Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Extraktion och rening av FAHD1-protein från svinnjure och muslever

Published: February 18, 2022 doi: 10.3791/63333
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Research Institute for Biomedical Aging Research, University of Innsbruck

Summary

Detta protokoll beskriver hur man extraherar fumarylacetoacetathydrolasdomäninnehållande protein 1 (FAHD1) från svinnjure och muslever. De förtecknade metoderna kan anpassas till andra proteiner av intresse och modifieras för andra vävnader.

Abstract

Fumarylacetoacetathydrolasdomäninnehållande protein 1 (FAHD1) är den första identifierade medlemmen av FAH-superfamiljen i eukaryoter, som fungerar som oxaloacetatdekarboxylas i mitokondrier. Denna artikel presenterar en serie metoder för extraktion och rening av FAHD1 från svinnjure och muslever. Omfattade metoder är jonutbyteskromatografi med snabb proteinvätskekromatografi (FPLC), preparativ och analytisk gelfiltrering med FPLC och proteomiska tillvägagångssätt. Efter total proteinutvinning undersöktes ammoniumsulfatutfällning och jonutbyteskromatografi, och FAHD1 extraherades via en sekventiell strategi med jonutbyte och storleksuteslutningskromatografi. Detta representativa tillvägagångssätt kan anpassas till andra proteiner av intresse (uttryckt på signifikanta nivåer) och modifieras för andra vävnader. Renat protein från vävnad kan stödja utvecklingen av högkvalitativa antikroppar och/eller potenta och specifika farmakologiska hämmare.

Introduction

Det eukaryota FAH-domäninnehållande proteinet 1 (FAHD1) fungerar som bifunktionellt oxaloacetat (OAA) dekarboxylas (ODx)1 och acylpyruvathydrolas (ApH)2. Det är lokaliserat i mitokondrier2 och tillhör den breda FAH-superfamiljen av enzymer 1,2,3,4,5,6. Medan dess ApH-aktivitet endast är av mindre relevans, är ODx-aktiviteten hos FAHD1 involverad i regleringen av TCA-cykelflödet 1,7,8,9. OAA krävs inte bara för den centrala citratsyntasreaktionen i trikarboxylsyracykeln utan fungerar också som en konkurrerande hämmare av succinatdehydrogenas som en del av elektrontransportsystemet och som en kataklerotisk metabolit. Nedreglering av FAHD1-genuttryck i humana navelvenendotelceller (HUVEC) resulterade i en signifikant minskning av cellproliferationshastigheten10 och signifikant hämning av mitokondriell membranpotential, associerad med en samtidig övergång till glykolys. Arbetsmodellen avser mitokondriell dysfunktion associerad senescens (MiDAS)11-liknande fenotyp8, där mitokondriella OAA-nivåer regleras hårt av FAHD1-aktivitet 1,8,9.

Rekombinant protein är lättare att få via uttryck och rening från bakterier12 snarare än från vävnad. Ett protein som uttrycks i bakterier kan emellertid vara partiskt av eventuell brist på post-translationella modifieringar, eller kan helt enkelt vara problematiskt (dvs. på grund av plasmidförlust, bakteriella stressreaktioner, förvrängda / oformade disulfidbindningar, ingen eller dålig utsöndring, proteinaggregering, proteolytisk klyvning etc.). För vissa tillämpningar måste protein erhållas från celllysat eller vävnad för att inkludera sådana modifieringar och/eller utesluta eventuella artefakter. Renat protein från vävnad stödjer utvecklingen av högkvalitativa antikroppar och/eller potenta och specifika farmakologiska hämmare för utvalda enzymer, såsom för FAHD113.

Detta manuskript presenterar en serie metoder för extraktion och rening av FAHD1 från svinnjure och muslever. De beskrivna metoderna kräver snabb proteinvätskekromatografi (FPLC) men använder i övrigt vanlig laboratorieutrustning. Alternativa metoder kan hittas någon annanstans 14,15,16,17. Efter total proteinextraktion innefattar det föreslagna protokollet en testfas, där underprotokoll för ammoniumsulfatutfällning och jonutbyteskromatografi diskuteras (Figur 1). Efter att ha definierat dessa underprotokoll extraheras proteinet av intresse via en sekventiell strategi med hjälp av jonutbyte och storleksuteslutningskromatografi med FPLC. Baserat på dessa riktlinjer kan det slutliga protokollet anpassas individuellt för andra proteiner av intresse.

Figure 1
Figur 1: Den övergripande strategin för detta protokoll. Från topp till botten: Protein extraheras från vävnader. Vävnadshomogenat framställs, centrifugeras och filtreras. För varje par supernatanta och pellet-härledda prover, tester för ammoniumsulfat utfällning och jonisk utbyte kromatografi (FPLC) måste utföras för att sondera för optimala förhållanden. Efter upprättandet av dessa underprotokoll kan proteinet extraheras via ett sekventiellt förfarande för ammoniumsulfatutfällning, jonbyteskromatografi och repetitiv storleksuteslutningskromatografi (FPLC) vid varierande pH- och saltkoncentrationer. Alla steg måste kontrolleras av western blot. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experiment utfördes i enlighet med institutionella riktlinjer. Svinnjure erhölls färsk från den lokala stormarknaden. Levervävnader skördades från C57BL6 vildtypsmöss som underhålls vid Institutet för biomedicinsk åldrandeforskning vid Innsbruck University, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Österrike under överinseende av Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr, omfattas av etiskt tillstånd som projektledare utfärdat 2013 (BMWF-66.008/0007-II/3b/2013). Underhåll och användning av mössen för projektet omfattas av etiskt tillstånd nr 2020-0.242.978 från 5 maj 2020, utfärdat av det österrikiska ministeriet för utbildning, vetenskap och forskning (BMBWF).

1. Förberedelser

OBS: Innan protokollet börjar måste flera saker förberedas, dvs proteinlysbufferten, råvävnadsprovet och en specifik antikropp, förutom allmänna kemikalier och material.

  1. Förbered 250 ml proteinlysbuffert per 100 g nettovikt av vävnad: 250 ml 1x PBS med 50 mM NaF, 1 mM PMSF, 2 μg / ml aprotinin och 1 mM aktiverat ortovanadat (se tabell 1). Filtrera lösningen med en 0,22 μm sprutfilterenhet.
    OBS: Aktivering av ortovanadat krävs före användning för att omvandla det till en mer potent hämmare av proteintyrosinfosfataser18. Aktiverat ortovanadat kan erhållas från kommersiella leverantörer, men också framställas enligt följande.
    1. Förbered en 200 mM stamlösning av (natrium) ortovanadat iddH2O. För beredning av 10 ml lösning, tillsätt 368 mgNa3VO4 till 9 ml vatten och lös upp genom omrörning. När den är upplöst, gör upp volymen till 10 ml medddH2O.
      OBS: Start-pH för natriumortovanadatlösningen kan variera med materialkällan, och pH måste justeras till 10 i ett repetitivt tillvägagångssätt enligt följande.
    2. Beroende på lösningens initiala pH, justera pH till 10 med NaOH eller HCl. Vid pH > 10 kommer lösningen att ha en gul färg. Koka lösningen tills den blir färglös, kyl ner den till rumstemperatur och kontrollera pH. Om pH är >10, tillsätt en liten volym HCl för att justera pH till 10. Vid denna tidpunkt kan lösningen bli gul igen.
    3. Upprepa kokningen och kylningen tills lösningen förblir färglös och pH stabiliseras vid 10 (ungefär 5-7 gånger). Vid denna tidpunkt resulterar tillsats av HCl i ett svagt utseende av gul färg i lösningen. Förvara aktiverat ortovanadat i 1 ml alikvoter vid -20 °C.
  2. Förbered rör med 2 ml lysbuffert per gram vävnad och placera dem på is.
    OBS: Detta protokoll använde åtta 50 ml rör, var och en fylld med 30 ml lysbuffert totalt för en svinnjure (ca 100-150 g) och två rör vardera fyllda med 40 ml lysbuffert för 20 muslever (vardera 1-2 g) totalt.
  3. Förbered vävnaden: dissekera vävnaden på en förrenad glasplatta placerad på is i en polystyrenskumlåda. Skär vävnadsbitar på cirka 100 mg vardera för att enkelt överföras till respektive rör för efterföljande lys. Överför vävnadsbitarna till de förberedda rören (steg 1.2).
  4. Förbered en mättad ammoniumsulfatlösning: värm 500 ml ddH2O till 70 °C och tillsätt gradvis ammoniumsulfatpulver under omrörning (se materialtabell) tills inget mer ammoniumsulfat är upplöst. Kyl denna (över)mättade lösning till rumstemperatur och förvara den vid 4 °C över natten.

