Summary
Bu protokol, domuz böbreği ve fare karaciğerinden fumarilasetotat hidrolaz alan içeren protein 1'in (FAHD1) nasıl çıkarılacağını açıklar. Listelenen yöntemler ilgilenilen diğer proteinlere uyarlanabilir ve diğer dokular için modifiye edilebilir.
Abstract
Fumarilasetotat hidrolaz alan içeren protein 1 (FAHD1), ökaryotlarda FAH süper ailesinin ilk tanımlanmış üyesidir ve mitokondride oksaloasetat dekarboksilaz olarak işlev görür. Bu makalede, FAHD1'in domuz böbreği ve fare karaciğerinden ekstraksiyonu ve saflaştırılması için bir dizi yöntem sunulmaktadır. Kapsanan yöntemler hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) ile iyonik değişim kromatografisi, FPLC ile preparatif ve analitik jel filtrasyonu ve proteomik yaklaşımlardır. Toplam protein ekstraksiyonundan sonra, amonyum sülfat çökeltmesi ve iyonik değişim kromatografisi araştırıldı ve FAHD1, iyonik değişim ve boyut dışlama kromatografisi kullanılarak sıralı bir strateji ile ekstrakte edildi. Bu temsili yaklaşım, ilgilenilen diğer proteinlere (önemli seviyelerde ifade edilir) uyarlanabilir ve diğer dokular için modifiye edilebilir. Dokudan saflaştırılmış protein, yüksek kaliteli antikorların ve / veya güçlü ve spesifik farmakolojik inhibitörlerin gelişimini destekleyebilir.
Introduction
Ökaryotik FAH etki alanı içeren protein 1 (FAHD1), iki fonksiyonlu oksaloasetat (OAA) dekarboksilaz (ODx)1 ve asilpiruvat hidrolaz (ApH)2 olarak işlev görür. Mitokondri2'de lokalizedir ve 1,2,3,4,5,6 enzimlerinin geniş FAH süper ailesine aittir. ApH aktivitesi sadece küçük bir öneme sahip olsa da, FAHD1'in ODx aktivitesi, TCA döngü akısı1,7,8,9'un düzenlenmesinde rol oynar. OAA sadece trikarboksilik asit döngüsündeki merkezi sitrat sentaz reaksiyonu için gerekli değildir, aynı zamanda elektron taşıma sisteminin bir parçası olarak ve bir kataplerotik metabolit olarak süksinat dehidrogenazın rekabetçi bir inhibitörü olarak da işlev görür. İnsan göbek damarı endotel hücrelerinde (HUVEC) FAHD1 gen ekspresyonunun aşağı regülasyonu, hücre proliferasyon hızında10 önemli bir azalmaya ve glikolize eşzamanlı bir geçişle ilişkili mitokondriyal membran potansiyelinin önemli ölçüde inhibisyona neden olmuştur. Çalışma modeli, mitokondriyal OAA seviyelerinin FAHD1 aktivitesi 1,8,9 tarafından sıkı bir şekilde düzenlendiği mitokondriyal disfonksiyon ile ilişkili yaşlanma (MiDAS)11 benzeri fenotip 8'i ifade eder.
Rekombinant proteinin dokudan ziyade bakteri12'den ekspresyon ve saflaştırma yoluyla elde edilmesi daha kolaydır. Bununla birlikte, bakterilerde eksprese edilen bir protein, post-translasyonel modifikasyonların olası eksikliği nedeniyle önyargılı olabilir veya basitçe sorunlu olabilir (yani, plazmid kaybı, bakteriyel stres tepkileri, çarpık / şekilsiz disülfit bağları, hiç veya zayıf sekresyon, protein agregasyonu, proteolitik bölünme, vb. Nedeniyle). Bazı uygulamalar için, bu tür modifikasyonları dahil etmek ve / veya olası eserleri dışlamak için hücre lizatından veya dokudan protein elde edilmesi gerekir. Dokudan saflaştırılmış protein, FAHD113 gibi seçilmiş enzimler için yüksek kaliteli antikorların ve / veya güçlü ve spesifik farmakolojik inhibitörlerin gelişimini destekler.
Bu el yazması, FAHD1'in domuz böbreği ve fare karaciğerinden ekstraksiyonu ve saflaştırılması için bir dizi yöntem sunmaktadır. Tarif edilen yöntemler hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) gerektirir, ancak aksi takdirde ortak laboratuvar ekipmanı kullanır. Alternatif yöntemler başka yerlerde bulunabilir14,15,16,17. Toplam protein ekstraksiyonundan sonra, önerilen protokol, amonyum sülfat çökeltmesi ve iyonik değişim kromatografisi için alt protokollerin tartışıldığı bir test aşamasını içerir (Şekil 1). Bu alt protokolleri tanımladıktan sonra, ilgilenilen protein, FPLC ile iyonik değişim ve boyut dışlama kromatografisi kullanılarak sıralı bir strateji ile çıkarılır. Bu kılavuzlara dayanarak, nihai protokol diğer ilgili proteinler için ayrı ayrı uyarlanabilir.
Şekil 1: Bu protokolün genel stratejisi. Yukarıdan aşağıya: Protein dokulardan çıkarılır. Doku homojenatı hazırlanır, santrifüj edilir ve filtrelenir. Her bir süpernatant ve pelet türevi numune çifti için, optimum koşullar için prob yapmak üzere amonyum sülfat çökeltme ve iyonik değişim kromatografisi (FPLC) testleri yapılmalıdır. Bu alt protokolleri oluşturduktan sonra, protein, değişen pH ve tuz konsantrasyonlarında sıralı bir amonyum sülfat çökeltme, iyonik değişim kromatografisi ve tekrarlayan boyut dışlama kromatografisi (FPLC) prosedürü ile ekstrakte edilebilir. Tüm adımların batı lekesi tarafından kontrol edilmesi gerekir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Domuz böbreği yerel süpermarketten taze olarak elde edildi. Karaciğer dokuları, Univ.-Doz gözetiminde Innsbruck Üniversitesi, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Avusturya'daki Biyomedikal Yaşlanma Araştırmaları Enstitüsü'nde tutulan C57BL6 vahşi tip farelerden toplandı. Dr. Pidder Jansen-Dürr, 2013 yılında verilen proje lideri olarak etik izin kapsamındadır (BMWF-66.008/0007-II/3b/2013). Proje için farelerin bakımı ve kullanımı, Avusturya Eğitim, Bilim ve Araştırma Bakanlığı (BMBWF) tarafından verilen 5 Mayıs 2020 tarihinden itibaren 2020-0.242.978 sayılı etik izin kapsamındadır.
1. Hazırlıklar
NOT: Protokol başlamadan önce, genel kimyasallar ve malzemelerin yanı sıra protein lizis tamponu, ham doku örneği ve spesifik bir antikor gibi birkaç şeyin hazırlanması gerekir.
- 100 g net doku ağırlığı başına 250 mL protein lizis tamponu hazırlayın: 50 mM NaF, 1 mM PMSF, 2 μg / mL aprotinin ve 1 mM aktive edilmiş ortovanadat ile 250 mL 1x PBS (bkz. Tablo 1). 0,22 μm şırınga filtre ünitesi kullanarak çözeltiyi filtreleyin.
NOT: Ortovanadatın aktivasyonu, protein tirozin fosfatazların daha güçlü bir inhibitörüne dönüştürülmesi için kullanılmadan önce gereklidir18. Aktif ortovanadat ticari tedarikçilerden elde edilebilir, ancak aşağıdaki gibi de hazırlanabilir.- ddH2O'da 200 mM'lik bir (sodyum) ortovanadat stok çözeltisi hazırlayın. 10 mL çözelti hazırlamak için, 368 mg Na3VO4 ila 9 mL su ekleyin ve karıştırarak çözün. Çözüldükten sonra, ddH2O ile hacmi 10 mL'ye kadar yükseltin.
NOT: Sodyum ortovanadat çözeltisinin başlangıç pH'ı, malzemenin kaynağına göre değişebilir ve pH'ın aşağıdaki gibi tekrarlayan bir yaklaşımla 10'a ayarlanması gerekir. - Çözeltinin başlangıç pH'ına bağlı olarak, pH'ı NaOH veya HCl ile 10'a ayarlayın. pH > 10'da, çözelti sarı bir renge sahip olacaktır. Çözeltiyi renksiz hale gelene kadar kaynatın, oda sıcaklığına soğutun ve pH'ı kontrol edin. pH >10 ise, pH'ı 10'a ayarlamak için küçük bir HCl hacmi ekleyin. Bu noktada, çözelti tekrar sararabilir.
- Çözelti renksiz kalana ve pH 10'da (yaklaşık 5-7 kez) stabilize olana kadar kaynatma ve soğutmayı tekrarlayın. Bu noktada, HCl eklenmesi, çözeltide sarı rengin soluk bir görünümüne neden olur. Aktif ortovanadadı -20 °C'de 1 mL alikotta saklayın.
- ddH2O'da 200 mM'lik bir (sodyum) ortovanadat stok çözeltisi hazırlayın. 10 mL çözelti hazırlamak için, 368 mg Na3VO4 ila 9 mL su ekleyin ve karıştırarak çözün. Çözüldükten sonra, ddH2O ile hacmi 10 mL'ye kadar yükseltin.
- Tüpleri gram doku başına 2 mL lizis tamponu ile hazırlayın ve buzun üzerine yerleştirin.
NOT: Bu protokol, her biri bir domuz böbreği (yaklaşık 100-150 g) için toplamda 30 mL lizis tamponu ile doldurulmuş sekiz adet 50 mL tüp ve toplamda 20 fare karaciğeri (her biri 1-2 g) için her biri 40 mL lizis tamponu ile doldurulmuş iki tüp kullanmıştır. - Dokuyu hazırlayın: dokuyu bir polistiren köpük kutuda buz üzerine yerleştirilmiş önceden temizlenmiş bir cam plaka üzerinde disseke edin. Sonraki lizis için ilgili tüplere kolayca aktarılmak üzere her biri yaklaşık 100 mg'lık doku parçalarını kesin. Doku parçalarını hazırlanan tüplere aktarın (adım 1.2).
- Doymuş bir amonyum sülfat çözeltisi hazırlayın: 500 mL ddH2O ila 70 ° C ısıtın ve karıştırırken, daha fazla amonyum sülfat çözülmeyene kadar yavaş yavaş amonyum sülfat tozu ekleyin ( Malzemeler Tablosuna bakınız). Bu (aşırı) doymuş çözeltiyi oda sıcaklığına soğutun ve gece boyunca 4 ° C'de saklayın.
2. Toplam protein ekstraksiyonu
NOT Numuneyi soğuk protein lizis tamponunda hazırladıktan sonra (bkz. adım 1.3), dokuyu ultrasonik bir prob ile sonikasyon yoluyla veya aşağıdaki gibi bir elektrikli homojenizatör kullanarak mümkün olan en iyi şekilde homojenize edin.
- Dokuların homojenizasyonu
- Bir domuz böbreği durumunda, numuneyi buz üzerinde tutarken süspansiyonu tercihen ultrasonik bir prob ile sonikleştirin (numuneyi buz üzerinde soğutmak için darbeler arasında 30 s aralıklı,% 50 görev döngüsü ile orta genlikte, 15 s darbenin 10 döngüsü).
- Fare organları söz konusu olduğunda, numuneyi buz üzerinde tutarken bir elektrikli homojenizatör (düşük kuvvetle başlayıp yavaşça orta kuvvete hızlanan) kullanarak süspansiyonu homojenize edin. Cihazı tıkayan organik maddeleri temizlemek için elektrikli homojenizatörü PBS'de düzenli olarak yıkayın.
- Numunelerden 20 μL alın ve homojenize edilmiş dokunun hücrelerinin uygun şekilde tahrip edilip edilmediğini mikroskop altında kontrol edin; aksi takdirde, homojenizasyonu tekrarlayın.
- Tüpleri 4 °C'de 30 dakika boyunca 10.000 x g'de bir masa üstü santrifüjde santrifüj yapın.
NOT: İsteğe bağlı olarak, aktarılmış olabilecek ilk peletin küçük fraksiyonlarını ortadan kaldırmak için süpernatantı 4 ° C'de 30 dakika boyunca 20.000 x g'de ikinci kez santrifüj edin. Bu, adım 2.3'te sonraki filtrelemeyi basitleştirecektir. - Süpernatantı taze bir tüpte toplayın ve buzun üzerine yerleştirin. Süpernatantı 0,45 μm ve 0,22 μm şırınga filtre üniteleri kullanarak sırayla filtreleyin. Süpernatantı 10 mL partilere ayırın ve kısa süreli depolama için -20 ° C'de veya daha uzun depolama için -80 ° C'de dondurun.
NOT: 0,45 μm ile ön filtreleme, 0,22 μm ile ikinci bir filtreleme adımı daha ince parçacıkları kaldırmadan önce parçacıkların çoğunu uzaklaştırır. 0,22 μm filtrenin doğrudan kullanılması, filtrelerin tıkanması riskine neden olabilir. - SDS-PAGE/batı leke analizi için süpernatanın 40 μL'sine 10 μL 5x SDS numune tamponu (bkz. Tablo 1) ekleyerek ve ardından 10 dakika boyunca 95 °C'de kaynatarak 50 μL'lik bir numune hazırlayın.
- İsteğe bağlı olarak, 900 μLddH 2O'da adım 2.2'de elde edilen yaklaşık 100 μL peleti yeniden askıya alın ve yukarıda açıklandığı gibi SDS-PAGE/batı leke analizi için bir örnek hazırlayın.
NOT: Pelet türevi örneklerin batı leke analizine dahil edilmesi, pozitif kontrole ek olarak, proteinin ekspresyonunun düşük olup olmadığını veya antikorun sorunlu olup olmadığını gösterecektir.
- İsteğe bağlı olarak, 900 μLddH 2O'da adım 2.2'de elde edilen yaklaşık 100 μL peleti yeniden askıya alın ve yukarıda açıklandığı gibi SDS-PAGE/batı leke analizi için bir örnek hazırlayın.
3. SDS-PAGE ve batı leke analizi
NOT: Protein çözünürlüğünü kontrol etmek için Western blot analizi gereklidir. Aşağıda, Islak/Tank lekeleme sistemi kullanılarak elektro-lekeleme için bir protokol açıklanmaktadır (bkz. SDS-PAGE için alternatif bir protokol19 başka bir yerde bulunabilir.
- Üreticinin talimatlarına göre süreksiz% 12,5'lik bir poliakrilamid SDS-PAGE jeli hazırlayın (yani, bir çözücü jelin üzerine bir istifleme jeli; bakınız Tablo 1). Adım 2 sırasında daha önce hazırlanmış örnekleri çalıştırın (adım 4, 5 ve 6'ya benzer; aşağıya bakın).
- İlk kuyucuğa bir protein işaretleyici merdiven yükleyin (bkz. İkinci kuyucuğa pozitif kontrol olarak 5 ng hFAHD1 rekombinant proteini (bakteri12'den elde edilir; bakınız Tablo 1) yükleyin.
- Daha sonra, analiz edilecek numunenin 20 μL'sini yükleyin ve kalan tüm kuyucukları 20 μL hazırlanmış SDS-PAGE 1x numune tamponu ile doldurun (yani, ddH2O ile seyreltilmiş 5x numune tamponu). SDS çalışan arabelleği kullanarak SDS-PAGE jellerini 125 V'ta çalıştırın (bkz. Tablo 1).
- SDS-PAGE tamamlandıktan sonra, bir batı lekesi analizi yapın ve FAHD1'e karşı yükseltilmiş mevcut antikoru kullanarak membranları araştırın (bakınız Tablo 1).
NOT: Numuneler ham doku homojenatından alındığından, genellikle SDS-PAGE ve batı leke analizinin kalitesi bu noktada tehlikeye girer; Bununla birlikte, ekstrakte edilecek proteinin süpernatant içinde çözünür olup olmadığını kontrol etmek önemlidir. Aşağıdaki protokol domuz böbreği ve karaciğer, kalp, beyin ve böbrek dahil olmak üzere farklı fare organları için test edilmiştir.- 10x batı lekesi transfer arabelleğini hazırlayın (bkz. Tablo 1). 1x batı lekesi transfer tamponunu hazırlayın (bakınız Tablo 1) ve 4 °C'ye soğutun.
- Metanol içinde 2 dakika boyunca bir PVDF membranını etkinleştirin. Membranı ddH 2 O'da2dakika yıkayın. Membranı 15 dakika boyunca 1x batı lekesi transfer tamponunda dengeleyin.
- SDS çalışan tamponu çıkarmak için sallarken SDS-jeli 10 dakika boyunca 1x PBS ile yıkayın ve ardından denge için jeli 10 dakika boyunca 1x batı lekesi transfer tamponunda inkübe edin. Elektro-lekeleme kasetini (yani, aktif PVDF membranını ve jelleri birleştirerek) üreticinin talimatlarına göre monte edin.
- Lekeyi, buzla dolu bir polistiren köpük kutuda veya soğuk odada (4 ° C) 1 saat boyunca 300 mA'da elektro-lekeleme yoluyla çalıştırın. PVDF membranını, açıkta kalan tarafı tüpün iç tarafına bakacak şekilde 50 mL'lik bir tüpe aktarın. Membranı, bir tüp silindiri üzerinde yuvarlanırken gece boyunca 4 °C'de 20 mL batı leke bloke edici tamponda (bakınız Tablo 1) inkübe edin (bkz.
- Ertesi gün, membranı yuvarlanırken aynı tüpte 20 mL batı lekesi yıkama tamponu (% 0.1 (v / v) Ara 20 ile PBS) 5 dakika boyunca yıkayın. Membranı aynı tüpte primer antikor2 (FAHD1'i hedefleme; bakınız Tablo 1) ile inkübe edin 1:500 batı leke bloke edici tamponda yuvarlanırken oda sıcaklığında 1 saat seyreltin.
- Membranı aynı tüpte her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın, haddeleme sırasında 20 mL batı lekesi yıkama tamponu ile. Membranı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca HRP konjuge sekonder antikor ile inkübe edin ( bakınız Malzeme Tablosu) 5 mL batı leke bloke edici tamponda 1:3000 seyreltin.
- Membranı aynı tüpte her biri 10 dakika boyunca üç kez 20 mL batı lekesi yıkama tamponu ile ve her biri 1x PBS ile 5 dakika boyunca iki kez yıkayın. Membranı bir kenarındaki cımbızla dikkatlice tutarak ve zarın zıt (alt) kenarı olan bir parça selüloz veya bir parça Whatman kağıdına dokunarak kurulayın. Membranı (açıkta kalan tarafı yukarı) temizlenmiş bir cam plakaya koyun.
- Tüm membranı 1 mL hazırlanmış ECL batı lekesi substratı ile pipet kullanarak dikkatlice örtün, hava kabarcığı oluşturmamaya özen gösterin. ECL çözeltisinin 3 dakika boyunca inkübe olmasına izin verin ve hemen X-ışını filmi kullanarak veya bir görüntüleme sistemi kullanarak membranı geliştirin.
NOT: Protein, örneklerin hiçbirinde değil, sadece pozitif kontrolde tespit edilmişse, bu, proteinin çözünmez olduğunu veya antikor tarafından tespit edilecek yeterli miktarda bulunmadığını gösterebilir. Pozitif kontrolün sadece nanogramları yüklendiyse, ilk senaryo daha olasıdır. Hiç protein tespit edilmediyse, antikorun kalitesini kontrol edin ve belki de monoklonal bir antikor yerine bir poliklonal antikora geçin. Nadir durumlarda, yani bazı hidrofobik proteinler için, protein santrifüjlemeden sonra tespit edilebilir, ancak filtrasyondan sonra tespit edilemez. Böyle bir durumda, hidrofobik proteinler için özel filtre ünitelerinin kullanılması önerilir.
- İsteğe bağlı olarak, proteinin SDS-PAGE jelden PVDF membranına başarılı bir şekilde aktarılmasını kontrol etmek için PVDF membranlarını batı lekesinden sonra boyayın.
NOT: Sorun giderme, yöntem geliştirme ve dokümantasyon için Coomassie boyama önerilir, ancak bu protokolü uyguladıktan sonra membranların daha fazla batı leke analizinde kaybolduğunu unutmayın. Ponceau S boyaması daha zayıf boyama verir, ancak membranlar yeniden incelenecekse kullanılabilir.- Boyama (Coomassie veya Ponceau S) ve leke giderme solüsyonlarını içeren küçük tepsiler hazırlayın.
- Cımbız kullanarak, zarı boyama çözeltisine koyun ve membran iyice lekelenene kadar hafifçe çalkalayın (5-10 dakika).
- Membranı leke çözücü çözeltiye aktarın ve çözelti doyana kadar çalkalayın (5-10 dakika). Membran üzerinde protein bantları gözlenene kadar destaining adımını tekrarlayın; hiç bant gözlenmezse, boyamayı daha uzun bir kuluçka süresiyle tekrarlayın. Membranı cımbız kullanarak bir cam plakaya yerleştirerek kurutun.
4. Test: Amonyum sülfat çökeltme
NOT: Amonyum sülfat çökeltmesi, proteinin çözünürlüğünü değiştirerek bir protein saflaştırma yöntemidir. Bir ön deneyde, amonyum sülfat konsantrasyonu, FAHD1'i çözelti içinde bırakırken, maksimum miktarda protein kirleticisini çökelten bir değere sıralı olarak arttırılır. Proteinin çözünürlüğü yine batı leke analizi ile incelenir.
- Adım 2.3'ten devam edin: ya numunenin bir alikotunu çözün ya da protein ekstraksiyonundan hemen sonra (yani, numuneyi dondurmadan) devam edin. Çözülmeden sonra olası çökelmeleri dışlamak için numuneyi 0,22 μm'lik bir filtre ünitesi kullanarak filtreleyin. Buz üzerinde altı adet 1,5 mL tüp hazırlayın ve her tüpe 250 μL numune aktarın.
- Yukarıda hazırlanan tüplerde% 5,% 10,% 15,% 20,% 25,% 25 ve% 30'luk bir seyreltme serisi hazırlayın ve protein lizis tamponu ile son hacmi 1000 μL'ye kadar yapın. Numuneleri bir tüp rotatörde gece boyunca 4 °C'de inkübe edin (bkz.
- Bir masa üstü santrifüj kullanarak, 4 ° C'de 30 dakika boyunca 10.000 x g'de santrifüj yapın ve tüm süpernatantları dikkatlice ayrı tüplere aktarın. Elde edilen peletleri hava ile kurutun ve her birini 1000 μL ddH2O içinde yeniden askıya alın.
- Önceki adımdaki her bir yeniden askıya alınmış pelet ve süpernatant çifti için, 40 μL'yi 10 μL 5x SDS numune tamponu ile karıştırın ve sıvının çoğu buharlaşana kadar açık kapaklarla 95 ° C'de kaynatın. Daha sonra, peleti ddH2O'da% 50 DMSO karışımında yeniden askıya alın.
- SDS-PAGE (adım 3) gerçekleştirin, ancak jelleri 3 saat boyunca 80 V'ta çalıştırın. Her bir amonyum sülfat konsantrasyonu için, yeniden askıya alınmış pelet ve süpernatanttan (adım 4.3) elde edilen numuneleri çiftler halinde yükleyin. Batı lekesi analizi yapın (adım 3).
- Saflaştırılacak proteinin (yani, FAHD1) süpernatandan türetilen numunede kaldığı en yüksek amonyum sülfat konsantrasyonunu kontrol edin. Sonuçlara dayanarak, gelecekteki deneylerde kullanılmak üzere ilgilenilen protein için bir amonyum sülfat çökeltme protokolü tanımlayın.
NOT: Amonyum sülfatın SDS-PAGE ve batı lekesini bozduğu iyi bilinmektedir. Amonyum sülfat konsantrasyonu arttıkça, batı leke analizinin kalitesi tehlikeye girecektir. Bununla birlikte, daha önce adım 3'te olduğu gibi, bu analiz, verilen amonyum sülfat konsantrasyonlarında ilgili proteinin çözünürlüğünü kontrol etmek için kullanılır. Bu protokol, diğer proteinleri çökeltmeyi amaçlarken, saflaştırılacak proteinin çözünür kalması gerekir.
5. Test: FPLC ile iyonik değişim kromatografisi
NOT: Yüklü fonksiyonel gruplara sahip moleküller, FPLC için bir silika parçacık sütununa bağlanır ve proteinlerin yüzey yüklerine göre farklılaşmasını sağlar. Katyonik değişim sütununu ve anyonik değişim sütununu kullanarak bu adımı iki kez gerçekleştirin (bkz. Protokol adımları katyonik veya anyonik değişim kromatografisi için aynıdır, ancak kullanılacak tamponlar farklıdır (bkz . Tablo 1); hem "düşük tuzlu" 15 mM NaCl hem de "yüksek tuzlu" 1 M NaCl koşullarıyla. Kullanılan kolonlar için 1 mL/dak debi önerilir.
- FPLC sistemini anyonik veya katyonik değişim sütunu ile kurun. Kolonu % 20 EtOH'luk (H2O'da) 5 sütun hacmi (CV) ile yıkayın, ardından 5 CV ddH2O Alternatif olarak, kolonu, kromatogramda daha fazla pik gözlenmeyene kadar sırayla 1 CV düşük tuz tamponu, yüksek tuz tamponu ve tekrar düşük tuz tamponu ile yıkayın, ancak en az bir kez yıkayın.
- Küçük ölçekte amonyum sülfat çökeltmesi için en uygun protokolü belirledikten sonra (adım 4), çökeltme protokolünü 10 mL orijinal doku homojenatına uygulayın (adım 2). İsteğe bağlı olarak, numuneyi düşük tuz tamponuna karşı çevirin.
- Numuneyi kolona uygulayın (örneğin, enjeksiyonla veya bir numune pompası kullanarak) ve akışı toplayın. Kolonu düşük tuz tamponunun 1 CV'si ile yıkayın.
- 3 CV içinde %100 düşük tuz tamponu / %0 yüksek tuz tamponundan %0 düşük tuz tamponu/%100 yüksek tuz tamponuna doğrusal gradyan elüsyonu ayarlayın. Gradyan bittikten sonra, kromatogramda 1 CV aralığında proteinle ilişkili pikler (280/255 nm'de UV emilimi) tespit edilmeyene kadar yüksek tuz tamponu ile çalışmaya devam edin.
- Kolonu temizlemek için 0,5 M NaOH (ddH 2 O'da) içinde çözünmüş 1mL% 25SDS uygulayın. Ardışık olarak, sütunu 3 CV ddH 2 O ve 3 CV ile% 20 EtOH (ddH2O olarak) ile yıkayın.
- Tüm pik fraksiyonların ve akışların SDS-PAGE örneklerini toplayın ve ilgilenilen proteinin varlığı için batı lekesi yoluyla araştırın (adım 3). Toplanan fraksiyonları sıvı azotta çıtçıtla dondurun ve -80 °C'de saklayın.
- Batı leke analizi tamamlandıktan sonra, ilgilenilen proteini içeren fraksiyonları çözün ve bir araya getirin ve diğerlerini atın. 5.1-5.5 arasındaki adımları alternatif sütunla (ör. katyonik veya anyonik değişim sütunu) tekrarlayın.
- Her iki sütun da incelendikten sonra, gelecekteki deneylerde kullanılmak üzere ilgilenilen protein için bir FPLC protokolü tanımlayın. Ultra santrifüjleme filtre üniteleri kullanarak protein çözeltisinin hacmini (10 kDa, Malzeme Tablosuna bakınız) 2 mL'ye düşürün.
NOT: Bu deney serisinin beklenen iki sonucu vardır. Ya ilgilenilen protein sütunlardan birine bağlanmıştır ve protein çözeltisi elüsyondan sonra zaten oldukça saftır ya da protein her iki durumda da akışta kalmıştır. İkinci senaryoda, protein akışta olmasına rağmen, bu adımın temizleme etkisi hala önemli olabilir. Böyle bir durumda, domuz böbreği ve fare karaciğerindeki FAHD1'de olduğu gibi, iyonik değişimin bu adımı hala gerçekleştirilecektir. Katyonik veya anyonik değişim kolonunun hiçbiri uygun bir temizleme etkisi sağlayamıyorsa, lizat ve tamponun pH'ını değiştirmeye ve FPLC'ye uygulamadan önce numuneyi çalışan tampona karşı çevirmeye çalışılabilir.
6. Amonyum sülfat çökeltme ve FPLC için tanımlanmış alt protokolleri kullanarak protein ekstraksiyonu
NOT: FPLC için bir silika jel kolondaki gözenekli parçacıklar ( Malzeme Tablosuna bakınız), proteinlerin hidrodinamik yarıçaplarına göre farklılaşmasını sağlar. Açıklanan adımlar, boyut dışlama kromatografisi (SEC) kullanılarak bir FPLC sistemi ile gerçekleştirilmelidir. Kullanılan SEC sütunu için (bkz . Malzeme Tablosu), 0,3 mL/dak akış hızı önerilir.
- Gerekli tüm malzemeleri hazırlayın (bkz. adım 1) ve toplam proteini dokudan çıkarın (bkz. adım 2). Test için kullanılmayan tüm doku homojenatı ile bir amonyum sülfat çökeltmesi gerçekleştirin (bkz. adım 4). Daha büyük hacimler için, lizatı ultra santrifüjleme filtre üniteleri (10 kDa; bakınız Malzeme Tablosu) kullanarak 50 mL veya daha küçük bir hacme kadar yoğunlaştırın.
- İyonik değişim kromatografisini kullanarak ilk saflaştırma adımını gerçekleştirin (bkz. adım 5).
- Önceki adımlarda açıklandığı gibi batı lekesi için numuneler hazırlayın. Batı leke analizi yapın ve iyonik değişim kromatografisinden fraksiyonlar içeren tüm FAHD1'leri bir araya getirin.
- Ultra santrifüjleme filtre üniteleri (10 kDa) kullanarak protein çözeltisinin hacmini 2 mL'ye düşürün. Herhangi bir mikro çökeltiyi gidermek için çözeltiyi 0,45 μm ve 0,22 μm şırınga filtre üniteleriyle sırayla filtreleyin.
- SEC sütununu, 1 mM DTT içeren 1 CV çalışan arabellek ile dengeleyin (bkz. Tablo 1). Numuneyi kolona yükleyin ve tüm proteinler salınana kadar kromatografiyi çalıştırın (1-2 CV).
- Kromatogramdaki önemli zirvelere karşılık gelen akışın 1 mL'lik fraksiyonlarını toplayın (280/255 nm'de UV absorpsiyonu) ve önceki adımlarda açıklandığı gibi SDS-PAGE ve batı leke analizi için toplanan her fraksiyonun 50 μL numunesini hazırlayın. Sıvı azot kullanarak tüm fraksiyonları çıtçıtla dondurun ve -80 °C'de saklayın.
- SEC sütununu art arda 1 CV ddH 2 O ve 1 CV %20 EtOH (ddH2O cinsinden) ile yıkayın. Batı-Leke analizi yapın ve fraksiyonları içeren tüm FAHD1'leri bir araya getirin. Ultra santrifüjleme filtre üniteleri kullanarak protein çözeltisinin hacmini 2 mL'ye düşürün (10 kDa, bkz.
- Ticari bir BCA tahlil kiti kullanarak protein konsantrasyonunu değerlendirin (bakınız Malzeme Tablosu).
NOT: Mobil fazın pH ve tuz içeriği, küresel proteinlerin elüsyon profilini etkileyebilir20. Asidik veya bazik koşullar, piklerin daha az tanımlanmış olmasına ve protein-matriks etkileşimlerinin artmasına ve proteinin sütun20'de kısmi tutulmasına neden olabilir. Bu etki, daha fazla protein saflaştırması için kullanılabilir. Adım 6'nın farklı akış hızları, pH ve tuz konsantrasyonları ile tekrarlanması, protein20'nin saflığını artırabilir.
7. Gümüş boyama
NOT: SDS-PAGE jellerinin gümüş boyama analizi, Coomassie boyamasında görülemeyen protein kontaminasyonlarını kontrol etmek için gereklidir. Aşağıdaki protokol, literatür21'de bulunabilecek birçok versiyondan biridir. Tüm inkübasyon adımlarını temiz bir cam tepside sallayarak gerçekleştirin. Tüm gümüş ve formaldehit içeren sıvıları özel bir atık kabında toplayın ve uygun şekilde atın.
- SDS-PAGE jellerini soğuk odada gece boyunca gümüş boyama sabitleme çözeltisinde (bakınız Tablo 1) inkübe edin. Jelleri gümüş boyama inkübasyon çözeltisinde (bakınız Tablo 1) oda sıcaklığında 3 saat boyunca inkübe edin. İsteğe bağlı olarak, soluk bantların algılanmasını iyileştirmek için glutaraldehit ekleyin (bkz. Tablo 1). Jelleri her biri 10 dakika boyunca ddH2O'da dört kez yıkayın.
- Jelleri gümüş boyama gümüş çözeltisinde (bakınız Tablo 1) 1 saat boyunca inkübe edin.
NOT: Şu andan itibaren tüm sıvıların ve jelin kendisinin toksik olan gümüş ve formaldehit içerdiğini unutmayın. - Jelleri gümüş boyama geliştirici çözümünde (bakınız Tablo 1) bantlar açıkça görünene kadar kuvvetli bir şekilde çalkalayarak inkübe edin. Reaksiyonu durdurmak için, geliştirici solüsyonu atın ve jelleri derhal gümüş boyama durdurma çözeltisinde (bakınız Tablo 1) en az 10 dakika boyunca inkübe edin.
NOT: Adım 7.2 ve 7.3'te lekelenen bantlar sürekli olarak daha gelişmiş hale gelecektir. Çözeltiye belirtilenden daha fazla formaldehit eklenmesi, boyama zayıfsa gerekli olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FAHD1 proteini, sunulan protokol kullanılarak domuz böbreği ve fare karaciğerinden ekstrakte edildi. Fare dokusu için, son saflaştırma adımından sonra birkaç μg elde etmek için birden fazla organ gereklidir. Bu nedenle, bu makale FAHD1'in domuz böbreklerinden ekstraksiyonuna odaklanmaktadır, bu da çok daha örnek bir deneydir. FAHD1'in fare karaciğerinden çıkarılması, bu protokolün zorluklarını ve olası tuzaklarını sunmak için gerçekleştirilir. Genellikle arındırmak istediği proteinin yüksek ekspresyon seviyesini gösteren organların kullanılması önerilir. İnsan Protein Atlası22 , model sistemindeki ifadeyi tahmin etmeye yardımcı olabilir veya bu seviyeleri değerlendirmek için farklı ham doku lizatlarıyla ön batı leke deneyleri yapılabilir. Tüm batı leke analizlerinde kullanılan pozitif kontrol, biraz daha yüksek moleküler ağırlıkta çalışan etiketli bir rekombinant proteindi.
İlk deney olarak, FAHD1'in domuz böbreğinden çıkarılması sunulmuştur. Doku homojenizasyonu (adım 1) ve toplam protein ekstraksiyonu (adım 2) süreci Ek Şekil 1'de sunulmuştur (bireysel adımların açıklaması için açıklamaya bakınız). Aşağıdaki deneyler için toplam lizatın onda biri kullanılmıştır.
Amonyum sülfat çökeltisi, lizata farklı konsantrasyonlarda amonyum sülfat eklenerek bu lizat için bir kez test edildi (adım 4) (Şekil 2). Santrifüjlemeden sonra, peletler ve süpernatantlar, insan FAHD1'e karşı yükseltilmiş tanımlanmış bir poliklonal antikor2 kullanılarak batı lekesi ile örneklendi ve analiz edildi. E. coli 12'den elde edilen 200 ng rekombinant His/S etiketli insan FAHD1 pozitif kontrol olarak yüklendi. FAHD1 protein bandı 25 kDa'da görülebilirken, etiketli pozitif kontrol 34 kDa'da çalışır. Bu verilere dayanarak, lizatın% 25 amonyum sülfat ile muamele edildiği, yani FAHD1'in hala süpernatant içinde olduğu koşullar, diğer proteinlerin çoğunun çökeltildiği bir protokol tanımlanmıştır. Bu, arıtma stratejisinde önemli bir adımdır. Amonyum sülfat çökeltmesi, diğer yöntemlere geçmeden önce etkili bir temizleme adımıdır. Not olarak,% 30'dan daha yüksek amonyum sülfat miktarları kullanılmayacaktır, çünkü amonyum sülfat SDS-PAGE ve batı lekesinin kalitesini kademeli olarak bozar.
Şekil 2: Amonyum sülfat çökeltmesi ve domuz FAHD1 için batı lekesi taraması . (A) Çözeltiden proteinleri çökeltmek için lizata farklı konsantrasyonlarda (maksimum% 5 ila% 25) amonyum sülfat ilave edildi. (B) Domuz FAHD1'in (25 kDa) varlığı, insan FAHD1'e karşı yükseltilmiş bir poliklonal antikor kullanılarak batı lekesi yoluyla değişen amonyum sülfat konsantrasyonlarına karşılık gelen bireysel pelet ve süpernatant çiftlerinde belirlendi. % 25 amonyum sülfat çökelmesine karşılık gelen süpernatant, süpernatantta hala domuz FAHD1'in varlığını gösterir ve aynı zamanda iyi miktarda başka proteini çökeltir. 200 ng His/S-etiketli rekombinant protein pozitif kontrol (34 kDa) olarak yüklendi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
İyonik değişim kolonlarını FPLC ile test ettikten sonra, domuz FAHD1'in pH 9'da bir anyonik değişim kromatografisinin akışında kaldığı bir strateji tanımlanmıştır (adım 5). Amonyum sülfat çökeltmesi ile% 25'te (önceki test deneylerinde tanımlandığı gibi) elde edilen lizat ile başlayarak, çözeltiden daha fazla proteini elimine etmek için anyonik değişim kromatografisi kullanılmıştır (Şekil 3A). Bağlayıcı proteinler kolondan elüsyon ile uzaklaştırılırken, akış pH 7.4'te SEC yoluyla daha da saflaştırıldı (Şekil 3B). Her iki adımı takiben, batı leke analizi, domuz FAHD1 içeren, havuzlanmış ve 2 mL'ye konsantre edilmiş tüm fraksiyonları tanımladı.
Resim 3: Domuz FAHD1'in FPLC ile saflaştırılması - bölüm 1. Kromatogram ve lekelerdeki kırmızı oklar FAHD1'in varlığını gösterir. Kromatogramda, "UV" 280 nm'deki UV absorpsiyonunu, "Cond" iletkenliği (tampondaki tuz konsantrasyonu ile ilgili) ve "Conc B", tampon gradyanındaki yüksek tuz tamponunun yüzdesini (% 0 saf düşük tuz tamponu; % 100 saf yüksek tuz tamponu) gösterir. (A) Domuz FAHD1'in anyonik değişim kolonu (FPLC) ile% 25'te amonyum sülfat çökeltmesi ile elde edilen lizattan saflaştırılması. Birçok protein kolona bağlanırken, akışta domuz FAHD1 bulunur. Kir ve protein olmayan kirleticiler kolondan elüsyon yoluyla uzaklaştırılırken, akış daha fazla işlenir. (B) (A)'daki önceki anyonik değişim kromatografisinden gelen akış, pH 7.4'te boyut dışlama kromatografisi (FPLC) ile daha da saflaştırılır. (A,B) Batı leke analizi (altta kırpılmış lekeler), domuz FAHD1 içeren, havuzlanmış ve konsantre edilmiş fraksiyonları tanımladı. Tam lekeler, batı leke analizinden sonra Coomassie lekeli membranı tasvir eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Filtrelenmiş numune tekrar SEC'e ancak pH 9'daki tampon koşullarında uygulandı (bkz. Tablo 1) (Şekil 4). Bu yaklaşımın arkasındaki mantık, mobil fazın pH ve tuz içeriğinin küresel proteinlerin elüsyon profilini etkileyebileceği20 ve bu tampon koşulları altında FAHD1 için geliştirilmiş bir elüsyon profilinin bulunmasıdır. Bir fraksiyon, proteinin kimliğini nihayet doğrulamak için temel enzim aktivitesi tahlilleri12 için yeterli saflık seviyelerinde protein içeriyordu.
Resim 4: Domuz FAHD1'in FPLC ile saflaştırılması - bölüm 2. Kromatogram ve lekelerdeki kırmızı oklar FAHD1'in varlığını gösterir. Daha önce anyonik değişim ve boyut dışlama kromatografisi ile saflaştırılan protein örnekleri, pH 9'da (üst panel) boyut dışlama kromatografisi (FPLC) ile daha da saflaştırılır. Sağ altta gösterilen batı leke analizi, domuz FAHD1 içeren, havuzlanmış ve konsantre (alt paneller) fraksiyonları tanımlar. Sol alttaki leke, batı lekesinden sonra zarın Coomassie lekesini gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Alternatif bir strateji (yani, SEC ve ardından iyonik değişim kromatografisi), amonyum sülfat çökeltmesinden sonra elde edilen lizatın 2 mL'si ile test edildi (adım 4) (Ek Şekil 2). Bu deneyin mantığı, ilk önce SEC kullanılarak, FAHD1 içeren fraksiyonların diğer proteinlerin çoğundan ayrılabilmesi, proteini daha da saflaştırmak için sonraki bir iyonik değişim kromatografisinin kullanılabilmesidir. İlk olarak, lizat pH 7.4'te SEC kullanılarak fraksiyone edildi (adım 6). Batı leke analizi, domuz FAHD1 içeren tüm fraksiyonları tanımladı. İkincisi, bu fraksiyonlar konsantre edildi ve pH 9'da (adım 5) bir anyonik değişim sütunu kullanılarak daha da saflaştırıldı. Kromatogramlar ve batı leke analizi (Ek Şekil 2), bu stratejinin cesaret verici olduğunu göstermektedir, çünkü iyonik değişim kromatogramı, batı lekesindeki zenginleştirilmiş protein seviyeleri ile ilişkili tanımlanmış dar bir tepe göstermektedir. Bununla birlikte, bu stratejinin dezavantajı, SEC'e (2 mL) uygulanacak ilk hacimle sınırlı olmasıdır, bu nedenle bu yöntemin verimi çok düşüktür. Örneğin, bütün bir domuz böbreğinin işlenmesi pratik değildir.
Bu protokolde bir başka değişiklik olarak, domuz FAHD1 de akışta mevcut olduğunda, anyonik değişim sütunundan önce bir katyonik değişim sütunu dahil edildi. Protokolün her adımında, fraksiyonlar içeren domuz FAHD1 örnekleri örneklenmiş ve başka bir yerde açıklandığı gibi bir ODx testi ile test edilmiştir(Ek Şekil 3). Spesifik enzimatik aktivite, saflık seviyesi ile birlikte, yani toplam protein başına artan göreceli FAHD1 miktarı ile birlikte artar.
İkinci bir örnek olarak, FAHD1'in fare karaciğerinden ekstraksiyonu, yani 20 fareden elde edilen karaciğer dokusunun bir koleksiyonu sunulmaktadır. FAHD1'in yukarıda sunulan domuz böbreğinden ekstraksiyonu ile karşılaştırıldığında, bu ekstraksiyonun daha sıkıcı olduğu kanıtlanmıştır. Protokolün aşağıda sunulacak olan birkaç adımında sorunlarla karşılaşıldı. Toplam protein, adım 2'de açıklandığı gibi ekstrakte edildi (Ek Şekil 4). Fare karaciğeri homojenatı çok yapışkan ve sümüksü bir varlık olma eğiliminde olduğundan, çözeltiyi daha çok bir sıvı gibi yapmak için ekstraksiyondan sonra lizis tamponunda 1: 3 seyreltilmiş lizatı önceden filtrelemek için filtre kağıtları (kahve filtre ünitelerine benzer) kullanılmıştır. Bu seyreltme, filtreleme prosedürünü geliştirdi; Bununla birlikte, proteinin batı lekesi ile daha sonra tespit edilmesini daha sıkıcı hale getirdi. Filtrasyondan sonra, hazırlanan lizatın daha fazla kullanımdan önce konsantre edilmesi gerekiyordu. Aşağıdaki deneyler için toplam lizatın onda biri kullanılmıştır.
Amonyum sülfat çökeltmesi için ilk test adımı (Ek Şekil 4I), karşılaşılabilecek olası bir sorunu göstermiştir. Daha yüksek konsantrasyonlardaki amonyum sülfat, SDS-PAGE jellerini bozar ve 150 V'ta çalıştırıldığında gülümseme etkisine neden olur (Ek Şekil 5A; negatif sonuç). Aynı SDS-PAGE 80 V'ta çalıştırıldığında olumlu bir sonuç görüntülenir (Ek Şekil 5B). İkinci durumda, gülümseme etkisi başlangıçta oluşur, ancak uygulanan düşük voltaj nedeniyle sonuçta çözülür. Lisatı filtreleyebilmek için ilk çözeltinin ağır bir şekilde seyreltilmesi gerektiğinden, bu örneklerin ilk batı leke analizi başarısız oldu, yani pozitif kontrol antikor tarafından tespit edildi, ancak uygulanan örneklerdeki protein tespit edilmedi. Bu problem, hem lizatın (santrifüj filtre üniteleri kullanılarak konsantre edilmiş) hem de antikorun daha yüksek bir konsantrasyonu kullanılarak ve titreme sırasında antikorun soğuk odada gece boyunca uygulanmasıyla çözüldü. Nihayetinde, batı leke analizi hem proteinin lizatta mevcut olduğu hem de proteinin% 15 amonyum sülfatta süpernatantta hala mevcut olduğu bilgisini sağlamıştır (Ek Şekil 5C). Not olarak, daha yüksek miktarda amonyum sülfat (>% 15) içeren SDS örnekleri, ısıtma sırasında çökeldi ve protein kayboldu. Bu aynı zamanda Coomassie boyamasında ve batı lekesinde de görülebilir (Ek Şekil 5C). Bu etki domuz böbreği için gözlenmemiştir, bu nedenle dokuya özgü olabilir.
%15'te amonyum sülfat çökelmesini takiben, pH 6.8'de katyonik değişim kromatografisine 10 mL lizat uygulandı. Batı leke analizi, fare FAHD1 proteininin akışta olduğunu gösterdi (Şekil 5A). Salınan protein fraksiyonu küçük gibi görünüyor; Bununla birlikte, bu örnek iyonik değişim kromatografisinin ikincil bir etkisini göstermektedir. Protokolün bu adımında, çözelti hala protein olmayabilecek birçok bileşik içerebilir. İyonik değişim kromatografisi, bu tür kontaminasyonlardan kurtulmanın hızlı ve kolay bir yoludur. İyonik değişim kromatografisinin gerçekleştirilmesinin birkaç saat sürdüğü göz önüne alındığında (tüm yıkama adımları dahil, deneyin kendisi yarım saat sürer), numuneyi protein dışı kontaminasyonlardan temizlemek için basit bir yöntem sağlar.
Şekil 5: FPLC ile fare FAHD1'in saflaştırılması. Kromatogram ve lekelerdeki kırmızı oklar FAHD1'in varlığını gösterir. (A) %15'te amonyum sülfat çökeltmesinden sonra, numune santrifüj edildi, filtrelendi (0.22 μm) ve bir katyonik değişim kolonuna uygulandı. Batı leke analizi, proteinin akışta olduğunu ve kromatogramın bu adımda diğer proteinlerin çoğunun çıkarılmadığını göstermektedir. Bununla birlikte, girdinin görünümünü ve viskozitesini akışla karşılaştırmak, toplanan akışın çok daha net olduğunu gösterir (giriş ve akışı karşılaştıran sağ panel). (B) Katyonik değişim kolonundan toplanan akış, santrifüjleme filtreleri aracılığıyla 2 mL'ye düşürüldü ve pH 7.4'te boyut dışlama kromatografisine uygulandı. (C) FAHD1 içeren fraksiyonlar bir araya getirildi, konsantre edildi ve pH 9'da ikinci bir boyut dışlama kromatografisi turuna uygulandı. (D) FAHD1 içeren fraksiyonlar tekrar bir araya getirildi ve kalan kontaminasyonları görmek için gümüş boyama ile SDS-PAGE'e uygulandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Numune ayrıca pH 7.4'te boyut dışlama kromatografisine uygulandı (Şekil 5B). Batı leke analizi, bir araya getirilen ve 2 mL'ye konsantre edilen fare FAHD1 proteinini içeren fraksiyonları gösterdi. Bu 2 mL konsantre, 10 μL β-merkaptoetanol ile -20 ° C'de donduruldu ve ertesi gün çözüldü. Şırınga filtre üniteleri (0.22 μm) ile filtrelenen bir çökelti oluşturuldu. Fare FAHD1 proteininin hala çözelti içinde olduğundan emin olmak için SDS-PAGE ve batı leke analizi için örnekler alındı.
Proteini içeren örnekler (batı leke analizinden) bir araya getirildi, santrifüjleme filtreleri ile konsantre edildi ve kalan kontaminasyonları görmek için gümüş boyama ile SDS-PAGE'ye uygulandı (Şekil 5D). Bu, protein çözeltisinin çok saf olmadığını ve fare karaciğerinden bu yöntemle elde edilen protein miktarlarının da çok yüksek olmadığını ortaya koymuştur (BCA tahlil kiti kullanılarak belirlenen toplamda birkaç μg; bakınız Malzeme Tablosu). Protein verimi, domuz FAHD1 durumunda çok daha yüksekti (bu adımda yaklaşık 1 mg). Domuz böbreğinden ekstrakte edilen FAHD1 proteininin saflık seviyesi yaklaşık% 80'dir (gümüş boyamasından sonra tahmin edilir; veriler gösterilmemiştir). Bu saflık , örneğin tanımlanmış bir antikor kullanılarak afinite kromatografisi ile daha da arttırılabilir. Bu protokolün bu ve diğer sınırlamaları aşağıda ayrıntılı olarak ele alınacaktır.
| Tampon/Çözelti/Malzeme Adı | Kompozisyon | ||
| Coomassie destaining çözümü | %30 (v/v) EtOH; % 5 (v/v) HOAc; ddH2O içinde | ||
| Coomassie boyama çözeltisi | % 0.05 Coomassie Parlak Mavi R-250; % 50 (v/v) MeOH; % 10 (v/v) HOAc; ddH2O içinde | ||
| Mono Q yüksek tuz tamponu | 20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; % 10 gliserol; ddH2O'da; NaOH ile pH'ı 9,0'a ayarlayın | ||
| Mono Q düşük tuz tamponu | 20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; ddH2 O'da; NaOH ile pH'ı 9,0'a ayarlayın | ||
| Mono S yüksek tuz tamponu | 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1 M NaCl; ddH2 O'da; HCl ile pH'ı 6,8'e ayarlayın | ||
| Mono S düşük tuz tamponu | 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 15 mM NaCl; ddH2 O'da; HCl ile pH'ı 6,8'e ayarlayın | ||
| Protein lizis tamponu | 1x PBS (250 mL); 50 mM NaF; 1mM PMSF; 2 μg / mL aprotinin, 1 mM aktif ortovanadat; ddH2O içinde | ||
| Tavşan Anti-hFAHD1 poliklonal antikoru (afinite izole edilmiş) | Özel yapım; poliklonal anti-hFAHD1 antikoru tavşan serumundan saflaştırılmış ve referans 12'ye göre FPLC ile saflaştırılmıştır | ||
| Rekombinant hFAHD1 proteini batı leke kontrolü | Batı leke kontrol proteini E.coli ile eksprese edilir ve referans 12'ye göre FPLC ile saflaştırılır. | ||
| SDS-PAGE 5x numune tamponu | 300 mM Tris HCl; 500 mM DDT; %10 (v/v) SDS ile; %50 (v/v) gliserin; % 0.05 (w / v) bromofenol mavisi; ddH2 O'da; HCl ile pH'ı 6,8'e ayarlayın | ||
| Süreksiz PAGE için SDS-PAGE çözme jeli (%12,5) | ddH2O (9,5 mL); 3 M Tris HCl (2,2 mL); 5,5 mL% 40 Akrilamid / Bis Çözeltisi (29: 1 oranı); %20 SDS (175 μL); TEMED (17 μL); % 10 amonyum persülfat (175 μL); istifleme jelinden önce dökülür ve polimerize edilmesine izin verilir; istifleme jelini üstüne dökün | ||
| SDS-PAGE çalışan arabellek | 25 mM Tris HCl; 190 mM glisin; % 0,5 (d) SDS ile; ddH2 O'da; NaOH ile pH'ı 8,3'e ayarlayın | ||
| Süreksiz PAGE için SDS-PAGE istifleme jeli (%12,5) | ddH2O (3,8 mL); 1 M Tris HCl (630 μL); 500 μL% 40 Akrilamid / Bis Çözeltisi (29: 1 rasyon); %20 SDS (25 μL); TEMED (5 μL); % 10 amonyum persülfat (50 μL); çözücü jel polimerize olduktan sonra dökülür; kuyular oluşturmak için bir jel tarak uygulayın | ||
| SEC (G75) çalışan arabellek | 15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; ddH2 O'da; NaOH ile pH'ı 7,4'e ayarlayın | ||
| Gümüş boyama çözümü geliştirme | ddH 2 O'da250mM Na2CO3; kullanmadan önce 100 mL'ye 12 μL %37 (v/v) formaldehit ekleyin | ||
| Gümüş boyama sabitleme çözeltisi | %40 (v/v) EtOH; %10 (v/v) HOAc; ddH2O içinde | ||
| Gümüş boyama inkübasyon çözeltisi | %30 (v/v) EtOH; 500 mM NaOAc; 8 mM Na 2 S2O3; ddH2 O'da; isteğe bağlı: kullanmadan önce 100 mL başına 600 μL %50 (v/v) glutaraldehit ekleyin | ||
| Gümüş boyama gümüş çözeltisi | %0,1 (w/v) AgNO3; ddH2 O'da; kullanmadan önce 100 mL'ye 25 μL %37 (v/v) formaldehit ekleyin | ||
| Gümüş boyama durdurma çözümü | pH 7.6'da 40 mM EDTA çözeltisi; 744 mg EDTA'yı 40 mL ddH2O'ya aktarın ve daha sonra çözünmesi ve pH'ı 7.6'ya ayarlamak için NaOH ekleyin. Son olarak, toplam ses seviyesini 50 mL'ye ayarlayın. | ||
| Batı leke bloke edici tampon | %0,1 (v/v) Aralık 20 ve %5 (w/v) yağsız süt tozu içeren PBS; filtrelenmiş | ||
| Batı lekesi transfer tamponu (10x) | Tris-HCl 250 mM; glisin 1.92 M; ddH2 O'da; NaOH ile pH'ı 8.3'e ayarlayın; oda sıcaklığında saklamak | ||
| Batı lekesi transfer tamponu (1x) | Batı leke transfer tamponu (10x) 100 mL; 800 mL ddH2O; 100 mL MeOH; 4 °C'de saklamak | ||
| Batı leke yıkama tamponu (PBS-T) | PBS ile %0,1 (d/d) Ara 20 | ||
Tablo 1.
Ek Şekil 1: Domuz böbreğinden toplam protein ekstraksiyonu. (A) Böbrek dokusunun, kaymayı önlemek için polistiren köpük üzerine konmuş, uygun şekilde temizlenmiş hazırlanmış bir cam plaka üzerinde bir neşter kullanılarak kesilmesi; (B) Protein/proteaz inhibitörleri ile 20 mL buz gibi soğuk lizis tamponu içeren 50 mL tüpler buz üzerinde inkübe edilir; (C) böbrek dokusu parçaları, hacim yaklaşık 30 mL'ye ulaşana kadar tampona yerleştirildi; (D) böbrek dokusu ultrason kullanılarak homojenize edildi (yani, sonikasyon); (E) ham homojenat, 30 dakika boyunca orta hızda bir masa üstü santrifüjde santrifüj edildi; (F) Birkaç numunenin aynı anda işlenmesi; (G) İlk santrifüjlemeden sonra, süpernatant santrifüj tüplerine ( E ile karşılaştırıldığında) aktarıldı ve 30 dakika boyunca yüksek hızda (10.000 x g) santrifüj edildi; (H) Bu santrifüjleme adımı, 50 mL tüplere aktarılan başka bir pelet ve süpernatan verir; (I/J) ön lizat sırayla 0,45 μm ve 0,2 μm filtre üniteleri ile filtrelenir, 10 mL partilere ayrılır ve daha sonra -80 °C'de depolanmak üzere sıvı azotla dondurulur. Batı leke analizi, tüm örneklerde (peletler, süpernatantlar, filtrelenmiş lizat) proteinin varlığını doğrulamak için kullanılır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 2: Domuz FAHD1'in FPLC ile saflaştırılması; alternatif strateji. Kromatogram ve lekelerdeki kırmızı oklar FAHD1'in varlığını gösterir. (A) Domuz FAHD1'in amonyum sülfat çökeltmesi ile elde edilen lizattan %25 oranında saflaştırılması ve pH 7.4'te boyut dışlama kromatografisi (FPLC). Batı leke analizi, domuz FAHD1 içeren, havuzlanmış ve konsantre edilmiş fraksiyonları tanımladı. (B) Daha önce boyut dışlama kromatografisi (panel A) ile saflaştırılan protein örnekleri, anyonik değişim kromatografisi (FPLC) ile daha da saflaştırılmıştır. Batı leke analizi, domuz FAHD1 içeren, havuzlanmış ve konsantre edilmiş fraksiyonları tanımlar. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 3: Domuz FAHD1'in spesifik enzim aktivitesi. Artan saflık seviyesinin bir fonksiyonu olarak spesifik enzim aktivitesi ölçülür. Tablo, göreceli enzim aktivitesini (nmol / dak) spesifik enzim aktivitesi (μmol / dak / mg) ile karşılaştırmaktadır. Tahlil, her saflaştırma adımından sonra domuz FAHD1'in sürekli artan aktivitesini göstermektedir. E. coli'den elde edilen rekombinant His/S-human FAHD1 (yeşil) ile karşılaştırılmıştır. 12, domuz FAHD1 biraz daha yüksek bir aktivite gösterdi (kırmızı) (n = 3). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 4: Fare karaciğerinden toplam protein ekstraksiyonu. (A,B,C) 20 fareden elde edilen dondurulmuş karaciğer dokusu ve lizis tamponu 50 mL tüplerde buz üzerinde hazırlandı; (D, E, F) karaciğer dokusu ultrason (yani sonikasyon) kullanılarak homojenize edildi; ham homojenat, 30 dakika boyunca orta hızda masa üstü bir santrifüjde santrifüj edildi; süpernatant santrifüj tüplerine aktarıldı ve 30 dakika boyunca yüksek hızda (10.000 x g) santrifüj edildi; (G, H, I) ön lizat, kağıt filtreler, 0.45 μm ve 0.2 μm filtre üniteleri ile sıralı olarak filtrelenir, 10 mL partilere ayrılır ve daha sonra -80 ° C'de depolamak için sıvı azotla dondurulur; (J) Çözeltiden proteini çökeltmek için lizata farklı konsantrasyonlarda (maksimum% 5 ila% 30) amonyum sülfat ilave edildi; (K) amonyum sülfat çökeltmesinden (panel J) sonra elde edilen peletler, SDS-PAGE ve batı leke analizi için numune almak üzere H2O'da yeniden askıya alındı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 5: Amonyum sülfat çökeltmesi ve fare FAHD1 için batı lekesi taraması. Lekelerdeki kırmızı oklar FAHD1'in varlığını gösterir. (A) Amonyum sülfat çökeltmesi 125 V'ta çalıştırıldıktan sonra elde edilen örneklerle SDS-PAGE. Bu jel sert bir gülümseme etkisi gösterdi ve böyle bir jel değerlendirilemez. Bu, olumsuz bir sonuç örneğidir. (B) Aynı örneklere sahip SDS-PAGE (panel A) tamamlanana kadar 80 V'ta çalıştırılmıştır. Bu jelde gülümseme etkisi yoktur ve bu olumlu bir sonuç örneğidir. (C) Amonyum sülfat çökeltmesinden sonra elde edilen numunelerin SDS PAGE ve batı lekesi analizi. Daha yüksek amonyum sülfat konsantrasyonlarındaki numuneler, belirtildiği gibi numune tamponunun içinde çökelebilir. Kaybolurlar ve artık Coomassie boyaması (solda) veya batı leke analizi (sağda) ile tespit edilemezler. Bu durumda en iyi amonyum sülfat konsantrasyonu% 15 olarak belirlenmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokoldeki kritik adımlar
Proteinlerin işlenmesi için ortak yönergeleri izlemek, buz üzerinde ve ılımlı pH ve tuz koşullarında çalışmak gibi esastır. Proteaz inhibitörlerinin kullanımı yöntem için faydalıdır, proteazom inhibitörlerinin kullanımı şiddetle tavsiye edilir. Numunenin dondurulması ve çözülmesi her zaman protein çökelmesine (en azından kısmen) neden olabilir, bu nedenle ilk protein lizatının çözülmüş herhangi bir alikotu (adım 2) ara vermeden sürekli olarak işlenmelidir. Mikroçökeltiyi gidermek için genellikle çözülmeden sonra santrifüj ve filtrasyon önerilir.
Bir dokudan elde edilen ilk protein lizatı hala proteinlerin yanı sıra birçok madde içerir. Lisatı temizlemek için iyonik değişim kromatografisi sütunları kullanılabilir. Ekstrakte etmek istenen protein iyonik değişim kolonuna bağlanmasa bile, akış giriş çözeltisinden çok daha net olabilir ve sonraki adımlarda işlenmesi daha kolay olabilir. Bu, FAHD1'in fare böbreklerinden ekstraksiyonu için gösterilmiştir (bkz. Şekil 5A).
Yöntemin sınırlamaları ve modifikasyonları
Bu protokol, FAHD1'in dokudan çıkarılması için bir protokolü tanımlar. Bu stratejiye dayanarak, FAHD proteinlerinin (FAHD1, FAHD2) diğer dokulardan ekstraksiyonu için genel bir yaklaşım elde edilebilirken, bireysel vakalar için spesifik uyarlamalar gerekebilir. Bu yöntemin örtük sınırlaması, belirli bir dokudaki FAHD1'in (veya FAHD proteinlerinin) göreceli ekspresyon seviyeleri ve bu dokunun yeterli miktarlarda mevcudiyetidir. Bu protokolde açıklanan genel şema, proteinin başlamak için uygun miktarda dokuda yüksek bir ekspresyonunu gerektirir. FAHD1'in domuz böbreğinden ve fare karaciğerinden ekstraksiyonu için örnekler verilmiştir, bunlar proteinin yüksek ekspresyon seviyelerini gösteren iki organdır. Bu protokolde açıklanan her adımda, örtük bir numune kaybı vardır, yani düşük başlangıçtaki protein miktarı daha da azalır. Sonuçta, bu protokol kullanılarak sadece düşük miktarda protein elde edilebilir. Domuz böbreği büyük bir organ olduğundan, bu yaklaşımla iki böbrekten yaklaşık bir gram protein (yaklaşık% 80 saflık; tahmini) çıkarılabilir. FAHD1'in fare karaciğerinden ekstraksiyonu için aynı protokolün uygulanması, sonunda sadece birkaç μg protein elde etmek için 20 fareden karaciğer örnekleri toplanmasını gerektiriyordu. Özetlenen yöntemleri kullanarak proteinin daha yüksek saflığını elde etmek sıkıcı olabilir ve gümüş boyama, boyut dışlama kromatografisinden sonra çözeltide hala birçok başka protein olabileceğini ortaya koymaktadır. Bu protokol, bir monoklonal antikor (örneğin, CAB025530) kullanarak afinite kromatografisi (NHS ile aktive edilmiş sütunlar) yoluyla arttırılabilir.
Burada listelenen tüm protokoller, kişinin çıkarmak istediği proteinin çözünür olmasını gerektirir. Kromatografi için optimum amonyum sülfat çökeltme koşulları ve pH/tuz ayarlamaları test edilmeli ve tanımlanmalıdır. İyonik değişim kromatografisinin iyi bir saflaştırma sonucu vermemesi durumunda, FPLC yapılmadan önce bir kromatografi tamponuna karşı diyaliz, proteinin çözünürlüğünü ve kromatografinin çözünürlüğünü arttırmanın bir seçeneği olabilir. Bununla birlikte, ham lizatı diyalize etmek önerilmez, çünkü bu, diyaliz tüpünün içinde masif ve kontrolsüz protein çökelmesine neden olabilir. Protein hidrofobik olma eğilimindeyse sorunlar ortaya çıkabilir ve protein yüksek hidrofobik ise protokoller uygulanamayabilir (örneğin, membran proteinleri). FAHD proteinleri, belirli bir doku lizatında FAHD2 (veriler gösterilmemiştir) için bulunduğu gibi kısmen çözünmez ise, diğer kromatografi türleri, örneğin, hidrofobik etkileşim kromatografisi (HIC) de araştırılabilir12.
Standart protokolün iki modifikasyonu sonuçlar bölümünde gösterilmiştir. FAHD1'in bir domuz böbreğinden saflaştırılması için, iyonik değişim kromatografisinden önce boyut dışlama kromatografisi kullanılmıştır (bakınız Ek Şekil 2). Bu yöntemle ilgili bir sorun, boyut dışlama kromatografisinin daha büyük koşu parkurlarına sahip olması ve numune hacminin çalışma sırasında güçlü bir şekilde artmasıdır. Yüksek çözünürlük23'e ulaşmak için numune hacmi, yatak hacminin% 2'sini geçmemelidir ve nihai seyreltme faktörü de toplanan elüsyon hacmine bağlıdır. 120 mL'lik bir sütun kullanılarak sağlanan örnekte, 2 mL'lik bir başlangıç hacmi önerilir. İlk numune, amonyum sülfat çökeltmesinden sonra, santrifüj filtre üniteleri kullanılarak konsantrasyonla, agregasyon veya çökeltme artefaktları olmadan, lizatın birkaç mL'sinden toplanabilir. FAHD1'in domuz böbreğinden saflaştırılması için bir örnek temsili bir sonuç olarak verilmiştir (ayrıca Ek Şekil 2'ye bakınız). Ancak, yalnızca küçük örnek hacimleriyle sınırlama bu yaklaşımın pratik olmamasına neden olabilir.
Yöntemin uygulamaları veya yönleri
Rekombinant proteinlerin bakterilerden ekspresyonu ve saflaştırılması,24,25 proteininin uygulanabilir miktarlarını (gram cinsinden) elde etmek için basit ve iyi kurulmuş bir yöntemdir. Bu FAHD112 için sunulmuştur. Bununla birlikte, bu yöntemlerin kullanılmasında, konağın olası zayıf büyümesi, inklüzyon vücut oluşumu, protein aktivitesinin kaybı veya değiştirilmesi ve bu nedenle, herhangi bir protein elde etmeme veya proteinin önyargılı bir formuna neden olma olasılığı (yanlış katlama, kötü translasyonel sonrası modifikasyonlar, vb.) Bu nedenle, iyi katlanmış ve uygun şekilde modifiye edilmiş proteini doğrudan dokudan çıkarabilen yöntemler geliştirmek çekicidir. Bununla birlikte, en büyük sorun, çoğu proteinin önemli seviyelerde ifade edilmemesidir ve örtük indüksiyon ve ardından bakterilerden protein ekstraksiyonu ile karşılaştırıldığında, elde edilecek protein miktarı tipik olarak birkaç büyüklük sırasına göre daha düşüktür. Rekombinant proteinin bakterilerden ucuz ve kolay ekstraksiyonu ile proteinin dokudan daha pahalı ve sıkıcı ekstraksiyonu arasında bir denge vardır. İkincisi ile ilgili en büyük ilerleme, proteini, katlanma ve / veya katalitik aktivitesini etkileyebilecek tüm karşılıklı etkiler de dahil olmak üzere, dokuda bulunan fizyolojik formunda çıkarabilmesidir.
Bu protokol tarafından ekstrakte edilen ve saflaştırılan protein, FAHD113'ün yetkin inhibitörlerini, olası protein etkileşim ortakları 9'uve protein 9'un henüz keşfedilmemiş olası rollerini tanımlamaya yardımcı olacaktır. Enzimatik inhibitörlerin incelenmesi, monoklonal antikorların geliştirilmesi ve ilk etapta protein yapısının incelenmesi, bakterilerden ekstrakte edilmek yerine dokudan ekstrakte edilen yüksek saflıkta protein alındığında büyük ölçüde desteklenir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların rekabet eden finansal çıkarları yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, Ayşe Öztürk ve Eva Albertini'nin teknik yardımları için çok müteşekkirdir. Karaciğer dokusunun oluşumu için kullanılan fareler, Univ.-Doz gözetiminde tutuldu. Dr. Pidder Jansen-Dürr (Innsbruck Üniversitesi Biyomedikal Yaşlanma Araştırmaları Enstitüsü, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Avusturya).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filter units | MERCK | SLGP033RS | Millex-HP, 0.22 µm, PES 33 mm, not steril |
| 0.45 µm filter units | MERCK | SLHP033NS | Millex-HP, 0.45 µm, PES 33 mm, not steril |
| 15 mL Falcon tubes | VWR | 734-0451 | centrifugal tubes |
| 50 mL Falcon tubes | VWR | 734-0448 | centrifugal tubes |
| 96-Well UV Microplate | Thermo-Fischer | 8404 | UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates |
| Acrylamide/Bis Solution (40%, 29:1 ratio) | BIO-RAD | #1610147 | 40% acrylamide/bis-acrylamide, 29:1 (3.3% crosslinker) solution for casting polyacrylamide gels |
| ÄKTA FPLC system | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | - | using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the "ÄKTA pure" system |
| Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | MERCK | UFC901024 | centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 15 mL |
| Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | MERCK | UFC801024 | centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 4 mL |
| Ammonium sulfate powder | MERCK | A4418 | ammonium sulphate for molecular biology, ≥99.0% |
| Ammoniumpersulfat reagent grade, 98% | MERCK | 215589 | Catalyst for acrylamide gel polymerization. |
| Coomassie Brilliant blue R 250 | MERCK | 1125530025 | Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) for electrophoresis Trademark of Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6.2 (10 g/l, H2O, 25 °C) |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MERCK | D9277 | Cellulose membranes for the exchange of buffers via dialysis. |
| Eppendof tubes 1.5 mL | VWR | 525-1042 | microcentrifugal tubes; autoclaved |
| HiLoad 26/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 28989334 | HiLoad Superdex 75 pg prepacked columns are for high-resolution size exclusion chromatography of recombinant proteins |
| Immun-Blot PVDF Membrane | BIO-RAD | #1620177 | PVDF membranes are protein blotting membranes optimized for fluorescent and multiplex fluorescent applications. |
| Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | #1703930 | Use the Mini Trans-Blot Cell for rapid blotting of Mini-PROTEAN precast and handcast gels. |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels | BIO-RAD | #1658004 | 4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam. |
| Mono Q 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 17516701 | Mono Q columns are strong anion exchange chromatography columns for protein analysis or small scale, high resolution polishing of proteins. |
| Mono S 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 17516901 | Mono S columns are strong cation exchange chromatography columns for protein analysis or small scale high resolution polishing of proteins. |
| PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa | Thermo-Fischer | 26616 | A mixture of 10 blue-, orange-, and green-stained proteins (10 to 180 kDa) for use as size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo-Fischer | 23225 | A two-component, high-precision, detergent-compatible protein assay for determination of protein concentration. |
| Sonifier 250; Ultrasonic Cell Disruptor w/ Converter | Branson | - | New models at https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf |
| Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP (affinity isolated) | Agilent Dako | P0399 | The antibody used for horseradish peroxidase conjugation reacts with rabbit immunoglobulins of all classes. |
| TEMED, 1,2-Bis(dimethylamino)ethane, TMEDA | MERCK | T9281 | TEMED (N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine) is molecule which allows rapid polymerization of polyacrylamide gels. |
| Tube Roller | - | - | A general tube rotator roller; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71 |
| Tube Rotator | - | - | A general tube rotator wheel; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123 |
| ULTRA-TURRAX; T 25 digital | IKA | 0003725000 | New models at https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/ |
References
- Pircher, H., et al. Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase. Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).
- Pircher, H., et al. Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase. Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36500-36508 (2011).
- Kang, T. -W., et al. Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development. Nature. 479 (7374), 547-551 (2011).
- Hong, H., Seo, H., Park, W., Kim, K. K. -J. Sequence, structure and function-based classification of the broadly conserved FAH superfamily reveals two distinct fumarylpyruvate hydrolase subfamilies. Environmental Microbiology. 22 (1), 270-285 (2020).
- Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase. Structure. 7 (9), London, England. 1023-1033 (1999).
- Bateman, R. L., et al. Mechanistic inferences from the crystal structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a bound phosphorus-based inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 276 (18), 15284-15291 (2001).
- Weiss, A. K. H., et al. Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1. Biochemical Journal. 475 (22), 3561-3576 (2018).
- Etemad, S., et al. Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 - a new regulator of mitochondrial function and senescence. Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).
- Weiss, A. K. H., et al. Regulation of cellular senescence by eukaryotic members of the FAH superfamily - A role in calcium homeostasis. Mechanisms of Ageing and Development. 190, 111284 (2020).
- Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-Dürr, P. Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells. Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).
- Wiley, C. D., et al. Mitochondrial dysfunction induces senescence with a distinct secretory phenotype. Cell Metabolism. 23 (2), 303-314 (2016).
- Weiss, A. K. H., et al. Expression, purification, crystallization, and enzyme assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59729 (2019).
- Weiss, A. K. H., et al. Inhibitors of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain Containing Protein 1 (FAHD1). Molcules. 26 (16), 5009 (2021).
- Mizutani, H., Kunishima, N. Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8. Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (9), 792-794 (2007).
- Lee, C. H. A simple outline of methods for protein isolation and purification. Endocrinology and Metabolism. 32 (1), Seoul, Korea. 18-22 (2017).
- Amer, H. E. A. Purification of proteins: Between meaning and different methods). Proteomics Technologies and Applications. , (2019).
- Niu, L., Yuan, H., Gong, F., Wu, X., Wang, W. Protein extraction methods shape much of the extracted proteomes. Frontiers in Plant Science. 9, 802 (2018).
- Gordon, J. A. Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor. Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).
- Gallagher, S. R.
- Ahmed, U., Saunders, G. Effect of pH on Protein Size Exclusion Chromatography. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf (2011).
- Sørensen, B. K., et al. Silver staining of proteins on electroblotting membranes and intensification of silver staining of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 304 (1), 33-41 (2002).
- Fagerberg, L., et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).
- Cytiva Life Fundamentals of size exclusion chromatography. , Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography (2022).
- Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Frontiers in Microbiology. 5, 172 (2014).
- Rosano, G. L., Morales, E. S., Ceccarelli, E. A. New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 28 (8), 1412-1422 (2019).
