Summary
このプロトコールは、ブタ腎臓およびマウス肝臓からフマリアセトアセテート加水分解酵素ドメイン含有タンパク質1(FAHD1)を抽出する方法を記載する。列挙された方法は、目的の他のタンパク質に適合させ、他の組織に対して改変してもよい。
Abstract
フマリアセト酢酸加水分解酵素ドメイン含有タンパク質1(FAHD1)は、真核生物においてFAHスーパーファミリーの最初の同定されたメンバーであり、ミトコンドリアにおいてオキサロ酢酸デカルボキシラーゼとして作用する。この記事では、豚の腎臓およびマウス肝臓からFAHD1を抽出および精製するための一連の方法を提示する。対象となる方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)によるイオン交換クロマトグラフィー、FPLCによる分取および分析ゲルろ過、およびプロテオミクスアプローチです。全タンパク質抽出後、硫酸アンモニウム沈殿およびイオン交換クロマトグラフィーを探索し、イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いた逐次戦略 を介して FAHD1を抽出した。この代表的なアプローチは、目的の他のタンパク質(有意なレベルで発現)に適合させ、他の組織について改変してもよい。組織から精製されたタンパク質は、高品質の抗体、および/または強力で特異的な薬理学的阻害剤の開発をサポートし得る。
Introduction
真核生物FAHドメイン含有タンパク質1(FAHD1)は、二官能性オキサロ酢酸(OAA)デカルボキシラーゼ(ODx)1およびアシルピルビン酸加水分解酵素(ApH)2として作用する。それはミトコンドリア2に局在し、酵素1、2、3、4、5、6の広範なFAHスーパーファミリーに属する。そのApH活性はわずかな関連性しかないが、FAHD1のODx活性はTCAサイクルフラックス1、7、8、9の調節に関与している。OAAは、トリカルボン酸サイクルにおける中央クエン酸合成酵素反応に必要とされるだけでなく、電子伝達系の一部として、およびカタプレロティック代謝産物としてコハク酸デヒドロゲナーゼの競合阻害剤としても作用する。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)におけるFAHD1遺伝子発現のダウンレギュレーションは、解糖系への付随的な切り替えに関連する細胞増殖速度10の有意な低下、およびミトコンドリア膜電位の有意な阻害をもたらした。作業モデルは、ミトコンドリア機能障害関連老化(MiDAS)11様表現型8を指し、ミトコンドリアOAAレベルはFAHD1活性1,8,9によって厳密に調節される。
組換えタンパク質は、組織からではなく細菌12から発現および精製を介して得る方が容易である。しかし、細菌で発現されるタンパク質は、翻訳後修飾の欠如の可能性によって偏っているか、単に問題となる可能性がある(すなわち、プラスミド喪失、細菌ストレス応答、歪んだ/未形成のジスルフィド結合、分泌不良、タンパク質凝集、タンパク質分解的切断など)。特定の用途では、タンパク質は、そのような修飾を含むため、および/または起こり得る人工物を排除するために、細胞溶解物または組織から取得する必要がある。組織から精製されたタンパク質は、FAHD113などの選択された酵素に対する高品質の抗体、および/または強力で特異的な薬理学的阻害剤の開発を支持する。
この原稿は、ブタ腎臓およびマウス肝臓からのFAHD1の抽出および精製のための一連の方法を提示する。記載されている方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)を必要としますが、それ以外の場合は一般的な実験装置を使用します。代替的な方法は、他の場所で見出すことができる14、15、16、17。全タンパク質抽出後、提案されたプロトコルには試験段階が含まれ、硫酸アンモニウム沈殿およびイオン交換クロマトグラフィーのサブプロトコルが議論される(図1)。これらのサブプロトコールを定義した後、目的のタンパク質は、イオン交換およびFPLCによるサイズ排除クロマトグラフィーを用いた逐次戦略を介して抽出される。これらのガイドラインに基づいて、最終プロトコールは、関心のある他のタンパク質に対して個別に適合され得る。
図 1: このプロトコルの全体的な戦略 上から下へ:タンパク質は組織から抽出されます。組織ホモジネートを調製し、遠心分離し、濾過した。上清およびペレット由来サンプルのペアごとに、硫酸アンモニウム沈殿およびイオン交換クロマトグラフィー(FPLC)の試験を実施して、最適な条件をプローブする必要があります。これらのサブプロトコールを確立した後、タンパク質は、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、および反復サイズ排除クロマトグラフィー(FPLC)の逐次手順 を介して 、様々なpHおよび塩濃度で抽出され得る。すべてのステップはウェスタンブロットによって制御される必要があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Protocol
すべての実験は、機関のガイドラインに準拠して実施した。豚の腎臓は地元のスーパーマーケットから新鮮に入手しました。肝臓組織は、オーストリアのインスブルック大学(Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Austria)の生物医学老化研究所で、大学-Dozの監督下で維持されているC57BL6野生型マウスから採取した。ピダー・ヤンセン=デュル博士は、2013年に発行されたプロジェクトリーダーとしての倫理的許可(BMWF-66.008/0007-II/3b/2013)によってカバーされました。このプロジェクトのためのマウスの維持と使用は、オーストリア教育科学研究省(BMBWF)が発行した2020年5月5日からの倫理的許可第2020-0.242.978号の対象となります。
1. 準備
注:プロトコルを開始する前に、一般的な化学物質および材料に加えて、タンパク質溶解バッファー、粗組織サンプル、および特定の抗体など、いくつかのものを調製する必要があります。
- 組織の正味重量100 gあたり250 mLのタンパク質溶解バッファーを調製する:50 mM NaF、1 mM PMSF、2 μg/mLアプロチニン、および1 mM活性化オルトバナジンを含む250 mLの1x PBSを調製する( 表1参照)。0.22 μmのシリンジフィルターユニットを使用して溶液をろ過します。
注:オルトバナジン酸塩の活性化は、タンパク質チロシンホスファターゼ18のより強力な阻害剤に変換するために使用する前に必要である。活性化されたオルトバナジン酸塩は、市販の供給業者から入手してもよいが、以下のようにして調製することもできる。- ddH2O中の(ナトリウム)オルトバナジン酸塩の200mMストック溶液を調製する。10mLの溶液を調製するために、368mgのNa3VO4を9mLの水に加え、攪拌して溶解する。溶解したら、ddH2Oで体積を10mLに構成する。
注:オルトバナジン酸ナトリウム溶液の開始pHは、材料の供給源によって異なる可能性があり、pHは、以下のように反復的なアプローチで10に調整する必要がある。 - 溶液の初期pHに応じて、NaOHまたはHClでpHを10に調整する。pH>10では、溶液は黄色を呈する。溶液が無色になるまで沸騰させ、室温まで冷却し、pHを確認してください。pHが>10の場合は、少量のHClを加えてpHを10に調整します。この時点で、ソリューションは再び黄色に変わることがあります。
- 溶液が無色のままでpHが10(約5〜7倍)に安定するまで、沸騰と冷却を繰り返します。この時点で、HClを添加すると、溶液中に黄色がかすかに現れる。活性化されたオルトバナジン酸塩を-20°Cで1mLアリコート中に保存する。
- ddH2O中の(ナトリウム)オルトバナジン酸塩の200mMストック溶液を調製する。10mLの溶液を調製するために、368mgのNa3VO4を9mLの水に加え、攪拌して溶解する。溶解したら、ddH2Oで体積を10mLに構成する。
- 組織1グラムあたり2mLの溶解緩衝液でチューブを調製し、氷の上に置く。
注:このプロトコルは、1頭のブタ腎臓(約100〜150g)に対して合計30mLの溶解緩衝液で満たされた8つの50mLチューブを使用し、2本のチューブにそれぞれ20匹のマウス肝臓(それぞれ1〜2g)用の40mLの溶解緩衝液で充填した。 - 組織を準備する:ポリスチレンフォームボックス内の氷の上に置かれた事前に洗浄されたガラス板上で組織を解剖する。その後の溶解のためにそれぞれのチューブに容易に移されるようにそれぞれ約100mgの組織片を切断する。組織片を調製したチューブに移す(ステップ1.2)。
- 飽和硫酸アンモニウム溶液を調製する:500mLのddH2Oを70°Cに加熱し、攪拌しながら、硫酸アンモニウム粉末( 原料表参照)を硫酸アンモニウムが溶解しなくなるまで徐々に加える。この(過)飽和溶液を室温まで冷却し、4°Cで一晩保存する。
2. 総タンパク質抽出
注 冷たいタンパク質溶解バッファーでサンプルを調製した後 (ステップ 1.3 を参照)、超音波プローブによる超音波処理 を介して 、または次のように電気ホモジナイザーを使用して、組織を可能な限り最適に均質化します。
- 組織の均質化
- 豚腎臓の場合、好ましくは、試料を氷上に保持しながら超音波プローブによって懸濁液を超音波処理する(15秒パルスの10サイクル、パルス間の30秒間隔で氷上の試料を冷却し、50%デューティサイクルで中程度の振幅で)。
- マウスの臓器の場合、サンプルを氷上に保ちながら、電気ホモジナイザーを使用して懸濁液を均質化します(低力から始めて、ゆっくりと中力まで加速します)。電気ホモジナイザーをPBSで定期的に洗浄して、デバイスを詰まらせる有機材料を除去します。
- サンプルから20μLを取り出し、均質化された組織の細胞が適切に破壊されているかどうかを顕微鏡下で確認する。それ以外の場合は、均質化を繰り返します。
- チューブを卓上遠心分離機で10,000 x g で4°Cで30分間遠心分離する。
注:オプションで、上清を20,000 x g で2回目に4°Cで30分間遠心分離し、移送された可能性のある初期ペレットの小さな画分を除去します。これにより、ステップ2.3の後続のフィルタリングが簡素化されます。 - 上清を新鮮なチューブに集め、氷の上に置きます。0.45 μm および 0.22 μm のシリンジフィルターユニットを使用して上清を順次ろ過します。上清を10mLバッチにアリコートし、短期保存の場合は-20°Cで、長期保存の場合は-80°Cで凍結します。
注: 0.45 μm で事前ろ過すると、粒子の大部分が除去され、0.22 μm で 2 回目のろ過ステップでより細かい粒子が除去されます。0.22 μmのフィルターを直接使用すると、フィルターが目詰まりする危険性があります。 - 上清40 μLに10 μLの5x SDSサンプルバッファー(表1参照)を加え、95°Cで 10分間煮沸することにより、SDS-PAGE/ウェスタンブロット分析用の50 μLサンプルを調製します。
- 必要に応じて、ステップ2.2で得られたペレット約100 μLを900 μLのddH2Oに再懸濁し、上記のようにSDS-PAGE/ウェスタンブロット分析用のサンプルを調製する。
注:陽性対照に加えて、ウェスタンブロット分析にペレット由来サンプルを含めることは、タンパク質の発現が低いか、または抗体が問題であることを示す。
- 必要に応じて、ステップ2.2で得られたペレット約100 μLを900 μLのddH2Oに再懸濁し、上記のようにSDS-PAGE/ウェスタンブロット分析用のサンプルを調製する。
3. SDS-PAGEとウェスタンブロット解析
注: タンパク質の溶解性をチェックするには、ウェスタンブロット分析が必要です。以下では、ウェット/タンクブロッティングシステムを使用したエレクトロブロッティングのプロトコルについて説明します( 材料表を参照)。SDS-PAGEの代替プロトコルは、他の場所で見つけることができる19。
- 製造者の指示に従って不連続な12.5%ポリアクリルアミドSDS-PAGEゲルを調製する(すなわち、解決ゲルの上にスタッキングゲル; 表1を参照のこと)。手順 2 で以前に準備したサンプルを実行します (手順 4、5、および 6 に似ています。以下を参照)。
- タンパク質マーカーはしごを最初のウェルにロードします( 材料表を参照)。陽性対照として5ngのhFAHD1組換えタンパク質(細菌12から得られた; 表1を参照されたい)を第2のウェルに負荷する。
- 続いて、分析対象のサンプル20 μLをロードし、残りのすべてのウェルを20 μLの調製されたSDS−PAGE 1xサンプルバッファー(すなわち、ddH2Oで希釈した5xサンプルバッファー)で満たす。SDS 実行バッファーを使用して、SDS-PAGE ゲルを 125 V で実行します ( 表 1 を参照)。
- SDS-PAGEが完了した後、ウェスタンブロット分析を行い、FAHD1に対して産生された利用可能な抗体を用いて膜をプローブする( 表1参照)。
注:サンプルは粗組織ホモジネートから採取されるため、通常、この時点でのSDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析の品質が損なわれます。ただし、抽出するタンパク質が上清に可溶であるかどうかを確認することが重要です。以下のプロトコールを、ブタ腎臓、および肝臓、心臓、脳、および腎臓を含む異なるマウス器官について試験した。- 10x ウェスタンブロット転送バッファーを準備します ( 表 1 を参照)。1xウェスタンブロット転写バッファー( 表1参照)を準備し、4°Cに冷却します。
- PVDF膜をメタノール中で2分間活性化する。膜をddH2Oで2分間洗浄する。1xウェスタンブロット転写バッファー中でメンブレンを15分間平衡化します。
- SDS実行バッファーを除去しながら、SDSゲルを1x PBSで10分間洗浄し、その後、1xウェスタンブロット転写バッファーで10分間インキュベートして平衡化します。エレクトロブロッティングカセットを組み立てる(すなわち、活性化PVDF膜とゲルを組み合わせる)ことは、製造元の指示に従って行う。
- ブロットをエレクトロブロッティングで、氷で満たされた発泡スチロールの箱または冷蔵室(4°C) で 1時間、ブロットを実行します。PVDF膜を、その露出側がチューブの内側を向いている50mLチューブに移す。膜を20mLのウェスタンブロットブロットブロッキングバッファー(表 1参照)中で、チューブローラー( 材料表を参照)上で転がしながら4°Cで一晩インキュベートする。
- 翌日、ロールしながら同じチューブ内の20mLのウェスタンブロット洗浄バッファー(0.1%(v/v)Tween 20を含むPBS)で膜を5分間洗浄する。ウェスタンブロットブロットブロッキングバッファーで1:500に希釈した一次抗体2 (標的FAHD1; 表1参照)と同じチューブ内でメンブレンを、圧延しながら室温で1時間インキュベートする。
- 同じチューブ内の膜を、圧延中に20mLのウェスタンブロット洗浄バッファーでそれぞれ10分間3回洗浄する。5mLのウェスタンブロットブロットブロッキングバッファーで1:3000に希釈したHRP結合二次抗体( 材料表を参照)でメンブレンを室温で30分間インキュベートする。
- 同じチューブ内の膜を、20mLのウェスタンブロット洗浄バッファーでそれぞれ10分間3回、1x PBSでそれぞれ5分間2回洗浄する。片方の端をピンセットで慎重に持ち、セルロース片またはワットマン紙を膜の反対側(下側)の端に触れて、膜を乾かします。膜(露出した側を上に)を清潔なガラス板の上に置きます。
- ピペットを使用して調製したECLウェスタンブロット基質1mLで膜全体を慎重に覆い、気泡を生じないように注意してください。ECL溶液を3分間インキュベートさせ、直ちにX線フィルムまたはイメージングシステムを使用して膜を発達させる。
注:タンパク質がいずれのサンプルでも検出されず、陽性対照でのみ検出された場合、これはタンパク質が不溶性であるか、抗体によって検出されるのに十分な量で存在しないことを示している可能性があります。陽性対照のナノグラムのみがロードされた場合、最初のシナリオがより可能性が高い。タンパク質がまったく検出されなかった場合は、抗体の品質を確認し、モノクローナル抗体ではなくポリクローナル抗体に切り替えることもできます。まれに、すなわち、いくつかの疎水性タンパク質について、タンパク質は遠心分離後に検出され得るが、濾過後には検出可能ではない。このような場合、疎水性タンパク質に特別なフィルターユニットを使用することをお勧めします。
- 任意選択で、ウェスタンブロット後にPVDF膜を染色して、SDS−PAGEゲルからPVDF膜へのタンパク質の正常な転写を制御する。
注:トラブルシューティング、メソッド開発、および文書化にはクーマシー染色が推奨されますが、このプロトコルを適用した後、膜はさらなるウェスタンブロット分析で失われることに注意してください。Ponceau S染色は弱い染色を与えるが、膜を再プローブする場合に使用することができる。- 染色物(クーマシーまたはポンソーS)と脱染色溶液を入れた小さなトレイを準備します。
- ピンセットを用いて、膜を染色溶液に入れ、膜がよく染色されるまで穏やかに振とう(5〜10分)。
- 膜を脱染溶液に移し、溶液が飽和するまで振とうする(5〜10分)。膜上にタンパク質バンドが観察できるようになるまで脱染色ステップを繰り返す。バンドがまったく観察されない場合は、より長いインキュベーション時間で染色を繰り返します。ピンセットを使用してガラス板の上に置いて膜を乾燥させます。
4.試験:硫酸アンモニウム沈殿
注:硫酸アンモニウム沈殿は、タンパク質の溶解度を変えることによってタンパク質を精製する方法である。予備実験では、硫酸アンモニウム濃度は、FAHD1を溶液中に残しながら、最大量のタンパク質夾雑物を沈殿させる値まで順次増加する。タンパク質の溶解度は、ウェスタンブロット分析 によって 再びプローブされる。
- ステップ2.3から続行する:サンプルのアリコートを解凍するか、タンパク質抽出の直後に(すなわち、サンプルを凍結せずに)続行する。0.22 μmのフィルターユニットを使用してサンプルをろ過し、解凍後に析出物の可能性を排除します。氷上で6本の1.5 mLチューブを用意し、各チューブに250 μLのサンプルを移す。
- 上記で調製したチューブに5%、10%、15%、20%、25%、および30%の硫酸アンモニウムの希釈系列を調製し、タンパク質溶解緩衝液で最終容量を1000μLにする。サンプルをチューブ回転子上で4°Cで一晩インキュベートする( 材料表を参照)。
- 卓上遠心分離機を用いて、10,000 x g で4°Cで30分間遠心分離し、すべての上清を別々のチューブに慎重に移した。得られたペレットを風乾し、それぞれを1000μLのddH2Oに再懸濁する。
- 前のステップからの再懸濁ペレットおよび上清の各ペアについて、40 μLを10 μLの5x SDSサンプルバッファーと混合し、液体の大部分が気化するまで開いた蓋で95°Cで沸騰させる。次いで、ペレットをddH2O中の50%DMSOの混合物に再懸濁する。
- SDS-PAGE(ステップ3)を実行しますが、ゲルを80Vで3時間実行します。硫酸アンモニウムの各濃度について、再懸濁ペレットおよび上清に由来するサンプルをペアでロードする(ステップ4.3)。ウェスタンブロット分析を実行します(ステップ3)。
- 精製されるタンパク質(すなわち、FAHD1)が上清に由来するサンプル中に残る硫酸アンモニウムの最高濃度をチェックする。その結果に基づいて、将来の実験で使用する目的のタンパク質に対する硫酸アンモニウム沈殿プロトコールを定義する。
注:硫酸アンモニウムは、SDS-PAGEおよびウェスタンブロットを歪めることがよく知られている。硫酸アンモニウムの濃度が増加するにつれて、ウェスタンブロット分析の品質が損なわれます。ただし、前のステップ3と同様に、この分析は、所定の濃度の硫酸アンモニウムにおける目的のタンパク質の溶解度をチェックするために使用されます。このプロトコールは、他のタンパク質を沈殿させることを目的としているが、精製されるタンパク質は可溶性のままでなければならない。
5. テスト: FPLCによるイオン交換クロマトグラフィー
注:荷電した官能基を持つ分子はFPLC用のシリカ粒子カラムに結合し、表面電荷に応じてタンパク質を分化させることができます。この工程を、陽イオン交換カラムおよび陰イオン交換カラムを用いて2回行う( 材料表を参照)。プロトコルステップは、カチオンクロマトグラフィーまたはアニオン交換クロマトグラフィーのいずれでも同じですが、使用するバッファーは異なります( 表1を参照)。「低塩」15mM NaClおよび「高塩」1M NaCl条件の両方を有する。使用するカラムには、1 mL/分の流量を推奨します。
- FPLCシステムをアニオン交換カラムまたはカチオン交換カラムでセットアップします。20% EtOH (H2 O 中) の 5 カラム容量 (CV) でカラムを洗浄し、続いて 5 CV の ddH2O でカラムを洗浄します。あるいは、クロマトグラムにピークが観察されなくなるまで、1 CV の低塩緩衝液、高塩緩衝液、および再度低塩緩衝液の順にカラムを洗浄しますが、少なくとも 1 回は洗浄します。
- 小規模での硫酸アンモニウム沈殿のための最適なプロトコールを決定した後(ステップ4)、沈殿プロトコールを10mLの元の組織ホモジネートに適用する(ステップ2)。任意選択で、低塩緩衝液に対して試料を透析する。
- サンプルをカラムに塗布し(例えば、注入またはサンプルポンプを使用して)、フロースルーを収集します。カラムを 1 CV の低塩バッファーで洗浄します。
- 100% 低塩バッファー/0% 高塩バッファーから 0% 低塩バッファー/100% 高塩バッファーまでの線形グラジエント溶出を 3 CV 以内に設定します。1 mL 画分を連続的に収集します。グラジエントが終了したら、1 CVの範囲にわたってクロマトグラムにタンパク質関連ピーク(280/255 nmでのUV吸収)が検出されなくなるまで、高塩緩衝液で実行し続けます。
- 0.5 M NaOH (ddH 2 O 中) に溶解した 1 mLの 25% SDS を塗布してカラムを洗浄します。連続して、3 CV の ddH 2 O および 3 CV の20% EtOH (ddH2O 単位) でカラムを洗浄します。
- すべてのピーク画分およびフロースルーのSDS-PAGEサンプルを収集し、ウェスタンブロット を介して 目的のタンパク質の存在をプローブします(ステップ3)。回収した画分を液体窒素中で急速凍結し、-80°Cで保存する。
- ウェスタンブロット分析が完了したら、目的のタンパク質を含む画分を解凍してプールし、残りを破棄します。代替カラム(すなわち、カチオン交換カラムまたはアニオン交換カラム)でステップ5.1〜5.5を繰り返します。
- 両方のカラムがプローブされたら、将来の実験で使用する目的のタンパク質のFPLCプロトコルを定義します。超遠心フィルターユニット(10 kDa、 材料表を参照)を使用してタンパク質溶液の体積を2 mLまで減らします。
注: この一連の実験では、2 つの期待される結果があります。目的のタンパク質がカラムの1つに付着していて、タンパク質溶液が溶出後にすでに非常に純粋であるか、またはタンパク質がどちらの場合もフロースルーに残っていたかのどちらかです。後者のシナリオでは、タンパク質はフロースルーにありますが、このステップの洗浄効果は依然として有意である可能性があります。このような場合、ブタ腎臓およびマウス肝臓におけるFAHD1については、このイオン交換の工程は依然として行われる。カチオン交換カラムもアニオン交換カラムも適切な洗浄効果を提供できない場合は、FPLCに塗布する前に、溶解液および緩衝液のpHを変更し、実行中のバッファーに対してサンプルを透析することができます。
6. 硫酸アンモニウム沈殿およびFPLCのための定義されたサブプロトコルを使用したタンパク質抽出
注:FPLC用シリカゲルカラム( 材料表を参照)内の多孔質粒子は、流体力学的半径に従ってタンパク質を分化させることを可能にする。記載されたステップは、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を使用して、FPLCシステムを用いて実施されるべきである。使用する SEC カラム ( 材料表を参照) の場合、0.3 mL/分の流量を推奨します。
- 必要な材料をすべて準備し(ステップ1を参照)、組織から総タンパク質を抽出します(ステップ2を参照)。試験に使用しなかったすべての組織ホモジネートを用いて硫酸アンモニウム沈殿を行う(ステップ4を参照)。容量が大きい場合は、超遠心フィルターユニット(10 kDa、 材料表を参照)を使用して溶解液を50 mL以下の小さな容量まで濃縮します。
- イオン交換クロマトグラフィーを用いて第1精製工程を行う(工程5参照)。
- 前の手順で説明したように、ウェスタンブロット用のサンプルを準備します。ウェスタンブロット分析を行い、イオン交換クロマトグラフィーからのすべてのFAHD1含有画分をプールする。
- 超遠心フィルターユニット(10 kDa)を使用して、タンパク質溶液の体積を2 mLまで減らします。0.45 μm および 0.22 μm のシリンジフィルターユニットで溶液を順次ろ過し、微小沈殿を除去します。
- 1 mM DTT を含む 1 CV の SEC ランニングバッファー ( 表 1 を参照) で SEC カラムを平衡化します。サンプルをカラムにロードし、すべてのタンパク質が溶出するまでクロマトグラフィーを実行します (1-2 CV)。
- クロマトグラムの有意なピーク(280/255 nmでのUV吸収)に対応するフロースルーの1 mLの画分を収集し、前の手順で説明したように、SDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析用に収集した各画分の50 μLサンプルを調製します。液体窒素を用いて全ての画分をスナップフリーズし、-80°Cで保存する。
- SEC カラムを 1 CV の ddH 2 O および 1 CV の20% EtOH (ddH2O 単位) で連続して洗浄します。ウェスタンブロット分析を実行し、フラクションを含むすべてのFAHD1をプールします。超遠心フィルターユニットを使用して、タンパク質溶液の体積を2mLまで減らします(10kDa、 材料表を参照)。
- 市販のBCAアッセイキットを用いてタンパク質濃度を評価します( 材料表を参照)。
注:移動相のpHおよび塩含有量は、球状タンパク質20の溶出プロファイルに影響を与える可能性がある。酸性または塩基性条件は、ピークの定義が少なくなり、タンパク質間相互作用が増加し、カラム20上のタンパク質の部分的な保持をもたらし得る。この効果は、さらなるタンパク質精製のために利用され得る。異なる流速、pH、および塩濃度を有するステップ6の反復は、タンパク質20の純度を高め得る。
7. 銀染色
注:SDS-PAGEゲルの銀染色分析は、クーマシー染色では見られない可能性のあるタンパク質汚染をチェックするために必要です。以下のプロトコルは、文献21に見出すことができる多くのバージョンのうちの1つである。すべてのインキュベーションステップは、清潔なガラストレイで振って行います。銀とホルムアルデヒドを含む液体はすべて特別な廃液容器に集め、適切に廃棄してください。
- SDS−PAGEゲルを銀染色固定溶液( 表1参照)中で低温室で一晩インキュベートする。ゲルを銀染色インキュベーション溶液( 表1参照)中で室温で3時間インキュベートする。任意選択で、かすかなバンドの検出を改善するためにグルタルアルデヒド( 表1参照)を添加する。ゲルをddH2Oでそれぞれ10分間4回洗浄する。
- ゲルを銀染色銀溶液( 表1参照)中で1時間インキュベートする。
注:これからは、すべての液体とゲル自体に有毒な銀とホルムアルデヒドが含まれていることに注意してください。 - ゲルを銀染色現像液( 表1参照)中で、バンドがはっきりと見えるまで激しく振とうしながらインキュベートする。反応を停止させるために、現像液を捨て、直ちにゲルを銀染色停止液(表1参照)中で最低 10分間インキュベートする。
メモ: 手順 7.2 および 7.3 で染色されたバンドは、常により発達します。染色が弱い場合、記載されているよりも多くのホルムアルデヒドを溶液に添加することが必要な場合があります。
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Representative Results
FAHD1タンパク質は、提示されたプロトコールを用いてブタ腎臓およびマウス肝臓から抽出した。マウス組織の場合、最終精製工程の後に数μgを得るために複数の臓器が必要である。このため、この記事では、豚の腎臓からのFAHD1の抽出に焦点を当てており、これははるかに例示的な実験です。マウス肝臓からのFAHD1の抽出は、このプロトコルの困難および可能性のある落とし穴を提示するために行われる。一般に、精製したいタンパク質の高い発現レベルを示す器官を使用することが推奨される。ヒトタンパク質アトラス22 は、モデル系における発現を推定するのに役立ち得るか、またはこれらのレベルを評価するために異なる粗組織溶解物を用いて予備的なウェスタンブロット実験を行ってもよい。すべてのウェスタンブロット解析で使用されたポジティブコントロールは、わずかに高い分子量で実行されるタグ付き組換えタンパク質でした。
第1の実験として、ブタ腎臓からのFAHD1の抽出が提示される。組織均質化(ステップ1)および全タンパク質抽出(ステップ2)のプロセスを 補足図1 に示します(個々のステップの説明については凡例を参照してください)。全溶解液の10分の1を小分けして、以下の実験に使用した。
硫酸アンモニウム沈殿は、この溶解物について、異なる濃度で溶解物に硫酸アンモニウムを添加することによって1回試験した(工程4)(図2)。遠心分離後、ペレット、および上清をサンプリングし、ヒトFAHD1に対して産生された定義済みのポリクローナル抗体2を用いてウェスタンブロットで分析した。大腸菌12から得られた組換えHis/Sタグ付きヒトFAHD1の200ngを陽性対照として負荷した。FAHD1タンパク質バンドは25kDaで見られ、タグ付き陽性対照は34kDaで実行されます。このデータに基づいて、溶解物を25%硫酸アンモニウムで処理するプロトコール、すなわち、FAHD1が上清中に留まり、他のタンパク質の大部分が沈殿する条件が定義された。これは浄化戦略における大きな一歩です。硫酸アンモニウム沈殿は、他の方法に進む前に有効な洗浄工程である。注目すべきは、硫酸アンモニウムがSDS-PAGEおよびウェスタンブロットの品質を徐々に歪めるため、30%を超える量の硫酸アンモニウムは使用されません。
図2:ブタFAHD1の硫酸アンモニウム沈殿およびウェスタンブロットスクリーニング (A)硫酸アンモニウムを溶解液に異なる濃度(最大5%〜25%)で添加し、溶液からタンパク質を沈殿させた。(b)ブタFAHD1(25kDa)の存在を、ヒトFAHD1に対して産生されたポリクローナル抗体を用いてウェスタンブロット を介して 変化する硫酸アンモニウム濃度に対応するペレットおよび上清の個々のペアにおいて決定した。25%硫酸アンモニウム沈殿に対応する上清は、依然として上清中にブタFAHD1の存在を示し、同時にかなりの量の他のタンパク質を沈殿させる。200ngのHis/Sタグ付き組換えタンパク質を陽性対照(34kDa)としてロードした。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
FPLCでイオン交換カラムをテストした後、ブタFAHD1がpH9のアニオン交換クロマトグラフィーのフロースルーに留まる戦略が定義されました(ステップ5)。硫酸アンモニウム沈殿によって得られた溶解物を25%(以前の試験実験によって定義されるとおり)から始めて、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて、溶液からさらなるタンパク質を除去した(図3A)。結合タンパク質をカラムからの溶出によって除去し、一方、フロースルーをpH 7.4でSEC を介して さらに精製した(図3B)。両方のステップに続いて、ウェスタンブロット分析により、ブタFAHD1を含むすべての画分を同定し、それらをプールし、2mLに濃縮した。
図3:FPLCによる豚FAHD1の精製 - パート1。 クロマトグラムおよびブロット中の赤い矢印は、FAHD1の存在を示す。クロマトグラムにおいて、「UV」は280nmにおけるUV吸収を示し、「Cond」は導電率(緩衝液中の塩濃度に関連する)を示し、「Conc B」は緩衝液勾配中の高塩緩衝液の割合を示す(0%純度低塩緩衝液;100%純度高塩緩衝液)。(a)陰イオン交換カラム(FPLC)による硫酸アンモニウム沈殿により得られた溶解液からブタFAHD1を25%で精製する工程。多くのタンパク質がカラムに結合する一方で、ブタFAHD1はフロースルーで見出される。汚れや非タンパク質汚染物質はカラムからの溶出によって除去され、フロースルーはさらに処理されます。(B)(A)における以前の陰イオン交換クロマトグラフィーからのフロースルーは、pH7.4でサイズ排除クロマトグラフィー(FPLC) を介して さらに精製される。(A,B)ウェスタンブロット分析(下部のクロップブロット)は、ブタFAHD1を含むフラクションを同定し、プールして濃縮した。完全なブロットは、ウェスタンブロット分析後のクーマシー染色膜を描いている。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
濾過した試料を、pH9の緩衝液条件下で再びSECにアプライした( 表1参照)(図4)。このアプローチの背後にある理論的根拠は、移動相のpHおよび塩含有量が球状タンパク質20の溶出プロファイルに影響を与える可能性があり、FAHD1の溶出プロファイルがこれらの緩衝液条件下で見出されたことである。1つの画分は、タンパク質の同一性を最終的に確認するための基本的な酵素活性アッセイ12 に適切な純度レベルのタンパク質を含んでいた。
図4:FPLCによるブタFAHD1の精製 - パート2。 クロマトグラムおよびブロット中の赤い矢印は、FAHD1の存在を示す。以前に陰イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーで精製したタンパク質サンプルは、pH 9(トップパネル)でサイズ排除クロマトグラフィー(FPLC) を介して さらに精製されます。右下に描かれたウェスタンブロット分析は、豚FAHD1を含み、プールされ濃縮されているフラクション(下部パネル)を識別します。左下のブロットは、ウェスタンブロット後の膜のクーマシー染色を示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
代替戦略(すなわち、SECに続いてイオン交換クロマトグラフィー)を、硫酸アンモニウム沈殿(ステップ4)後に得られた2mLの溶解物を用いて試験した(補足図2)。この実験の理論的根拠は、最初にSECを使用することによって、FAHD1含有画分を他のタンパク質の大部分から分離し、その後のイオン交換クロマトグラフィーを使用してタンパク質をさらに精製することができることである。まず、溶解物をpH7.4でSECを用いて分画した(ステップ6)。ウェスタンブロット分析により、ブタFAHD1を含むすべての画分が同定された。第二に、これらの画分を濃縮し、pH9の陰イオン交換カラムを用いてさらに精製した(ステップ5)。クロマトグラムおよびウェスタンブロット分析(補足図2)は、イオン交換クロマトグラムがウェスタンブロットの濃縮タンパク質レベルに関連する定義された狭いピークを示すため、この戦略が有望であることを示しています。ただし、この戦略の欠点は、SEC(2mL)に適用される初期容量によって制限されるため、この方法のスループットが非常に低いことです。例えば、豚の腎臓全体を処理することは実用的ではありません。
このプロトコルの別の変形例として、ブタFAHD1もフロースルー中に存在していた場合、アニオン交換カラムの前にカチオン交換カラムが含まれていた。プロトコールの各ステップにおいて、ブタFAHD1含有画分のサンプルをサンプリングし、他の場所12 に記載されるようにODxアッセイで試験した(補足図3)。特異的酵素活性は、純度のレベルとともに、すなわち、総タンパク質当たりのFAHD1の相対量の増加とともに増加する。
第2の例として、マウス肝臓からのFAHD1の抽出、すなわち、20匹のマウスから得られた肝臓組織の集合体が提示される。上記で提示した豚腎臓からのFAHD1の抽出と比較して、この抽出はより退屈であることが証明された。プロトコルのいくつかのステップで問題が発生しましたが、以下で説明します。全タンパク質は、ステップ2(補足図4)に記載されるように抽出した。マウス肝臓ホモジネートは非常に粘着性がありぬるぬるした実体である傾向があるので、濾紙(コーヒーフィルターユニットに類似)を使用して溶解液を予備ろ過し、抽出後に溶解緩衝液で1:3に希釈して、溶液をより液体のようにした。この希釈により、ろ過手順が強化されました。しかし、それはウェスタンブロットによるタンパク質のその後の検出をより退屈にした。濾過後、調製した溶解液は、さらなる使用前に濃縮しなければならなかった。全溶解液の10分の1を小分けして、以下の実験に使用した。
硫酸アンモニウム沈殿に関する第1の試験ステップ(補足図4I)は、遭遇する可能性のある問題を示した。高濃度の硫酸アンモニウムはSDS-PAGEゲルを破壊し、150Vで泳ぐとスマイル効果を引き起こします(補足図5A;陰性結果)。同じ SDS-PAGE を 80 V で実行すると、肯定的な結果が表示されます (補足図 5B)。後者の場合、スマイル効果は最初に形成されますが、印加される電圧が低いため最終的に解決されます。溶解液を濾別するために初期溶液を多希釈しなければならなかったため、これらのサンプルの初期ウェスタンブロット分析は成功しなかった、すなわち、陽性対照は抗体によって検出されたが、適用されたサンプル中のタンパク質は検出されなかった。この問題は、より高濃度の溶解液(遠心フィルターユニットを使用して濃縮)と抗体の両方を使用し、振とうしながら冷蔵室で一晩抗体を塗布することによって解決された。最終的に、ウェスタンブロット分析は、タンパク質が溶解物中に存在するという情報と、タンパク質が15%硫酸アンモニウムの上清中にまだ存在していたという情報の両方を提供しました(補足図5C)。注目すべきは、より多量の硫酸アンモニウム(>15%)を含むSDSサンプルが加熱中に沈殿し、タンパク質が失われたことである。これは、クーマシー染色およびウェスタンブロットにおいても見ることができる(補足図5C)。この効果は豚の腎臓では観察されなかったので、組織特異的である可能性があります。
15%での硫酸アンモニウム沈殿に続いて、10mLの溶解物をpH6.8の陽イオン交換クロマトグラフィーに適用した。ウェスタンブロット解析は、マウスFAHD1タンパク質がフロースルーにあるように表示した(図5A)。溶出されたタンパク質画分は軽微であるように思われる。ただし、この例ではイオン交換クロマトグラフィーの二次的な効果を示しています。プロトコールのこのステップでは、溶液は、タンパク質ではないかもしれない多くの化合物を依然として含んでいてもよい。イオン交換クロマトグラフィーは、このような汚染を取り除くための迅速かつ簡単な方法です。イオン交換クロマトグラフィーの実行には数時間かかるため(すべての洗浄ステップを含め、実験自体には30分かかります)、非タンパク質汚染からサンプルをクリアする簡単な方法を提供します。
図5:FPLCによるマウスFAHD1の精製。 クロマトグラムおよびブロット中の赤い矢印は、FAHD1の存在を示す。(a)硫酸アンモニウム沈殿を15%にした後、試料を遠心分離し、濾過(0.22 μm)し、陽イオン交換カラムにアプライした。ウェスタンブロット分析は、タンパク質がフロースルーにあることを示し、クロマトグラムは、このステップによって他のタンパク質の多くが除去されていないことを示している。ただし、入力の外観と粘度をフロースルーと比較すると、収集されたフロースルーがはるかに明確であることがわかります(右のパネルは入力とフロースルーを比較します)。(b)陽イオン交換カラムから回収したフロースルーを遠心分離フィルター を介して 2mLに還元し、pH7.4でサイズ排除クロマトグラフィーに適用した。(c)FAHD1を含む画分をプールし、濃縮し、pH9で第2ラウンドのサイズ排除クロマトグラフィーに適用した。(d)FAHD1を含む画分を再びプールし、銀染色でSDS−PAGEに塗布し、残りの汚染を見た。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
試料をさらにpH7.4でのサイズ排除クロマトグラフィーに適用した(図5B)。ウェスタンブロット分析は、マウスFAHD1タンパク質を含む画分を表示し、それをプールし、2mLに濃縮した。この2mL濃縮物を10μLのβメルカプトエタノールで-20°Cで凍結し、翌日解凍した。沈殿物が形成され、シリンジフィルターユニット(0.22μm) を介して 濾過された。SDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析のためのサンプルを採取し、マウスFAHD1タンパク質がまだ溶液中であることを確認した。
タンパク質を含むサンプル(ウェスタンブロット分析から)をプールし、遠心分離フィルター を介して 濃縮し、銀染色でSDS−PAGEに適用して、残りの汚染を確認した(図5D)。これにより、タンパク質溶液は高純度ではなく、マウス肝臓からこの方法 を介して 得られたタンパク質の量もそれほど高くないことが明らかになった(BCAアッセイキットを用いて決定された合計で数μg; 材料表を参照)。タンパク質収率は、ブタFAHD1(このステップで約1mg)の場合にはるかに高かった。豚の腎臓から抽出されたFAHD1タンパク質の純度レベルは約80%である(銀染色後に推定;データは示さず)。この純度は、例えば、規定された抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィー を介してさらに増加させることができる。このプロトコルのそのような制限および他の制限については、以下でさらに詳細に議論する。
| バッファ/ソリューション/材料の名前 | 組成 | ||
| クマシー脱染液 | 30% (v/v) EtOH;5 % (v/v) HOAc;ddH 2 Oで | ||
| クマシー染色液 | 0.05% クーマシー ブリリアントブルー R-250;50 % (v/v) MeOH;10 % (v/v) HOAc;ddH 2 Oで | ||
| モノQ高塩バッファー | 20 mM トリス塩酸;1 M NaCl;10 % グリセロール;ddH2Oで;NaOHでpHを9.0に調整する | ||
| モノQ低塩バッファー | 20 mM トリス塩酸;15 mM NaCl;ddH2O;NaOHでpHを9.0に調整する | ||
| モノS高塩バッファー | 44 mM NaH2PO4;6 mMNa2HPO4;1 M NaCl;ddH2O;HClでpHを6.8に調整する | ||
| モノS低塩バッファー | 44 mM NaH2PO4;6 mMNa2HPO4;15 mM NaCl;ddH2O;HClでpHを6.8に調整する | ||
| タンパク質溶解バッファー | 1x PBS (250 mL);50 mM NaF;1mM PMSF;2μg/mLアプロチニン、1mM活性化オルトバナジン酸塩;ddH 2 Oで | ||
| ウサギ抗hFAHD1ポリクローナル抗体(アフィニティー単離) | カスタムメイド;ウサギ血清から精製し、参考文献12に従ってFPLCで精製したポリクローナル抗hFAHD1抗体 | ||
| 組換えhFAHD1タンパク質ウェスタンブロットコントロール | 大腸菌で発現したウェスタンブロット対照タンパク質を、参考文献12に記載のFPLCで精製した。 | ||
| SDS-PAGE 5x サンプルバッファー | 300 mM トリス塩酸;500 ミリグラム DDT;10% (w/v) SDS;50% (v / v)グリセリン;0.05% (w / v) ブロモフェノールブルー;ddH2O;HClでpHを6.8に調整する | ||
| 不連続ページのためのSDS-PAGE解決ゲル(12.5%) | ddH2O (9.5 mL);3 M トリス塩酸 (2.2 mL);5.5mLの40%アクリルアミド/ビス溶液(29:1比);20% SDS (175 μL);テメッド (17 μL);10%過硫酸アンモニウム(175μL);スタッキングゲルの前にキャストし、それを重合させる。スタッキングゲルを上にキャストする | ||
| SDS-PAGE 実行バッファ | 25 mM トリス塩酸;190mMグリシン;0.5 % (w / v) SDS;ddH2O;NaOHでpHを8.3に調整する | ||
| 不連続ページのためのSDS-PAGEスタッキングゲル(12.5%) | ddH2O (3.8 mL);1 M トリス塩酸 (630 μL);500 μLの40%アクリルアミド/ビス溶液(29:1配給);20% SDS (25 μL);テメッド (5 μL);10%過硫酸アンモニウム(50μL);前記分割ゲルが重合した後にキャストする工程と、ゲルコームを適用して井戸を作る | ||
| SEC (G75) 実行バッファ | 15 mM トリス塩酸;300 mM NaCl;ddH2O;NaOHでpHを7.4に調整する | ||
| 銀染色現像液 | ddH2O中の250mMNa2CO3;使用前に12 μLの37%(v/v)ホルムアルデヒドを100 mLに加える | ||
| 銀染色定着液 | 40% (v/v) EtOH;10% (v/v) HOAc;ddH 2 Oで | ||
| 銀染色インキュベーション溶液 | 30% (v/v) EtOH;500 mM NaOAc;8mMNa2S2O3;ddH2O;オプション:使用前に100mLあたり50%(v/v)グルタルアルデヒドを600μL加える | ||
| 銀染色銀溶液 | 0.1% (w / v) AgNO3;ddH2O;使用前に25 μLの37%(v/v)ホルムアルデヒドを100 mLに加える | ||
| 銀染色停止液 | pH 7.6での40mM EDTA溶液;744mgのEDTAを40mLのddH2Oに移し、NaOHを加えて溶解させ、pHを7.6に調整する。最後に、総容量を50mLに調整する。 | ||
| ウェスタンブロットブロッキングバッファ | 0.1%(v / v)トゥイーン20および5%(w / v)脱脂粉乳を含むPBS。ろ過 | ||
| ウェスタンブロット転送バッファ(10x) | トリス塩酸250ミリアンペア月;グリシン1.92M;ddH2O;NaOHでpHを8.3に調整する。室温で保存する | ||
| ウェスタンブロット転送バッファ(1x) | ウェスタンブロット転写バッファー(10x)100mL;800mLのddH2O;100mLのMeOH;4°Cで保存 | ||
| ウェスタンブロット洗浄バッファー(PBS-T) | PBS (0.1% (v/v) トゥイーン 20 | ||
表 1.
補足図1:豚腎臓からの総タンパク質抽出。 (A)腎臓組織を、摺動を防ぐためにポリスチレンフォームの上に置き、適切に洗浄されたガラス板上のメスを用いて切断した。(B)タンパク質/プロテアーゼ阻害剤を含む20mLの氷冷溶解緩衝液を含む50mLチューブを氷上でインキュベートする。(c)腎臓組織片を、体積が約30mLに達するまで緩衝液に投入した;(d)超音波を用いて均質化した腎臓組織(すなわち、超音波処理);(e)粗ホモジネートを卓上遠心分離機で中速で30分間遠心分離した;(f)複数のサンプルを同時に処理した工程;(g)最初の遠心分離後、上清を遠沈管に移し( Eと比較して)、高速(10,000 x g)で30分間遠心分離した;(h)この遠心分離工程は、別のペレットおよび上清を生じ、これを50mLチューブに移す工程;(I/J)予備溶解物を0.45 μmおよび0.2 μmのフィルターユニットで順次ろ過し、10 mLバッチに小分けし、液体窒素でスナップ凍結してその後-80°Cで保存します。 ウェスタンブロット分析は、すべてのサンプル(ペレット、上清、濾過溶解物)中のタンパク質の存在を検証するために使用される。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:FPLCによるブタFAHD1の精製;代替戦略。 クロマトグラムおよびブロット中の赤い矢印は、FAHD1の存在を示す。(a)pH7.4でのサイズ排除クロマトグラフィー(FPLC)による25%での硫酸アンモニウム沈殿によって得られた溶解物からのブタFAHD1の精製。ウェスタンブロット分析により、ブタFAHD1を含む画分を同定し、それらをプールして濃縮した。(B)サイズ排除クロマトグラフィー(パネル A)で予め精製したタンパク質サンプルを、陰イオン交換クロマトグラフィー(FPLC) を介して さらに精製した。ウェスタンブロット分析は、ブタFAHD1を含む画分を同定し、それらをプールして濃縮した。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図3:ブタFAHD1の比酵素活性。純度レベルを上昇させる関数として比酵素活性を測定した。この表は、相対酵素活性(nmol/分)と比酵素活性(μmol/分/mg)を比較したものです。アッセイは、各精製ステップの後にブタFAHD1の絶えず増加する活性を示す。大腸菌から得られた組換えHis/SヒトFAHD1(緑色)と比較した。図12において、豚FAHD1はわずかに高い活性(赤色)を示した(n=3)。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図4:マウス肝臓からの総タンパク質抽出。 (A、B、C)20匹のマウスからのスナップ凍結肝臓組織および溶解緩衝液を50mLチューブ中で氷上で調製した;(D,E,F)肝臓組織を超音波を用いて均質化(すなわち、超音波処理);粗ホモジネートを卓上遠心分離機で中速で30分間遠心分離した。上清を遠沈管に移し、高速(10,000 x g)で30分間遠心分離した。(G,H,I)予め溶解物をペーパーフィルター、0.45μmおよび0.2μmフィルターユニットで順次ろ過し、10mLバッチに小分けし、液体窒素で急速凍結してその後-80°Cで保存する。(j)硫酸アンモニウムを、溶液からタンパク質を沈殿させるために、異なる濃度(最大5%〜30%)で溶解物に添加し;(k)硫酸アンモニウム沈殿後に得られたペレット(パネル J)をH2Oに再懸濁し、SDS−PAGEおよびウェスタンブロット分析のためのサンプルを採取した。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図5:マウスFAHD1についての硫酸アンモニウム沈殿およびウェスタンブロットスクリーニング。 ブロット中の赤い矢印はFAHD1の存在を示す。(a)SDS−PAGEを硫酸アンモニウム沈殿後に得られたサンプルと共に、125Vで実行した。このゲルは劇的なスマイル効果を示し、そのようなゲルは評価できません。これは否定的な結果の例です。(B)同じサンプル(パネルA)を用いたSDS-PAGEを、完了するまで80Vで実行した。このゲルにはスマイル効果はなく、これは肯定的な結果の一例です。(c)SDS PAGE及び硫酸アンモニウム沈殿後に得られた試料のウェスタンブロット分析。硫酸アンモニウムのより高い濃度のサンプルは、示されているように、サンプルバッファー内で沈殿することがあります。それらは失われ、クーマシー染色(左)またはウェスタンブロット分析(右)のいずれか によって 検出できなくなります。硫酸アンモニウムの最良の濃度は、この場合、15%であると決定された。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
プロトコルの重要なステップ
タンパク質の取り扱いに関する一般的なガイドラインに従うことは、氷上や適度なpHおよび塩条件下での作業など、不可欠です。プロテアーゼ阻害剤の使用は、この方法にとって有益であるが、プロテアソーム阻害剤の使用は強く推奨される。サンプルを凍結および融解すると、常にタンパク質沈殿(少なくとも部分的に)が生じる可能性があるため、初期タンパク質溶解物の融解アリコート(ステップ2)は、中断することなく連続的に処理する必要があります。解凍後の遠心分離および濾過は、一般に、微小沈殿を除去するために推奨される。
組織から得られた最初のタンパク質溶解物には、タンパク質以外にも多くの物質が含まれています。イオン交換クロマトグラフィーカラムは、溶解物を透明化するために使用することができる。抽出したいタンパク質がイオン交換カラムに結合しなくても、フロースルーは入力溶液よりもはるかに明確で、後続のステップで処理が容易です。これは、マウス腎臓からのFAHD1の抽出について示される( 図5A参照)。
方法の制限と修正
このプロトコルは、組織からのFAHD1の抽出のためのプロトコルを記述する。この戦略に基づいて、他の組織からFAHDタンパク質(FAHD1、FAHD2)を抽出するための一般的なアプローチが導出され得るが、個々の症例に特異的な適応が必要な場合がある。この方法の暗黙の限界は、所与の組織におけるFAHD1(またはFAHDタンパク質)の相対的発現レベルおよび適切な量でのこの組織の利用可能性である。このプロトコールに記載される全体的なスキームは、最初に適切な量の組織においてタンパク質の高発現を必要とする。ブタ腎臓およびマウス肝臓からのFAHD1の抽出のための例が提供されており、これらはタンパク質の高い発現レベルを示す2つの器官である。このプロトコールに記載される各ステップにおいて、試料の暗黙の損失があり、すなわち、タンパク質の低初期量はさらに減少する。最終的に、このプロトコルを使用して達成できるタンパク質の量は少なくなります。豚の腎臓は大きな器官であるため、このアプローチによって2つの腎臓から約1グラムのタンパク質(純度約80%、推定)を抽出することができます。マウス肝臓からのFAHD1の抽出に同じプロトコールを適用するには、20匹のマウスから肝臓サンプルを採取する必要があり、最終的にわずか数μgのタンパク質しか得られなかった。概説された方法を用いてより高純度のタンパク質を得ることは退屈である可能性があり、銀染色は、サイズ排除クロマトグラフィー後も溶液中に他の多くのタンパク質がまだ存在する可能性があることを明らかにしている。モノクローナル抗体(例えば、CAB025530)を使用して、アフィニティークロマトグラフィー(NHS活性化カラム) を介して このプロトコルを強化することができます。
ここにリストされているすべてのプロトコルは、抽出したいタンパク質が可溶性であることを要求します。クロマトグラフィーのための硫酸アンモニウム沈殿およびpH/塩調整の最適条件を試験し、定義する必要があります。イオン交換クロマトグラフィーが良好な精製結果を提供しない場合、FPLCを行う前にクロマトグラフィー緩衝液に対する透析を行うことは、タンパク質の溶解度およびクロマトグラフィーの分解能を改善する選択肢であり得る。しかし、粗溶解液を透析することは、透析チューブ内で大規模で制御不能なタンパク質沈殿を引き起こす可能性があるため、推奨されません。タンパク質が疎水性である傾向がある場合、問題が生じる可能性があり、タンパク質が疎水性が高い場合(例えば、膜タンパク質)は、プロトコルが適用できない可能性がある。所与の組織溶解物中のFAHD2について見出されるようにFAHDタンパク質が部分的に不溶性である場合(データは示さず)、他のタイプのクロマトグラフィー、例えば疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)も同様に探索され得る12。
標準プロトコルの 2 つの変更が結果セクションに示されています。ブタ腎臓からのFAHD1の精製のために、イオン交換クロマトグラフィーの前にサイズ排除クロマトグラフィーを使用した( 補足図2参照)。この方法の問題点は、サイズ排除クロマトグラフィーではランニングトラックが大きく、サンプル量が実行中に強く増加することです。サンプル量は、高分解能23を達成するためにベッド容量の2%を超えてはならず、最終的な希釈係数は収集された溶出量にも依存します。120 mL カラムを使用した提供の例では、初期容量 2 mL を推奨します。初期試料は、硫酸アンモニウム沈殿後の数mLの溶解液から、遠心フィルターユニットを用いた濃縮によって、凝集または沈殿アーチファクトなしに収集され得る。ブタ腎臓からのFAHD1の精製のための例が代表的な結果として提供される( 補足図2も参照のこと)。ただし、少量のサンプルのみに制限があるため、このアプローチは実用的ではない場合があります。
方法の用途または指示
細菌からの組換えタンパク質の発現および精製は、タンパク質24、25の実現可能な量(グラム単位)を得るために、簡単で十分に確立された方法である。これはFAHD112で提示されています。しかしながら、これらの方法を使用することには、宿主の貧弱な成長、封入体形成、タンパク質活性の喪失または変化、およびしたがって、タンパク質を全く得られない可能性、またはタンパク質の偏った形態(ミスフォールディング、悪い翻訳後修飾など)をもたらす可能性など、いくつかの可能な欠点がある。したがって、組織からよく折り畳まれ、適切に修飾されたタンパク質を直接抽出できる方法の開発は魅力的です。しかしながら、大きな問題は、ほとんどのタンパク質が有意なレベルで発現していないことであり、そして細菌からのタンパク質の暗黙の誘導およびその後の抽出と比較して、得られるタンパク質の量は典型的には数桁低い。細菌からの組換えタンパク質の安価で容易な抽出と、組織からのタンパク質のより高価で退屈な抽出との間にはトレードオフがある。後者の主な進歩は、その折り畳みおよび/または触媒活性に影響を与える可能性のあるすべての相互効果を含む、組織中に存在する生理学的形態でタンパク質を抽出することができることである。
このプロトコールによって抽出および精製されたタンパク質は、FAHD113の有能な阻害剤、可能なタンパク質相互作用パートナー9、およびタンパク質9の可能性のあるまだ発見されていない役割を同定するのに役立つであろう。酵素阻害剤の研究、モノクローナル抗体の開発、そもそものタンパク質構造の研究は、細菌から抽出するのではなく、組織から抽出されたタンパク質を高純度で持つ場合に大きく支持されます。
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Disclosures
著者らは競合する金銭的利益を持っていない。
Acknowledgments
著者らは、Ayse ÖztürkとEva Albertiniによる技術支援に非常に感謝しています。肝臓組織の生成に用いたマウスは、大学-Dozの監督下で維持した。Pidder Jansen-Dürr博士(インスブルック大学生物医学老化研究所、Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Austria).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filter units | MERCK | SLGP033RS | Millex-HP, 0.22 µm, PES 33 mm, not steril |
| 0.45 µm filter units | MERCK | SLHP033NS | Millex-HP, 0.45 µm, PES 33 mm, not steril |
| 15 mL Falcon tubes | VWR | 734-0451 | centrifugal tubes |
| 50 mL Falcon tubes | VWR | 734-0448 | centrifugal tubes |
| 96-Well UV Microplate | Thermo-Fischer | 8404 | UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates |
| Acrylamide/Bis Solution (40%, 29:1 ratio) | BIO-RAD | #1610147 | 40% acrylamide/bis-acrylamide, 29:1 (3.3% crosslinker) solution for casting polyacrylamide gels |
| ÄKTA FPLC system | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | - | using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the "ÄKTA pure" system |
| Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | MERCK | UFC901024 | centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 15 mL |
| Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | MERCK | UFC801024 | centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 4 mL |
| Ammonium sulfate powder | MERCK | A4418 | ammonium sulphate for molecular biology, ≥99.0% |
| Ammoniumpersulfat reagent grade, 98% | MERCK | 215589 | Catalyst for acrylamide gel polymerization. |
| Coomassie Brilliant blue R 250 | MERCK | 1125530025 | Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) for electrophoresis Trademark of Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6.2 (10 g/l, H2O, 25 °C) |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MERCK | D9277 | Cellulose membranes for the exchange of buffers via dialysis. |
| Eppendof tubes 1.5 mL | VWR | 525-1042 | microcentrifugal tubes; autoclaved |
| HiLoad 26/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 28989334 | HiLoad Superdex 75 pg prepacked columns are for high-resolution size exclusion chromatography of recombinant proteins |
| Immun-Blot PVDF Membrane | BIO-RAD | #1620177 | PVDF membranes are protein blotting membranes optimized for fluorescent and multiplex fluorescent applications. |
| Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | #1703930 | Use the Mini Trans-Blot Cell for rapid blotting of Mini-PROTEAN precast and handcast gels. |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels | BIO-RAD | #1658004 | 4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam. |
| Mono Q 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 17516701 | Mono Q columns are strong anion exchange chromatography columns for protein analysis or small scale, high resolution polishing of proteins. |
| Mono S 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 17516901 | Mono S columns are strong cation exchange chromatography columns for protein analysis or small scale high resolution polishing of proteins. |
| PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa | Thermo-Fischer | 26616 | A mixture of 10 blue-, orange-, and green-stained proteins (10 to 180 kDa) for use as size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo-Fischer | 23225 | A two-component, high-precision, detergent-compatible protein assay for determination of protein concentration. |
| Sonifier 250; Ultrasonic Cell Disruptor w/ Converter | Branson | - | New models at https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf |
| Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP (affinity isolated) | Agilent Dako | P0399 | The antibody used for horseradish peroxidase conjugation reacts with rabbit immunoglobulins of all classes. |
| TEMED, 1,2-Bis(dimethylamino)ethane, TMEDA | MERCK | T9281 | TEMED (N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine) is molecule which allows rapid polymerization of polyacrylamide gels. |
| Tube Roller | - | - | A general tube rotator roller; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71 |
| Tube Rotator | - | - | A general tube rotator wheel; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123 |
| ULTRA-TURRAX; T 25 digital | IKA | 0003725000 | New models at https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/ |
References
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