Een open-source, volledig aanpasbare 5-keuze seriële reactietijd taak toolbox voor geautomatiseerde gedragstraining van knaagdieren

Summary

Het huidige protocol beschrijft de ontwikkeling van een open-source 5-keuze seriële reactietijd taak toolbox voor knaagdiermodellen, met behulp van Arduino en aanverwante hardware en een veelzijdige Matlab toolbox, inclusief een optioneel script voor geautomatiseerde gedragstraining. De scripts zijn aanpasbaar en vergemakkelijken de implementatie van verschillende trial-and-test ontwerpen.

Abstract

De 5-keuze seriële reactietijdtaak (5-CSRTT) is een gedragstest die vaak wordt gebruikt om visuospatiale aandacht en impulsiviteit bij knaagdieren te bestuderen. De taak vereist dat dieren aandacht besteden aan een horizontale reeks van vijf kleine openingen uitgerust met lichtbronnen en, binnen een beperkt tijdvenster, één verlichte doelopening met de neus prikken om een voedselbeloning te krijgen bij het voedselmagazijn in de tegenoverliggende wand van de kamer. De taak houdt rekening met gedragscontrolemaatregelen zoals responsnauwkeurigheid en reactietijden en maakt het mogelijk om selectieve aandacht en impulsiviteit af te leiden. Taakmoeilijkheden kunnen worden beheerst door de stimulusduur en het taakontwerp in het algemeen aan te passen. Commercieel verkrijgbare apparatuur bestaat meestal uit een experimentele kamer en bepaalde software om taakparameters te specificeren, maar vanwege vaste hard- en software stellen ze veel beperkingen aan veranderingen in het algemene experimentele ontwerp en specifieke taakvereisten en de bijbehorende gegevensuitvoer. In dit artikel wordt een volledig aanpasbaar alternatief uitgelegd op basis van een gebruiksvriendelijke single-board microcontroller en standaard elektrotechnische componenten, een open-access Arduino-script en een Matlab-toolbox voor respectievelijk hardwarebesturing en gedragstaakspecificaties. De toolbox bevat een optionele trapprocedure, die geautomatiseerde gedragstraining mogelijk maakt. De complete hardware-installatie, die kan worden geïnstalleerd in aangepaste kamers, en de vrij aanpasbare software moedigen niet-gestandaardiseerde taak- en kamerontwerpen aan. Het ontwerp van het systeem en de open-source code voor hardwarebesturing en experimentele setup worden beschreven.

Introduction

De 5-CSRTT is een gedragstest, vaak gebruikt bij knaagdieren om visuele aandachtsprocessen en impulsiviteit te bestuderen 1,2,3,4,5,6, zoals het bepalen van de rol van het cholinerge systeem in aandacht en de invloed van noradrenalineheropnameremmers op impulsief gedrag 7 . Het standaardapparaat maakt het mogelijk om verschillende controlemaatregelen te observeren, zoals responsnauwkeurigheid, reactietijden, impulsief en dwangmatig gedrag, motoriek en motivatie 1,2,3,4,5. Het bestaat uit een horizontale reeks van vijf met LED uitgeruste openingen, een voedselmagazijn op de kamerwanden tegenover de openingen en huisverlichting ^2,5. Bij een typische taak wordt het huislicht verlicht en wordt het begin van een sessie gemarkeerd door de verlichting van het voedselmagazine, waar een gratis pellet wordt afgeleverd. De proefcursus wordt gestart wanneer het dier het magazijn neus-prikt om de pellet¹ op te halen. Daarna wordt het licht van het voedselmagazine gedoofd en begint het inter-trial interval (ITI), waarbij het dier zijn aandacht op de openingen moet richten. Zodra de ITI is verstreken, wordt een stimulusverlichting gepresenteerd in een van de openingen ^1,2,5. De stimulus wordt gegeven voor een specifieke lengte die bekend staat als de stimulusduur (StD). Het dier kan reageren op de stimulus terwijl deze wordt gepresenteerd of gedurende een beperkt tijdvenster nadat de soa voorbij is, bekend als limited hold (LH). Om te reageren, moet het dier de doelopening met de neus prikken en, indien correct uitgevoerd, wordt een beloning vrijgegeven in het voedselmagazine ^1,2,5. Anders resulteert elke onjuiste reactie, evenals elke reactie vóór de presentatie van de stimulus (anticiperend of voortijdig) of het niet reageren (weglaten) in een time-out (TO), waarbij het huislicht gedurende een bepaalde duur^{wordt uitgeschakeld 1,2,5} (figuur 1). Over het algemeen meet de discriminerende stimulusnauwkeurigheid het aandachtsfunctioneren, terwijl voortijdige en volhardende reacties (herhaalde reacties bij de openingen na stimuluspresentatie) worden beschouwd als maatstaven voor impulsief gedrag en compulsiviteit, respectievelijk 1,4,5,6.

Figuur 1: Mogelijke proefsequenties van een typische 5-CSRTT. Na het intertriale interval wordt het stimuluslampje voor een bepaalde duur ingeschakeld en vervolgens uitgeschakeld tijdens het interval beperkte wachttijd. De rat kan correct antwoorden en een beloning ontvangen of verkeerd antwoorden en gedurende deze tijd een time-out krijgen. Als de rat niet op tijd antwoordt, resulteert het weglaten ervan in een time-out. Evenzo, als het reageert vóór de presentatie van de lichtprikkel, resulteert de voortijdige reactie in een time-out. Een andere proefperiode begint na het verzamelen van de beloning of het einde van de time-outperiode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De 5-CSRTT wordt veel gebruikt vanwege de flexibiliteit: door parameters van de onderzoeksopzet te wijzigen, kunnen verschillende subcategorieën van aandacht worden onderzocht. Terwijl het dier bijvoorbeeld geacht wordt zijn aandacht te verdelen over de vijf verschillende openingen (visuospatiale aandacht), maakt het gebruik van irrelevante stimuli (bijv. Auditieve stimuli) het testen van selectieve of aanhoudende aandacht^mogelijk 1,2,5,6. Daartoe kan de experimentele opstelling worden uitgebreid met luidsprekers, die kunnen worden gebruikt als afleidende of zelfs versterkende stimuli 1,2,5,6. Bovendien kan de aandachtsbelasting direct worden gemoduleerd door de stimuluspresentatie te wijzigen of de ITI-duur¹⁰ te randomiseren. De 5-CSRTT wordt niet alleen gebruikt bij knaagdieren ^3,7, maar is onlangs aangepast om niet-menselijke primaten ^1,7,8 en vis ^7,9 te testen, wat de haalbaarheid ervan verder aantoont. Een volledig aanpasbare 5-CSRTT toolbox maakt het mogelijk om het standaard knaagdierparadigma eenvoudig aan te passen aan andere diermodellen. Bovendien stimuleert de aanpassingsflexibiliteit van de 5-CSRTT-toolbox ook onderzoek met behulp van niet-standaard taakontwerpen.

De volledig aanpasbare 5-CSRTT toolbox die hier wordt gepresenteerd, bevat een Arduino-script voor hardwarebesturing, geprogrammeerd in een geïntegreerde ontwikkelomgeving. Het bestaat ook uit een Matlab-toolbox (versie R2019b of jonger) voor experimentcontrole. Het volgende protocol legt uit hoe u de 5-CSRTT toolbox configureert met het veelgebruikte standaardparadigma en toont optionele configuraties voor niet-standaard paradigma's.

Protocol

De experimentele procedure in dit protocol werd uitgevoerd volgens de aanbevelingen van de EU-richtlijn 2010/63 voor het welzijn van proefdieren en in overeenstemming met de dierenwelzijnswet van de Duitse bondsregering en werd goedgekeurd door de lokale autoriteiten. Omdat het onderzoek alleen gedragstraining vereiste, werden er geen dieren geëuthanaseerd en werden ze allemaal in de houderij gehouden nadat het onderzoek was uitgevoerd. Het onderzoek werd uitgevoerd met tien mannelijke Lister hooded ratten (4 maanden oud aan het begin van de gedragstraining).

1. Huisvesting, houderij en behandeling van dieren

1. Huisratten samen met maximaal vijf nestgenoten in een standaardkooi met geschikt strooiselmateriaal, volgens de aanbevelingen van uw dierenwelzijnscommissie.
2. Bewaar de ratten in een geventileerde ruimte met een gecontroleerde temperatuur van 20 ± 2 °C en een relatieve vochtigheid van maximaal 50% met een licht/donkercyclus van 12:12 uur, of in overeenstemming met de aanbevelingen van uw dierenwelzijnscommissie. Beperk de toegang tot voedsel (12 g chow per dag per rat, zie Tabel met materialen) en zorg voor onbeperkte toegang tot water.
3. Markeer de staarten van de dieren met behulp van een permanente niet-toxische inktmarker.
4. Voordat u met het gedragsexperiment begint, moet u de ratten minstens een week behandelen totdat ze gewend zijn om door experimentatoren te worden gehanteerd en de ratten kennis laten maken met de belonende voedselkorrels om voedselneofobie te verminderen.

2. Voorbereiding van de hardware- en besturingssoftware

1. Open de vrij beschikbare Integrated Development Environment (IDE) Software (zie Materiaaltabel). Klik op Bestand > Openen en klik op het script voor hardwarecontrole (Aanvullend bestand 1).
2. Sluit de microcontroller USB aan op de computer. Controleer of de automatisch gekozen board- en processorinformatie overeenkomt met het aangesloten microcontrollerbord door linksboven in het scherm op Tools te klikken. Selecteer de bijbehorende board- en processorinformatie en klik op Poort om de beschikbare poort te selecteren.
3. Klik in de linkerbovenhoek van het scherm op Sketch > Include Library > Manage Libraries. Typ in het nieuw geopende venster Bibliotheekbeheer de term "Adafruit Motor Shield V2" in de zoekbalk en klik op de knop Installeren in de bijbehorende bibliotheek. Herhaal hetzelfde proces voor de zoekterm "Adafruit Neopixel".
4. Klik linksboven in het scherm op Verifiëren (de knop met een vinkje) om er zeker van te zijn dat er geen fouten in het script staan. Klik op Uploaden (de knop met een pijl naar rechts) om het script te uploaden naar het microcontrollerbord.

3. Voorbereiding van de experimentbesturingssoftware

1. Zorg ervoor dat alle vier de scripts en functies voor experimentbeheer zich in dezelfde map bevinden.
   1. Open het programmeerplatform, klik op het tabblad HOME-werkbalk in de bovenste helft van het scherm en klik op Pad instellen. Klik op Map toevoegen en selecteer de map met alle experimentbesturingsscripts.
   2. Klik op Opslaan en sluit het venster Pad instellen . Klik op Openen op het tabblad HOME-werkbalk in de bovenste helft van het scherm en open de volgende scripts en functies: Gebruiker (Aanvullend bestand 2), Trap (Aanvullend bestand 3) en DataProc (Aanvullend bestand 4).
2. Volg de instructies voor het downloaden en installeren van de Psychtoolbox-software om de ESC-knopfunctionaliteit in te schakelen die door de toolbox wordt gebruikt (zie Tabel met materialen voor de toegangslink).

4. Configuratie van parameters die worden gebruikt in de 5-CSRTT toolbox

1. Bereid de gereedschapskist voor op gewenning.
   OPMERKING: Figuur 2 geeft het 5-CSRTT-apparaat weer dat voor het huidige onderzoek is gebruikt.
   1. Selecteer het geopende gebruikersscript . Zorg ervoor dat de gewenningsvariabele op regel 7 is ingesteld op 'true'. Schrijf een getal in minuten (bijv. '30' gedurende 30 minuten) op regel 8 om een tijdslimiet voor de gewenning in te stellen. Schrijf op regel 9 een getal tussen 0,01 en 1 (volledige helderheid) om een helderheidsniveau voor het stimuluslicht te kiezen.
      OPMERKING: Het helderheidsniveau dat in dit project wordt gebruikt, is ingesteld op 0,2.
   2. Voer het gedragsexperiment uit (stap 5).
2. Bereid de toolbox voor op de experimenteersessie.
   1. Selecteer het geopende gebruikersscript . Zorg ervoor dat de variabele op regel 7 is gedefinieerd als 'false'.
   2. Typ op regel 12 het mappad in waar de experimentgegevens automatisch worden opgeslagen (bijvoorbeeld 'C:\Users\trainer\Desktop\5CSRTT'). Zorg ervoor dat er een map met deze exacte naam bestaat.
   3. Typ de onderwerpidentificatie op regel 13 (bv. "rood1").
   4. Zorg ervoor dat de variabele op regel 14 is gedefinieerd als 'true', zodat de gegenereerde gegevens automatisch worden opgeslagen in het mappad.
   5. Zorg ervoor dat de variabele op regel 15 is gedefinieerd als 'waar' en typ een getal in op de regels 16 en 17 om respectievelijk een proef- en tijdslimiet (in min) in te stellen, waarna het programma automatisch stopt.
   6. Configureer de parameters voor een standaard 5-CSRTT-paradigma.
      1. Controleer of de variabele op regel 32 is ingesteld op 'true' voor een gratis levering van pellets vóór de eerste proef. Definieer de variabele op regel 33 als 'true' om ervoor te zorgen dat er een tijdschriftvermelding is voordat elke proef begint. Controleer of de variabele op regel 34 is ingesteld als 'gedefinieerd' en typ een getal op regel 35 om de lengte van de ITI in seconden op te geven.
      2. Zorg ervoor dat de variabele die op regel 37 is gedefinieerd, is ingesteld op 'waar', zodat onderzoeken met voortijdige antwoorden de onderzoekslimiet van de sessie niet beïnvloeden. Typ een numerieke waarde op regel 38 die de lh-lengte (limited hold) in seconden definieert.
      3. Zorg ervoor dat de variabele op regel 39 is ingesteld op 'geen' en dat de variabele op regel 40 is gedefinieerd als 'false'. Typ een getal op regel 41 om de TO-lengte in seconden te definiëren en zorg ervoor dat de variabele op regel 42 is ingesteld op 'false'.
      4. Typ op regel 45 een numerieke waarde die overeenkomt met het aantal openingen dat kan worden verlicht (bijvoorbeeld '5'). Zorg ervoor dat de variabele op regel 46 is gedefinieerd als 'pseudorandom' of 'willekeurig' en typ een getal op regel 47, waarbij de std-lengte in seconden wordt ingesteld. Controleer of de variabele op regel 48 is gedefinieerd als 'enkelvoudig' en de numerieke waarde op regel 49 '1'. Typ op regel 50 een getal om de helderheid van de doelprikkel te definiëren.
      5. Controleer of de variabelen op de regels 64 en 65 zijn gedefinieerd als respectievelijk 'binair' en 'niet-afhankelijk'. Typ een numerieke waarde op regel 71 die overeenkomt met het aantal voedselpellets dat moet worden vrijgegeven na een correcte neusprik.
      6. Voer het gedragsexperiment uit (stap 5).
   7. Configureer de parameters voor een niet-standaard 5-CSRTT-paradigma.
      OPMERKING: Alle stappen die in dit subhoofdstuk worden beschreven, zijn optioneel.
      1. Als een automatische prestatiecontrole gewenst is voor het gebruik van de geautomatiseerde traptrainingsprocedure, zorg er dan voor dat de variabele op regel 18 als 'waar' is gedefinieerd en typ een numerieke waarde in op regel 20 die de frequentie van de prestatiecontrole definieert. Typ een getal op regel 21 om het minimumaantal onderzoeken te definiëren dat tijdens de huidige sessie moet worden voltooid voordat de prestaties van de proefpersoon worden berekend. Zorg ervoor dat de variabele op regel 21 is gedefinieerd als 'alle', zodat alle proeven van de huidige sessie worden opgenomen in de prestatiecontrole.
      2. Zorg ervoor dat de variabele op regel 22 is ingesteld op 'true', zodat het programma de parameters van de huidige sessie bijwerkt zodat deze overeenkomen met een eerder voltooide sessie. Typ op regel 23 'laatste' in om vast te stellen dat de laatste sessie wordt geüpload.
         OPMERKING: Het programma werkt de parameters bij op basis van specificaties in de functie "Trap" en springt naar het eerder voltooide niveau. Een specifieke dataset die moet worden geüpload, kan ook worden gekozen door het exacte pad naar het gegevensbestand met het einde ".mat" in te voeren.
      3. Als de geautomatiseerde gedragstraining gewenst is, zorg er dan voor dat de variabele op regel 26 is ingesteld op 'true'. Typ een numerieke waarde op regel 27 en 28 om respectievelijk het trainingsniveau te definiëren waarmee u wilt beginnen en het totale aantal beschikbare niveaus. Als een verdeling van cohorten wenselijk is, typt u een naam (bijvoorbeeld 'groep1') op regel 29 die de groep specificeert.
         OPMERKING: Elke groep kan zijn eigen set trainingsniveaus en criteria gebruiken voor niveau-updates. De parameters voor elke groep worden gedefinieerd in de functie "Trap" (stap 4.2.8.).
      4. Typ op regel 34 'willekeurig' in als een gerandomiseerde ITI-duur gewenst is. Typ een numeriek interval (bijvoorbeeld '[0,2]') om het interval te definiëren dat een gerandomiseerd getal bevat dat wordt toegevoegd aan de vaste ITI-duur.
      5. Om ervoor te zorgen dat onderzoeken met voortijdige reacties de onderzoekslimiet van de sessie beïnvloeden, typt u 'false' in op regel 37.
      6. Als u een tijdvenster wilt definiëren waarin extra neusprikken worden geteld als volhardende antwoorden, typt u een numerieke waarde op regel 39. Typ 'waar' in op regel 40 zodat voorbarige antwoorden een time-out oproepen.
      7. Om verschillende groepen van de doelopeningen te definiëren, typt u 'buur', 'verschoven' of 'alle' op regel 48. Typ een numerieke waarde op regel 49, waarmee u het totale aantal doelopeningen definieert. Als gedimde stimuli gewenst zijn, typt u een numerieke waarde in op de lijnen 51 en 52, die respectievelijk het totale aantal gedimde diafragma's en de helderheid ervan definiëren.
      8. Als de emissie van een korte toon (Toon C4, 262 Hz (Wetenschappelijke Toonhoogtenotatie)) vóór stimuluspresentatie gewenst is, zorg er dan voor dat de variabele op regel 55 is ingesteld op 'true'. Typ numerieke waarden op de regels 56, 57 en 58 om het tijdvenster (in milliseconden) te definiëren tussen de toon- en stimuluspresentatie van de spreker, de duur van de toon (in milliseconden) en het volume van de toon (getallen tussen 0 (geen toon) en 1 (volledig volume) zijn toegestaan).
      9. Als de emissie van een korte toon (Tone C6, 1047 Hz) na een succesvolle nose-poke gewenst is, zorg er dan voor dat de variabele op lijn 59 is ingesteld op 'true'. Typ een numerieke waarde op de regels 60 en 61 die de duur van de toon (in milliseconden) en het volume van de toon definiëren (getallen tussen 0 (geen toon) en 1 (volledig volume) zijn toegestaan).
      10. Als reacties in gedimde verlichte openingen moeten worden beloond, zorg er dan voor dat de variabele op regel 64 is ingesteld op 'non-binair'. Typ een numerieke waarde op regel 73 om het aantal voedselpellets te definiëren dat wordt geleverd voor neusprikken in gedimde verlichte openingen.
      11. Als u meer dan één pelletdispenser gebruikt, typt u het overeenkomstige motornummer op de lijnen 70 en 72 voor neusprikken in doelopeningen en gedimde verlichte openingen.
          OPMERKING: Het motornummer kan 1 of 2 zijn. De schroefklemmen M3 en M4 van het bijbehorende motorschild zijn gedefinieerd in het script voor hardwarebesturing.
      12. Als het indelen van de beloning op basis van reactietijd gewenst is, zorg er dan voor dat de variabele op regel 65 is ingesteld op 'afhankelijk'.
          1. Definieer de afhankelijkheid van neusprikken in doelopeningen door numerieke waarden in regel 67 in te voeren die de reactietijd (in seconden), het motornummer en het aantal te leveren voedselpellets in verschillende categorieën verdelen, zodat een specifiek reactietijdinterval overeenkomt met een gekozen motornummer en aantal pellets.
          2. Typ nummers in op regel 68 om verschillende categorieën te definiëren voor reactietijd (in seconden), motornummer en aantal voedselpellets die moeten worden geleverd voor neusprikken in gedimde verlichte openingen.
   8. Configureer de trapfunctie door de onderstaande stappen te volgen.
      OPMERKING: Deze stap is optioneel.
      1. Selecteer de geopende trapfunctie . Typ op regel 4 de naam van de eerste groep (bijvoorbeeld 'groep1'). Typ indien van toepassing de naam van de tweede groep (bijv. 'groep2') op regel 77.
      2. Als u de parameters voor het tweede trainingsniveau voor de eerste groep wilt wijzigen, typt u een van de parameters die zijn berekend in de prestatiecontrole op regel 17 (bijvoorbeeld PerformanceCheck.NumCorrect > = 30 als de criteria 30 neusprikken correct beantwoorden).
         OPMERKING: Wijzig de parameter "Config_trigger == 2" niet bij het automatisch laden van de vorige sessie (stap 4.2.7.2.).
      3. Typ op regel 19 een variabele die u wilt bijwerken en een numerieke waarde indien van toepassing (bijv. 'Config.LED.StimDuration = 30' om de StD-lengte in te stellen op 30 s).
         OPMERKING: Het aantal te wijzigen parameters en hun nieuwe waarde kunnen vrij worden gekozen. De enige vereiste is dat de te updaten parameter moet worden ingevoerd na de variabele 'UpdateTrigger = 1' in elk niveau dat de update gewenst is.
   9. Configureer de functie "DataProc".
      1. Selecteer de geopende DataProc-functie . Als een grafiek met het overzicht van de sessie automatisch moet worden uitgezet en opgeslagen, typt u de opdrachten voor de gewenste plot vanaf regel 83.
         OPMERKING: De huidige commando's op regel 83 en verder geven een overzicht van de uitkomst van de sessie en enkele noodzakelijke controlemaatregelen, zoals het totale aantal voortijdige antwoorden of het aantal pushes van het voedselpanel tijdens een ITI.

5. Gedragsexperiment

1. Vervoer de rattenkooi ten minste 30 minuten voor de gewenning of proefsessie van het vivarium naar de experimenteerruimte om de dieren vertrouwd te maken met de testruimte.
2. Bereid voor de gewenningssessie de operante kamer voor door twee beloningsvoedselkorrels in elk van de openingen en vijf voedselpellets in de magazijndeur te plaatsen. Configureer de parameters voor de sessie door stap 2-4.1 te volgen.
   OPMERKING: De operante kamer die voor dit protocol werd gebruikt, was een gemodificeerde Skinner PVC-doos met afmetingen van 30 x 30 x 45 cm.
   OPMERKING: Voor de eerste gewenningsfase plakt u de klepdeur van het magazijn af om open te blijven. Verwijder voor de tweede gewenningsfase de tape op de klepdeur van het magazijn.
3. Selecteer het geopende gebruikersscript . Zorg ervoor dat de beschrijving 'COM' op regel 75 overeenkomt met de gekozen beschikbare poort in stap 2.2. Als deze niet overeenkomt, wijzigt u de numerieke waarde in het script voor experimentbesturing (bijvoorbeeld van 'COM3' naar 'COM4').
4. Plaats de ratten voorzichtig in de kamer.
5. Klik in het geopende gebruikersscript op het werkbalktabblad EDITOR op de bovenste helft van het scherm en klik vervolgens op de groene afspeelknop Uitvoeren. Controleer of het programma correct wordt uitgevoerd door de informatie "Opdrachtvenster" te lezen.
6. Als u het experiment op elk gewenst moment wilt stoppen, drukt u op de escape-toets ESC op het toetsenbord van de computer. Wacht tot er een bericht wordt weergegeven in het opdrachtvenster. Typ "y" en druk op de Enter-toets op het toetsenbord van de computer om de huidige sessie te stoppen en de verkregen gegevens op te slaan.
7. Wanneer de limiet voor gewenning of sessietijd of proef is bereikt (respectievelijk stap 4.1.1 of 4.2.5), controleert u het bericht dat wordt weergegeven in het opdrachtvenster. Typ "y" en druk op de Enter-toets op het toetsenbord van de computer om de huidige sessie te stoppen.
   OPMERKING: Het bericht wordt alleen weergegeven aan het begin van een nieuwe proef en stopt de lopende sessie totdat een antwoord is getypt ("y" om de sessie te stoppen of "n" om het experiment voort te zetten).
8. Controleer in het geval van een gewenningssessie of de rat alle voedselkorrels heeft geconsumeerd. Herhaal de gewenningsfase totdat alle pellets zijn verbruikt voordat u doorgaat naar de volgende gewenningsfase of, na de tweede fase, start u met de 5-CSRTT-training.
9. Reinig na de sessie de wanden en vloer van de operatiekamer, bijvoorbeeld met een 70% ethanoloplossing en keukenpapier. Voordat u de volgende rat introduceert, wacht u 2-3 minuten totdat de ethanolgeur verdwijnt.
10. Wanneer de experimentdag voorbij is, koppelt u de USB-microcontroller los van de computer. Sluit desgewenst beide scripts voor hardware en experimentbeheer.

Representative Results

Figuur 2: Het 5-CSRTT-apparaat dat voor de huidige studie is gebruikt. Het apparaat draait op een laptop uitgerust met de 5-CSRTT toolbox, die een script biedt voor het besturen van de microcontroller en alle gerelateerde apparatuur en meerdere scripts voor het besturen van het 5-CSRTT experiment. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De volledig aanpasbare toolbox is eenvoudig te gebruiken en gebaseerd op een single-board microcontroller en standaard elektrotechnische componenten. Figuur 3 toont een vereenvoudigd schakelschema en bedradingsschema. Het hele diafragma bestaat uit 5 LED's als lichtprikkels en vijf infraroodsensoren om neusprikken te detecteren. Het huislicht bestaat uit één strip met acht LED's en het voedselmagazine is gemaakt van een opening met een klepdeur met een microschakelaar, een motoraangedreven pelletdispenser en een strip met acht LED's voor verlichting. Het circuit is ook een voorbeeld van aansluitingen voor optionele componenten zoals de passieve zoemerluidspreker voor auditieve feedback en een digitale potentiometer voor volumeregeling. Voor een lijst van de apparatuur die is gebruikt bij het ontwikkelen van deze toolbox, zie Tabel met materialen.

Figuur 3: Vereenvoudigd circuit van de microcontrollerhardware. Om gemakkelijk en snel aanpasbaar te zijn, is de microcontroller-apparatuur aangesloten via een breadboard. Van linksboven naar linksonder, met de klok mee: Een microcontrollerkaart is verbonden met een motorschild en een DC-motor (die de pelletdispensermotor vertegenwoordigt). Aan de rechterkant zijn de LED-strips voor zowel het huis als de voedselmagazineverlichting, en in het midden zijn alle vijf witte LED's voor het stimuluslicht en de vijf infraroodsensorparen die in de openingen worden gebruikt. Onder het microcontrollerbord bevindt zich een eenvoudige microschakelaar (die de schakelaar vertegenwoordigt die wordt gebruikt in de klepdeur van het voedselmagazijn). Tot slot zijn in het midden een passieve zoemerluidspreker en een digitale potentiometer afgebeeld. Deze afbeelding is gemaakt met behulp van de open-source software Fritzing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Koppeling en functies van alle componenten van de experimentbesturingsscripts en vereenvoudigd diagram van de functie "Code". (A) Het script "Gebruiker" stuurt zijn parameters naar de functie "Code", die op zijn beurt rechtstreeks linkt naar de functie "Trap", waardoor het elke parameter kan bijwerken die wordt gebruikt in de functie "Code" terwijl het experiment aan de gang is. De functie "Code" stuurt vervolgens zijn resultaten naar de functie "DataProc" aan het einde van de sessie. (B) Voordat een experimentsessie wordt gestart, controleert de functie "Code" eerst of het gewenningsprotocol moet worden gestart. Zo niet, dan stelt het de parameters in op basis van de definities die zijn gekozen in het script "Gebruiker". Voordat elke proef begint, controleert de functie vervolgens of de ESC-toets op het toetsenbord is ingedrukt. Zo niet, dan gaat het verder met een nieuwe proef. Anders stopt het de experimentsessie en worden de verzamelde gegevens doorgegeven aan de functie DataProc. Met deze kritische controle voordat elke proef wordt gestart, kan het programma stoppen voordat een gekozen tijdslimiet is bereikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Interacties tussen de verschillende experimentcontrolescripts zijn te zien in figuur 4A. Het script 'Gebruiker' bevat alle parameters die het experiment definiëren. Daar kunnen variabelen die de timing, het aantal en de helderheid van verlichte stimuli, ITI-duur en dergelijke van het experiment bepalen, vrij worden gekozen. De codefunctie (aanvullend bestand 5) bevat een gedetailleerde beschrijving van een enkele studie en alle mogelijke uitkomsten, die gedurende het hele experiment wordt herhaald, zoals weergegeven in figuur 4B. Bovendien bestaat het uit een protocol voor de gewenning van het dier aan het apparaat. De codefunctie controleert ook regelmatig de prestaties van het dier. Verder is de Trapfunctie optioneel. De prestaties van het onderwerp worden vergeleken met eerder ingestelde criteria en de gewenste parameters worden automatisch bijgewerkt als de prestaties van het dier aan deze criteria voldoen. De trapfunctie kan ook rekening houden met de verkregen resultaten van de sessie van de vorige dag. Terwijl het experiment wordt uitgevoerd, berekent een prestatiecontrole aan het einde van een onderzoek de nauwkeurigheid, weglatingen en het totale aantal juiste reacties van de voltooide onderzoeken en vergelijkt het resultaat met de gewenste criteria voor een niveau-update, zoals gespecificeerd in de functie Trap. Ten slotte verwerkt de DataProc-functie alle verzamelde gegevens en genereert eenvoudige grafieken voor snelle analyse. Aan het einde van een sessie slaat de toolbox automatisch alle gegevens op in een *.mat-bestand en genereert een extra *.xlsx-bestand met de essentiële informatie uit het experiment.

Figuur 5: Voorbeeld van verschillende stimulusconfiguraties van de 5-CSRTT toolbox. Het diagram illustreert mogelijke combinaties van doelstimuli in afhankelijkheid van de gekozen configuratie. Zowel de "alle" als de "enkele" configuraties worden gebruikt in het standaardparadigma (voor het gewennings- en gedragsexperiment). De "neighbour" en "shifted" configuraties tonen niet-standaard stimulusconfiguraties, waardoor het gebruik van andere aantallen verlichte stimuli mogelijk is, die ook een ander contrast kunnen hebben dan de doelprikkel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocolstap 4.2.7.7 noemt een optionele functie: het wijzigen van de groepering van doelopeningen. Het standaard 5-CSRTT paradigma maakt gebruik van één enkele doelprikkel. Hier laten we zien hoe de gepresenteerde toolbox aanpassingen van het standaardparadigma mogelijk maakt. Figuur 5 toont enkele mogelijke groepscombinaties uit in totaal vijf diafragma's met betrekking tot de gekozen configuratie. De "alle" configuratie verlicht alle beschikbare diafragma's, zodat elk diafragma nu een doelopening is, wat nuttig kan zijn in de eerste trainingsfasen. De buurmanconfiguratie zorgt ervoor dat het (vrij gekozen) aantal doelopeningen naast elkaar liggen. Instellingen kunnen zo worden opgegeven dat de buren niet identiek zijn aan het doelopening, maar worden verlicht met een lager (of zelfs hoger) contrast. Het gebruik van diafragma's met verschillende lichtcontrasten maakt het mogelijk om nieuwe paradigma's te testen, zoals het gebruik van verschillend beoordeelde beloningen voor neusprikken in de diafragma's met hoog of laag contrast. Figuur 5 toont een voorbeeld met drie doelopeningen met identieke verlichting. De enkele configuratie wordt meestal gebruikt in de standaard 5-CSRTT, waar slechts één doel wordt verlicht. Ten slotte breidt de verschoven configuratie de buurconfiguratie uit. Het verschuift de buurstimulans naar het laatste of eerste diafragma in het geval dat het doelopening zich respectievelijk op de eerste of laatste positie bevindt. Net als in de buurmanconfiguratie kan de verlichtingssterkte van de buren vrij worden gekozen, omdat deze hetzelfde of anders is dan het doelopening. Ook kan het aantal totale verlichte stimuli vrij worden gekozen. De toolbox berekent vervolgens automatisch alle mogelijke stimuli. De parameter "Config.LED.NumHighLED" moet echter worden ingesteld op "1" voor deze configuratie.

Volgens het protocol werd de training van ratten (N = 10) voor de 5-CSRTT uitgevoerd volgens de trainingsstadia in tabel 1.

Tabel 1: 5-CSRTT trainingsschema en criteria om naar het volgende niveau te gaan. (A) Het interprotestinterval werd in elk trainingsniveau constant gehouden op 5 s. (B) Stimulusduur voor elk opleidingsniveau. (C) Limited Hold (LH) tijdvenster, de maximale tijd die wordt getolereerd tussen stimulus uit en elke neus-prikrespons. D) Het totale aantal juiste antwoorden dat nodig is om het betreffende opleidingsniveau te halen. (E) Het nauwkeurigheidspercentage wordt berekend als . (F) Percentage omissiefouten wordt gedefinieerd als . Dit criterium omvat geen voorbarige reacties. Klik hier om deze tabel te downloaden.

De prestaties van de ratten werden vergeleken met het aantal trainingsdagen (sessies) dat nodig was om elk trainingsniveau in tabel 1 te voltooien. Alle dieren begonnen op trainingsniveau 1 met een soa en LH van elk 60 s. Sommige ratten (N = 5) kregen echter een verbeterde gewenningstraining om enkele van de eerder gemelde extra stimulusopties te testen, wat het verschil verklaart in het aantal sessies dat de individuele dieren in trainingsniveau 1 bleven. Voltooiing van het niveau werd gekenmerkt door het bereiken van een totaal van 30 of meer juiste antwoorden. Soa en LH namen af tijdens de volgende niveaus, terwijl de criteria om door te gaan naar het volgende trainingsniveau zwaarder werden, waardoor de aandachtsvraag van de taak ^{1,6 toenam}.

Tabel 2 toont de automatisch gegenereerde *.xlsx spreadsheet van één voorbeeld rat tijdens één sessie. De rat begon met de configuratie die was gespecificeerd in trainingsniveau 5. Na vier proeven ging de rat door naar niveau 6, gezien de proeven die in de huidige sessie werden uitgevoerd plus de nauwkeurigheid die in de vorige sessie werd bereikt. Hoeveel proeven minimaal in de huidige sessie moeten worden uitgevoerd om door te gaan naar het volgende trainingsniveau, wordt gespecificeerd in de variabele "Config.Experiment.MinNumTrials". In dezelfde sessie ging de rat door naar trainingsniveau 7 na het voltooien van 66 proeven in niveau 6 en het bereiken van de vereiste van > 80% nauwkeurigheid en < 20% weglating. In totaal werden ratten gedurende 26 dagen getraind met behulp van de configuratie van trainingsniveaus zoals beschreven in tabel 1. Het aantal bestede sessies per opleidingsniveau is weergegeven in figuur 6A. De zwarte lijn toont het gemiddelde over alle onderwerpen en elke gekleurde lijn toont de gegevens van één rat. Alle ratten bereikten het achtste niveau binnen 14-22 sessies (figuur 6B). Figuur 6C toont de gemiddelde prestaties van proefpersonen per trainingsniveau en over alle trainingsdagen in het 5-CSRTT-apparaat. De onderbroken zwarte lijn vertegenwoordigt het nauwkeurigheidspercentage en de rechte zwarte lijn het weglatingspercentage. Nauwkeurigheid werd berekend als de verhouding tussen het aantal juiste reacties en het totale aantal reacties. Omissies werden berekend als de verhouding tussen het aantal omissies en het totale aantal onderzoeken (d.w.z. de som van correcte reacties, onjuiste reacties en omissies). De grijze lijn geeft het gemiddelde totale aantal juiste antwoorden aan voor alle onderzoeken op elk niveau. Figuur 6D toont de uiteindelijke nauwkeurigheid die door elk onderwerp op het achtste en laatste trainingsniveau is bereikt.

Gemiddeld brachten ratten 5,9 (±1,03 SEM) sessies door om niveau 1 te voltooien, tussen 1,5 (±0,17) en 3,5 (±0,5) sessies om niveau 2 tot 6 te voltooien, en 1,7 (±0,16) sessies om niveau 7 te voltooien voordat ze het laatste niveau 8 bereikten. Zoals blijkt uit figuur 6A, was de variantie tussen de proefpersonen het meest significant in de beginniveaus (SD = 3,25 in niveau 1, 1,58 in niveau 2) en nam deze af in latere niveaus (respectievelijk 0,47 en 0,48 in niveau 6 en 7). In niveau 4, toen de stimulusduur verder werd verminderd, nam het gemiddelde aantal doorgebrachte sessies (2,6 ± 0,52) en de variantie tussen ratten (1,64) toe, waarbij twee ratten 5 en 6 dagen nodig hadden om het niveau te concluderen.

Figuur 6: Resultaten van het gedragsexperiment met de 5-CSRTT toolbox. (A) Het aantal uitgevoerde sessies op elk trainingsniveau. De zwarte lijn geeft het gemiddelde aantal sessies van alle onderwerpen voor elk niveau weer (gemiddelde ± SEM) en gekleurde lijnen vertegenwoordigen de gegevens van individuele proefpersonen. (B) Het absolute aantal sessies dat nodig is om het eindniveau te bereiken, per onderwerp. (C) Gemiddelde prestatiemetingen gedurende de opleiding (gemiddelde ± SEM). De gestippelde zwarte lijn geeft de nauwkeurigheid weer van alle onderwerpen over alle gegeven antwoorden in alle sessies per trainingsniveau, en de zwarte lijn toont het bijbehorende omissiepercentage. De grijze lijn geeft het gemiddelde absolute aantal juiste antwoorden van alle onderwerpen op elk trainingsniveau weer. D) Nauwkeurigheid per proefpersoon tijdens het achtste en laatste opleidingsniveau. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 2: Verzamelde gegevens van één voorbeeldrat tijdens één trainingssessie. Kolom A geeft het aantal proefversies weer over de sessie met betrekking tot het huidige trainingsniveau, zoals weergegeven in kolom B. Kolom C geeft de ITI-duur weer en kolom D geeft de starttijd van de proef weer. Kolommen E tot en met I tonen het helderheidsniveau voor de LED-stimulus in diafragma's 1 tot en met 5, respectievelijk. Een helderheidsniveau van 0 betekent dat de stimulus was uitgeschakeld en een helderheidsniveau van 0,2 betekent dat de stimulus werd ingeschakeld met 20% van de maximale intensiteit. De kolommen J en K tonen de exacte tijd waarop de stimulus respectievelijk is in- en uitgeschakeld. Kolom L geeft de uitkomst van het onderzoek weer: 0 betekent "weglating", 1 betekent "juiste respons", 3 betekent "onjuiste respons" (neus prikken in niet-doelopening) en 4 betekent "prematuur". Kolom M laat zien welk diafragma tijdens de proef met de neus werd geprikt, terwijl kolom N de exacte tijd van de neusprik weergeeft. Kolommen O, P en Q tonen respectievelijk de tijd waarop de pelletdispensermotor werd ingeschakeld, het bijbehorende motornummer en het tijdstip waarop de rat de pelletdispenser opende om zijn beloning te krijgen. Kolom R geeft de eindtijd van de proefversie weer. De kolommen S, T, U, V en W tonen respectievelijk het totale aantal voortijdige reacties, time-outs, panelduivels tijdens een ITI, het totale aantal perseveratieve antwoorden en de totale looptijd van de sessie in minuten. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Script voor de hardwarebesturing van de IDE-software (Arduino-code). Dit omvat alle commando's om de hardware en elektrotechnische componenten van de toolbox te besturen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Script voor de functie "Gebruiker" in de experimentbesturingssoftware. Dit omvat alle parameters die het experiment definiëren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 3: Script voor de functie "Trap" in de experimentbesturingssoftware. Dit bewaakt de prestaties van het onderwerp en vergelijkt deze met de eerder ingestelde criteria. De gewenste parameters worden automatisch bijgewerkt als de prestaties van het dier aan deze criteria voldoen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 4: Script voor de functie "DataProc" in de experimentbesturingssoftware. Dit verwerkt alle verzamelde gegevens en genereert eenvoudige grafieken voor snelle analyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 5: Script voor de functie "Code". Dit omvat een gedetailleerde beschrijving van een enkele studie en alle mogelijke uitkomsten, die tijdens het hele experiment wordt herhaald. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Het huidige protocol is gericht op het ontwikkelen en testen van een goedkoop en volledig aanpasbaar alternatief voor het standaard, in de handel verkrijgbare 5-keuze seriële reactietijdtaakapparaat. Gewoonlijk bieden commercieel verkrijgbare soorten apparaten een beperkte reeks functies als dat nodig is om het standaardonderzoek 5-CSRTT uit te voeren. Hierdoor zijn niet-standaard wijzigingen in de specifieke onderzoeksopzet, zoals wijzigingen in de proefvolgorde of doelstimuluscombinaties, meestal niet mogelijk. Bovendien worden veel van de beschikbare soorten apparaten geleverd met specifieke, gesloten software die mogelijk geen toegang biedt tot alle gedragsgegevens van het experiment, zoals de timing en het diafragma van voorbarige en volhardende antwoorden. Het essentiële voordeel van de hier gepresenteerde toolbox is daarentegen - naast de lage kosten - de mogelijkheid om veel verschillende proefontwerpen en onderzoeksparadigma's te implementeren. Momenteel ondersteunt de toolbox de definitie van meerdere stimulusontwerpen, zoals het toestaan van gedimde stimuli en het gebruik van twee pelletafgiftesystemen en beloningsafhankelijkheid van reactietijd. Het ondersteunt ook het gebruik van een miniatuurluidspreker voor auditieve feedback. Het primaire doel is echter om eenvoudige aanpassingen van de proefvolgorde mogelijk te maken volgens het doel van de gebruiker, zoals het introduceren van gedimde verlichte openingen en belonende schema's voor besluitvormingstaken of het integreren van state-of-the-art positieve versterkingstrainingsbenaderingen¹¹. Bovendien worden alle ruwe gegevens die tijdens de sessie zijn verzameld, beschikbaar gesteld voor verdere analyse. De toolbox biedt een trapfunctie voor geautomatiseerde gedragstraining, die ook volledig aanpasbaar is en waarmee de gebruiker de criteria voor elke niveau-update, het aantal trainingsniveaus en de bij te werken parameters kan wijzigen. Bovendien is het apparaat zelf zeer aanpasbaar en zijn veranderingen in het proefontwerp en de indeling van de kamer gemakkelijk haalbaar, waardoor het mogelijk is om het 5-CSRTT-paradigma toe te passen op diersoorten die een ander onderzoeksontwerp nodig hebben dan wat de commercieel beschikbare soorten apparaten bieden.

Specifieke onderdelen van het protocol voor de softwareconfiguratie zijn van cruciaal belang voor een soepele workflow: vooral voor de eerste dag van het experiment is de voorbereiding van zowel de hardware- als experimentbesturingssoftware (stappen 2 en 3) en de configuratie van stap 5.3 cruciaal. Ervoor zorgen dat de seriële poortverbinding tussen de microcontrollerhardware, de software en de experimentbesturingssoftware goed werkt, is van cruciaal belang voor het opzetten van een volledig functionerende 5-CSRTT-toolbox. Aan het begin van elke experimentdag is het raadzaam om de drie bovenstaande stappen te herhalen om ervoor te zorgen dat de hardware- en experimentbesturingsscripts correct zijn geconfigureerd.

Ten slotte is de huidige beperking van de toolbox de implementatie ervan naar één exclusief programmeerplatform, wat helaas het gebruik ervan als een complete open-source toolbox in gevaar brengt. Niettemin moet de toolbox in principe gemakkelijk kunnen worden aangepast aan andere programmeertalen zoals Python, omdat het verloop van één proef ongewijzigd blijft.

In vergelijking met bestaande alternatieve methoden maakt de hier geïntroduceerde 5-CSRTT-toolbox de implementatie van het standaard 5-CSRTT-paradigma en wijzigingen ervan mogelijk, zoals het definiëren van een ingesteld tijdvenster voor volhardende antwoorden of het introduceren van afleidende of versterkende stimuli zoals luidsprekers of knipperende lichten. Naast het feit dat het gemakkelijk te gebruiken en zeer aanpasbaar is, is het apparaat goedkoop en kan het gemakkelijk worden gerepliceerd, en het stimuleert onderzoek met behulp van niet-knaagdierdiermodellen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1200 Ohm Resistor			Already available in the lab
8-bit 10 kΩ digital potentiometer	Microchip	MCP42010-I/P	From Conrad.de: 1083205
ARD MEGA2560 KIT Arduino - Mega 2560 R3 Lernset	JOY-IT	ARD-Set01	From Reichelt.de: ARD MEGA2560 KIT
ARD SHD MOTOR Arduino Shield - Motor	Adafruit	1438	From Reichelt.de: ARD SHD MOTOR
ARDUINO STACKABLE HEADER KIT - R3	Sparkfun Electronics	PRT-11417	From Antratek.de: PRT-11417
Chow	Altromin	1324 N	Altromin chow products
Euro-Gehäuse	Hammond Electronics	1591EBK	From Conrad.de: 520691
Food pellets	Bio-Serv	F0021	From Bio-serv.com: Dustless Precision Pellets Rodent
Fritzing	Interaction Design Lab Potsdam		Fritzing Software download
Integrated Development Environment	Arduino		Arduino IDE download (Freely available)
IR Break Beam Sensor - 3mm LEDs	Adafruit	2167	From Mouser.de: 485-2167
Laptop or Computer
LED white round 5mm 2000mcd 20mA	TruComponents	1573731	From Conrad.de: 1573731
Microswitch	Hartmann	MBB1 01 A 01 C 09 A	From Conrad.com: 707243
NeoPixel Stick - 8 WS2812 5050 RGB LEDs	Adafruit	1426	From Reichelt.de: DEBO LED NP8 2
Passive buzzer Speaker	Conrad Components	93038c213a	From Conrad.de: 1511468
Pellet release disk			Already available in the lab. Similar products depicted below. Keep in mind that some of these products make use of different (and stronger) motors and infrared sensors. The use of the microswitch (row 7) and the  Arduino Motor Shield (row 3) need to be adapted to fit these new specifications. We recommend 3d printing the disk to work with the provided materials and software. Carbatec universal base plate Open Science Framework Open Feeder Open Ephys 3d Model Food Pellet Dispenser Campden Instruments 45mg pellet dispenser
Programming platform	Mathworks	R2019b or younger
Psychtoolbox Software		V3	Psychtoolbox-3 download
Spur GEAR-MOTOR with DC brush motor	Micromotors	B138F.12.208	Micromotos Series B138F Technical data