2. Total proteinutvinning

Efter att ha förberett provet i kallproteinlysbuffert (se steg 1.3), homogenisera vävnaden så gott som möjligt via ultraljudsbehandling av en ultraljudssond, eller med hjälp av en elektrisk homogenisator enligt följande.

  1. Homogenisering av vävnader
    1. När det gäller en svinnjure, sonicate suspensionen helst av en ultraljudssond medan provet hålls på is (10 cykler med 15 s puls, med intervaller på 30 s mellan pulserna för att kyla provet på is, vid medelamplitud med 50% arbetscykel).
    2. När det gäller musorgan, homogenisera suspensionen med en elektrisk homogenisator (börjar med låg kraft och långsamt accelererar till medelkraft) samtidigt som provet hålls på is. Tvätta regelbundet den elektriska homogenisatorn i PBS för att ta bort organiskt material som täpper till enheten.
    3. Ta 20 μL ur proverna och kontrollera under mikroskopet om cellerna i den homogeniserade vävnaden är korrekt förstörda; annars upprepar du homogeniseringen.
  2. Centrifugera rören i en bordscentrifug vid 10 000 x g i 30 min vid 4 °C.
    OBS: Eventuellt centrifugera supernatanten en andra gång vid 20 000 x g i 30 min vid 4 ° C för att eliminera små fraktioner av den ursprungliga pelletsen som kan ha överförts. Detta kommer att förenkla den efterföljande filtreringen i steg 2.3.
  3. Samla supernatanten i ett nytt rör och lägg den på is. Filtrera supernatanten sekventiellt med 0,45 μm och 0,22 μm sprutfilterenheter. Alicitera supernatanten i 10 ml satser och frys dem vid -20 °C för kortvarig lagring eller vid -80 °C för längre lagring.
    OBS: Förfiltrering med 0,45 μm tar bort majoriteten av partiklarna innan ett andra filtreringssteg med 0,22 μm tar bort de finare partiklarna. Att använda filtret 0,22 μm direkt kan orsaka risk för igensättning av filtren.
  4. Förbered ett 50 μL-prov för SDS-PAGE/western blot-analys genom att tillsätta 10 μL 5x SDS-provbuffert (se tabell 1) till 40 μL av supernatanten och koka sedan vid 95 °C i 10 min.
    1. Eventuellt kan du återanvända cirka 100 μL pellets erhållen i steg 2.2 i 900 μLddH2Ooch förbereda ett prov för SDS-PAGE/western blot-analys enligt beskrivningen ovan.
      OBS: Inkludering av pelletshärledda prover i western blot-analysen, förutom den positiva kontrollen, kommer att indikera om uttrycket av proteinet är lågt eller om antikroppen är problematisk.

3. SDS-PAGE och western blot analys

OBS: Western blot analys krävs för att kontrollera om protein löslighet. Nedan beskrivs ett protokoll för elektroblottning med hjälp av ett vått / tankblottningssystem (se Materialtabell). Ett alternativt protokoll för SDS-PAGE finns någon annanstans19.

  1. Förbered en diskontinuerlig 12,5% polyakrylamid SDS-PAGE-gel enligt tillverkarens instruktioner (dvs. en staplingsgel ovanpå en upplösande gel; se tabell 1). Kör de prover som tidigare förberetts under steg 2 (liknande steg 4, 5 och 6; se nedan).
    1. Ladda en proteinmarkörstege i den första brunnen (se Materialtabell). Ladda 5 ng hFAHD1 rekombinant protein (erhållet från bakterier12; se tabell 1) som en positiv kontroll i den andra brunnen.
    2. Ladda därefter 20 μL av provet som ska analyseras och fyll alla återstående brunnar med 20 μL beredd SDS-PAGE 1x provbuffert (dvs 5x provbuffert utspädd medddH2O). Kör SDS-PAGE-gelerna vid 125 V med hjälp av bufferten som körs på SDS (se tabell 1).
  2. När SDS-PAGE är klar, utför en western blot-analys och sondera membranen med hjälp av den tillgängliga antikroppen som höjs mot FAHD1 (se tabell 1).
    OBS: Eftersom proverna tas från råvävnadshomogenat äventyras vanligtvis kvaliteten på SDS-PAGE och western blot-analysen vid denna tidpunkt; Det är dock viktigt att kontrollera om proteinet som ska extraheras är lösligt i supernatanten. Följande protokoll testades för svinnjure och olika musorgan, inklusive lever, hjärta, hjärna och njure.
    1. Förbered 10x western blot transfer buffert (se tabell 1). Förbered 1x western blot transfer buffert (se tabell 1) och kyl den till 4 °C.
    2. Aktivera ett PVDF-membran i 2 min i metanol. Tvätta membranet i ddH2O i 2 min. Balansera membranet i 15 min i 1x western blot transfer buffert.
    3. Tvätta SDS-gelén med 1x PBS i 10 min medan du skakar för att ta bort SDS-löpande buffert och inkubera sedan gelén i 1x western blot transfer buffert i 10 min för jämvikt. Montera elektroblottingkassetten (dvs kombinera det aktiverade PVDF-membranet och gelerna) enligt tillverkarens instruktioner.
    4. Kör fläcken via elektroblotting vid 300 mA i 1 timme i en polystyrenskumlåda fylld med is eller i kylrummet (4 ° C). Överför PVDF-membranet till ett 50 ml rör med dess exponerade sida vänd mot rörets inre sida. Inkubera membranet i 20 ml western blot blocking buffer (se tabell 1) över natten vid 4 °C medan du rullar på en rörrulle (se Materialtabell).
    5. Nästa dag, tvätta membranet i 5 min med 20 ml western blot tvättbuffert (PBS med 0,1% (v / v) Tween 20) i samma rör medan du rullar. Inkubera membranet i samma rör med den primära antikroppen2 (riktad mot FAHD1; se tabell 1) utspädd 1:500 i western blot blocking buffert i 1 timme vid rumstemperatur under rullning.
    6. Tvätta membranet i samma rör tre gånger i 10 minuter vardera med 20 ml western blot tvättbuffert medan du rullar. Inkubera membranet i 30 min vid rumstemperatur med HRP-konjugerad sekundär antikropp (se materialtabell) utspädd 1:3000 i 5 ml western blot blocking buffert.
    7. Tvätta membranet i samma rör tre gånger i 10 min vardera med 20 ml western blot tvättbuffert och två gånger i 5 min vardera med 1x PBS. Torka membranet genom att försiktigt hålla det med pincett på ena kanten och genom att röra vid en bit cellulosa eller en bit Whatman-papper med motsatt (nedre) kant av membranet. Lägg membranet (exponerad sida uppåt) på en rengjord glasplatta.
    8. Täck försiktigt hela membranet med 1 ml beredd ECL western blot substrat med en pipett, var försiktig så att du inte skapar några luftbubblor. Låt ECL-lösningen inkubera i 3 minuter och utveckla omedelbart membranet med röntgenfilm eller med hjälp av ett bildsystem.
      OBS: Om proteinet detekterades i inget av proverna utan endast i den positiva kontrollen kan detta tyda på att proteinet är olösligt eller inte finns i tillräckliga mängder som ska detekteras av antikroppen. Om endast nanogram av den positiva kontrollen laddades är det första scenariot mer sannolikt. Om inget protein upptäcktes alls, kontrollera antikroppens kvalitet och kanske byta till en polyklonal antikropp snarare än en monoklonal antikropp. I sällsynta fall, dvs. för vissa hydrofoba proteiner, kan proteinet vara detekterbart efter centrifugering, men inte efter filtrering. I ett sådant fall rekommenderas att använda speciella filterenheter för hydrofoba proteiner.
  3. Eventuellt fläcka PVDF-membranen efter western blot för att kontrollera den framgångsrika överföringen av proteinet från SDS-PAGE-gelén till PVDF-membranet.
    OBS: Coomassie-färgning rekommenderas för felsökning, metodutveckling och dokumentation, men tänk på att efter applicering av detta protokoll förloras membran till ytterligare western blot-analys. Ponceau S-färgning ger svagare färgning men kan användas om membranen ska undersökas igen.
    1. Förbered små brickor som innehåller färgningen (Coomassie eller Ponceau S) och avfärgningslösningar.
    2. Använd pincett, sätt membranet i färgningslösningen och skaka försiktigt tills membranet är färgat väl (5-10 min).
    3. Överför membranet till den kvarhållande lösningen och skaka tills lösningen är mättad (5-10 min). Upprepa kvarhållandet tills proteinbanden kan observeras på membranet; om inga band observeras alls, upprepa färgningen med en längre inkubationstid. Torka membranet genom att placera det på en glasplatta med pincett.

4. Testning: Ammoniumsulfatutfällning

OBS: Ammoniumsulfatutfällning är en metod för proteinrening genom att förändra proteinets löslighet. I ett preliminärt experiment ökas ammoniumsulfatkoncentrationen sekventiellt till ett värde som fäller ut en maximal mängd proteinföroreningar, samtidigt som FAHD1 lämnas i lösning. Lösligheten hos proteinet undersöks igen via western blot-analys.

  1. Fortsätt från steg 2.3: tina antingen en alikvot av provet eller fortsätt direkt efter proteinextraktion (dvs. utan att frysa provet). Filtrera provet med en filterenhet på 0,22 μm för att utesluta eventuella utfällningar efter upptining. Förbered sex 1,5 ml rör på is och överför 250 μL prov till varje rör.
  2. Förbered en utspädningsserie av 5%, 10%, 15%, 20%, 25% och 30% ammoniumsulfat i rören beredda ovan och utgör den slutliga volymen till 1000 μL med proteinlysbuffert. Inkubera proverna vid 4 °C över natten på en rörrotator (se Materialtabell).
  3. Använd en bordscentrifug, centrifugera vid 10 000 x g i 30 minuter vid 4 ° C och överför försiktigt alla supernatanter till separata rör. Lufttorka de resulterande pelletsna och återsuspendera var och en av dem i 1000 μLddH2O.
  4. För varje par resuspenderade pellets och supernatant från föregående steg, blanda 40 μL med 10 μL 5x SDS-provbuffert och koka vid 95 ° C med öppna lock tills det mesta av vätskan har förångats. Återsuspendera sedan pelletsen i en blandning av 50% DMSO iddH2O.
  5. Utför SDS-PAGE (steg 3) men kör gelerna vid 80 V i 3 timmar. För varje koncentration av ammoniumsulfat, ladda proverna härledda från den återutnyttjade pelleten och supernatanten (steg 4.3) i par. Utför en western blot-analys (steg 3).
  6. Kontrollera om det finns den högsta koncentrationen av ammoniumsulfat, vid vilken proteinet som ska renas (dvs. FAHD1) förblir i provet som härrör från supernatanten. Baserat på resultaten, definiera ett ammoniumsulfatutfällningsprotokoll för proteinet av intresse, som ska användas i framtida experiment.
    OBS: Ammoniumsulfat är välkänt för att snedvrida SDS-PAGE och western blot. När koncentrationen av ammoniumsulfat ökar kommer kvaliteten på western blot-analysen att äventyras. Men som med steg 3 tidigare används denna analys för att kontrollera lösligheten hos proteinet av intresse vid givna koncentrationer av ammoniumsulfat. Detta protokoll syftar till att fälla ut andra proteiner, medan proteinet som ska renas måste förbli lösligt.

5. Testning: jonutbyteskromatografi med FPLC

OBS: Molekyler med laddade funktionella grupper är bundna till en kiseldioxidpartikelkolonn för FPLC, vilket möjliggör differentiering av proteiner enligt deras ytladdning. Utför detta steg två gånger med hjälp av katjonisk utbyteskolumn och anjonutbyteskolumn (se Materialtabell). Protokollstegen är desamma för antingen katjonisk eller anjonisk utbyteskromatografi, men buffertarna som ska användas är olika (se tabell 1). båda med "lågt salt" 15 mM NaCl och "högt salt" 1 M NaCl-förhållanden. För de kolumner som används rekommenderas en flödeshastighet på 1 ml/min.

  1. Ställ in FPLC-systemet med kolumnen anjonisk eller katjonisk utbyte. Tvätta kolonnen med 5 kolonnvolymer (CV) på 20% EtOH (iH2O), följt av 5 CV ddH2O. Tvätta växelviskolonnen med 1 CV låg saltbuffert, hög saltbuffert och återigen låg saltbuffert i ordningen tills inga fler toppar observeras i kromatogrammet, men tvätta minst en gång.
  2. Efter bestämning av det optimala protokollet för ammoniumsulfatutfällning i liten skala (steg 4), applicera utfällningsprotokollet till 10 ml originalvävnadshomogenat (steg 2). Eventuellt dialysera provet mot den låga saltbufferten.
    1. Applicera provet på kolonnen (t.ex. genom injektion eller med hjälp av en provpump) och samla upp genomströmningen. Tvätta kolonnen med 1 CV av den låga saltbufferten.
  3. Ställ in en linjär gradienteluering från 100% låg saltbuffert / 0% hög saltbuffert till 0% låg saltbuffert / 100% hög saltbuffert inom 3 CV. Samla kontinuerligt 1 ml fraktioner. När gradienten är klar, fortsätt att köra med den höga saltbufferten tills inga fler proteinassocierade toppar (UV-absorption vid 280/255 nm) detekteras i kromatogrammet över intervallet 1 CV.
  4. Applicera 1 ml 25% SDS upplöst i 0,5 M NaOH (iddH2O) för att rengöra kolonnen. Tvätta kolonnen i följd med 3 CVddH2Ooch 3 CV på 20% EtOH (i ddH2O).
  5. Samla in SDS-PAGE-prover av alla toppfraktioner och genomströmningen och sondera dem via western blot för närvaron av proteinet av intresse (steg 3). Snäppfry de uppsamlade fraktionerna i flytande kväve och förvara dem vid -80 °C.
  6. När western blot-analysen är klar, tina och slå samman fraktionerna som innehåller proteinet av intresse och kassera de andra. Upprepa steg 5.1-5.5 med den alternativa kolumnen (dvs. katjonisk eller anjonisk utbyteskolumn).
  7. Efter att båda kolumnerna har undersökts, definiera ett FPLC-protokoll för proteinet av intresse, som ska användas i framtida experiment. Minska volymen av proteinlösningen med hjälp av ultracentrifugeringsfilterenheter (10 kDa, se materialtabell) ner till 2 ml.
    OBS: Det finns två förväntade resultat av denna serie experiment. Antingen har proteinet av intresse fäst vid en av kolonnerna, och proteinlösningen är redan ganska ren efter eluering, eller så förblev proteinet i genomströmningen i båda fallen. I det senare scenariot, även om proteinet är i genomströmningen, kan rengöringseffekten av detta steg fortfarande vara betydande. I ett sådant fall, som för FAHD1 i svinnjure och muslever, kommer detta steg av jonutbyte fortfarande att utföras. Om varken katjon- eller anjonbyteskolonnen kan ge en korrekt rengöringseffekt kan man försöka modifiera lysatets och buffertens pH och dialysera provet mot den löpande bufferten innan den läggs på FPLC.

6. Proteinextraktion med hjälp av definierade delprotokoll för ammoniumsulfatutfällning och FPLC

OBS: Porösa partiklar i en kiselgelkolonn för FPLC (se materialtabell) möjliggör differentiering av proteiner enligt deras hydrodynamiska radie. De beskrivna stegen ska utföras med ett FPLC-system med användning av storleksuteslutningskromatografi (SEC). För den SEC-kolumn som används (se Materialtabell) rekommenderas en flödeshastighet på 0,3 ml/min.

  1. Förbered alla nödvändiga material (se steg 1) och extrahera det totala proteinet från vävnaden (se steg 2). Utför en ammoniumsulfatutfällning med allt vävnadshomogenat som inte användes för testning (se steg 4). För större volymer, koncentrera lysatet med ultracentrifugeringsfilterenheter (10 kDa; se materialtabell) ner till en mindre volym på 50 ml eller mindre.
  2. Utför ett första reningssteg med jonbyteskromatografi (se steg 5).
    1. Förbered prover för western blot, som beskrivits i föregående steg. Utför western blot-analys och poola alla FAHD1 som innehåller fraktioner från jonutbyteskromatografi.
    2. Minska volymen av proteinlösningen ner till 2 ml med hjälp av ultracentrifugeringsfilterenheter (10 kDa). Filtrera lösningen sekventiellt med 0,45 μm och 0,22 μm sprutfilterenheter för att avlägsna eventuell mikroutfällning.
  3. Balansera SEC-kolumnen med 1 CV för SEC löpande buffert (se tabell 1), som innehåller 1 mM DTT. Ladda provet på kolonnen och kör kromatografin tills alla proteiner är eluerade (1-2 CV).
    1. Samla in fraktioner av 1 ml av genomströmningen som motsvarar signifikanta toppar i kromatogrammet (UV-absorption vid 280/255 nm) och förbered 50 μL prover av varje insamlad fraktion för SDS-PAGE och western blot analys, som beskrivits i föregående steg. Frys alla fraktioner med flytande kväve och förvara dem vid -80 °C.
  4. Tvätta SEC-kolonnen i följd med 1 CVddH2Ooch 1 CV på 20% EtOH (i ddH2O). Utför western-Blot-analys och slå samman alla FAHD1 som innehåller fraktioner. Minska volymen av proteinlösningen ner till 2 ml med hjälp av ultracentrifugeringsfilterenheter (10 kDa, se Materialtabell).
  5. Bedöm proteinkoncentrationen med hjälp av ett kommersiellt BCA-analyskit (se Materialtabell).
    OBS: PH- och salthalten i den mobila fasen kan påverka elueringsprofilen för globulära proteiner20. Sura eller basiska förhållanden kan leda till att toppar är mindre definierade och ökade protein-matrisinteraktioner som leder till partiell retention av protein på kolonnen20. Denna effekt kan utnyttjas för ytterligare proteinrening. En upprepning av steg 6 med olika flödeshastigheter, pH och saltkoncentrationer kan öka proteinets renhet20.

7. Silverfärgning

OBS: Silverfärgningsanalys av SDS-PAGE-geler krävs för att kontrollera proteinföroreningar som kanske inte ses med Coomassie-färgning. Följande protokoll är en av många versioner som finns i litteraturen21. Utför alla inkubationssteg genom att skaka i en ren glasbricka. Samla alla silver- och formaldehydhaltiga vätskor i en speciell avfallsbehållare och kassera dem ordentligt.

  1. Inkubera SDS-PAGE-gelerna i silverfärgningsfixeringslösning (se tabell 1) över natten i kylrummet. Inkubera gelerna i silverfärgningsinkubationslösning (se tabell 1) i 3 timmar vid rumstemperatur. Alternativt tillsätt glutaraldehyd (se tabell 1) för att förbättra detekteringen av svaga band. Tvätta gelerna fyra gånger iddH2Oi 10 minuter vardera.
  2. Inkubera gelerna i silverfärgningssilverlösning (se tabell 1) i 1 timme.
    OBS: Tänk på att från och med nu innehåller alla vätskor och gelén i sig silver och formaldehyd som är giftiga.
  3. Inkubera gelerna i silverfärgningslösning (se tabell 1) med kraftig skakning tills banden är tydligt synliga. För att stoppa reaktionen, kassera utvecklarlösningen och inkubera omedelbart gelerna i silverfärgningsstopplösning (se tabell 1) i minst 10 minuter.
    OBS: Band färgade i steg 7.2 och 7.3 kommer ständigt att bli mer utvecklade. Att tillsätta mer formaldehyd till lösningen än vad som anges kan vara nödvändigt om färgningen är svag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

FAHD1-protein extraherades från svinnjure och muslever med hjälp av det presenterade protokollet. För musvävnad krävs flera organ för att erhålla flera μg efter det slutliga reningssteget. Av denna anledning fokuserar denna artikel på utvinning av FAHD1 från svinnjurar, vilket är ett mycket mer exemplifierande experiment. Extraktionen av FAHD1 från muslevern utförs för att presentera svårigheterna och möjliga fallgropar i detta protokoll. Det rekommenderas generellt att använda organ som visar en hög uttrycksnivå av det protein man vill rena. Human Protein Atlas22 kan vara till hjälp för att uppskatta uttrycket i modellsystemet, eller så kan man utföra preliminära western blot-experiment med olika råa vävnadslysater för att bedöma dessa nivåer. Den positiva kontrollen som användes i alla western blot-analyser var ett märkt rekombinant protein som löpte med en något högre molekylvikt.

Som ett första experiment presenteras extraktionen av FAHD1 från svinnjuren. Processen för vävnadshomogenisering (steg 1) och total proteinextraktion (steg 2) presenteras i kompletterande figur 1 (se förklaringen för en beskrivning av de enskilda stegen). En alikvoterad tiondel av det totala lysatet användes för följande experiment.

Ammoniumsulfatutfällning testades en gång för detta lysat, genom tillsats av ammoniumsulfat till lysatet i olika koncentrationer (steg 4) (Figur 2). Efter centrifugering provtogs pellets och supernatanter med western blot med användning av en definierad polyklonal antikropp2 upphöjd mot human FAHD1. 200 ng rekombinant His/S-märkt humant FAHD1 erhållet från E. coli12 laddades som den positiva kontrollen. FAHD1-proteinbandet kan ses vid 25 kDa, medan den märkta positiva kontrollen körs vid 34 kDa. Baserat på dessa data definierades ett protokoll där lysatet behandlas med 25% ammoniumsulfat, dvs förhållanden vid vilka FAHD1 fortfarande finns i supernatanten, medan majoriteten av andra proteiner fälls ut. Detta är ett stort steg i reningsstrategin. Ammoniumsulfatutfällning är ett effektivt rengöringssteg innan du fortsätter med andra metoder. Observera att mängder ammoniumsulfat högre än 30% inte kommer att användas, eftersom ammoniumsulfat gradvis snedvrider kvaliteten på SDS-PAGE och western blot.

Figure 2
Figur 2: Ammoniumsulfatutfällning och western blot screening för svin FAHD1. (A) Ammoniumsulfat tillsattes till lysatet i olika koncentrationer (5% till 25% maximalt) för att fälla ut proteiner från lösningen. (B) Förekomsten av svin FAHD1 (25 kDa) bestämdes i de enskilda paren pellets och supernatant som motsvarar varierande ammoniumsulfatkoncentrationer via western blot med användning av en polyklonal antikropp som höjdes mot humant FAHD1. Supernatanten motsvarande 25% ammoniumsulfatutfällning visar fortfarande närvaron av svin FAHD1 i supernatanten, samtidigt som en bra mängd andra proteiner fälls ut. 200 ng av His/S-märkt rekombinant protein laddades som en positiv kontroll (34 kDa). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Efter att ha testat joniska utbyteskolonner med FPLC definierades en strategi där svin FAHD1 förblir i genomströmningen av en anjonisk utbyteskromatografi vid pH 9 (steg 5). Från och med lysat erhållet genom ammoniumsulfatutfällning vid 25% (enligt definitionen av tidigare testexperiment) användes anjonisk utbyteskromatografi för att eliminera ytterligare proteiner från lösningen (Figur 3A). Bindande proteiner avlägsnades genom eluering från kolonnen, medan genomströmningen renades ytterligare via SEC vid pH 7,4 (figur 3B). Efter båda stegen identifierade western blot-analysen alla fraktioner som innehöll svin FAHD1, som poolades och koncentrerades till 2 ml.

Figure 3
Figur 3: Rening av svin FAHD1 med FPLC - del 1. Röda pilar i kromatogrammet och fläckar indikerar närvaron av FAHD1. I kromatogrammet betecknar "UV" UV-absorptionen vid 280 nm, "Cond" betecknar ledningsförmågan (relaterad till saltkoncentrationen i bufferten) och "Conc B" betecknar procentandelen hög saltbuffert i buffertgradienten (0% ren låg saltbuffert; 100% ren hög saltbuffert). A) Rening av svin FAHD1 från lysat erhållet genom ammoniumsulfatutfällning vid 25 % med en anjonisk utbyteskolonn (FPLC). Medan många proteiner binder till kolonnen finns svin FAHD1 i genomströmningen. Smuts och icke-proteinföroreningar avlägsnas genom eluering från kolonnen, medan genomströmningen bearbetas ytterligare. (B) Genomströmningen från den tidigare anjoniska utbyteskromatografin i (A) renas ytterligare via storleksuteslutningskromatografi (FPLC) vid pH 7,4. (A,B) Western blot analysis (beskurna fläckar längst ner) identifierade fraktioner som innehåller svin FAHD1, som är sammanflätade och koncentrerade. De fulla fläckarna visar det Coomassie-färgade membranet efter western blot-analys. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Det filtrerade provet applicerades igen på SEC men vid buffertförhållanden vid pH 9 (se tabell 1) (figur 4). Motiveringen bakom detta tillvägagångssätt är att pH- och saltinnehållet i den mobila fasen kan påverka elueringsprofilen för globulära proteiner20, och en förbättrad elueringsprofil för FAHD1 hittades under dessa buffertförhållanden. En fraktion innehöll protein med tillräckliga renhetsnivåer för basiska enzymaktivitetsanalyser12 för att slutligen bekräfta proteinets identitet.

Figure 4
Figur 4: Rening av svin FAHD1 med FPLC - del 2. Röda pilar i kromatogrammet och fläckar indikerar närvaron av FAHD1. Proteinprover som tidigare renats med anjonutbyte och storleksuteslutningskromatografi renas ytterligare via storleksuteslutningskromatografi (FPLC) vid pH 9 (toppanel). Western blot-analys som visas längst ner till höger identifierar fraktioner som innehåller svin FAHD1, som är poolade och koncentrerade (bottenpaneler). Fläcken längst ner till vänster visar Coomassie-färgningen av membranet efter den västra fläcken. Klicka här för att se en större version av denna figur.

En alternativ strategi (dvs. SEC följt av jonbyteskromatografi) testades med 2 ml av lysatet erhållet efter ammoniumsulfatutfällning (steg 4) (kompletterande figur 2). Motiveringen för detta experiment är att genom att först använda SEC kan FAHD1-innehållande fraktioner separeras från majoriteten av andra proteiner, medan en efterföljande jonutbyteskromatografi kan användas för att ytterligare rena proteinet. För det första fraktionerades lysatet med sec vid pH 7,4 (steg 6). Western blot analys identifierade alla fraktioner som innehöll svin FAHD1. För det andra koncentrerades dessa fraktioner och renades ytterligare med användning av en anjonisk utbyteskolonn vid pH 9 (steg 5). Kromatogrammen och western blot-analysen (kompletterande figur 2) visar att denna strategi är uppmuntrande eftersom jonutbyteskromatogrammet visar en definierad smal topp som är förknippad med berikade proteinnivåer i västra fläcken. Nackdelen med denna strategi är emellertid att den är begränsad av den ursprungliga volymen som ska appliceras på SEC (2 ml), så genomströmningen av denna metod är mycket låg. Att bearbeta en hel svinnjure är till exempel inte praktiskt.

Som en annan modifiering av detta protokoll inkluderades en katjonisk utbyteskolonn före den anjoniska utbyteskolonnen när svinet FAHD1 också var närvarande i genomströmningen. Vid varje steg i protokollet provtogs prover av svin-FAHD1 innehållande fraktioner och testades med en ODx-analys, enligt beskrivningen på andra ställen12 (kompletterande figur 3). Den specifika enzymatiska aktiviteten ökar tillsammans med renhetsgraden, dvs tillsammans med den ökande relativa mängden FAHD1 per totalt protein.

Som ett andra exempel presenteras extraktionen av FAHD1 från muslever, dvs en samling levervävnad erhållen från 20 möss. Jämfört med extraktionen av FAHD1 från svinnjuren som presenterades ovan visade sig denna extraktion vara mer tråkig. Problem uppstod vid flera steg i protokollet, vilket kommer att presenteras i det följande. Totalt protein extraherades enligt beskrivningen i steg 2 (kompletterande figur 4). Eftersom musleverhomogenat tenderar att vara en mycket klibbig och slemmig enhet, användes filterpapper (liknande kaffefilterenheter) för att förfiltrera lysatet, som späddes 1: 3 i lysbuffert efter extraktion, för att göra lösningen mer som en vätska. Denna utspädning förbättrade filtreringsförfarandet; Det gjorde emellertid den efterföljande upptäckten av proteinet med western blot mer tråkig. Efter filtrering måste det beredda lysatet koncentreras före vidare användning. En alikvoterad tiondel av det totala lysatet användes för följande experiment.

Ett första teststeg för ammoniumsulfatutfällning (kompletterande figur 4I) visade ett möjligt problem som kan uppstå. Ammoniumsulfat vid högre koncentrationer stör SDS-PAGE-geler och orsakar en leende effekt när den körs vid 150 V (kompletterande figur 5A; negativt resultat). Samma SDS-PAGE-körning vid 80 V visar ett positivt resultat (kompletterande figur 5B). I det senare fallet bildas leendeeffekten initialt men löses slutligen på grund av den lägre spänningen som appliceras. Eftersom den ursprungliga lösningen måste spädas kraftigt för att kunna filtrera lysatet, misslyckades den initiala western blot-analysen av dessa prover, dvs den positiva kontrollen detekterades av antikroppen, men inte proteinet i de applicerade proverna. Detta problem löstes med hjälp av en högre koncentration av både lysatet (koncentrerat med hjälp av centrifugalfilterenheter) och antikroppen, och genom att applicera antikroppen över natten i kylrummet medan du skakade. I slutändan gav western blot-analysen både informationsbitarna om att proteinet var närvarande i lysatet och att proteinet fortfarande var närvarande i supernatanten vid 15% ammoniumsulfat (kompletterande figur 5C). Observera att SDS-prover som innehåller högre mängder ammoniumsulfat (>15%) fälldes ut under uppvärmning och proteinet förlorades. Detta kan också ses i Coomassie-färgningen och den västra fläcken (kompletterande figur 5C). Denna effekt observerades inte för svinnjuren, så den kan vara vävnadsspecifik.

Efter ammoniumsulfatutfällning vid 15% applicerades 10 ml lysat på katjonisk utbyteskromatografi vid pH 6,8. Western blot-analys visade att musen FAHD1-proteinet var i genomströmningen (figur 5A). Den eluerade proteinfraktionen verkar vara mindre; Detta exempel visar emellertid en sekundär effekt av jonutbyteskromatografi. Vid detta steg i protokollet kan lösningen fortfarande innehålla många föreningar som kanske inte är protein. Jonisk utbyteskromatografi är ett snabbt och enkelt sätt att bli av med sådana föroreningar. Med tanke på att det tar några timmar att utföra jonutbyteskromatografi (inklusive alla tvättsteg, själva experimentet tar en halvtimme), ger det en enkel metod för att rensa provet från icke-proteinföroreningar.

Figure 5
Figur 5: Rening av mus FAHD1 med FPLC. Röda pilar i kromatogrammet och fläckar indikerar närvaron av FAHD1. (A) Efter ammoniumsulfatutfällning vid 15% centrifugerades provet, filtrerades (0,22 μm) och applicerades på en katjonisk utbyteskolonn. Western blot-analys visar att proteinet är i genomströmningen och kromatogrammet visar att inte mycket av de andra proteinerna har avlägsnats genom detta steg. Att jämföra ingångens utseende och viskositet med genomströmningen visar dock att det insamlade genomflödet är mycket tydligare (höger panel som jämför ingång och genomströmning). (B) Genomströmningen som samlades in från katjonbyteskolonnen reducerades till 2 ml via centrifugeringsfilter och applicerades på storleksuteslutningskromatografi vid pH 7.4. (C) Fraktionerna som innehåller FAHD1 poolades, koncentrerades och applicerades på en andra omgång av storleksuteslutningskromatografi vid pH 9. (D) Fraktionerna som innehöll FAHD1 slogs återigen samman och applicerades på SDS-PAGE med silverfärgning för att se de återstående föroreningarna. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Provet tillämpades vidare på storleksuteslutningskromatografi vid pH 7,4 (figur 5B). Western blot-analys visade fraktioner innehållande musen FAHD1-proteinet, som poolades och koncentrerades till 2 ml. Detta 2 ml koncentrat frystes vid -20 °C med 10 μL β-merkaptoetanol och tinades nästa dag. En fällning bildades som filtrerades via sprutfilterenheter (0,22 μm). Prover för SDS-PAGE och western blot-analys togs för att säkerställa att musen FAHD1-proteinet fortfarande var i lösning.

Prover som innehöll proteinet (från western blot-analys) poolades, koncentrerades via centrifugeringsfilter och applicerades på SDS-PAGE med silverfärgning för att se de återstående föroreningarna (Figur 5D). Detta visade att proteinlösningen inte är särskilt ren och att mängderna protein som erhölls via denna metod från muslever inte heller var särskilt höga (några μg totalt som bestämt med BCA-analyskit; se Materialtabell). Proteinutbytet var mycket högre för svin FAHD1 (ca 1 mg i detta steg). Renhetsgraden för FAHD1-protein extraherat från svinnjuren är cirka 80 % (uppskattad efter silverfärgning; data visas inte). Denna renhet kan ökas ytterligare genom exempelvis affinitetskromatografi med hjälp av en definierad antikropp. Sådana och andra begränsningar av detta protokoll kommer att diskuteras i detalj längre ner.

Namn på buffert/lösning/material Sammansättning
Coomassie kvarhållande lösning 30% (v/v) EtOH; 5 % (v/v) HOAc; iddH2O
Coomassie färgning lösning 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250; 50 % (v/v) MeOH; 10 % (v/v) HOAc; iddH2O
Mono Q hög saltbuffert 20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % glycerol; i ddH2O; justera pH till 9,0 med NaOH
Mono Q låg saltbuffert 20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; iddH2O; justera pH till 9,0 med NaOH
Mono S hög saltbuffert 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1 M NaCl; iddH2O; justera pH till 6,8 med HCl
Mono S låg saltbuffert 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 15 mM NaCl; iddH2O; justera pH till 6,8 med HCl
Buffert för proteinlys 1x PBS (250 ml); 50 mM NaF; 1mM PMSF; 2 μg/ml aprotinin, 1 mM aktiverat ortovanadat; iddH2O
Kanin Anti-hFAHD1 polyklonal antikropp (affinitet isolerad) Skräddarsydd; polyklonal anti-hFAHD1-antikropp renad från kaninserum och renad med FPLC enligt referens 12
Rekombinant hFAHD1-protein western blot kontroll Western blot control protein uttryckt i E.coli och renat med FPLC enligt referens 12.
SDS-PAGE 5x provbuffert 300 mM Tris HCl; 500 mM DDT; 10% (w/v) SDS; 50% (v/ v) glycerin; 0,05% (med / v) bromfenolblå; iddH2O; justera pH till 6,8 med HCl
SDS-PAGE-lösningsgel (12,5 %) för diskontinuerlig PAGE ddH2O(9,5 ml); 3 M Tris HCl (2,2 ml); 5,5 ml akrylamid/bis-lösning (förhållandet 29:1). 20% SDS (175 μL); TEMED (17 μL); 10% ammoniumpersulfat (175 μL); gjut före staplingsgelen och låt den polymerisera; gjut staplingsgelen ovanpå
SDS-PAGE löpande buffert 25 mM Tris HCl; 190 mM glycin; 0,5 % (vikt/v) SDS; iddH2O; justera pH till 8,3 med NaOH
SDS-PAGE staplingsgel (12,5 %) för diskontinuerlig PAGE ddH2O(3,8 ml); 1 M Tris HCl (630 μL); 500 μL 40 % akrylamid/Bis-lösning (29:1-ranson); 20% SDS (25 μL); TEMED (5 μL); 10% ammoniumpersulfat (50 μL); gjuten efter att den upplösande gelén har polymeriserats; applicera en gelkam för att skapa brunnar
SEC (G75) löpande buffert 15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; iddH2O; justera pH till 7,4 med NaOH
Silverfärgning utvecklar lösning 250 mMNa2CO3 iddH2O; tillsätt 12 μL 37 % (v/v) formaldehyd till 100 ml före användning
Fixeringslösning för silverfärgning 40% (v/v) EtOH; 10% (v/v) HOAc; iddH2O
Silverfärgning inkubationslösning 30% (v/v) EtOH; 500 mM NaOAc; 8 mM Na2S2O3; iddH2O; valfritt: tillsätt 600 μL 50 % (v/v) glutaraldehyd per 100 ml före användning
Silverfärgning silverlösning 0,1 % (w/v) AgNO3; iddH2O; tillsätt 25 μL 37 % (v/v) formaldehyd till 100 ml före användning
Silverfärgning stopplösning 40 mM EDTA-lösning vid pH 7,6; överför 744 mg EDTA till 40 mlddH2Ooch tillsätt sedan NaOH för att lösa upp och justera pH till 7,6. Slutligen justera den totala volymen till 50 ml.
Buffert för blockering av västra fläckar PBS med 0,1% (v/v) Tween 20 och 5% (w/v) skummjölkspulver; filtrerad
Buffert för överföring av westernblot (10x) Tris-HCl 250 mM; glycin 1,92 M; iddH2O; justera pH till 8,3 med NaOH; förvara vid rumstemperatur
Buffert för överföring av westernblot (1x) Western blot transfer buffert (10x) 100 ml; 800 mlddH2O; 100 ml MeOH; förvara vid 4 °C
Western blot tvättbuffert (PBS-T) PBS med 0,1% (v/v) Tween 20

Tabell 1.

Kompletterande figur 1: Total proteinextraktion från svinnjure. (A) Njurvävnad skars med en skalpell på en förberedd ordentligt rengjord glasplatta på polystyrenskum för att förhindra glidning; B) 50 ml rör innehållande 20 ml iskall lysbuffert med protein-/proteashämmare inkuberas på is, (C) njurvävnadsbitar sattes i bufferten tills volymen nådde cirka 30 ml; (D) njurvävnad homogeniserades med ultraljud (dvs ultraljudsbehandling); E) Råhomogenat centrifugerades i en bordscentrifug med medelhastighet i 30 minuter. F) Flera prover bearbetades samtidigt. G) Efter den första centrifugeringen överfördes supernatanten till centrifugrör (jämför med E) och centrifugerades med hög hastighet (10 000 x g) i 30 minuter. H) Detta centrifugeringssteg ger en annan pellets och supernatant som överförs till 50 ml rör. (I/J) förlysatet filtreras sekventiellt med 0,45 μm och 0,2 μm filterenheter, aliciterar i 10 ml satser och snäppfryses med flytande kväve för därefter lagring vid -80 °C. Western blot analys används för att verifiera närvaron av proteinet i alla prover (pellets, supernatanter, filtrerat lysat). Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2: Rening av svin FAHD1 med FPLC; alternativ strategi. Röda pilar i kromatogrammet och fläckar indikerar närvaron av FAHD1. A) Rening av svin FAHD1 från lysat erhållet genom ammoniumsulfatutfällning vid 25 % med storleksuteslutningskromatografi (FPLC) vid pH 7,4. Western blot analys identifierade fraktioner som innehåller svin FAHD1, som poolades och koncentrerades. (B) Proteinprover som tidigare renats med storleksuteslutningskromatografi (panel A) renades ytterligare via anjonisk utbyteskromatografi (FPLC). Western blot analys identifierar fraktioner som innehåller svin FAHD1, som poolades och koncentrerades. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 3: Specifik enzymaktivitet hos svin FAHD1. Uppmätt specifik enzymaktivitet som en funktion av ökande renhetsnivå. I tabellen jämförs relativ enzymaktivitet (nmol/min) med specifik enzymaktivitet (μmol/min/mg). Analysen visar en ständigt ökande aktivitet av svin FAHD1 efter varje reningssteg. Jämfört med den rekombinanta His/S-human FAHD1 (grön) erhållen från E. coli. 12, svin FAHD1 visade en något högre aktivitet (röd) (n = 3). Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 4: Total proteinextraktion från muslever. (A,B,C) Snäppfryst levervävnad från 20 möss och lysbuffert framställdes på is i 50 ml rör; (D,E,F) levervävnad homogeniserades med ultraljud (dvs ultraljudsbehandling); Råhomogenat centrifugerades i en bordscentrifug med medelhastighet i 30 minuter; supernatanten överfördes till centrifugrör och centrifugerades med hög hastighet (10 000 x g) i 30 minuter; G,H,I) Förlysatet filtreras sekventiellt med pappersfilter, 0,45 μm och 0,2 μm filterenheter, aliciteeras i 10 ml satser och snäppfryses med flytande kväve för lagring därefter vid -80 °C. J) Ammoniumsulfat tillsattes lysatet i olika koncentrationer (högst 5–30 %) för att fälla ut protein från lösningen. (K) Pellets erhållna efter ammoniumsulfatutfällning (panel J) resuspenderades iH2Oför att ta prover för SDS-PAGE och western blot-analys. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 5: Ammoniumsulfatutfällning och western blot screening för mus FAHD1. Röda pilar i fläckarna indikerar närvaron av FAHD1. (A) SDS-PAGE med prover erhållna efter ammoniumsulfatutfällning kördes vid 125 V. Denna gel visade en drastisk leende effekt, och en sådan gel kan inte utvärderas. Detta är ett exempel på ett negativt resultat. (B) SDS-PAGE med samma prover (panel A) kördes vid 80 V tills den var klar. Det finns ingen leende effekt i denna gel, och detta är ett exempel på ett positivt resultat. (C) SDS PAGE och western blot analys av de prover som erhållits efter ammoniumsulfatutfällning. Prover vid högre koncentrationer av ammoniumsulfat kan fällas ut inuti provbufferten, enligt anvisningarna. De går förlorade och kan inte upptäckas längre, varken via Coomassie-färgning (vänster) eller western blot-analys (höger). Den bästa koncentrationen av ammoniumsulfat bestämdes i detta fall till 15%. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiska steg i protokollet
Att följa gemensamma riktlinjer för hantering av proteiner är viktigt, till exempel att arbeta på is och vid måttliga pH- och saltförhållanden. Användningen av proteashämmare är fördelaktig för metoden, medan användningen av proteasomhämmare rekommenderas starkt. Frysning och upptining av provet kan alltid leda till proteinutfällning (åtminstone delvis), så all upptinad alikvot av initialt proteinlysat (steg 2) bör bearbetas kontinuerligt utan avbrott. Centrifugering och filtrering efter upptining rekommenderas i allmänhet för att avlägsna mikroutfällning.

Det ursprungliga proteinlysatet erhållet från en vävnad innehåller fortfarande många ämnen förutom proteiner. Joniska utbyteskromatografikolonner kan användas för att rensa lysatet. Även om proteinet man vill extrahera inte binder till jonbyteskolonnen kan genomströmningen vara mycket tydligare än ingångslösningen och lättare att bearbeta i efterföljande steg. Detta visas för extraktion av FAHD1 från musnjurar (se figur 5A).

Begränsningar och modifieringar av metoden
Detta protokoll beskriver ett protokoll för extraktion av FAHD1 från vävnaden. Baserat på denna strategi kan en allmän strategi för extraktion av FAHD-proteiner (FAHD1, FAHD2) härledas från annan vävnad, medan specifika anpassningar kan krävas för enskilda fall. Den implicita begränsningen av denna metod är de relativa uttrycksnivåerna av FAHD1 (eller FAHD-proteiner) i en given vävnad och tillgängligheten av denna vävnad i tillräckliga mängder. Det övergripande schemat som beskrivs i detta protokoll kräver ett högt uttryck av proteinet i en lämplig mängd vävnad till att börja med. Exempel på extraktion av FAHD1 från svinnjure och muslever har tillhandahållits, vilket är två organ som visar höga uttrycksnivåer av proteinet. Vid varje steg som beskrivs i detta protokoll finns det en implicit förlust av prov, dvs den låga initiala mängden protein minskas ytterligare. I slutändan kan endast låga mängder protein uppnås med hjälp av detta protokoll. Eftersom svinnjuren är ett stort organ kan cirka ett gram protein (cirka 80% renhet; uppskattat) extraheras med detta tillvägagångssätt från två njurar. Att tillämpa samma protokoll för extraktion av FAHD1 från muslever krävde insamling av leverprover från 20 möss, för att endast erhålla några μg protein i slutändan. Att erhålla högre renhet hos proteinet med hjälp av de skisserade metoderna kan vara tråkigt, och silverfärgning avslöjar att efter storleksuteslutningskromatografi kan det fortfarande finnas många andra proteiner i lösning. Man kan förstärka detta protokoll via affinitetskromatografi (NHS-aktiverade kolumner) med hjälp av en monoklonal antikropp (t.ex. CAB025530).

Alla protokoll som listas här kräver att proteinet man vill extrahera är lösligt. Optimala förhållanden för ammoniumsulfatutfällning och pH/saltjusteringar för kromatografi måste testas och definieras. Om jonutbyteskromatografin inte ger några goda reningsresultat kan dialys mot en kromatografibuffert före utförande av FPLC vara ett alternativ för att förbättra proteinets löslighet och kromatografins upplösning. Det rekommenderas dock inte att dialysera rålysatet, eftersom detta kan leda till massiv och okontrollerad proteinutfällning inuti dialysröret. Problem kan uppstå om proteinet tenderar att vara hydrofobt, och protokollen kanske inte är tillämpliga om proteinet är mycket hydrofobt (t.ex. membranproteiner). Om FAHD-proteiner är delvis olösliga som funna för FAHD2 (data visas inte) i ett givet vävnadslysat, kan även andra typer av kromatografi, till exempel hydrofob interaktionskromatografi (HIC) undersökas12.

Två modifieringar av standardprotokollet har visats i resultatavsnittet. För rening av FAHD1 från en svinnjure användes storleksuteslutningskromatografi före jonbyteskromatografi (se kompletterande figur 2). Ett problem med den här metoden är att storleksuteslutningskromatografi har större löparbanor och provvolymen ökar kraftigt under körningen. Provvolymen bör inte överstiga 2% av bäddvolymen för att uppnå hög upplösning23, och den slutliga utspädningsfaktorn beror också på den uppsamlade elueringsvolymen. I det angivna exemplet med en 120 ml kolonn rekommenderas en initial volym på 2 ml. Det ursprungliga provet kan samlas in från flera ml av lysatet efter ammoniumsulfatutfällning, genom koncentration med användning av centrifugalfilterenheter, utan aggregering eller utfällningsartefakter. Ett exempel på rening av FAHD1 från en svinnjure ges som ett representativt resultat (se även kompletterande figur 2). Begränsningen till endast små urvalsvolymer kan dock göra denna metod opraktisk.

Tillämpningar eller anvisningar för metoden
Uttryck och rening av rekombinanta proteiner från bakterier är en enkel och väletablerad metod för att erhålla genomförbara mängder (i gram) protein 24,25. Detta har presenterats för FAHD112. Det finns emellertid flera möjliga nackdelar med att använda dessa metoder, såsom möjlig dålig tillväxt av värden, inklusionskroppsbildning, förlust av eller förändrad proteinaktivitet, och därför möjligheten att inte erhålla något protein alls eller resultera i en partisk form av proteinet (felveckning, dåliga post-translationella modifieringar etc.). Att utveckla metoder som kan extrahera välveckat och korrekt modifierat protein från vävnad direkt är därför tilltalande. Det största problemet är emellertid att de flesta proteiner inte uttrycks på signifikanta nivåer, och jämfört med den implicita induktionen och efterföljande extraktionen av protein från bakterier är mängden protein som ska erhållas vanligtvis flera storleksordningar lägre. Det finns en avvägning mellan billig och enkel extraktion av rekombinant protein från bakterier och den dyrare och tråkigare extraktionen av protein från vävnad. Det stora framsteget med det senare är att man kan extrahera proteinet i sin fysiologiska form som finns i vävnaden, inklusive alla ömsesidiga effekter som kan påverka dess vikning och / eller katalytiska aktivitet.

Protein som extraheras och renas genom detta protokoll kommer att bidra till att identifiera kompetenta hämmare av FAHD113, möjliga proteininteraktionspartners9 och möjliga men oupptäckta roller för proteinet9. Studien av enzymatiska hämmare, utvecklingen av monoklonala antikroppar och studien av proteinstrukturen i första hand stöds starkt när protein med hög renhet extraheras från vävnad snarare än extraheras från bakterier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Författarna är mycket tacksamma för den tekniska hjälpen av Ayse Öztürk och Eva Albertini. Möss som användes för generering av levervävnad upprätthölls under överinseende av Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr (Institutet för biomedicinsk åldrandeforskning vid Innsbruck universitet, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Österrike).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm filter units MERCK SLGP033RS Millex-HP, 0.22 µm, PES 33 mm, not steril
0.45 µm filter units MERCK SLHP033NS Millex-HP, 0.45 µm, PES 33 mm, not steril
15 mL Falcon tubes VWR 734-0451 centrifugal tubes
50 mL Falcon tubes VWR 734-0448 centrifugal tubes
96-Well UV Microplate Thermo-Fischer 8404 UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates
Acrylamide/Bis Solution (40%, 29:1 ratio) BIO-RAD #1610147 40% acrylamide/bis-acrylamide, 29:1 (3.3% crosslinker) solution for casting polyacrylamide gels
ÄKTA FPLC system GE Healthcare Life Sciences / Cytiva - using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the "ÄKTA pure" system
Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa MERCK UFC901024 centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 15 mL
Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa MERCK UFC801024 centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 4 mL
Ammonium sulfate powder MERCK A4418 ammonium sulphate for molecular biology, ≥99.0%
Ammoniumpersulfat reagent grade, 98% MERCK 215589 Catalyst for acrylamide gel polymerization.
Coomassie Brilliant blue R 250 MERCK 1125530025 Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) for electrophoresis Trademark of Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6.2 (10 g/l, H2O, 25 °C)
Dialysis tubing cellulose membrane MERCK D9277 Cellulose membranes for the exchange of buffers via dialysis.
Eppendof tubes 1.5 mL VWR 525-1042 microcentrifugal tubes; autoclaved
HiLoad 26/600 Superdex 75 pg GE Healthcare Life Sciences / Cytiva 28989334 HiLoad Superdex 75 pg prepacked columns are for high-resolution size exclusion chromatography of recombinant proteins
Immun-Blot PVDF Membrane BIO-RAD #1620177 PVDF membranes are protein blotting membranes optimized for fluorescent and multiplex fluorescent applications.
Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell BIO-RAD #1703930 Use the Mini Trans-Blot Cell for rapid blotting of Mini-PROTEAN precast and handcast gels.
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels BIO-RAD #1658004 4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam.
Mono Q 10/100 GL GE Healthcare Life Sciences / Cytiva 17516701 Mono Q columns are strong anion exchange chromatography columns for protein analysis or small scale, high resolution polishing of proteins.
Mono S 10/100 GL GE Healthcare Life Sciences / Cytiva 17516901 Mono S columns are strong cation exchange chromatography columns for protein analysis or small scale high resolution polishing of proteins.
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa Thermo-Fischer 26616 A mixture of 10 blue-, orange-, and green-stained proteins (10 to 180 kDa) for use as size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting.
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo-Fischer 23225 A two-component, high-precision, detergent-compatible protein assay for determination of protein concentration.
Sonifier 250; Ultrasonic Cell Disruptor w/ Converter Branson - New models at https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf
Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP (affinity isolated) Agilent Dako P0399 The antibody used for horseradish peroxidase conjugation reacts with rabbit immunoglobulins of all classes.
TEMED, 1,2-Bis(dimethylamino)ethane, TMEDA MERCK T9281 TEMED (N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine) is molecule which allows rapid polymerization of polyacrylamide gels.
Tube Roller - - A general tube rotator roller; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71
Tube Rotator - - A general tube rotator wheel; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123
ULTRA-TURRAX; T 25 digital IKA 0003725000 New models at https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pircher, H., et al. Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase. Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).
  2. Pircher, H., et al. Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase. Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36500-36508 (2011).
  3. Kang, T. -W., et al. Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development. Nature. 479 (7374), 547-551 (2011).
  4. Hong, H., Seo, H., Park, W., Kim, K. K. -J. Sequence, structure and function-based classification of the broadly conserved FAH superfamily reveals two distinct fumarylpyruvate hydrolase subfamilies. Environmental Microbiology. 22 (1), 270-285 (2020).
  5. Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase. Structure. 7 (9), London, England. 1023-1033 (1999).
  6. Bateman, R. L., et al. Mechanistic inferences from the crystal structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a bound phosphorus-based inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 276 (18), 15284-15291 (2001).
  7. Weiss, A. K. H., et al. Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1. Biochemical Journal. 475 (22), 3561-3576 (2018).
  8. Etemad, S., et al. Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 - a new regulator of mitochondrial function and senescence. Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).
  9. Weiss, A. K. H., et al. Regulation of cellular senescence by eukaryotic members of the FAH superfamily - A role in calcium homeostasis. Mechanisms of Ageing and Development. 190, 111284 (2020).
  10. Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-Dürr, P. Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells. Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).
  11. Wiley, C. D., et al. Mitochondrial dysfunction induces senescence with a distinct secretory phenotype. Cell Metabolism. 23 (2), 303-314 (2016).
  12. Weiss, A. K. H., et al. Expression, purification, crystallization, and enzyme assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59729 (2019).
  13. Weiss, A. K. H., et al. Inhibitors of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain Containing Protein 1 (FAHD1). Molcules. 26 (16), 5009 (2021).
  14. Mizutani, H., Kunishima, N. Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8. Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (9), 792-794 (2007).
  15. Lee, C. H. A simple outline of methods for protein isolation and purification. Endocrinology and Metabolism. 32 (1), Seoul, Korea. 18-22 (2017).
  16. Amer, H. E. A. Purification of proteins: Between meaning and different methods). Proteomics Technologies and Applications. , (2019).
  17. Niu, L., Yuan, H., Gong, F., Wu, X., Wang, W. Protein extraction methods shape much of the extracted proteomes. Frontiers in Plant Science. 9, 802 (2018).
  18. Gordon, J. A. Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor. Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).
  19. Gallagher, S. R. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. , (2012).
  20. Ahmed, U., Saunders, G. Effect of pH on Protein Size Exclusion Chromatography. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf (2011).
  21. Sørensen, B. K., et al. Silver staining of proteins on electroblotting membranes and intensification of silver staining of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 304 (1), 33-41 (2002).
  22. Fagerberg, L., et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).
  23. Cytiva Life Fundamentals of size exclusion chromatography. , Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography (2022).
  24. Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Frontiers in Microbiology. 5, 172 (2014).
  25. Rosano, G. L., Morales, E. S., Ceccarelli, E. A. New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 28 (8), 1412-1422 (2019).

Tags

Biokemi utgåva 180 FAHD FAHD1 oxaloacetat dekarboxylas ODx vävnad FPLC kromatografi proteinextraktion
Extraktion och rening av FAHD1-protein från svinnjure och muslever
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Andric, A., Wagner, E., Heberle, A., … More

Andric, A., Wagner, E., Heberle, A., Holzknecht, M., Weiss, A. K. H. Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver. J. Vis. Exp. (180), e63333, doi:10.3791/63333 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter