antistof (se tabel over materialer) fortyndet 1:3000 i 5 ml western blot-blokerende buffer.
    7. Vask membranen i det samme rør tre gange i 10 minutter hver med 20 ml western blot vaskebuffer og to gange i 5 minutter hver med 1x PBS. Tør membranen ved forsigtigt at holde den med en pincet på den ene kant og ved at røre ved et stykke cellulose eller et stykke Whatman-papir med den modsatte (nederste) kant af membranen. Sæt membranen (udsat side op) på en rengjort glasplade.
    8. Dæk forsigtigt hele membranen med 1 ml forberedt ECL western blot substrat ved hjælp af en pipette, og pas på ikke at skabe luftbobler. Lad ECL-opløsningen inkubere i 3 minutter, og udvikl straks membranen ved hjælp af røntgenfilm eller ved hjælp af et billeddannelsessystem.
      BEMÆRK: Hvis proteinet blev påvist i ingen af prøverne, men kun i den positive kontrol, kan dette tyde på, at proteinet er uopløseligt eller ikke er til stede i tilstrækkelige mængder til at blive detekteret af antistoffet. Hvis kun nanogram af den positive kontrol blev indlæst, er det første scenario mere sandsynligt. Hvis der slet ikke blev påvist noget protein, skal du kontrollere kvaliteten af antistoffet og måske skifte til et polyklonalt antistof snarere end et monoklonalt antistof. I sjældne tilfælde, dvs. for nogle hydrofobe proteiner, kan proteinet påvises efter centrifugering, men ikke efter filtrering. I et sådant tilfælde anbefales det at anvende specielle filterenheder til hydrofobe proteiner.
  3. Eventuelt skal PVDF-membranerne plettes efter western blot for at kontrollere den vellykkede overførsel af proteinet fra SDS-PAGE-gelen til PVDF-membranen.
    BEMÆRK: Coomassie-farvning anbefales til fejlfinding, metodeudvikling og dokumentation, men husk, at membraner efter anvendelse af denne protokol går tabt til yderligere western blot-analyse. Ponceau S-farvning giver svagere farvning, men kan anvendes, hvis membranerne skal undersøges igen.
    1. Forbered små bakker indeholdende farvning (Coomassie eller Ponceau S) og affarvningsopløsninger.
    2. Brug pincet til at sætte membranen i farvningsopløsningen og ryst forsigtigt, indtil membranen er farvet godt (5-10 min).
    3. Overfør membranen til den afholdende opløsning og ryst, indtil opløsningen er mættet (5-10 min). Gentag affarvningstrinnet, indtil proteinbåndene kan observeres på membranen; Hvis der slet ikke observeres nogen bånd, skal du gentage farvningen med en længere inkubationstid. Tør membranen ved at placere den på en glasplade ved hjælp af pincet.

4. Test: Ammoniumsulfatudfældning

BEMÆRK: Ammoniumsulfatudfældning er en metode til proteinrensning ved at ændre proteinets opløselighed. I et indledende forsøg øges ammoniumsulfatkoncentrationen sekventielt til en værdi, der udfælder en maksimal mængde proteinforurenende stoffer, mens FAHD1 efterlades i opløsning. Opløseligheden af proteinet undersøges igen via western blot-analyse.

  1. Fortsæt fra trin 2.3: Optø enten en alikvote af prøven eller fortsæt direkte efter proteinekstraktion (dvs. uden at fryse prøven). Prøven filtreres ved hjælp af en filterenhed på 0,22 μm for at udelukke mulige bundfald efter optøning. Forbered seks 1,5 ml rør på is, og overfør 250 μL prøve ind i hvert rør.
  2. Forbered en fortyndingsserie på 5%, 10%, 15%, 20%, 25% og 30% ammoniumsulfat i de ovenfor fremstillede rør, og udgør det endelige volumen til 1000 μL med proteinlysebuffer. Inkubere prøverne ved 4 °C natten over på en rørrotator (se materialetabel).
  3. Ved hjælp af en bordpladecentrifuge centrifugeres ved 10.000 x g i 30 minutter ved 4 °C og overføres forsigtigt alle supernatanterne til separate rør. Lufttør de resulterende pellets og resuspend hver af dem i 1000 μLddH20.
  4. For hvert par resuspended pellet og supernatant fra det foregående trin blandes 40 μL med 10 μL 5x SDS-prøvebuffer og koges ved 95 °C med åbne låg, indtil det meste af væsken er fordampet. Derefter suspenderes pelleten igen i en blanding af 50% DMSO iddH20.
  5. Udfør SDS-PAGE (trin 3), men kør gelerne ved 80 V i 3 timer. For hver koncentration af ammoniumsulfat lægges prøverne fra den resuspenderede pellet og supernatant (trin 4.3) parvis. Udfør en western blot-analyse (trin 3).
  6. Kontroller for den højeste koncentration af ammoniumsulfat, hvor det protein, der skal renses (dvs. FAHD1), forbliver i prøven afledt af supernatanten. Baseret på resultaterne defineres en ammoniumsulfatudfældningsprotokol for proteinet af interesse, der skal anvendes i fremtidige eksperimenter.
    BEMÆRK: Ammoniumsulfat er velkendt for at forvrænge SDS-PAGE og western blot. Efterhånden som koncentrationen af ammoniumsulfat stiger, vil kvaliteten af western blot-analysen blive kompromitteret. Som med trin 3 før anvendes denne analyse imidlertid til at kontrollere opløseligheden af proteinet af interesse ved givne koncentrationer af ammoniumsulfat. Denne protokol har til formål at udfælde andre proteiner, mens proteinet, der skal renses, skal forblive opløseligt.

5. Test: ionisk udvekslingskromatografi med FPLC

BEMÆRK: Molekyler med ladede funktionelle grupper er bundet til en silicapartikelkolonne til FPLC, hvilket muliggør differentiering af proteiner i henhold til deres overfladeladning. Udfør dette trin to gange ved hjælp af kolonnen kationisk udveksling og kolonnen anionisk udveksling (se Tabel over materialer). Protokoltrinnene er de samme for enten kationisk eller anionisk udvekslingskromatografi, men de buffere, der skal anvendes, er forskellige (se tabel 1); begge med "lavt salt" 15 mM NaCl og "højt salt" 1 M NaCl betingelser. For de anvendte kolonner anbefales en strømningshastighed på 1 ml/min.

  1. Konfigurer FPLC-systemet med kolonnen anionisk eller kationisk udveksling. Kolonnen vaskes med 5 kolonnevolumener (CV'er) på 20 % EtOH (iH20) efterfulgt af 5 CV'er af ddH2 O. Alternativt vaskes kolonnen med 1 CV med lav saltbuffer, høj saltbuffer og igen lav saltbuffer i rækkefølgen, indtil der ikke observeres flere toppe i kromatogrammet, men vask mindst én gang.
  2. Efter bestemmelse af den optimale protokol for ammoniumsulfatudfældning i lille skala (trin 4) skal du anvende udfældningsprotokollen på 10 ml originalt vævshomogenat (trin 2). Eventuelt dialyseres prøven mod den lave saltbuffer.
    1. Påfør prøven på kolonnen (f.eks. ved injektion eller ved hjælp af en prøvepumpe), og opsaml gennemstrømningen. Vask søjlen med 1 CV af den lave saltbuffer.
  3. Opret en lineær gradienteluering fra 100% lav saltbuffer / 0% høj saltbuffer til 0% lav saltbuffer / 100% høj saltbuffer inden for 3 CV'er. Opsaml kontinuerligt 1 ml fraktioner. Når gradienten er afsluttet, skal du fortsætte med at køre med den høje saltbuffer, indtil der ikke påvises flere proteinrelaterede toppe (UV-absorption ved 280/255 nm) i kromatogrammet over området 1 CV.
  4. Påfør 1 ml 25% SDS opløst i 0,5 M NaOH (iddH20) for at rengøre søjlen. Fortløbende vaskes søjlen med 3 CV'er af ddH2O og 3 CV'er på 20% EtOH (i ddH2O).
  5. Saml SDS-PAGE-prøver af alle peak-fraktioner og gennemstrømningen, og undersøg dem via western blot for tilstedeværelsen af proteinet af interesse (trin 3). Snap-freeze de opsamlede fraktioner i flydende nitrogen og opbevar dem ved -80 °C.
  6. Når western blot-analysen er afsluttet, optøes og puljes de fraktioner, der indeholder proteinet af interesse, og kasserer de andre. Gentag trin 5.1-5.5 med den alternative kolonne (dvs. kationisk eller anionisk udvekslingskolonne).
  7. Når begge kolonner er blevet undersøgt, skal du definere en FPLC-protokol for proteinet af interesse, der skal bruges i fremtidige eksperimenter. Reducer volumenet af proteinopløsningen ved hjælp af ultracentrifugeringsfilterenheder (10 kDa, se materialetabel) ned til 2 ml.
    BEMÆRK: Der er to forventede resultater af denne serie af eksperimenter. Enten har proteinet af interesse knyttet sig til en af kolonnerne, og proteinopløsningen er allerede ret ren efter eluering, eller proteinet forblev i gennemstrømningen i begge tilfælde. I sidstnævnte scenario, selvom proteinet er i gennemstrømningen, kan rengøringseffekten af dette trin stadig være signifikant. I et sådant tilfælde, som for FAHD1 i svinenyre og muselever, vil dette trin i ionisk udveksling stadig blive udført. Hvis hverken den kationiske eller anioniske udvekslingskolonne kan give en ordentlig rengøringseffekt, kan man forsøge at ændre pH-værdien i lysatet og bufferen og dialysere prøven mod den kørende buffer inden påføring på FPLC.

6. Proteinekstraktion ved hjælp af definerede underprotokoller for ammoniumsulfatudfældning og FPLC

BEMÆRK: Porøse partikler i en silicagelsøjle til FPLC (se materialetabel) muliggør differentiering af proteiner i henhold til deres hydrodynamiske radius. De beskrevne trin skal udføres med et FPLC-system ved hjælp af størrelsesudelukkelseskromatografi (SEC). For den anvendte SEC-kolonne (se Tabel over materialer) anbefales en strømningshastighed på 0,3 ml/min.

  1. Forbered alle de nødvendige materialer (se trin 1), og ekstraher det samlede protein fra vævet (se trin 2). Udfør en ammoniumsulfatudfældning med alt vævshomogenat, der ikke blev anvendt til testning (se trin 4). For større volumener koncentreres lysatet ved hjælp af ultracentrifugeringsfilterenheder (10 kDa; se materialetabel) ned til et mindre volumen på 50 ml eller mindre.
  2. Udfør et første rensningstrin ved hjælp af ionisk udvekslingskromatografi (se trin 5).
    1. Forbered prøver til western blot, som beskrevet i de foregående trin. Udfør western blot-analyse og pool alle FAHD1, der indeholder fraktioner fra ionisk udvekslingskromatografi.
    2. Reducer volumenet af proteinopløsningen ned til 2 ml ved hjælp af ultracentrifugeringsfilterenheder (10 kDa). Filtrer opløsningen sekventielt med 0,45 μm og 0,22 μm sprøjtefilterenheder for at fjerne enhver mikroudfældning.
  3. Ligevægt SEC-kolonnen med 1 CV af SEC-løbende buffer (se tabel 1), der indeholder 1 mM DTT. Læg prøven på søjlen, og kør kromatografien, indtil alle proteinerne er elueret (1-2 CV).
    1. Der indsamles fraktioner på 1 ml af gennemstrømningen, der svarer til signifikante toppe i kromatogrammet (UV-absorption ved 280/255 nm), og der forberedes 50 μL-prøver af hver indsamlet fraktion til SDS-PAGE og western blot-analyse som beskrevet i de foregående trin. Snap-freeze alle fraktionerne ved hjælp af flydende nitrogen, og opbevar dem ved -80 °C.
  4. Vask SEC-kolonnen fortløbende med 1 CV af ddH2O og 1 CV på 20% EtOH (i ddH20). Udfør western-Blot-analyse, og opstømm alle FAHD1-holdige fraktioner. Reducer volumenet af proteinopløsningen ned til 2 ml ved hjælp af ultracentrifugeringsfilterenheder (10 kDa, se materialetabel).
  5. Vurder proteinkoncentrationen ved hjælp af et kommercielt BCA-analysesæt (se materialetabel).
    BEMÆRK: PH- og saltindholdet i den mobile fase kan påvirke elueringsprofilen af kugleformede proteiner20. Sure eller basiske forhold kan resultere i, at toppe er mindre definerede, og at proteinmatrixinteraktioner øges, hvilket fører til delvis tilbageholdelse af protein i kolonne20. Denne effekt kan udnyttes til yderligere proteinrensning. En gentagelse af trin 6 med forskellige strømningshastigheder, pH og saltkoncentrationer kan forbedre proteinets renhed20.

7. Sølvfarvning

BEMÆRK: Sølvfarvningsanalyse af SDS-PAGE geler er påkrævet for at kontrollere for proteinforureninger, der muligvis ikke ses med Coomassie-farvning. Følgende protokol er en blandt mange versioner, der kan findes i litteraturen21. Udfør alle inkubationstrin ved at ryste i en ren glasbakke. Saml alle sølv- og formaldehydholdige væsker i en speciel affaldsbeholder og kassér dem korrekt.

  1. Inkuber SDS-PAGE gelerne i sølvfarvningsfikseringsopløsning (se tabel 1) natten over i kølerummet. Inkuber gelerne i sølvfarvningsinkubationsopløsning (se tabel 1) i 3 timer ved stuetemperatur. Tilsæt eventuelt glutaraldehyd (se tabel 1) for at forbedre påvisningen af svage bånd. Vask gelerne fire gange i ddH2O i 10 minutter hver.
  2. Inkuber gelerne i sølvfarvning sølvopløsning (se tabel 1) i 1 time.
    BEMÆRK: Husk, at fra nu af indeholder alle væsker og selve gelen sølv og formaldehyd, som er giftige.
  3. Inkuber gelerne i sølvfarvningsudvikleropløsning (se tabel 1) med kraftig omrystning, indtil båndene er tydeligt synlige. For at stoppe reaktionen skal udvikleropløsningen kasseres, og gelerne straks inkuberes i sølvfarvningsstopopløsning (se tabel 1) i mindst 10 minutter.
    BEMÆRK: Bånd farvet i trin 7.2 og 7.3 vil konstant blive mere udviklede. Tilsætning af mere formaldehyd til opløsningen end angivet kan være nødvendigt, hvis farvningen er svag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

FAHD1-protein blev ekstraheret fra svinenyre og muselever ved hjælp af den præsenterede protokol. For musevæv kræves flere organer for at opnå flere μg efter det endelige oprensningstrin. Af denne grund fokuserer denne artikel på udvinding af FAHD1 fra svinenyrer, hvilket er et meget mere eksemplarisk eksperiment. Ekstraktionen af FAHD1 fra museleveren udføres for at præsentere vanskelighederne og mulige faldgruber i denne protokol. Det anbefales generelt at bruge organer, der viser et højt ekspressionsniveau af det protein, man ønsker at rense. Human Protein Atlas22 kan være en hjælp til at estimere ekspressionen i modelsystemet, eller man kan udføre indledende western blot-eksperimenter med forskellige råvævslysater for at vurdere disse niveauer. Den positive kontrol, der blev brugt i alle western blot-analyser, var et mærket rekombinant protein, der kørte med en lidt højere molekylvægt.

Som et første forsøg præsenteres ekstraktionen af FAHD1 fra svinenyren. Processen med vævshomogenisering (trin 1) og total proteinekstraktion (trin 2) er præsenteret i supplerende figur 1 (se forklaringen for en beskrivelse af de enkelte trin). En alikvoteret tiendedel af det samlede lysat blev brugt til følgende eksperimenter.

Ammoniumsulfatudfældning blev testet en gang for dette lysat ved at tilsætte ammoniumsulfat til lysatet i forskellige koncentrationer (trin 4) (figur 2). Efter centrifugering blev pellets og supernatanter udtaget og analyseret med western blot ved anvendelse af et defineret polyklonalt antistof2 hævet mod humant FAHD1. 200 ng rekombinant His/S mærket human FAHD1 opnået fra E. coli12 blev indlæst som den positive kontrol. FAHD1-proteinbåndet kan ses ved 25 kDa, mens den mærkede positive kontrol kører ved 34 kDa. Baseret på disse data blev der defineret en protokol, hvor lysatet behandles med 25% ammoniumsulfat, dvs. betingelser, hvor FAHD1 stadig er i supernatanten, mens størstedelen af andre proteiner udfældes. Dette er et stort skridt i rensningsstrategien. Ammoniumsulfatudfældning er et effektivt rengøringstrin, inden du fortsætter med andre metoder. Bemærk, at mængder ammoniumsulfat højere end 30% ikke vil blive anvendt, fordi ammoniumsulfat gradvist forvrænger kvaliteten af SDS-PAGE og western blot.

Figure 2
Figur 2: Ammoniumsulfatudfældning og western blot-screening for svin FAHD1. (A) Ammoniumsulfat blev tilsat lysatet i forskellige koncentrationer (maksimalt 5% til 25%) for at udfælde proteiner fra opløsningen. (B) Tilstedeværelsen af svine FAHD1 (25 kDa) blev bestemt i de enkelte par pellets og supernatant svarende til varierende ammoniumsulfatkoncentrationer via western blot ved anvendelse af et polyklonalt antistof opdrættet mod human FAHD1. Supernatanten svarende til 25% ammoniumsulfatudfældning viser stadig tilstedeværelsen af svine FAHD1 i supernatanten, samtidig med at den udfælder en god mængde andre proteiner. 200 ng af Hans/S-mærket rekombinant protein blev indlæst som en positiv kontrol (34 kDa). Klik her for at se en større version af denne figur.

Efter test af ioniske udvekslingskolonner med FPLC blev der defineret en strategi, hvor svine FAHD1 forbliver i gennemstrømningen af en anionisk udvekslingskromatografi ved pH 9 (trin 5). Begyndende med lysat opnået ved ammoniumsulfatudfældning ved 25% (som defineret ved tidligere testforsøg) blev anionisk udvekslingskromatografi anvendt til at eliminere yderligere proteiner fra opløsningen (figur 3A). Bindende proteiner blev fjernet ved eluering fra kolonnen, mens gennemstrømningen blev yderligere oprenset via SEC ved pH 7,4 (figur 3B). Efter begge trin identificerede western blot-analysen alle de fraktioner, der indeholdt svine FAHD1, der blev samlet og koncentreret til 2 ml.

