Una caja de herramientas de tareas de tiempo de reacción en serie de 5 opciones de código abierto y totalmente personalizable para el entrenamiento conductual automatizado de roedores

Summary

El presente protocolo describe el desarrollo de una caja de herramientas de tiempo de reacción en serie de 5 opciones de código abierto para modelos animales de roedores, utilizando Arduino y hardware relacionado y una caja de herramientas versátil de Matlab, que incluye un script opcional para el entrenamiento conductual automatizado. Los scripts son personalizables y facilitan la implementación de diferentes diseños de prueba y prueba.

Abstract

La tarea de tiempo de reacción en serie de 5 opciones (5-CSRTT) es una prueba de comportamiento que se utiliza a menudo para estudiar la atención visoespacial y la impulsividad en roedores. La tarea requiere que los animales asignen atención a una matriz horizontal de cinco pequeñas aberturas equipadas con fuentes de luz y, dentro de una ventana de tiempo limitado, golpeen la nariz con una abertura de objetivo iluminada para obtener una recompensa de alimentos en la revista de alimentos ubicada en la pared opuesta de la cámara. La tarea considera medidas de control conductual como la precisión de la respuesta y los tiempos de reacción y permite inferir la atención selectiva y la impulsividad. La dificultad de la tarea se puede controlar modificando la duración del estímulo y el diseño de la tarea en general. Los aparatos disponibles comercialmente generalmente consisten en una cámara experimental y un software particular para especificar los parámetros de la tarea, pero debido al hardware y el software fijos, plantean muchas limitaciones en los cambios en el diseño experimental general y los requisitos específicos de la tarea y la salida de datos relacionada. Este artículo explica una alternativa totalmente personalizable basada en un microcontrolador de placa única fácil de usar y componentes electrotécnicos estándar, un script Arduino de acceso abierto y una caja de herramientas matlab para el control de hardware y las especificaciones de tareas de comportamiento, respectivamente. La caja de herramientas incluye un procedimiento de escalera opcional, lo que permite el entrenamiento conductual automatizado. La configuración completa del hardware, que se puede instalar en cámaras personalizadas, y el software de libre adaptación fomentan el diseño no estandarizado de tareas y cámaras. Se describe el diseño del sistema y el código de código abierto para el control de hardware y la configuración experimental.

Introduction

El 5-CSRTT es una prueba de comportamiento, a menudo utilizada en roedores para estudiar los procesos atencionales visuales y la impulsividad 1,2,3,4,5,6, como determinar el papel del sistema colinérgico en la atención y la influencia de los inhibidores de la recaptación de norepinefrina en los comportamientos impulsivos 7 . El aparato estándar permite observar diversas medidas de control como la precisión de la respuesta, los tiempos de reacción, el comportamiento impulsivo y compulsivo, la capacidad motora y la motivación ^1,2,3,4,5. Consiste en una matriz horizontal de cinco aberturas equipadas con LED, un cargador de alimentos en las paredes de la cámara que se oponen a las aberturas y luces de la casa ^2,5. En una tarea típica, la luz de la casa se ilumina, y el comienzo de una sesión está marcado por la iluminación de la revista de alimentos, donde se entrega un pellet gratis. El curso de prueba se inicia cuando el animal asoma la nariz del cargador para recuperar el pellet¹. Después de eso, la luz del cargador de alimentos se apaga y comienza el intervalo entre pruebas (ITI), durante el cual se supone que el animal debe dirigir su atención hacia las aberturas. Una vez transcurrido el ITI, se presenta una iluminación de estímulo en una de las aberturas ^1,2,5. El estímulo se da para una longitud específica conocida como la duración del estímulo (StD). El animal puede responder al estímulo mientras se presenta o durante una ventana de tiempo limitada después de que termine la ETS, conocida como retención limitada (LH). Para responder, el animal tiene que perforar la apertura del objetivo y, si se hace correctamente, se libera una recompensa en la revista de alimentos ^1,2,5. De lo contrario, cualquier respuesta incorrecta, así como cualquier respuesta antes de la presentación del estímulo (anticipatoria o prematura) o cualquier falta de respuesta (omisión) da como resultado un tiempo de espera (TO), durante el cual la luz de la casa se apaga durante un cierto período ^1,2,5 (Figura 1). En general, la precisión del estímulo discriminativo mide el funcionamiento atencional, mientras que las respuestas prematuras y perseverantes (respuestas repetidas en las aberturas después de la presentación del estímulo) se consideran medidas de comportamiento impulsivo y compulsividad, respectivamente 1,4,5,6.

Figura 1: Posibles secuencias de ensayo de un 5-CSRTT típico. Después del intervalo intertrial, la luz de estímulo se enciende durante un período específico y, a continuación, se apaga durante el intervalo de retención limitada. La rata puede responder correctamente y recibir una recompensa o responder incorrectamente y obtener un tiempo de espera durante este tiempo. Si la rata no responde a tiempo, su omisión resulta en un tiempo de espera. Del mismo modo, si responde antes de la presentación del estímulo de luz, su respuesta prematura resulta en un tiempo de espera. Otra prueba comienza después de la recolección de la recompensa o el final del período de tiempo de espera. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El 5-CSRTT es ampliamente utilizado debido a su flexibilidad: al cambiar los parámetros del diseño del ensayo, se pueden investigar diferentes subcategorías de atención. Por ejemplo, mientras que se supone que el animal divide su atención a través de las cinco aberturas diferentes (atención visuoespacial), el uso de estímulos irrelevantes (por ejemplo, estímulos auditivos) permite probar la atención selectiva o sostenida 1,2,5,6. Para ello, la configuración experimental se puede ampliar incluyendo altavoces, que pueden utilizarse como estímulos distractores o incluso de refuerzo 1,2,5,6. Además, la carga atencional se puede modular directamente alterando la presentación del estímulo o aleatorizando la duración itI¹⁰. El 5-CSRTT no solo se utiliza en roedores ^3,7, sino que recientemente se ha adaptado para probar primates no humanos ^1,7,8 y peces ^7,9, mostrando aún más su viabilidad. Una caja de herramientas 5-CSRTT totalmente personalizable permite una fácil adaptación del paradigma estándar de roedores a otros modelos animales. Además, la flexibilidad de personalización de la caja de herramientas 5-CSRTT también fomenta la investigación utilizando diseños de tareas no estándar.

La caja de herramientas 5-CSRTT totalmente personalizable que se presenta aquí contiene un script Arduino para el control de hardware, programado en un entorno de desarrollo integrado. También consta de una caja de herramientas de Matlab (versión R2019b o inferior) para el control de experimentos. El siguiente protocolo explica cómo configurar la caja de herramientas 5-CSRTT con el paradigma estándar ampliamente utilizado y muestra configuraciones opcionales para paradigmas no estándar.

Protocol

El procedimiento experimental en este protocolo se realizó siguiendo las recomendaciones de la directiva de la UE 2010/63 para el Bienestar de los Animales de Experimentación y de acuerdo con la Ley de Bienestar Animal emitida por el Gobierno Federal de Alemania y fue aprobada por las autoridades locales. Dado que la investigación solo requirió entrenamiento conductual, no se sacrificó a ningún animal y todos se mantuvieron en la cría después de que se realizó la investigación. La investigación se realizó utilizando diez ratas encapuchadas Lister macho (4 meses de edad al comienzo del entrenamiento conductual).

1. Alojamiento, cría y manipulación de animales

1. Ratas domésticas junto con hasta cinco compañeros de camada en una jaula estándar con material de cama adecuado, de acuerdo con las recomendaciones de su comité de bienestar animal.
2. Mantenga a las ratas en una habitación ventilada con una temperatura controlada de 20 ± 2 ° C y una humedad relativa de un máximo del 50% con un ciclo de luz / oscuridad de 12:12 h, o de acuerdo con las recomendaciones de su comité de bienestar animal. Restringir el acceso a los alimentos (12 g de chow al día por rata, ver Tabla de Materiales) y proporcionar acceso sin restricciones al agua.
3. Marque las colas de los animales con un marcador de tinta permanente no tóxico.
4. Antes de comenzar el experimento de comportamiento, manipule a las ratas durante al menos una semana hasta que estén acostumbradas a ser manipuladas por los experimentadores, e introduzca a las ratas a los gránulos de alimentos gratificantes para reducir la neofobia alimentaria.

2. Preparación del hardware y software de control

1. Abra el software de entorno de desarrollo integrado (IDE) disponible gratuitamente (consulte la Tabla de materiales). Haga clic en Archivo > Abrir y haga clic en el script para el control de hardware (Archivo complementario 1).
2. Conecte el microcontrolador USB al ordenador. Compruebe si la información de la placa y el procesador elegidos automáticamente corresponden a la placa del microcontrolador conectada haciendo clic en Herramientas en la mitad superior izquierda de la pantalla. Seleccione la información correspondiente de la placa y el procesador, y haga clic en Puerto para seleccionar el puerto disponible.
3. En la mitad superior izquierda de la pantalla, haga clic en Sketch > Incluir biblioteca > Administrar bibliotecas. En la ventana del Administrador de bibliotecas recién abierta, escriba el término "Adafruit Motor Shield V2" en la barra de búsqueda y haga clic en el botón Instalar en la biblioteca correspondiente. Repita el mismo proceso para el término de búsqueda "Adafruit Neopixel".
4. En la mitad superior izquierda de la pantalla, haga clic en Verificar (el botón con una marca de verificación) para asegurarse de que no haya errores en el script. Haga clic en Cargar (el botón con una flecha a la derecha) para cargar el script en la placa del microcontrolador.

3. Preparación del software de control de experimentos

1. Asegúrese de que los cuatro scripts y funciones para el control de experimentos se encuentran en la misma carpeta.
   1. Abra la plataforma de programación, haga clic en la pestaña de la barra de herramientas HOME en la mitad superior de la pantalla y haga clic en Establecer ruta. Haga clic en Agregar carpeta y seleccione la carpeta que contiene todos los scripts de control del experimento.
   2. Haga clic en Guardar y cierre la ventana Establecer ruta . Haga clic en Abrir en la pestaña de la barra de herramientas HOME en la mitad superior de la pantalla y abra los siguientes scripts y funciones: Usuario (Archivo complementario 2), Escalera (Archivo complementario 3) y DataProc (Archivo complementario 4).
2. Siga las instrucciones para descargar e instalar el software Psychtoolbox para habilitar la funcionalidad del botón ESC utilizada por la caja de herramientas (consulte la Tabla de materiales para el enlace de acceso).

4. Configuración de los parámetros utilizados en la caja de herramientas 5-CSRTT

1. Prepare la caja de herramientas para la habituación.
   NOTA: La Figura 2 representa el aparato 5-CSRTT utilizado para el presente estudio.
   1. Seleccione el script de usuario abierto. Asegúrese de que la variable de habituación de la línea 7 esté establecida en 'true'. Escriba un número en minutos (por ejemplo, '30' durante 30 minutos) en la línea 8 para establecer un límite de tiempo para la habituación. En la línea 9, escriba un número entre 0.01 y 1 (brillo completo) para elegir un nivel de brillo para la luz de estímulo.
      NOTA: El nivel de brillo utilizado en este proyecto se establece en 0,2.
   2. Realice el experimento conductual (paso 5).
2. Prepare la caja de herramientas para la sesión del experimento.
   1. Seleccione el script de usuario abierto. Asegúrese de que la variable de la línea 7 se defina como "false".
   2. En la línea 12, escriba la ruta del directorio donde se guardarán automáticamente los datos del experimento (por ejemplo, 'C:\Users\trainer\Desktop\5CSRTT'). Asegúrese de que existe un directorio con este nombre exacto.
   3. Escriba la identificación del sujeto en la línea 13 (por ejemplo, «rojo1»).
   4. Asegúrese de que la variable de la línea 14 se defina como 'true', de modo que los datos generados se guarden automáticamente en la ruta del directorio.
   5. Asegúrese de que la variable en la línea 15 se defina como "true" y escriba un número en las líneas 16 y 17 para establecer un límite de prueba y tiempo (en min), respectivamente, después de lo cual el programa se detendrá automáticamente.
   6. Configure los parámetros para un paradigma estándar 5-CSRTT.
      1. Compruebe si la variable en la línea 32 está configurada como "true" para una entrega gratuita de pellets antes de la primera prueba. Defina la variable en la línea 33 como "verdadera" para asegurar una entrada en la revista antes de que comience cada prueba. Compruebe si la variable de la línea 34 está configurada como "definida" y escriba un número en la línea 35 para especificar la longitud de la ITI en segundos.
      2. Asegúrese de que la variable definida en la línea 37 esté establecida en "true" para que los ensayos con respuestas prematuras no influyan en el límite de prueba de la sesión. Escriba un valor numérico en la línea 38 que definirá la longitud de retención limitada (LH) en segundos.
      3. Asegúrese de que la variable de la línea 39 esté establecida en 'none' y que la variable de la línea 40 se defina como 'false'. Escriba un número en la línea 41 para definir la longitud TO en segundos y asegúrese de que la variable en la línea 42 esté establecida en 'false'.
      4. Escriba un valor numérico en la línea 45 que corresponda al número de aberturas que se pueden iluminar (por ejemplo, '5'). Asegúrese de que la variable en la línea 46 se defina como "pseudoaleatoria" o "aleatoria" y escriba un número en la línea 47, estableciendo la longitud de stD en segundos. Compruebe si la variable de la línea 48 se define como «única» y el valor numérico de la línea 49 es «1». En la línea 50, escriba un número para definir el brillo del estímulo objetivo.
      5. Compruebe si las variables de las líneas 64 y 65 se definen como "binarias" y "no dependientes", respectivamente. Escriba un valor numérico en la línea 71 correspondiente al número de gránulos de alimentos que se liberarán después de un golpe de nariz correcto.
      6. Realice el experimento conductual (paso 5).
   7. Configure los parámetros para un paradigma 5-CSRTT no estándar.
      NOTA: Todos los pasos descritos en este subcapítulo son opcionales.
      1. Si se desea una comprobación automática del rendimiento para utilizar el procedimiento automatizado de formación de escaleras, asegúrese de que la variable de la línea 18 se defina como «true» y escriba un valor numérico en la línea 20 que defina la frecuencia de la comprobación de rendimiento. Escriba un número en la línea 21 para definir el número mínimo de ensayos que se completarán durante la sesión actual antes de calcular el rendimiento del sujeto. Asegúrese de que la variable de la línea 21 se defina como "todas" para que todas las pruebas de la sesión actual se incluyan en la comprobación del rendimiento.
      2. Asegúrese de que la variable de la línea 22 esté establecida en 'true' para que el programa actualice los parámetros de la sesión actual para que coincidan con una sesión completada anteriormente. En la línea 23, escriba 'latest' para establecer que se cargará la última sesión.
         NOTA: El programa actualizará los parámetros en función de las especificaciones de la función "Escalera", saltando al nivel previamente completado. También se puede elegir un conjunto de datos específico que se cargará escribiendo la ruta exacta al archivo de datos con la terminación ".mat".
      3. Si se desea el entrenamiento conductual automatizado, asegúrese de que la variable en la línea 26 esté establecida en 'true'. Escriba un valor numérico en las líneas 27 y 28 para definir el nivel de formación con el que empezar y el número total de niveles disponibles, respectivamente. Si es deseable una división de cohortes, escriba un nombre (por ejemplo, 'grupo1') en la línea 29 que especifique el grupo.
         NOTA: Cada grupo puede usar su propio conjunto de niveles de entrenamiento y criterios para las actualizaciones de nivel. Los parámetros para cada grupo se definen en la función "Escalera" (paso 4.2.8.).
      4. En la línea 34, escriba 'aleatorio' si se desea una duración itI aleatoria. Escriba un intervalo numérico (por ejemplo, '[0,2]') para definir el intervalo que contiene un número aleatorio que se agregará a la duración fija de ITI.
      5. Para asegurarse de que los ensayos con respuestas prematuras influyen en el límite de pruebas de la sesión, escriba "falso" en la línea 37.
      6. Para definir una ventana de tiempo durante la cual se contarán los golpes nasales adicionales como respuestas perseverantes, escriba un valor numérico en la línea 39. Escriba "verdadero" en la línea 40 para que las respuestas prematuras evoquen un tiempo de espera.
      7. Para definir diferentes agrupaciones de las aberturas objetivo, escriba 'vecino', 'desplazado' o 'todos' en la línea 48. Escriba un valor numérico en la línea 49, definiendo el número total de aperturas objetivo. Si se desean estímulos atenuados, escriba un valor numérico en las líneas 51 y 52, definiendo el número total de aperturas atenuadas y su brillo, respectivamente.
      8. Si se desea la emisión de un tono corto (Tono C4, 262 Hz (Notación de tono científico)) antes de la presentación del estímulo, asegúrese de que la variable en la línea 55 esté establecida en "verdadero". Escriba valores numéricos en las líneas 56, 57 y 58 para definir la ventana de tiempo (en milisegundos) entre el tono del orador y la presentación del estímulo, la duración del tono (en milisegundos) y el volumen del tono (se permiten números entre 0 (sin tono) y 1 (volumen completo).
      9. Si se desea la emisión de un tono corto (Tono C6, 1047 Hz) después de un golpe de nariz exitoso, asegúrese de que la variable en la línea 59 esté configurada en 'true'. Escriba un valor numérico en las líneas 60 y 61 que definan la duración del tono (en milisegundos) y el volumen del tono (se permiten números entre 0 (sin tono) y 1 (volumen completo).
      10. Si las respuestas en aperturas iluminadas atenuadas deben ser recompensadas, asegúrese de que la variable en la línea 64 esté establecida en 'no binario'. Escriba un valor numérico en la línea 73 para definir el número de gránulos de alimentos entregados para golpes nasales en aberturas iluminadas atenuadas.
      11. Si utiliza más de un dispensador de pellets, escriba el número de motor correspondiente en las líneas 70 y 72 para los golpes de nariz en las aberturas objetivo y las aberturas iluminadas atenuadas.
          NOTA: El número de motor puede ser 1 o 2. Los terminales de tornillo M3 y M4 del escudo del motor correspondientes se definen en el script para el control de hardware.
      12. Si se desea calificar la recompensa en función del tiempo de reacción, asegúrese de que la variable en la línea 65 esté configurada en 'dependiente'.
          1. Defina la dependencia de los golpes nasales en las aberturas objetivo escribiendo valores numéricos en la línea 67 que dividirán el tiempo de reacción (en segundos), el número de motor y el número de gránulos de alimentos que se entregarán en diferentes categorías, de modo que un intervalo de tiempo de reacción específico corresponda a un número de motor elegido y al número de pellets.
          2. Escriba los números en la línea 68 para definir diferentes categorías para el tiempo de reacción (en segundos), el número de motor y el número de gránulos de alimentos que se entregarán para los golpes nasales en aberturas iluminadas atenuadas.
   8. Configure la función Escalera siguiendo los pasos que se indican a continuación.
      NOTA: Este paso es opcional.
      1. Seleccione la función Escalera abierta. En la línea 4, escriba el nombre del primer grupo (por ejemplo, «grupo1»). Si procede, escriba el nombre del segundo grupo (por ejemplo, «grupo2») en la línea 77.
      2. Para cambiar los parámetros para el segundo nivel de entrenamiento para el primer grupo, escriba uno de los parámetros calculados en la comprobación de rendimiento en la línea 17 (por ejemplo, PerformanceCheck.NumCorrect > = 30 si los criterios responden correctamente a 30 golpes de nariz).
         NOTA: No cambie el parámetro "Config_trigger == 2" cuando utilice la carga automática de la sesión anterior (paso 4.2.7.2.).
      3. En la línea 19, escriba una variable que desee actualizar y un valor numérico si corresponde (por ejemplo, 'Config.LED.StimDuration = 30' para establecer la longitud de la STD en 30 s).
         NOTA: El número de parámetros que se van a cambiar y su nuevo valor se pueden elegir libremente. El único requisito es que el parámetro que se va a actualizar debe escribirse después de la variable 'UpdateTrigger = 1' en cada nivel que se desee la actualización.
   9. Configure la función "DataProc".
      1. Seleccione la función DataProc abierta. Si un gráfico con la visión general de la sesión necesita ser trazado y guardado automáticamente, escriba los comandos para el gráfico deseado desde la línea 83 en adelante.
         NOTA: Los comandos actuales en la línea 83 en adelante trazan una visión general del resultado de la sesión y algunas medidas de control necesarias, como el número total de respuestas prematuras o el número de empujones del panel de alimentos durante una ITI.

5. Experimento conductual

1. Transporte la jaula de ratas desde el vivero a la sala experimental al menos 30 minutos antes de la sesión de habituación o experimento para familiarizar a los animales con la sala de pruebas.
2. Para la sesión de habituación, prepare la cámara operante colocando dos gránulos de alimentos de recompensa en cada una de las aberturas y cinco gránulos de alimentos en la puerta del cargador. Configure los parámetros de la sesión siguiendo los pasos 2-4.1.
   NOTA: La cámara operante utilizada para este protocolo fue una caja de PVC Skinner modificada con dimensiones de 30 x 30 x 45 cm.
   NOTA: Para la primera etapa de habituación, pegue con cinta adhesiva la puerta de la solapa del cargador para que permanezca abierta. Para la segunda etapa de habituación, retire la cinta adhesiva de la puerta de la solapa del cargador.
3. Seleccione el script de usuario abierto. Asegúrese de que la descripción «COM» de la línea 75 coincida con el puerto disponible elegido en el paso 2.2. Si no coincide, cambie el valor numérico en el script de control del experimento (por ejemplo, de 'COM3' a 'COM4').
4. Coloque suavemente las ratas en la cámara.
5. En el script de usuario abierto, haga clic en la pestaña de la barra de herramientas EDITOR en la mitad superior de la pantalla y, a continuación, haga clic en el botón verde Ejecutar. Compruebe si el programa se está ejecutando correctamente leyendo la información de la "Ventana de comandos".
6. Para detener el experimento en cualquier momento, presione la tecla de escape ESC en el teclado de la computadora. Espere a que aparezca un mensaje en la pantalla de la ventana de comandos. Escriba "y" y presione la tecla Enter en el teclado de la computadora para detener la sesión actual y guardar los datos adquiridos.
7. Cuando se alcance el límite de tiempo de habituación o sesión o prueba (paso 4.1.1 o 4.2.5, respectivamente), compruebe el mensaje que aparece en la pantalla de la ventana de comandos. Escriba "y" y presione la tecla Enter en el teclado de la computadora para detener la sesión actual.
   NOTA: El mensaje solo se mostrará al comienzo de una nueva prueba y detendrá la sesión en curso hasta que se escriba una respuesta ("y" para detener la sesión o "n" para continuar el experimento).
8. En el caso de una sesión de habituación, verifique si la rata consumió todos los gránulos de alimentos. Repita la etapa de habituación hasta que se consuman todos los gránulos antes de avanzar a la siguiente etapa de habituación o, después de la segunda etapa, comience el entrenamiento 5-CSRTT.
9. Después de la sesión, limpie las paredes y el piso de la cámara operante, por ejemplo, con una solución de etanol al 70% y una toalla de papel. Antes de introducir la siguiente rata, espere 2-3 minutos hasta que el olor a etanol se disipe.
10. Cuando termine el día del experimento, desconecte el microcontrolador USB de la computadora. Opcionalmente, cierre ambos scripts para el control de hardware y experimentos.

Representative Results

Figura 2: El aparato 5-CSRTT utilizado para el presente estudio. El aparato se ejecuta en una computadora portátil equipada con la caja de herramientas 5-CSRTT, que proporciona un script para controlar el microcontrolador y todos los equipos relacionados y múltiples scripts para controlar el experimento 5-CSRTT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La caja de herramientas totalmente personalizable es fácil de usar y se basa en un microcontrolador de placa única y componentes electrotécnicos estándar. La Figura 3 muestra un diagrama simplificado de circuito y cableado. Toda la apertura consta de 5 LEDs como estímulos de luz y cinco sensores infrarrojos para detectar pinchazos en la nariz. La luz de la casa consiste en una tira con ocho LED, y el cargador de alimentos está hecho de una abertura con una puerta de solapa con un micro interruptor, un dispensador de pellets accionado por motor y una tira con ocho LED para la iluminación. El circuito también ejemplifica las conexiones para componentes opcionales, como el altavoz de timbre pasivo para la retroalimentación auditiva y un potenciómetro digital para el ajuste de volumen. Para obtener una lista de los equipos utilizados en el desarrollo de esta caja de herramientas, consulte la Tabla de materiales.

Figura 3: Circuito simplificado del hardware del microcontrolador. Para ser fácil y rápidamente personalizable, el equipo del microcontrolador se conecta a través de una placa de pruebas. De arriba a la izquierda a abajo a la izquierda, en el sentido de las agujas del reloj: una placa de microcontrolador está conectada a un escudo del motor y un motor de CC (que representa el motor del dispensador de pellets). A la derecha están las tiras de LED para las luces de la casa y del cargador de alimentos, y en el medio están los cinco LED blancos para la luz de estímulo y los cinco pares de sensores infrarrojos utilizados en las aberturas. Debajo de la placa del microcontrolador hay un microinterruptor simple (que representa el interruptor utilizado en la puerta de la solapa del cargador de alimentos). Finalmente, un altavoz de timbre pasivo y un potenciómetro digital se representan en el medio. Esta imagen fue realizada utilizando el software de código abierto Fritzing. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Vinculación y funciones de todos los componentes de los scripts de control del experimento y diagrama simplificado de la función "Código". (A) El script "Usuario" envía sus parámetros a la función "Código", que a su vez se vincula directamente a la función "Escalera", lo que le permite actualizar cualquier parámetro utilizado en la función "Código" mientras el experimento está en curso. La función "Código" envía sus resultados a la función "DataProc" al final de la sesión. (B) Antes de iniciar una sesión de experimento, la función "Código" primero verifica si se supone que debe iniciar el protocolo de habituación. De lo contrario, configura los parámetros en función de las definiciones elegidas en el script "Usuario". Antes de que comience cada prueba, la función comprueba si se ha pulsado la tecla ESC del teclado. Si no, continúa con un nuevo juicio. De lo contrario, detiene la sesión del experimento y pasa los datos recopilados a la función DataProc. Esta comprobación crítica antes de que comience cada prueba permite que el programa se detenga antes de que se alcance el límite de tiempo elegido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las interacciones entre los diferentes scripts de control de experimentos se pueden ver en la Figura 4A. El script "Usuario" incluye todos los parámetros que definen el experimento. Allí, las variables que determinan el tiempo del experimento, el número y el brillo de los estímulos iluminados, la duración de ITI y similares se pueden elegir libremente. La función Código (Archivo Suplementario 5) incluye una descripción detallada de un solo ensayo y todos los resultados posibles, que se reitera a lo largo del experimento, como se muestra en la Figura 4B. Además, consiste en un protocolo para la habituación del animal al aparato. La función Código también verifica regularmente el rendimiento del animal. Además, la función Escalera es opcional. El rendimiento del sujeto se compara con los criterios establecidos anteriormente, y los parámetros deseados se actualizan automáticamente si el rendimiento del animal cumple con estos criterios. La función Escalera también puede considerar los resultados adquiridos de la sesión del día anterior. Mientras se ejecuta el experimento, una comprobación del rendimiento al final de un ensayo calculará la precisión, las omisiones y el número total de respuestas correctas de los ensayos completados y comparará el resultado con los criterios deseados para una actualización de nivel, como se especifica en la función Escalera. Finalmente, la función DataProc procesa todos los datos recopilados y genera gráficos simples para un análisis rápido. Al final de una sesión, la caja de herramientas guarda automáticamente todos los datos en un archivo *.mat y genera un archivo *.xlsx adicional con la información esencial del experimento.

Figura 5: Ejemplo de diferentes configuraciones de estímulo de la caja de herramientas 5-CSRTT. El diagrama ejemplifica posibles combinaciones de estímulos objetivo en función de la configuración elegida. Tanto las configuraciones "todas" como "únicas" se utilizan en el paradigma estándar (para el experimento de habituación y comportamiento). Las configuraciones "vecinas" y "desplazadas" muestran configuraciones de estímulo no estándar, lo que permite el uso de otros números de estímulos iluminados, que también pueden tener un contraste diferente al estímulo objetivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El paso de protocolo 4.2.7.7 menciona una característica opcional: cambiar la agrupación de las aperturas objetivo. El paradigma estándar 5-CSRTT hace uso de un solo estímulo objetivo. Aquí, ejemplificamos cómo la caja de herramientas presentada permite modificaciones del paradigma estándar. La Figura 5 muestra algunas posibles combinaciones de grupos de un total de cinco aperturas relacionadas con la configuración elegida. La configuración "todos" ilumina todas las aperturas disponibles para que cada apertura sea ahora una apertura objetivo, lo que puede ser útil en las etapas iniciales de entrenamiento. La configuración de vecino se asegura de que el número (libremente elegido) de aperturas objetivo sea vecino entre sí. Los ajustes se pueden especificar de tal manera que los vecinos no sean idénticos a la apertura objetivo, sino que se iluminen con un contraste más bajo (o incluso más alto). El uso de aperturas con diferentes contrastes de iluminación permite probar nuevos paradigmas, como el uso de recompensas de diferentes grados para los golpes de nariz en las aperturas de alto o bajo contraste. La Figura 5 muestra un ejemplo con tres aperturas objetivo con iluminación idéntica. La configuración única se utiliza normalmente en el estándar 5-CSRTT, donde solo se ilumina un único objetivo. Finalmente, la configuración desplazada extiende la configuración vecina. Desplaza el estímulo vecino hacia la última o primera apertura en caso de que la apertura objetivo esté en la primera o última posición, respectivamente. Al igual que en la configuración del vecino, la fuerza de iluminación de los vecinos se puede elegir libremente, siendo la misma o diferente de la apertura objetivo. Además, el número de estímulos iluminados generales se puede elegir libremente. A continuación, la caja de herramientas calcula todos los estímulos posibles automáticamente. Sin embargo, el parámetro "Config.LED.NumHighLED" debe establecerse en "1" para esta configuración.

Siguiendo el protocolo, el entrenamiento de ratas (N = 10) para el 5-CSRTT se realizó de acuerdo con las etapas de entrenamiento presentadas en la Tabla 1.

Tabla 1: 5-CsrTT programa de capacitación y criterios para pasar al siguiente nivel. (A) El intervalo entre ensayos se mantuvo constante a 5 s en cada nivel de entrenamiento. (B) Duración del estímulo para cada nivel de entrenamiento. (C) Ventana de tiempo de retención limitada (LH), el tiempo máximo tolerado entre el estímulo apagado y cualquier respuesta de golpe en la nariz. D) El número total de respuestas correctas necesarias para superar el nivel de capacitación respectivo. (E) El porcentaje de precisión se calcula como . (F) El porcentaje de errores de omisión se define como . Este criterio no incluye las respuestas prematuras. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

El rendimiento de las ratas se comparó con el número de días de entrenamiento (sesiones) necesarios para completar cada nivel de entrenamiento dado en la Tabla 1. Todos los animales comenzaron en el nivel de entrenamiento 1 con una StD y LH de 60 s cada uno. Sin embargo, algunas ratas (N = 5) recibieron un entrenamiento de habituación mejorado para probar algunas de las opciones de estímulo adicionales informadas anteriormente, lo que explica la diferencia en el número de sesiones que los animales individuales permanecieron en el nivel de entrenamiento 1. La finalización del nivel se caracterizó por alcanzar un total de 30 o más respuestas correctas. StD y LH disminuyeron durante los siguientes niveles, mientras que los criterios para avanzar al siguiente nivel de entrenamiento se hicieron más difíciles, aumentando la demanda atencional de la tarea ^1,6.

La Tabla 2 muestra la hoja de cálculo *.xlsx generada automáticamente de una rata de ejemplo durante una sesión. La rata comenzó con la configuración especificada en el nivel de entrenamiento 5. Después de cuatro ensayos, la rata avanzó al nivel 6, considerando los ensayos realizados en la sesión actual más la precisión lograda en la sesión anterior. La cantidad de ensayos que deben realizarse como mínimo en la sesión actual para avanzar al siguiente nivel de entrenamiento se especifica en la variable "Config.Experiment.MinNumTrials". En la misma sesión, la rata avanzó al nivel de entrenamiento 7 después de completar 66 ensayos en el nivel 6 y lograr el requisito de > 80% de precisión y < 20% de omisión. En total, las ratas fueron entrenadas durante 26 días utilizando la configuración de los niveles de entrenamiento como se proporciona en la Tabla 1. El número de sesiones dedicadas por nivel de capacitación se proporciona en la Figura 6A. La línea negra muestra el promedio en todos los sujetos, y cada línea de color muestra los datos de una rata. Todas las ratas alcanzaron el octavo nivel en 14-22 sesiones (Figura 6B). La Figura 6C muestra el rendimiento medio de los sujetos por nivel de entrenamiento y en todos los días de entrenamiento en el aparato 5-CSRTT. La línea negra discontinua representa el porcentaje de precisión y la línea negra recta representa el porcentaje de omisión. La precisión se calculó como la relación entre el número de respuestas correctas y el número total de respuestas. Las omisiones se calcularon como la relación entre el número de omisiones y el número total de ensayos (es decir, la suma de respuestas correctas, respuestas incorrectas y omisiones). La línea gris indica el número total promedio de respuestas correctas en todos los ensayos de cada nivel. La Figura 6D muestra la precisión final alcanzada por cada sujeto en el octavo y último nivel de entrenamiento.

En promedio, las ratas pasaron 5.9 (±1.03 SESIONES SEM) para completar el nivel 1, entre 1.5 (±0.17) y 3.5 (±0.5) sesiones para completar el nivel 2 a 6, y 1.7 (±0.16) sesiones para completar el nivel 7 antes de alcanzar el nivel final 8. Como se desprende de la Figura 6A, la varianza entre sujetos fue más significativa en los niveles iniciales (DE = 3,25 en el nivel 1, 1,58 en el nivel 2) y disminuyó en los niveles posteriores (0,47 y 0,48 en los niveles 6 y 7, respectivamente). En el nivel 4, cuando la duración del estímulo se redujo aún más, el número promedio de sesiones dedicadas (2,6 ± 0,52) y la varianza entre ratas (1,64) aumentaron, con dos ratas que tardaron 5 y 6 días en concluir el nivel.

Figura 6: Resultados del experimento conductual con la caja de herramientas 5-CSRTT. (A) El número de sesiones realizadas en cada nivel de entrenamiento. La línea negra representa el número promedio de sesiones de todas las asignaturas para cada nivel (media ± SEM), y las líneas de color representan los datos de los sujetos individuales. B) El número absoluto de sesiones necesarias para alcanzar el nivel final, por asignatura. (C) Mediciones de desempeño promediadas a lo largo de la capacitación (media ± SEM). La línea negra punteada representa la precisión de todos los sujetos en todas las respuestas dadas en todas las sesiones por nivel de entrenamiento, y la línea negra muestra el porcentaje de omisión correspondiente. La línea gris representa el número absoluto promedio de respuestas correctas de todos los sujetos en cada nivel de entrenamiento. (D) Precisión por asignatura durante el octavo y último nivel de entrenamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 2: Datos recopilados de una rata de ejemplo durante una sesión de entrenamiento. La columna A muestra el recuento de pruebas durante la sesión con respecto al nivel de entrenamiento actual, como se muestra en la columna B. La columna C muestra la duración de ITI y la columna D muestra la hora de inicio de la prueba. Las columnas E a I muestran el nivel de brillo para el estímulo LED en aperturas 1 a 5, respectivamente. Un nivel de brillo de 0 significa que el estímulo estaba desactivado, y un nivel de brillo de 0.2 significa que el estímulo se encendió con el 20% de su intensidad máxima. Las columnas J y K muestran la hora exacta en que se encendió y apagó el estímulo, respectivamente. La columna L muestra el resultado del ensayo: 0 significa "omisión", 1 significa "respuesta correcta", 3 significa "respuesta incorrecta" (nariz clavada en la abertura no objetivo) y 4 significa "prematuro". La columna M muestra qué apertura se pinchó en la nariz durante el ensayo, mientras que la columna N representa el momento exacto del golpe en la nariz. Las columnas O, P y Q muestran el momento en que se encendió el motor dispensador de pellets, el número de motor correspondiente y el momento en que la rata abrió el dispensador de pellets para obtener su recompensa, respectivamente. La columna R muestra la hora de finalización de la prueba. Las columnas S, T, U, V y W muestran el número total de respuestas prematuras, los tiempos de espera, las pulsaciones de panel durante una ITI, el número total de respuestas perseverantes y el tiempo de ejecución total de la sesión en minutos, respectivamente. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Archivo complementario 1: Script para el control de hardware del software IDE (código Arduino). Esto incluye todos los comandos para controlar el hardware y los componentes electrotécnicos de la caja de herramientas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Script para la función "Usuario" en el software de control de experimentos. Esto incluye todos los parámetros que definen el experimento. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 3: Script para la función "Escalera" en el software de control de experimentos. Esto monitorea el desempeño del sujeto y lo compara con los criterios establecidos anteriormente. Los parámetros deseados se actualizan automáticamente si el rendimiento del animal cumple con estos criterios. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 4: Script para la función "DataProc" en el software de control de experimentos. Esto procesa todos los datos recopilados y genera gráficos simples para un análisis rápido. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 5: Script para la función "Código". Esto incluye una descripción detallada de un solo ensayo y todos los resultados posibles, que se reitera a lo largo del experimento. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

El presente protocolo tiene como objetivo desarrollar y probar una alternativa de bajo costo y totalmente personalizable al aparato de tarea de tiempo de reacción en serie estándar de 5 opciones disponible comercialmente. Por lo general, los tipos de aparatos disponibles comercialmente proporcionan un conjunto limitado de características según sea necesario para ejecutar la investigación estándar 5-CSRTT. Debido a esto, las modificaciones no estándar en el diseño específico del ensayo, como los cambios en la secuencia del ensayo o las combinaciones de estímulos objetivo, generalmente no son posibles. Además, muchos de los tipos de aparatos disponibles vienen con software específico y cerrado que puede no proporcionar acceso a todos los datos de comportamiento del experimento, como el tiempo y la apertura del número de respuestas prematuras y perseverantes. En contraste, la ventaja vital de la caja de herramientas presentada aquí es, además de su bajo costo, la posibilidad de implementar muchos diseños de ensayos y paradigmas de investigación diferentes. Actualmente, la caja de herramientas admite la definición de múltiples diseños de estímulos, como permitir estímulos atenuados y usar dos sistemas de entrega de pellets y recompensar la dependencia del tiempo de reacción. También admite el uso de un altavoz en miniatura para la retroalimentación auditiva. Sin embargo, el propósito principal es permitir modificaciones fáciles de la secuencia de prueba de acuerdo con el objetivo del usuario, como la introducción de aberturas iluminadas atenuadas y horarios gratificantes para tareas de toma de decisiones o la integración de enfoques de entrenamiento de refuerzo positivo de última generación¹¹. Además, todos los datos en bruto adquiridos durante la sesión están disponibles para su posterior análisis. La caja de herramientas proporciona una función de escalera para el entrenamiento conductual automatizado, que también es totalmente personalizable y permite al usuario cambiar los criterios para cada actualización de nivel, el número de niveles de entrenamiento y los parámetros a actualizar. Además, el aparato en sí es altamente adaptable, y los cambios en el diseño del ensayo y el diseño de la cámara son fácilmente factibles, lo que permite aplicar el paradigma 5-CSRTT a especies animales que necesitan un diseño de investigación diferente al que ofrecen los tipos de aparatos disponibles comercialmente.

Las partes específicas del protocolo para la configuración del software son fundamentales para garantizar un flujo de trabajo fluido: especialmente para el primer día del experimento, la preparación tanto del hardware como del software de control del experimento (pasos 2 y 3) y la configuración del paso 5.3 es crucial. Asegurarse de que la conexión del puerto serie entre el hardware del microcontrolador, su software y el software de control de experimentos funciona correctamente es fundamental para establecer una caja de herramientas 5-CSRTT en pleno funcionamiento. Al comienzo de cada día de experimento, es recomendable repetir los tres pasos mencionados anteriormente para asegurarse de que el hardware y los scripts de control del experimento estén configurados correctamente.

Finalmente, la limitación actual de la caja de herramientas es su implementación a una plataforma de programación exclusiva, lo que desafortunadamente compromete su uso como una caja de herramientas completa de código abierto. Sin embargo, en principio, la caja de herramientas debería ser fácilmente adaptable a otros lenguajes de programación como Python, ya que el curso de una prueba permanece sin cambios.

En comparación con los métodos alternativos existentes, la caja de herramientas 5-CSRTT introducida aquí permite la implementación del paradigma estándar 5-CSRTT y modificaciones del mismo, como definir una ventana de tiempo establecida para respuestas perseverantes o introducir estímulos que distraigan o refuercen como altavoces o luces parpadeantes. Además de ser fácil de usar y altamente adaptable, el aparato es de bajo costo y se puede replicar fácilmente, e incentiva la investigación utilizando modelos animales no roedores.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1200 Ohm Resistor			Already available in the lab
8-bit 10 kΩ digital potentiometer	Microchip	MCP42010-I/P	From Conrad.de: 1083205
ARD MEGA2560 KIT Arduino - Mega 2560 R3 Lernset	JOY-IT	ARD-Set01	From Reichelt.de: ARD MEGA2560 KIT
ARD SHD MOTOR Arduino Shield - Motor	Adafruit	1438	From Reichelt.de: ARD SHD MOTOR
ARDUINO STACKABLE HEADER KIT - R3	Sparkfun Electronics	PRT-11417	From Antratek.de: PRT-11417
Chow	Altromin	1324 N	Altromin chow products
Euro-Gehäuse	Hammond Electronics	1591EBK	From Conrad.de: 520691
Food pellets	Bio-Serv	F0021	From Bio-serv.com: Dustless Precision Pellets Rodent
Fritzing	Interaction Design Lab Potsdam		Fritzing Software download
Integrated Development Environment	Arduino		Arduino IDE download (Freely available)
IR Break Beam Sensor - 3mm LEDs	Adafruit	2167	From Mouser.de: 485-2167
Laptop or Computer
LED white round 5mm 2000mcd 20mA	TruComponents	1573731	From Conrad.de: 1573731
Microswitch	Hartmann	MBB1 01 A 01 C 09 A	From Conrad.com: 707243
NeoPixel Stick - 8 WS2812 5050 RGB LEDs	Adafruit	1426	From Reichelt.de: DEBO LED NP8 2
Passive buzzer Speaker	Conrad Components	93038c213a	From Conrad.de: 1511468
Pellet release disk			Already available in the lab. Similar products depicted below. Keep in mind that some of these products make use of different (and stronger) motors and infrared sensors. The use of the microswitch (row 7) and the  Arduino Motor Shield (row 3) need to be adapted to fit these new specifications. We recommend 3d printing the disk to work with the provided materials and software. Carbatec universal base plate Open Science Framework Open Feeder Open Ephys 3d Model Food Pellet Dispenser Campden Instruments 45mg pellet dispenser
Programming platform	Mathworks	R2019b or younger
Psychtoolbox Software		V3	Psychtoolbox-3 download
Spur GEAR-MOTOR with DC brush motor	Micromotors	B138F.12.208	Micromotos Series B138F Technical data