Figure 3
Figur 3: Oprensning af svin FAHD1 med FPLC - del 1. Røde pile i kromatogrammet og blots angiver tilstedeværelsen af FAHD1. I kromatogrammet betegner "UV" UV-absorptionen ved 280 nm, "Cond" betegner ledningsevnen (relateret til saltkoncentrationen i bufferen), og "Conc B" angiver procentdelen af høj saltbuffer i buffergradienten (0% ren lav saltbuffer; 100% ren højsaltbuffer). (A) Oprensning af svine FAHD1 fra lysat opnået ved ammoniumsulfatudfældning ved 25% med en anionisk udvekslingskolonne (FPLC). Mens mange proteiner binder sig til søjlen, findes svine FAHD1 i gennemstrømningen. Snavs og ikke-proteinforurenende stoffer fjernes ved eluering fra søjlen, mens gennemstrømningen behandles yderligere. (B) Gennemstrømning fra den tidligere anioniske udvekslingskromatografi i (A) renses yderligere via størrelseseksklusionskromatografi (FPLC) ved pH 7,4. (A,B) Western blot-analyse (beskårne blots i bunden) identificerede fraktioner indeholdende svin FAHD1, der er samlet og koncentreret. De fulde blots skildrer den Coomassie-farvede membran efter western blot-analyse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Den filtrerede prøve blev påført igen på SEC, men ved bufferbetingelser ved pH 9 (se tabel 1) (figur 4). Rationalet bag denne tilgang er, at pH- og saltindholdet i den mobile fase kan påvirke elueringsprofilen af kugleformede proteiner20, og der blev fundet en forbedret elueringsprofil for FAHD1 under disse bufferbetingelser. En fraktion indeholdt protein med tilstrækkelige renhedsniveauer til basiskenzymaktivitetsassays 12 for endelig at bekræfte proteinets identitet.

Figure 4
Figur 4: Oprensning af svin FAHD1 med FPLC - del 2. Røde pile i kromatogrammet og blots angiver tilstedeværelsen af FAHD1. Proteinprøver, der tidligere er oprenset med anionisk udveksling og størrelsesudelukkelseskromatografi, renses yderligere via størrelseseksklusionskromatografi (FPLC) ved pH 9 (toppanel). Western blot-analyse afbildet nederst til højre identificerer fraktioner, der indeholder svine FAHD1, der er samlet og koncentreret (bundpaneler). Pletten nederst til venstre viser Coomassie-farvningen af membranen efter den vestlige plet. Klik her for at se en større version af denne figur.

En alternativ strategi (dvs. SEC efterfulgt af ionisk udvekslingskromatografi) blev testet med 2 ml lysat opnået efter ammoniumsulfatudfældning (trin 4) (supplerende figur 2). Begrundelsen for dette eksperiment er, at ved først at anvende SEC kan FAHD1 indeholdende fraktioner adskilles fra de fleste andre proteiner, mens en efterfølgende ionisk udvekslingskromatografi kan anvendes til yderligere at rense proteinet. For det første blev lysatet fraktioneret under anvendelse af SEC ved pH 7,4 (trin 6). Western blot-analyse identificerede alle fraktioner, der indeholdt svine FAHD1. For det andet blev disse fraktioner koncentreret og yderligere renset under anvendelse af en anionisk udvekslingskolonne ved pH 9 (trin 5). Kromatogrammerne og western blot-analysen (supplerende figur 2) viser, at denne strategi er opmuntrende, fordi det ioniske udvekslingskromatogram viser en defineret smal top, der er forbundet med berigede proteinniveauer i den vestlige plet. Ulempen ved denne strategi er imidlertid, at den er begrænset af det oprindelige volumen, der skal anvendes på SEC (2 ml), så gennemstrømningen af denne metode er meget lav. Behandling af en hel svinenyre er for eksempel ikke praktisk.

Som en anden ændring af denne protokol blev en kationisk udvekslingskolonne inkluderet før den anioniske udvekslingskolonne, da svinet FAHD1 også var til stede i gennemstrømningen. På hvert trin i protokollen blev der udtaget prøver af svinene FAHD1 indeholdende fraktioner, som blev undersøgt med et ODx-assay som beskrevet andetsteds12 (supplerende figur 3). Den specifikke enzymatiske aktivitet øges sammen med renhedsniveauet, dvs. sammen med den stigende relative mængde FAHD1 pr. Total protein.

Som et andet eksempel præsenteres ekstraktionen af FAHD1 fra muselever, dvs. en samling levervæv opnået fra 20 mus. Sammenlignet med ekstraktionen af FAHD1 fra svinenyren præsenteret ovenfor, viste denne ekstraktion sig at være mere kedelig. Der opstod problemer på flere trin i protokollen, som vil blive præsenteret i det følgende. Det samlede proteinindhold blev ekstraheret som beskrevet i trin 2 (supplerende figur 4). Da museleverhomogenat har tendens til at være en meget klæbrig og slimet enhed, blev filterpapir (svarende til kaffefilterenheder) brugt til at forfiltrere lysatet, som blev fortyndet 1: 3 i lysisbuffer efter ekstraktion for at gøre opløsningen mere som en væske. Denne fortynding forbedrede filtreringsproceduren; det gjorde imidlertid den efterfølgende påvisning af proteinet med western blot mere kedelig. Efter filtrering måtte det tilberedte lysat koncentreres inden videre anvendelse. En alikvoteret tiendedel af det samlede lysat blev brugt til følgende eksperimenter.

Et første testtrin for ammoniumsulfatudfældningen (supplerende figur 4I) viste et muligt problem, der kan opstå. Ammoniumsulfat ved højere koncentrationer forstyrrer SDS-PAGE geler og forårsager en smileffekt, når den køres ved 150 V (supplerende figur 5A; negativt resultat). Den samme SDS-PAGE, der køres ved 80 V, viser et positivt resultat (supplerende figur 5B). I sidstnævnte tilfælde dannes smileeffekten oprindeligt, men løses i sidste ende på grund af den anvendte lavere spænding. Da den oprindelige opløsning skulle fortyndes kraftigt for at kunne filtrere lysatet, var den indledende western blot-analyse af disse prøver mislykket, dvs. den positive kontrol blev påvist af antistoffet, men ikke proteinet i de påførte prøver. Dette problem blev løst ved hjælp af en højere koncentration af både lysatet (koncentreret ved hjælp af centrifugalfilterenheder) og antistoffet og ved at anvende antistoffet natten over i kølerummet, mens det rystede. I sidste ende gav western blot-analysen både informationen om, at proteinet var til stede i lysatet, og at proteinet stadig var til stede i supernatanten ved 15% ammoniumsulfat (supplerende figur 5C). Bemærk, at SDS-prøver indeholdende større mængder ammoniumsulfat (>15%) udfældes under opvarmning, og proteinet gik tabt. Dette kan også ses i Coomassie-farvningen og den vestlige plet (supplerende figur 5C). Denne effekt blev ikke observeret for svinenyren, så den kan være vævsspecifik.

Efter ammoniumsulfatudfældning ved 15% blev 10 ml lysat påført kationisk udvekslingskromatografi ved pH 6,8. Western blot-analyse viste, at musens FAHD1-protein var i gennemstrømningen (figur 5A). Den eluerede proteinfraktion synes at være mindre; Dette eksempel viser imidlertid en sekundær effekt af ionisk udvekslingskromatografi. På dette trin i protokollen kan opløsningen stadig indeholde mange forbindelser, der muligvis ikke er protein. Ionisk udvekslingskromatografi er en hurtig og nem måde at slippe af med sådanne forureninger. I betragtning af at udførelse af ionisk udvekslingskromatografi tager et par timer at udføre (inklusive alle vasketrin, selve eksperimentet tager en halv time), giver det en simpel metode til at rydde prøven fra ikke-proteinforureninger.

Figure 5
Figur 5: Oprensning af mus FAHD1 med FPLC. Røde pile i kromatogrammet og blots angiver tilstedeværelsen af FAHD1. (A) Efter ammoniumsulfatudfældning på 15 % blev prøven centrifugeret, filtreret (0,22 μm) og påført en kationisk udvekslingskolonne. Western blot-analyse viser, at proteinet er i gennemstrømningen, og kromatogrammet viser, at ikke meget af de andre proteiner er blevet fjernet ved dette trin. Sammenligning af udseendet og viskositeten af input med gennemstrømningen viser imidlertid, at den indsamlede gennemstrømning er meget klarere (højre panel, der sammenligner input og gennemstrømning). B) Gennemstrømningen, der blev indsamlet fra den kationiske udvekslingskolonne, blev reduceret til 2 ml via centrifugeringsfiltre og anvendt på størrelsesudelukkelseskromatografi ved pH 7,4. C) Fraktionerne indeholdende FAHD1 blev samlet, koncentreret og anvendt på en anden runde af størrelsesekskromatografi ved pH 9. (D) Fraktionerne indeholdende FAHD1 blev igen samlet og påført SDS-PAGE med sølvfarvning for at se de resterende forureninger. Klik her for at se en større version af denne figur.

Prøven blev yderligere anvendt på størrelsesudelukkelseskromatografi ved pH 7,4 (figur 5B). Western blot-analyse viste fraktioner indeholdende musens FAHD1-protein, der blev samlet og koncentreret til 2 ml. Dette 2 ml koncentrat blev frosset ved -20 °C med 10 μL β-mercaptoethanol og optøet den næste dag. Der blev dannet et bundfald, der blev filtreret via sprøjtefilterenheder (0,22 μm). Prøver til SDS-PAGE og western blot analyse blev taget for at sikre, at musen FAHD1 protein stadig var i opløsning.

Prøver indeholdende proteinet (fra western blot-analyse) blev samlet, koncentreret via centrifugeringsfiltre og påført SDS-PAGE med sølvfarvning for at se de resterende forureninger (figur 5D). Dette afslørede, at proteinopløsningen ikke er meget ren, og at mængderne af protein opnået via denne metode fra muselever heller ikke var særlig høje (nogle få μg i alt som bestemt ved hjælp af BCA-analysesæt; se Tabel over materialer). Proteinudbyttet var meget højere i tilfælde af svine FAHD1 (ca. 1 mg i dette trin). Renhedsniveauet af FAHD1-protein ekstraheret fra svinenyren er ca. 80% (estimeret efter sølvfarvning; data ikke vist). Denne renhed kan øges yderligere via f.eks. affinitetskromatografi ved hjælp af et defineret antistof. Sådanne og andre begrænsninger i denne protokol vil blive diskuteret i detaljer yderligere nedenfor.

Navn på buffer/opløsning/materiale Sammensætning
Coomassie afholdningsopløsning 30% (v/v) EtOH; 5 % (v/v) HOAc i ddH2O
Coomassie farvningsopløsning 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250; 50 % (v/v) MeOH; 10 % (v/v) HOAc i ddH2O
Mono Q høj saltbuffer 20 mM Tris-HCl; 1 m NaCl; 10 % glycerol; i ddH2O; juster pH til 9,0 med NaOH
Mono Q buffer med lavt saltindhold 20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; i ddH2O; juster pH til 9,0 med NaOH
Mono S høj saltbuffer 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1 m NaCl; i ddH2O; juster pH til 6,8 med HCL
Mono S buffer med lavt saltindhold 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 15 mM NaCl; i ddH2O; juster pH til 6,8 med HCL
Protein lysis buffer 1x PBS (250 ml); 50 mM NaF; 1mM PMSF; 2 μg/ml aprotinin, 1 mM aktiveret orthovanadat; i ddH2O
Kanin Anti-hFAHD1 polyklonalt antistof (affinitet isoleret) Specialfremstillet; polyklonalt anti-hFAHD1-antistof oprenset fra kaninserum og oprenset med FPLC i henhold til reference 12
Rekombinant hFAHD1 protein western blot kontrol Western blot-kontrolprotein udtrykt i E.coli og oprenset med FPLC i henhold til reference 12.
SDS-SIDE 5x prøvebuffer 300 mM Tris HCl; 500 mM DDT; 10% (w/v) SDS; 50% (v/v) glycerin; 0,05% (m/v) bromphenolblå; i ddH2O; juster pH til 6,8 med HCL
SDS-PAGE opløsningsgel (12,5 %) til diskontinuerlig PAGE ddH2O (9,5 ml); 3 M Tris HCl (2,2 ml); 5,5 ml 40 % acrylamid/Bis-opløsning (29:1-forhold); 20% SDS (175 μL); TEMED (17 μL); 10% ammoniumpersulfat (175 μL); støbt før stablingsgelen og lad den polymerisere; støbt stablingsgelen ovenpå
SDS-PAGE kører buffer 25 mM Tris HCl; 190 mM glycin; 0,5 % (w/v) SDS i ddH2O; juster pH til 8,3 med NaOH
SDS-PAGE stablingsgel (12,5 %) til diskontinuerlig PAGE ddH20(3,8 ml); 1 M Tris HCl (630 μL); 500 μL 40 % acrylamid/Bis-opløsning (29:1-ration); 20% SDS (25 μL); TEMED (5 μL); 10% ammoniumpersulfat (50 μL); støbt efter at opløsningsgelen er polymeriseret; påfør en gelkam for at skabe brønde
SEC (G75) kører buffer 15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; i ddH2O; juster pH til 7,4 med NaOH
Sølvfarvning udviklende løsning 250 mMNa2CO3 i ddH20; Tilsæt 12 μL 37 % (v/v) formaldehyd til 100 ml før brug
Sølvfarvning fastgørelsesopløsning 40% (v/v) EtOH; 10% (v/v) HOAc; i ddH2O
Sølvfarvning inkubationsopløsning 30% (v/v) EtOH; 500 mM NaOAc; 8 mM Na2S2O3; i ddH2O; valgfrit: Tilsæt 600 μL 50 % (v/v) glutaraldehyd pr. 100 ml før brug
Sølvfarvning sølvopløsning 0,1% (w/v) AgNO3; i ddH2O; Tilsæt 25 μL 37% (v/v) formaldehyd til 100 ml før brug
Sølvfarvning stop opløsning 40 mM EDTA-opløsning ved pH 7,6; overfør 744 mg EDTA til 40 mlddH20og tilsæt derefter NaOH for at opløse og justere pH til 7,6. Til sidst justeres det samlede volumen til 50 ml.
Western blot blokerer buffer PBS med 0,1 % (v/v) Tween 20 og 5 % (w/v) skummetmælkspulver; filtreret
Western blot overførselsbuffer (10x) Tris-HCl 250 mM; glycin 1,92 M; i ddH2O; juster pH til 8,3 med NaOH; opbevares ved stuetemperatur
Western blot overførselsbuffer (1x) Western blot overførselsbuffer (10x) 100 ml; 800 mlddH20; 100 ml MeOH; opbevares ved 4 °C
Western blot vaskebuffer (PBS-T) PBS med 0,1% (v/v) Tween 20

Tabel 1.

Supplerende figur 1: Total proteinekstraktion fra svinenyre. (A) Nyrevæv blev skåret ved hjælp af en skalpel på en forberedt korrekt rengjort glasplade sat på polystyrenskum for at forhindre glidning; B) 50 ml rør indeholdende 20 ml iskold lysisbuffer med protein/proteasehæmmere inkuberes på is C) nyrevævsstykker blev sat i bufferen, indtil volumenet nåede ca. 30 ml (D) nyrevæv blev homogeniseret ved hjælp af ultralyd (dvs. sonikering); E) råhomogenat blev centrifugeret i en bordcentrifuge ved medium hastighed i 30 minutter F) flere prøver blev behandlet samtidigt G) efter første centrifugering blev supernatanten overført til centrifugerør (sammenlignet med E) og centrifugeret ved høj hastighed (10.000 x g) i 30 minutter H) dette centrifugeringstrin giver en anden pellet og supernatant, som overføres til 50 ml rør; (I/J) forlysatet filtreres sekventielt med 0,45 μm og 0,2 μm filterenheder, aliciteret i 10 ml batches og snapfryses med flydende nitrogen til efterfølgende opbevaring ved -80 °C. Western blot-analyse bruges til at verificere tilstedeværelsen af proteinet i alle prøver (pellets, supernatanter, filtreret lysat). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Oprensning af svin FAHD1 med FPLC; alternativ strategi. Røde pile i kromatogrammet og blots angiver tilstedeværelsen af FAHD1. A) Oprensning af svine-FAHD1 fra lysat opnået ved ammoniumsulfatudfældning ved 25 % med størrelsesudelukkelseskromatografi (FPLC) ved pH 7,4. Western blot-analyse identificerede fraktioner, der indeholder svine FAHD1, der var samlet og koncentreret. (B) Proteinprøver, der tidligere var oprenset med størrelseseksklusionskromatografi (panel A), blev yderligere oprenset via anionisk udvekslingskromatografi (FPLC). Western blot-analyse identificerer fraktioner, der indeholder svine FAHD1, der blev samlet og koncentreret. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 3: Specifik enzymaktivitet hos svine FAHD1. Målt specifik enzymaktivitet som funktion af stigende renhedsniveau. Tabellen sammenligner relativ enzymaktivitet (nmol/min) med specifik enzymaktivitet (pmol/min/mg). Analysen viser en konstant stigende aktivitet af svin FAHD1 efter hvert rensningstrin. Sammenlignet med den rekombinante His/S-humane FAHD1 (grøn) opnået fra E. coli. 12, svin FAHD1 viste en lidt højere aktivitet (rød) (n = 3). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 4: Total proteinekstraktion fra muselever. (A,B,C) Snapfrosset levervæv fra 20 mus og lysisbuffer blev fremstillet på is i 50 ml rør; (D, E, F) levervæv blev homogeniseret ved hjælp af ultralyd (dvs. sonikering); råhomogenat blev centrifugeret i en bordcentrifuge ved medium hastighed i 30 minutter; supernatanten blev overført til centrifugerør og centrifugeret ved høj hastighed (10.000 x g) i 30 minutter; (G,H,I) forlysatet filtreres sekventielt af papirfiltre, 0,45 μm og 0,2 μm filterenheder, aliciteret i 10 ml batches og snapfryses med flydende nitrogen til efterfølgende opbevaring ved -80 °C (J) ammoniumsulfat blev tilsat lysatet i forskellige koncentrationer (højst 5% til 30%) for at udfælde protein fra opløsningen; (K) pellets opnået efter ammoniumsulfatudfældning (panel J) blev resuspended iH20for at udtage prøver til SDS-PAGE og western blot-analyse. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 5: Ammoniumsulfatudfældning og western blot-screening for mus FAHD1. Røde pile i blots indikerer tilstedeværelsen af FAHD1. (A) SDS-PAGE med prøver opnået efter ammoniumsulfatudfældning blev kørt ved 125 V. Denne gel viste en drastisk smileffekt, og en sådan gel kan ikke evalueres. Dette er et eksempel på et negativt resultat. (B) SDS-PAGE med de samme prøver (panel A) blev kørt ved 80 V, indtil den var færdig. Der er ingen smileffekt i denne gel, og dette er et eksempel på et positivt resultat. C) SDS PAGE og western blot-analyse af prøverne opnået efter ammoniumsulfatudfældning. Prøver i højere koncentrationer af ammoniumsulfat kan udfældes inde i prøvebufferen som angivet. De går tabt og kan ikke længere opdages, hverken via Coomassie-farvning (venstre) eller western blot-analyse (højre). Den bedste koncentration af ammoniumsulfat blev i dette tilfælde bestemt til at være 15%. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiske trin i protokollen
At følge fælles retningslinjer for håndtering af proteiner er afgørende, såsom at arbejde på is og ved moderate pH- og saltforhold. Anvendelsen af proteasehæmmere er gavnlig for metoden, mens brugen af proteasomhæmmere anbefales stærkt. Frysning og optøning af prøven kan altid resultere i proteinudfældning (i det mindste delvist), så enhver optøet alikvot initialproteinlysat (trin 2) skal behandles kontinuerligt uden pause. Centrifugering og filtrering efter optøning anbefales generelt at fjerne mikrofældning.

Det oprindelige proteinlysat opnået fra et væv indeholder stadig mange stoffer udover proteiner. Ioniske udvekslingskromatografikolonner kan bruges til at rydde lysatet. Selvom det protein, man ønsker at udvinde, ikke binder sig til ionudvekslingskolonnen, kan gennemstrømningen være meget klarere end inputopløsningen og lettere at behandle i efterfølgende trin. Dette er vist for ekstraktion af FAHD1 fra musenyrer (se figur 5A).

Begrænsninger og ændringer af metoden
Denne protokol beskriver en protokol til ekstraktion af FAHD1 fra vævet. På grundlag af denne strategi kan der udledes en generel tilgang til ekstraktion af FAHD-proteiner (FAHD1, FAHD2) fra andet væv, mens specifikke tilpasninger kan være nødvendige i individuelle tilfælde. Den implicitte begrænsning af denne metode er de relative ekspressionsniveauer af FAHD1 (eller FAHD-proteiner) i et givet væv og tilgængeligheden af dette væv i tilstrækkelige mængder. Det overordnede skema, der er beskrevet i denne protokol, kræver en høj ekspression af proteinet i en passende mængde væv til at begynde med. Eksempler på ekstraktion af FAHD1 fra svinenyre og muselever er blevet tilvejebragt, som er to organer, der viser høje ekspressionsniveauer af proteinet. Ved hvert trin, der er beskrevet i denne protokol, er der et implicit tab af prøve, dvs. den lave indledende mængde protein mindskes yderligere. I sidste ende kan kun lave mængder protein opnås ved hjælp af denne protokol. Fordi svinenyren er et stort organ, kan omkring et gram protein (ca. 80% renhed; estimeret) ekstraheres ved denne tilgang fra to nyrer. Anvendelse af den samme protokol til ekstraktion af FAHD1 fra muselever krævede indsamling af leverprøver fra 20 mus for kun at opnå et par μg protein i sidste ende. At opnå højere renhed af proteinet ved hjælp af de skitserede metoder kan være kedeligt, og sølvfarvning afslører, at der efter størrelsesudelukkelseskromatografi stadig kan være mange andre proteiner i opløsning. Man kunne forstærke denne protokol via affinitetskromatografi (NHS-aktiverede kolonner) ved hjælp af et monoklonalt antistof (f.eks. CAB025530).

Alle de protokoller, der er anført her, nødvendiggør, at det protein, man ønsker at ekstrahere, er opløseligt. Optimale betingelser for ammoniumsulfatudfældning og pH/saltjusteringer for kromatografi skal testes og defineres. Hvis den ioniske udvekslingskromatografi ikke giver nogen gode oprensningsresultater, kan dialyse mod en kromatografibuffer, inden FPLC udføres, være en mulighed for at forbedre proteinets opløselighed og kromatografiens opløsning. Det anbefales dog ikke at dialysere rålysatet, da dette kan føre til massiv og ukontrolleret proteinudfældning inde i dialyserøret. Problemer kan opstå, hvis proteinet har tendens til at være hydrofobt, og protokollerne kan ikke være anvendelige, hvis proteinet er stærkt hydrofobt (f.eks. Membranproteiner). Hvis FAHD-proteiner er delvist uopløselige som fundet for FAHD2 (data ikke vist) i et givet vævslysat, kan andre typer kromatografi, f.eks. hydrofob interaktionskromatografi (HIC), også undersøges12.

To ændringer af standardprotokollen er blevet vist i resultatafsnittet. Til rensning af FAHD1 fra en svinenyre blev der anvendt størrelseseksklusionskromatografi før ionisk udvekslingskromatografi (se supplerende figur 2). Et problem med denne metode er, at størrelsesudelukkelseskromatografi har større løbespor, og prøvevolumenet stiger kraftigt under kørslen. Prøvevolumenet må ikke overstige 2% af sengevolumenet for at opnå høj opløsning23, og den endelige fortyndingsfaktor afhænger også af det opsamlede elueringsvolumen. I det medfølgende eksempel ved hjælp af en kolonne på 120 ml anbefales et indledende volumen på 2 ml. Den indledende prøve kan udtages fra flere ml af lysatet efter ammoniumsulfatudfældning ved koncentration ved anvendelse af centrifugalfilterenheder uden aggregering eller udfældningsartefakter. Et eksempel på rensning af FAHD1 fra en svinenyre er angivet som et repræsentativt resultat (se også supplerende figur 2). Begrænsningen til kun at være små prøvemængder kan imidlertid gøre denne fremgangsmåde upraktisk.

Anvendelser eller retninger af metoden
Ekspression og oprensning af rekombinante proteiner fra bakterier er en ligetil og veletableret metode til opnåelse af mulige mængder (i gram) protein24,25. Dette er blevet præsenteret for FAHD112. Der er dog flere mulige ulemper ved at anvende disse metoder, såsom mulig dårlig vækst af værten, inklusionskropsdannelse, tab af eller ændret proteinaktivitet og derfor muligheden for slet ikke at opnå noget protein eller resultere i en forudindtaget form af proteinet (misfoldning, dårlige post-translationelle modifikationer osv.). Udvikling af metoder, der kan udtrække godt foldet og korrekt modificeret protein fra væv direkte, er derfor tiltalende. Det største problem er imidlertid, at de fleste proteiner ikke udtrykkes på signifikante niveauer, og sammenlignet med den implicitte induktion og efterfølgende ekstraktion af protein fra bakterier er mængden af protein, der skal opnås, typisk flere størrelsesordener lavere. Der er en afvejning mellem den billige og nemme udvinding af rekombinant protein fra bakterier og den dyrere og kedeligere ekstraktion af protein fra væv. Det største fremskridt med sidstnævnte er, at man kan udtrække proteinet i dets fysiologiske form, der er til stede i vævet, herunder alle gensidige virkninger, der kan påvirke dets foldning og / eller katalytiske aktivitet.

Protein ekstraheret og oprenset ved denne protokol vil bidrage til at identificere kompetente hæmmere afFAHD1 13, mulige proteininteraktionspartnere9 og mulige, men uopdagede roller af proteinet9. Undersøgelsen af enzymatiske hæmmere, udviklingen af monoklonale antistoffer og undersøgelsen af proteinstrukturen i første omgang understøttes i høj grad, når protein ved høj renhed ekstraheres fra væv snarere end ekstraheres fra bakterier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Forfatterne er meget taknemmelige for den tekniske bistand fra Ayse Öztürk og Eva Albertini. Mus, der blev brugt til generering af levervæv, blev opretholdt under tilsyn af Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr (Institut for Biomedicinsk Aldringsforskning ved Innsbruck Universitet, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Østrig).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm filter units MERCK SLGP033RS Millex-HP, 0.22 µm, PES 33 mm, not steril
0.45 µm filter units MERCK SLHP033NS Millex-HP, 0.45 µm, PES 33 mm, not steril
15 mL Falcon tubes VWR 734-0451 centrifugal tubes
50 mL Falcon tubes VWR 734-0448 centrifugal tubes
96-Well UV Microplate Thermo-Fischer 8404 UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates
Acrylamide/Bis Solution (40%, 29:1 ratio) BIO-RAD #1610147 40% acrylamide/bis-acrylamide, 29:1 (3.3% crosslinker) solution for casting polyacrylamide gels
ÄKTA FPLC system GE Healthcare Life Sciences / Cytiva - using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the "ÄKTA pure" system
Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa MERCK UFC901024 centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 15 mL
Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa MERCK UFC801024 centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 4 mL
Ammonium sulfate powder MERCK A4418 ammonium sulphate for molecular biology, ≥99.0%
Ammoniumpersulfat reagent grade, 98% MERCK 215589 Catalyst for acrylamide gel polymerization.
Coomassie Brilliant blue R 250 MERCK 1125530025 Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) for electrophoresis Trademark of Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6.2 (10 g/l, H2O, 25 °C)
Dialysis tubing cellulose membrane MERCK D9277 Cellulose membranes for the exchange of buffers via dialysis.
Eppendof tubes 1.5 mL VWR 525-1042 microcentrifugal tubes; autoclaved
HiLoad 26/600 Superdex 75 pg GE Healthcare Life Sciences / Cytiva 28989334 HiLoad Superdex 75 pg prepacked columns are for high-resolution size exclusion chromatography of recombinant proteins
Immun-Blot PVDF Membrane BIO-RAD #1620177 PVDF membranes are protein blotting membranes optimized for fluorescent and multiplex fluorescent applications.
Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell BIO-RAD #1703930 Use the Mini Trans-Blot Cell for rapid blotting of Mini-PROTEAN precast and handcast gels.
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels BIO-RAD #1658004 4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam.
Mono Q 10/100 GL GE Healthcare Life Sciences / Cytiva 17516701 Mono Q columns are strong anion exchange chromatography columns for protein analysis or small scale, high resolution polishing of proteins.
Mono S 10/100 GL GE Healthcare Life Sciences / Cytiva 17516901 Mono S columns are strong cation exchange chromatography columns for protein analysis or small scale high resolution polishing of proteins.
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa Thermo-Fischer 26616 A mixture of 10 blue-, orange-, and green-stained proteins (10 to 180 kDa) for use as size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting.
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo-Fischer 23225 A two-component, high-precision, detergent-compatible protein assay for determination of protein concentration.
Sonifier 250; Ultrasonic Cell Disruptor w/ Converter Branson - New models at https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf
Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP (affinity isolated) Agilent Dako P0399 The antibody used for horseradish peroxidase conjugation reacts with rabbit immunoglobulins of all classes.
TEMED, 1,2-Bis(dimethylamino)ethane, TMEDA MERCK T9281 TEMED (N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine) is molecule which allows rapid polymerization of polyacrylamide gels.
Tube Roller - - A general tube rotator roller; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71
Tube Rotator - - A general tube rotator wheel; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123
ULTRA-TURRAX; T 25 digital IKA 0003725000 New models at https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pircher, H., et al. Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase. Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).
  2. Pircher, H., et al. Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase. Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36500-36508 (2011).
  3. Kang, T. -W., et al. Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development. Nature. 479 (7374), 547-551 (2011).
  4. Hong, H., Seo, H., Park, W., Kim, K. K. -J. Sequence, structure and function-based classification of the broadly conserved FAH superfamily reveals two distinct fumarylpyruvate hydrolase subfamilies. Environmental Microbiology. 22 (1), 270-285 (2020).
  5. Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase. Structure. 7 (9), London, England. 1023-1033 (1999).
  6. Bateman, R. L., et al. Mechanistic inferences from the crystal structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a bound phosphorus-based inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 276 (18), 15284-15291 (2001).
  7. Weiss, A. K. H., et al. Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1. Biochemical Journal. 475 (22), 3561-3576 (2018).
  8. Etemad, S., et al. Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 - a new regulator of mitochondrial function and senescence. Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).
  9. Weiss, A. K. H., et al. Regulation of cellular senescence by eukaryotic members of the FAH superfamily - A role in calcium homeostasis. Mechanisms of Ageing and Development. 190, 111284 (2020).
  10. Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-Dürr, P. Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells. Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).
  11. Wiley, C. D., et al. Mitochondrial dysfunction induces senescence with a distinct secretory phenotype. Cell Metabolism. 23 (2), 303-314 (2016).
  12. Weiss, A. K. H., et al. Expression, purification, crystallization, and enzyme assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59729 (2019).
  13. Weiss, A. K. H., et al. Inhibitors of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain Containing Protein 1 (FAHD1). Molcules. 26 (16), 5009 (2021).
  14. Mizutani, H., Kunishima, N. Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8. Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (9), 792-794 (2007).
  15. Lee, C. H. A simple outline of methods for protein isolation and purification. Endocrinology and Metabolism. 32 (1), Seoul, Korea. 18-22 (2017).
  16. Amer, H. E. A. Purification of proteins: Between meaning and different methods). Proteomics Technologies and Applications. , (2019).
  17. Niu, L., Yuan, H., Gong, F., Wu, X., Wang, W. Protein extraction methods shape much of the extracted proteomes. Frontiers in Plant Science. 9, 802 (2018).
  18. Gordon, J. A. Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor. Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).
  19. Gallagher, S. R. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. , (2012).
  20. Ahmed, U., Saunders, G. Effect of pH on Protein Size Exclusion Chromatography. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf (2011).
  21. Sørensen, B. K., et al. Silver staining of proteins on electroblotting membranes and intensification of silver staining of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 304 (1), 33-41 (2002).
  22. Fagerberg, L., et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).
  23. Cytiva Life Fundamentals of size exclusion chromatography. , Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography (2022).
  24. Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Frontiers in Microbiology. 5, 172 (2014).
  25. Rosano, G. L., Morales, E. S., Ceccarelli, E. A. New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 28 (8), 1412-1422 (2019).

Tags

Biokemi udgave 180 FAHD FAHD1 oxaloacetat decarboxylase ODx væv FPLC kromatografi proteinekstraktion
Ekstraktion og oprensning af FAHD1-protein fra svinenyre og muselever
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Andric, A., Wagner, E., Heberle, A., … More

Andric, A., Wagner, E., Heberle, A., Holzknecht, M., Weiss, A. K. H. Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver. J. Vis. Exp. (180), e63333, doi:10.3791/63333 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter