Summary
Detta protokoll beskriver den detaljerade, låginmatningsprovberedningen för enkärnig sekvensering, inklusive dissektion av musöverlägsna livmoderhals- och stellatganglier, celldissociation, kryokonservering, kärnisolering och hashtag-streckkodning.
Abstract
Det autonoma hjärtnervsystemet är avgörande för att kontrollera hjärtfunktionen, såsom hjärtfrekvens och hjärtkontraktilitet, och är uppdelad i sympatiska och parasympatiska grenar. Normalt finns det en balans mellan dessa två grenar för att upprätthålla homeostas. Hjärtsjukdomstillstånd som hjärtinfarkt, hjärtsvikt och högt blodtryck kan dock inducera ombyggnad av celler som är involverade i hjärtinnervation, vilket är förknippat med ett negativt kliniskt resultat.
Även om det finns stora mängder data för den histologiska strukturen och funktionen hos det autonoma hjärtnervsystemet, är dess molekylärbiologiska arkitektur inom hälsa och sjukdom fortfarande gåtfull i många aspekter. Nya tekniker som encells RNA-sekvensering (scRNA-seq) är lovande för genetisk karakterisering av vävnader med encellsupplösning. Emellertid, den relativt stora storleken av neuroner kan hindra den standardiserade användningen av dessa tekniker. Här utnyttjar detta protokoll droppbaserad enkärnig RNA-sekvensering (snRNA-seq), en metod för att karakterisera den biologiska arkitekturen hos hjärtsympatiska nervceller i hälsa och sjukdom. Ett stegvis tillvägagångssätt har visat sig utföra snRNA-seq av de bilaterala överlägsna cervikala (SCG) och stellat ganglierna (StG) dissekerade från vuxna möss.
Denna metod möjliggör långvarig provbevarande, vilket upprätthåller en adekvat RNA-kvalitet när prover från flera individer / experiment inte kan samlas in samtidigt inom en kort tidsperiod. Streckkodning av kärnorna med hashtag-oligos (HTO) möjliggör demultiplexering och spårning av distinkta ganglioniska prover efter sekvensering. Efterföljande analyser avslöjade framgångsrik kärnfångst av neuronala, satellitgliala och endotelceller i de sympatiska ganglierna, vilket validerades av snRNA-seq. Sammanfattningsvis ger detta protokoll ett stegvis tillvägagångssätt för snRNA-seq av sympatiska yttre hjärtganglier, en metod som har potential för bredare tillämpning i studier av innervering av andra organ och vävnader.
Introduction
Det autonoma nervsystemet (ANS) är en avgörande del av det perifera nervsystemet som upprätthåller kroppshomeostas, inklusive anpassning till miljöförhållanden och patologi1. Det är involverat i reglering av flera organsystem i hela kroppen, såsom kardiovaskulära, respiratoriska, matsmältnings-, och endokrina system. ANS är indelat i sympatiska och parasympatiska grenar. Ryggmärgsgrenar av det sympatiska nervsystemet synaps i ganglier i den sympatiska kedjan, belägna bilateralt i en paravertebral position. De bilaterala cervikala och bröstkorgsganglierna, särskilt StG, är viktiga komponenter som deltar i hjärtsympatisk innervation. I sjukdomstillstånd, såsom hjärtischemi, kan neuronal ombyggnad inträffa, vilket resulterar i en sympatisk överväxel2. Den neuronala ombyggnaden har visats i flera histologiska studier på människor och flera andra djurarter 3,4,5,6. En detaljerad biologisk karakterisering av hjärtischemiinducerad neuronal ombyggnad i hjärtsympatiska ganglier saknas för närvarande, och de grundläggande biologiska egenskaperna hos specialiserade neuronala celltyper eller subtyper inom hjärtsympatiska nervsystemet (SNS) är inte helt bestämda ännu i hälsa och sjukdom7.
Nya tekniker, såsom scRNA-seq, har öppnat portar för genetisk karakterisering av små vävnader på encellsnivå 8,9. Den relativt stora storleken på neuroner kan dock hindra optimerad användning av dessa encellstekniker hos människor10. Dessutom kräver encellssekvensering en hög genomströmning av celler för att återställa ett tillräckligt cellantal på grund av en hög förlust i sekvenseringsprocessen. Detta kan visa sig vara utmanande när man studerar små vävnader som är svåra att fånga i en session och kräver flera prover för att införa tillräckligt med enstaka celler för sekvensering. Den nyligen utvecklade droppbaserade snRNA-seq-tekniken (dvs. 10x Chromium-plattformen) möjliggör studier av biologiska skillnader mellan enstaka kärnor11,12. snRNA-seq har en fördel jämfört med scRNA-seq för stora celler (>30 μm), som kanske inte fångas i Gel Bead in Emulsions (GEMs), samt förbättrad kompatibilitet med omfattande dissociation och / eller långvarig bevarande 13,14,15.
Heterogenitet, antalet neuronala celler och andra celler berikade i hjärt-SNS är viktiga aspekter för karakteriseringen av ANS i hälso- och sjukdomstillstånd. Dessutom bidrar den organ- eller regionspecifika innervationen av varje sympatisk ganglion till SNS komplexitet. Dessutom har livmoderhals-, stellat- och bröstganglier i den sympatiska kedjan visat sig innervera olika regioner i hjärtat16. Därför är det nödvändigt att utföra enkärnig analys av ganglioniska celler härledda från enskilda ganglier för att studera deras biologiska arkitektur.
Droppbaserad snRNA-seq möjliggör transkriptomomfattande uttrycksprofilering för en pool med tusentals celler från flera prover samtidigt med lägre kostnader än plattbaserade sekvenseringsplattformar. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt för droppbaserad snRNA-seq att vara mer lämplig för cellulär fenotypklassificering och ny subpopulationsidentifiering av celler inom SCG och StG. I synnerhet ger detta protokoll ett kortfattat stegvis tillvägagångssätt för identifiering, isolering och enkärnig RNA-sekvensering av sympatiska yttre hjärtganglier, en metod som har potential för en bred tillämpning i studier av karakterisering av ganglier som innerverar andra relaterade organ och vävnader i hälsa och sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll beskriver alla steg som krävs för snRNA-seq av murina cervikala och / eller cervicothoracic (stellate) ganglier. Kvinnliga och manliga C57BL/6J-möss (15 veckor gamla, n = 2 för varje kön) användes. Ytterligare en Wnt1-Cre;mT/mG-mus användes för att visualisera ganglierna för dissektionsändamål 17,18. Denna extra mus genererades genom korsning av en B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J-mus och en B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J-mus. Alla djurförsök utfördes enligt Guide for Care and Use of Laboratory Animals publicerad av NIH och godkänd av den djurförsöksetiska kommittén vid Leiden University (Licensnummer AVD1160020185325, Leiden, Nederländerna). Se materialförteckningen för detaljer om allt material, utrustning, programvara och djur som används i protokollet.
1. Förberedelser
OBS: Alla steg utförs i ett cellodlingsflödesskåp.
- Rengör pincetten och saxen genom att nedsänka instrumenten i 70% etanol i 20 min.
- Förbered ganglionmediet bestående av neurobasalt medium kompletterat med B-27 plus (1x), L-glutamin (2 mM) och 1% antibiotisk-antimykotisk. Förvarda ganglionmediet vid rumstemperatur.
- Förbered matsmältningslösningen: 0,25% Trypsin-EDTA (1:1) och 1 400 U/ml kollagenas typ 2 upplöst i ganglionmediet.
- Förbered färsk, kall (4 °C) celltvättbuffert (0,4 % bovint serumalbumin [BSA]) och lysbuffert (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mMMgCl2 och 0,1 % nonjoniskt tvättmedel, 40 U/ml RNAse i nukleasfritt vatten) för kärnisolering.
- Förbered kärntvättbufferten (1x fosfatbuffrad saltlösning [PBS] med 2,0% BSA och 0,2U / μL RNase Inhibitor).
- Förbered ST-färgningsbuffert (ST-SB) (10 mM Tris-HCl, 146 mM NaCl, 21 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 2% BSA, 0,02% Tween-20 i nukleasfritt vatten).
2. Dissektion av vuxna mus överlägsna cervikala ganglier (SCG)
- Avliva mössen och håll dem på is.
OBS: I den aktuella studien avlivades totalt 4 C57BL6 / J-möss genom CO 2-kvävning. Alternativt kan isofluran användas följt av exsanguination när en stor mängd blod behöver samlas in för andra studieändamål. - Fäst musen på ett dissektionskort med stift och douse den med 70% etanol för att minimera spridningen av päls (rakning är inte nödvändigt).
- Under ett stereomikroskop öppnar du huden i nackregionen genom att göra ett mittlinjesnitt med sax, flytta de submandibulära körtlarna åt sidan och ta bort sternomastoidmuskeln för att exponera och lokalisera den gemensamma halspulsådern och dess förgrening (figur 1A, B, se pil).
- Dissekera höger och vänster halspulsåderbifurcation och vävnaden som är fäst vid den. Överför varje dissekerad bit vävnad till en separat 3,5 cm petriskål som innehåller kall PBS.
- Leta efter SCG som är fäst vid halspulsådern. Rengör SCG ytterligare genom att ta bort artären och annan fäst vävnad i petriskålen (figur 1E).
3. Dissektion av vuxna mus stellat ganglier (StG)
- För att dissekera StG, gör ett mittlinjesnitt i buken, följt av att öppna membranet och den ventrala bröstväggen.
- Ta bort hjärtat och lungorna för att exponera ryggkorgen. Leta efter vänster och höger StG anterolateral till musculus colli longus (MCL) vid nivån på den första ribben (figur 1C, D, indikerad med streckade linjer).
- Dissekera både vänster och höger StG med pincett och överför dem separat till 3,5 cm petriskålar som innehåller kall PBS (figur 1F).
4. Isolering och kryokonservering av mus ganglioniska celler
Steg 4-6 sammanfattas i figur 2.
- Överför försiktigt alla enskilda SCG och StG för att separera 1,5 ml mikrocentrifugrör med pincett.
OBS: Använd inte pipettspetsar för att överföra ganglierna eftersom ganglierna är benägna att fästa vid väggen av plastpipettspetsar. - Tillsätt 500 μL 0,25% trypsin-EDTA-lösning till varje mikrocentrifugrör och inkubera i ett skakvattenbad vid 37 °C i 40 minuter.
OBS: Detta steg syftar till att underlätta matsmältningen och cellfrisättningen nedan i kollagenas typ 2-lösningen. - Bered ett 15 ml rör som innehåller 5 ml ganglionmedium för varje prov. Låt ganglierna sätta sig ner i botten av mikrocentrifugrören. Samla supernatanten, som innehåller mycket få ganglioniska celler, överför supernatanten till de beredda 15 ml rören och märk varje rör. Alternativt, för att spara lite tid, aspirera trypsin-EDTA-supernatanten utan insamling eftersom mycket få dissocierade celler kan detekteras i den.
OBS: En liten mängd trypsin-EDTA-lösning (~ 10-30 μL) kan lämnas i mikrocentrifugröret för att undvika avlägsnande av ganglierna. Undvik pipettering i detta steg eftersom det kan skada ganglierna och leda till låg produktion av ganglioniska celler efteråt. - Tillsätt 500 μL kollagenas typ 2-lösning i varje mikrocentrifugrör och inkubera i ett skakvattenbad vid 37 °C i 35–40 minuter. Försök att återsuspendera ganglion efter 35 min; om ganglionen fortfarande är intakt och inte dissocierar, förläng inkubationstiden eller öka koncentrationen av kollagenas typ 2-lösning vid behov.
OBS: Inkubationstiden kan variera beroende på ganglionstorleken. - Resuspend ganglierna i kollagenaslösning genom pipettering upp och ner ~ 10 gånger eller tills vävnadsklumpar inte längre detekteras.
- Överför cellsuspensionen till det tidigare använda 15 ml röret som innehåller ganglierna odlingsmediet och trypsin-EDTA-suspensionen från samma ganglion. Snurra ner cellsuspensionen med en svängande skopretorcentrifug i 10 min, 300 × g vid rumstemperatur. Kassera försiktigt cell supernatanten.
OBS: Eftersom de ganglioniska cellerna är dissocierade från en enda ganglion kan cellpelleten vara för liten för att detektera med ögat; en liten mängd supernatant kan lämnas i röret för att undvika oavsiktligt avlägsnande av cellpelleten. - Resuspendera de ganglioniska cellerna i 270 μL fetalt bovint serum (FBS, lågt endotoxin) och överför varje cell-FBS-suspension till en 1 ml kryovulell.
- För att räkna cellerna, blanda 5 μL av den ganglioniska cellsuspensionen med 5 μL 0,4% trypanblått färgämne och ladda blandningen i en hemocytometer. Räkna det totala antalet och levande celler under ett mikroskop.
OBS: Cellviabiliteten (antal levande celler / totalt cellantal = viabilitet %) är vanligtvis över 90% med detta dissociationsprotokoll. Antalet levande celler för en enda ganglion (antingen SCG eller StG) faller vanligtvis inom intervallet 9 000-60 000 celler när ganglionen isoleras från en mus i åldern 12 till 16 veckor. - Tillsätt 30 μL dimetylsulfoxid (DMSO) till varje cell-FBS-suspension i kryomedialer, blanda väl och överför kryomedialer till en cellfrysningsbehållare som hålls vid rumstemperatur. Förvara den kryovialbelastade behållaren vid -80 °C över natten och överför kryotyperna till flytande kväve nästa dag för långvarig konservering före sekvensering.
5. Nucleus isolering
OBS: Vänster och höger SCG isolerad från fyra möss (totalt 8 prover) användes som ett exempel i följande kärnisolerings- och sekvenseringspreparat. Håll allt på is under hela proceduren. På grund av osynligheten hos små kärnpellets rekommenderas en centrifug med svängande hinkar för att underlätta avlägsnande av supernatant under hela proceduren.
- Förbered 15 ml rör med en sil (30 μm) ovanpå och förrinser silen med 1 ml av ganglionmediet.
- Ta ut kryotyperna från flytande kväve och tina dem omedelbart i ett vattenbad vid 37 °C. När en liten pellet av is lämnas i kryomedialen, ta kryomedialen ur vattenbadet.
- Återställ de ganglioniska cellerna genom att släppa 1 ml av ganglionmediet i varje kryovial medan du skakar försiktigt för hand. Valfritt: För att utvärdera cellåtervinning, blanda cellsuspensionen efter återhämtning och ta ut 5 μl cellsuspension för räkning av levande celler, enligt beskrivningen i steg 4.8.
- Ladda varje ganglionisk cellsuspension på en separat sil (beredd i steg 5.1) och skölj varje sil med 4-5 ml ganglionmedium.
- Centrifugera den ansträngda cellsuspensionen i 5 minuter vid 300 × g, ta bort supernatanten försiktigt och återsuspendera cellerna i 50 μL celltvättbuffert.
- Överför cellsuspensionen till ett lågbindande DNA / RNA 0,5 ml mikrocentrifugrör.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 500 × g i 5 minuter vid 4 °C.
- Ta bort 45 μL av supernatanten utan att vidröra rörets botten för att undvika att cellpelleten lossnar.
- Tillsätt 45 μL kyld lysbuffert och pipettera försiktigt upp och ner med en 200 μL pipettspets.
- Inkubera cellerna i 8 min på is.
- Tillsätt 50 μL kallkärnig tvättbuffert till varje rör. Blanda inte.
- Centrifugera kärnsuspensionen vid 600 × g i 5 minuter vid 4 °C.
- Ta bort 95 μL av supernatanten utan att störa kärnpelleten.
- Tillsätt 45 μL kyld kärntvättbuffert till pelleten. Valfritt: Ta 5 μL kärnsuspension, blanda med 5 μL 0,4% trypanblått för att räkna och kontrollera kärnornas kvalitet under ett mikroskop med en hemocytometer.
- Centrifugera kärnsuspensionen vid 600 × g i 5 minuter vid 4 °C.
- Ta bort supernatanten utan att röra vid rörets botten för att undvika att kärnpelleten lossnar.
6. Nucleus-streckkodning med hashtag-oligos (HTO) och multiplexering
OBS: HTO-färgningssteg modifierades och optimerades för kärnmärkning av mycket låga mängder (ganglioniska) kärnor enligt den tidigare applikationen i kortikal vävnad av Gaublomme et al.15.
- Tillsätt 50 μL ST-SB-buffert till kärnpelleten, pipettera försiktigt 8-10 gånger tills kärnorna är helt återsuspenderade.
- Tillsätt 5 μl Fc-blockerande reagens per 50 μl st-SB/kärnor-blandningen och inkubera i 10 minuter på is.
- Tillsätt 1 μl (0,5 μg) enkärnig hashtag-antikropp per rör i ST-SB/nuklei-blandningen och inkubera i 30 minuter på is.
OBS: Kortare inkubationstid leder till lägre effektivitet för hashtag-märkning, vilket visas i de representativa resultaten. - Tillsätt 100 μL ST-SB till varje rör. Blanda inte.
- Centrifugera kärnsuspensionen i 5 min, 600 × g vid 4 °C.
- Ta bort 145 μL av supernatanten utan att störa kärnpelleten.
- Upprepa steg 6.4 och 6.5. Ta bort supernatanten så mycket som möjligt utan att röra vid rörets botten för att undvika att kärnpelleten lossnar.
- Resuspend kärnpelleten i 50 μL ST-SB och blanda försiktigt kärnorna.
- Ta 5 μL av kärnsuspensionen och blanda den med 5 μL 0,4% trypanblå för att räkna kärnorna under ett mikroskop. Se figur 3A för en representativ bild av kärnor blandade med trypanblått och laddat i en hemocytometer.
- Centrifugera kärnsuspensionen i 5 minuter vid 600 × g vid 4 °C.
- Resuspendera kärnorna i ST-SB för att uppnå en målkärnkoncentration på 1 000-3 000 kärnor/μL för varje prov enligt motsvarande kärnantal.
- Slå samman proverna för att uppnå önskat antal celler.
OBS: Till exempel, i detta experiment, var 8 prover lika poolade för att uppnå totalt 25 000 kärnor för att omedelbart gå vidare till 10x Genomics Chromium och snRNA-seq efteråt. Kärnantalet faller vanligtvis inom intervallet 6 000-40 000 celler när ganglion isoleras från en mus i åldern 12 till 16 veckor. Endast omkring hälften av de totala laddade kärnorna kan fångas upp med droppbaserad snRNA-seq. Till exempel framställdes en 25 000 kärnblandning för att säkerställa infångning av 10 000 kärnor, vilket behövs för ytterligare biblioteksberedning och sekvensering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvalitetskontrollanalys av enkärnig cDNA-biblioteksberedning och snRNA-seq
Representativa resultat beskriver sekvenseringsresultat för 10 000 fångade kärnor i en enda pool med ett 25 000 läsningar / kärngenuttrycksbibliotek och ett 5 000 reads / nucleus hashtag-bibliotek. Figur 3B illustrerar kvalitetskontrollresultaten för 1st sträng cDNA, genuttryck (GEX) bibliotek och HTO-bibliotek, som kontrollerades med Bioanalyzer. De HTO-härledda cDNA: erna förväntas vara mindre än 180 bp, medan mRNA-härledda cDNA är större än 300 bp. Ett högkvalitativt GEX-bibliotek kan identifieras som en bred topp från 300 till 1 000 bp, och HTO-biblioteket identifieras som en specifik topp på 194 bp. Cell Ranger användes för demultiplexering, fastq-filgenerering och läsjustering som standardinställning. Seurat R-paket19 användes därefter för kvalitetskontroll och nedströmsanalyser.
Demultiplexering av snRNA-seq-data utfördes genom att identifiera HTO: er med hjälp av Seurats inbyggda demultiplexeringsstrategi. Den demultiplexerande förmågan för varje HTO visualiserades först med HTO-uttrycksfiler (Kompletterande figur S1). I värmekartan i figur 4A detekteras singlets som kärnor med specifikt HTO-uttryck, medan dubbletter och negativ visar ospecifikt uttryck av flera eller inga HTO. Observera att cirka 33% av kärnorna detekterades som negativa med hjälp av en 10 min HTO-antikroppsinkutionsmetod. Förlängning av inkubationstiden (steg 6.3) från 10 min till 30 min i ett efterföljande experiment avslöjade en anmärkningsvärd minskning av negativt märkta kärnor (kompletterande figur S2). Dessa resultat indikerar att förlängning av antikroppsinkubationstiden kan förbättra hashtag-effektiviteten.
Violindiagram i figur 4B-D visar antalet gener (nFeature_RNA), antalet unika molekylära identifierare (UMI) (nCount_RNA) och andelen mitokondriella antal (percent.mt) inom snRNA-seq-datasetet för att identifiera outliers och kärnor av låg kvalitet. Kärnor inkluderades endast i nedströmsanalys när följande kriterier var uppfyllda: i) nFeature_RNA > 500 och nCount_RNA < 20 000; ii) percent.mt < 5%; iii) den enskilda kärnan visade tydligt uttryck för en enda HTO. Antalet genuttryck normaliserades med standardmetoden i Seurat: 875 (2,71%) gener detekterades som mycket variabla gener (figur 4E). snRNA-seq GEX skalades, utfördes och armbågsdiagrammet användes för att bedöma inkluderingen av huvudkomponenter som skulle användas för nedströmsanalyser (figur 4F). Totalt ingick 18 datorer. Klustring utfördes med en upplösning på 0, 4.
Kärnorna grupperades och dimensionsreduktion (UMAP) utfördes för visualisering av de 12 enskilda klustren (figur 5A). Medianvärdet för antalet råa gener per kluster varierar mellan 991,5 och 4 586 (kompletterande figur S3A, B). Visualisering av uppdelningen av HTO-antikropparna inom UMAP avslöjar en tydlig fördelning av ganglier, vilket indikerar att alla kluster presenteras i varje ganglion (Figur 5B). För att validera noggrannheten i HTO-provsegregeringen bedömdes uttrycket av X Inactive Specific Transcript (Xist, uttryckt i den inaktiva kvinnliga X-kromosomen) för att identifiera de manliga proverna och de kvinnliga proverna (figur 5C). Xist-uttrycket var i enlighet med hashtag-märkningen, vilket visade att HTO 1-4-märkta prover var kvinnliga prover och HTO 5-8-märkta prover var manliga prover. Detta tyder på att den kuraterade HTO-märkningen är mycket specifik.
För att ytterligare verifiera kvaliteten och upplösningen av sekvenseringsdata med den nuvarande metoden undersöktes först några viktiga transkript av sympatiska neuroner. Resultaten visar närvaron av sympatiska neuroner som starkt uttrycker Th, Dbh och Snap25 i kluster 5 och 7 (figur 5D-F). Satellitgliala celler detekterades med uttrycket S100b i kluster 0-3 (figur 5G)20. Endotelceller detekterades i kluster 4 med ett högt uttryck av Pecam1 (figur 5H) och stromaceller i kluster 8 med ett högt uttryck av Acta2 (figur 5I). Dessa resultat stöder den framgångsrika kärnanfångningen av neuronala, satellitglittrande, endotel- och stromaceller i den sympatiska ganglionen med hjälp av snRNA-seq.
Figur 1: Dissektion av vuxna musöverlägsna cervikala ganglier och stellat ganglier. (B) För att underlätta visualisering användes en Wnt1Cre;mT/mG-mus. Asterisker indikerar SCG (eGFP+), pilspetsar indikerar förgrening av halspulsådern. Vänster panel, faskontrastbild; höger panel, fluorescerande bild. (C) Brightfield-bild av platsen för StG. (D) Asterisker indikerar StG (eGFP+), streckade linjer indikerar MCL. Vänster panel, faskontrastbild; höger panel, fluorescerande bild. (E) Dissekerade ganglier överförs till en petriskål separat för vidare rengöring under ett stereomikroskop. (F) Vänster panel, den dissekerade SCG med halspulsådern fortfarande fäst. Streckad kontur indikerar SCG. Höger panel, den dissekerade och rengjorda StG har formen av en inverterad triangel, vilket indikeras av den streckade konturen. Skalstreck = 1 000 μm. Förkortningar: SCG = överlägsna cervikala ganglier; StG = stellat ganglier; MCL = musculus colli longus; eGFP = förbättrat grönt fluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Arbetsflöde för provberedning och hashtag-färgningsbaserad multiplexering för snRNA-seq. Flödesschemat visar stegen från dissociationen av ganglioniska celler (orange), kärnisolering (blå) och hashtag-antikroppsfärgning och multiplexering (grön) som utförs för snRNA-seq. Förkortningar: FBS = fetalt bovint serum; ST-SB = ST-färgningsbuffert; snRNA-seq = enkärnig RNA-sekvensering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Kvalitetskontroll av kärnisolering och beredning av genuttrycksbibliotek. Kärnor indikeras med pilar. Skalstreck = 100 μm. (B) Bioanalyzer-resultat av 1st sträng cDNA (överst), GEX-bibliotek (mitten) och HTO-bibliotek (botten). Förkortningar: GEX = genuttryck; HTO = hashtag oligo. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Kvalitetskontroll av hashtag-oligomärkningseffektivitet och kvalitetskontroll av snRNA-seq. (B-D) Fioldiagram över kvalitetskontrollmått som visar antalet gener (nFeature_RNA, B); Antalet UMI (nCount_RNA, C). procentandelen mitokondriella räkningar (percent.mt, D). (E) Av de totalt 32 285 sekvenserade generna identifierades 875 (2,71%) som mycket variabla funktioner som visualiseras i spridningsdiagrammet. (F) Armbågsdiagram för datorer för att bestämma inkludering av sann signal som används för klustring. Förkortningar: snRNA-seq = enkärnig RNA-sekvensering; HTO = hashtag oligo; Datorer = huvudkomponenter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Representativa resultat av analysen av snRNA-seq. (B) UMAP-diagram som visualiserar fördelningen av de sammanslagna HTO-proverna. (C) Fiolplott som validerar kvinnliga samplingar (högt Xist-uttryck) efter demultiplexering. (D-I) UMAP-diagram som visar utvalda markörgener; klustren uttrycker starkt motsvarande gener som anges inom de röda cirklarna: D-F, sympatiska neuroner (Th, Dbh, Snap25); G) Satellitglittrande celler (S100b). (H) Endotelceller (Pecam1); (I) Stromalceller (Acta2). Förkortningar: snRNA-seq = enkärnig RNA-sekvensering; HTO = hashtag oligo; UMAP = enhetlig grenrörs approximation och projektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur S1: Kvalitetskontrollmått för ett representativt sekvenseringsresultat med en kärna. HTO-uttrycksprofiler för enskilda prover som visualiserar den demultiplexerande förmågan hos de använda hashtag-antikropparna. Förkortning: HTO = hashtag oligo. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S2: Värmekarta för HTO-uttryck för efterföljande prover inkuberade med HTO-antikroppar i 30 minuter. Jämförelse av antalet negativt märkta kärnor efter HTO-demultiplexering med figur 4A visar en markant förbättring av kärnmärkningen efter förlängning av antikroppskubationstiden. Förkortning: HTO = hashtag oligo. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S3: Median och kvantiler av genuttryck per kluster. (A) Medianvärdet för icke-nollrått genuttryck för varje kluster. (B) Beskrivande statistik över icke-nollrått genuttryck för varje kluster. Q1: 25:e percentilen, Q3: 75:e percentilen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskrivs ett detaljerat protokoll som fokuserar på i) dissektion av vuxna musöverlägsna cervikala och stellat sympatiska ganglier, ii) isolering och kryokonservering av de ganglioniska cellerna, iii) kärnisolering och iv) kärnbarkodning med HTO-märkning för multiplexeringsändamål och snRNA-seq.
Med detta protokoll kan sympatiska ganglioniska celler enkelt erhållas genom att dissociera enskilda ganglier med hjälp av vanligt trypsin och kollagenas. Långvarig bevarande av isolerade ganglioniska celler uppnås också lätt genom att frysa celler i FBS kompletterat med 10% DMSO, vilket visade en hög kvalitet på återhämtningen efter upptining. Dessutom, jämfört med konventionell encells RNA-sekvensering, har användningen av droppbaserad snRNA-seq av enstaka murina sympatiska ganglier i kombination med appliceringen av HTO-färgningsbaserad kärnbarkodning följande fördelar: i) prover kan bevaras under lång tid tills alla prover är redo för ytterligare kärnisolering; ii) kärnor av god kvalitet isolerade från flera små ganglier kan slås samman för sekvensering utan en batcheffekt orsakad av separerad provberedning; iii) förmågan att spåra det distinkta ganglioniska ursprunget efter sekvensering med hjälp av kärnstreckkoder; och iv) kostnadseffektivitet, eftersom endast en enda biblioteksberedning behövs. Viktigt är att det beskrivna isolerings- och cellodlingsprotokollet ger en enda enhetlig metod för både murina livmoderhals- och stellatganglier och är potentiellt tillämplig på andra ganglier, såsom dorsala rotganglier och andra arter, t.ex. mänskliga ganglier.
En av de stora fördelarna med scRNA-seq är förmågan att identifiera (nya) celltyper och att avslöja sällsynta cellpopulationer som inte kunde detekteras av bulk RNA-seq. Den droppbaserade scRNA-seq-plattformen underlättar infångning av fler celler. Det kan således ge en aggregerad bild av celltyperna (sub) och transkriptionell heterogenitet hos en stor cellpopulation jämfört med en plattbaserad sekvenseringsplattform. Den droppbaserade (t.ex. 10x Chromium) plattformen är dock inte lämplig för celler större än 50 μm, vilket begränsar dess tillämpning i stora celler såsom mänskliga neuroner (~ 100 μm). Tillgängligheten av snRNA-seq-tekniken övervinner denna nackdel på grund av den lilla storleken på en kärna. Dessutom är snRNA-seq en användbar metod för genuttrycksstudier av mycket sammankopplade och lågavkastande celler såsom neuroner och frysta vävnader.
Även om det är möjligt att direkt isolera kärnor från vävnader utan föregående celldissociation, var det fördelaktigt för utbytet att ta en tvåstegs kärnisoleringsmetod som först dissocierar ganglionen i enskilda celler (som kan bevaras i flytande kväve) följt av kärnisoleringen. På grund av den lilla storleken på en mus sympatisk ganglion fann man att fler kärnor erhölls med hjälp av en tvåstegs kärnisoleringsmetod än med en enstegs kärnisoleringsmetod. Kvalitetskontrollen av cDNA-, biblioteks- och sekvenseringsanalyserna indikerar god kärnor / RNA-kvalitet. Dessutom förbättras logistiken, eftersom prover kan samlas in och lagras vid olika tidpunkter före kollektiv sekvensering. Enkärnig analys avslöjade också framgångsrik återhämtning och infångning av neuroner och glialceller, vilket tyder på att den beskrivna tvåstegs kärnisoleringsmetoden kan vara bättre lämpad för applicering i små vävnader.
En annan fördel med detta protokoll är multiplexeringen med streckkodade antikroppar21. Musens sympatiska ganglion är en liten vävnad (medelstorlek 0,1 mm3), och det låga antalet celler som härrör från en enskild ganglion är otillräckligt för droppbaserad sekvensering i sig. Att slå samman flera ganglier av olika möss eller olika ganglier av samma mus kommer dock att orsaka förlust av antingen individuell musinformation eller individuell ganglioninformation. Som en lösning är HTO-färgningssteget enkelt att utföra och möjliggör streckkodsmärkning av kärnor som härrör från olika möss eller olika ganglier före kärnpoolning. Noggrannheten hos HTO-demultiplexering verifieras i detta protokoll genom matchat Xist-uttryck i kända kvinnliga kärnor. Kärnmultiplexering med streckkodade antikroppar minskar därför batcheffekter och sänker sekvenseringskostnaden.
En potentiell begränsning av snRNAseq kan vara att det kan finnas skillnader mellan RNA-sammansättningen i kärnan och cytoplasman på grund av den naturliga närvaron av begynnande transkript i kärnan, associerad med tidigt svar på neuronala aktiviteter22,23. Kärnan och cytoplasman kan också skilja sig åt i transkript beroende på cellcykeltillståndet24. Färre transkript upptäcktes i en enskild kärna (~ 7 000 gener) än i en cell (~ 11 000 gener)14. Därför kan scRNA-seq och snRNA-seq ge olika resultat på transkriptnivå. Ändå visade jämförelsen mellan scRNA-seq och snRNA-seq en liknande förmåga att diskriminera neuronala celltyper av hjärnvävnad14. För att förbättra diskrimineringen mellan mycket liknande celltyper eller subtyper av snRNA-seq kan fler kärnor behövas för att kompensera för den lägre gendetekteringsförmågan jämfört med scRNA-seq. Dessutom, även om noggrannheten i HTO-demultiplexering är tillräcklig, är förlusten av vissa data oundviklig eftersom inte alla kärnor visar HTO-specificitet. Ytterligare optimering av antikroppsinubationen kan minimera antalet kärnor med dubbelt eller negativt uttryck av HTO.
Sammantaget tillhandahåller detta protokoll det experimentella förfarandet för sekvensering av neuronala kärnor från sympatiska ganglier med hjälp av ett lätt att följa arbetsflöde som börjar från ganglionisolering till kärnberedning av låg inmatning av celler, följt av HTO-färgningsbaserad kärnmärkning för snRNA-seq. Protokollet ger en detaljerad översikt över alla viktiga steg som enkelt kan utföras och tillämpas på olika ganglier i murina och andra arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Susan L. Kloet (Institutionen för humangenetik, LUMC, Leiden, Nederländerna) för hennes hjälp med experimentell design och användbara diskussioner. Vi tackar Emile J. de Meijer (Institutionen för humangenetik, LUMC, Leiden, Nederländerna) för hjälpen med enkärnig RNA-isolering och biblioteksförberedelse för sekvensering. Detta arbete stöds av den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO) [016.196.346 till M.R.M.J.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals and reagents | |||
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 0.4% trypan blue dye | Bio-Rad | 1450021 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| B-27 | Gibco | A3582801 | |
| Collagenase type 2 | Worthington | LS004176 | use 1,400 U/mL |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 67685 | |
| Ethanol absolute ≥99.5% | VWR | VWRC83813.360 | |
| Fetal bovine serum (low endotoxin) | Biowest | S1810-500 | |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Cell wash buffer |
| DPBS (Ca2+, Mg2+free) | Gibco | 14190-169 | Cell wash buffer |
| Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | Nucleus Lysis buffer |
| Nonidet P40 Substitute (nonionic detergent) | Sigma-Aldrich | 74385 | Nucleus Lysis buffer |
| Nuclease free water (not DEPC-treated) | Invitrogen | AM9937 | Nucleus Lysis buffer |
| Protector RNase Inhibitor, 40 U/µL | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Nucleus Lysis buffer |
| Sodium Chloride Solution, 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | Nucleus Lysis buffer |
| Trizma Hydrochloride Solution, 1 M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | Nucleus Lysis buffer |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Nucleus wash |
| DPBS (Ca2+, Mg2+free) | Gibco | 14190-169 | Nucleus wash |
| Protector RNase Inhibitor,40 U/µL | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Nucleus wash |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | ST staining buffer (ST-SB) |
| Calcium chloride solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | ST staining buffer (ST-SB) |
| Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Nuclease free water (not DEPC treated) | Invitrogen | AM9937 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Sodium Chloride Solution, 5M | Sigma-Aldrich | 59222C | ST staining buffer (ST-SB) |
| Trizma Hydrochloride Solution, 1M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Tween-20 | Merck Millipore | 822184 | ST staining buffer (ST-SB) |
| TotalSeq-A0451 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 1 Antibody | Biolegend | 682205 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0452 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 2 Antibody | Biolegend | 682207 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0453 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 3 Antibody | Biolegend | 682209 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0461 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 11 Antibody | Biolegend | 682225 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0462 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 12 Antibody | Biolegend | 682227 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0463 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 13 Antibody | Biolegend | 682229 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0464 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 14 Antibody | Biolegend | 682231 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0465 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 15 Antibody | Biolegend | 682233 | Hashtag antibody |
| TruStain FcX (human) | Biolegend | 422302 | FC receptor blocking solution |
| Equipment and consumables | |||
| Bright-Line Hemacytometer | Merck | Z359629-1EA | |
| Centrifuge 5702/R A-4-38 | Eppendorf | EP022629905 | |
| CoolCell LX Cell Freezing Container | Corning | CLS432003-1EA | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 479-6840 | |
| DNA LoBind 0.5 mL Eppendorf tube | Eppendorf | EP0030108035-250EA | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30121872 | |
| Falcon 35 mm Not TC-treated Petri dish | Corning | 351008 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 10773501 | |
| Forceps Dumont #5 | Fine science tools | 11252-40 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine science tools | 14091-09 | |
| Ice Pan, rectangular 4 L Orange | Corning | CLS432106-1EA | |
| Leica MS5 | Leica | Microscope | |
| Moria MC50 Scissors | Fine science tools | 15370-50 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine science tools | 15012-12 | |
| Olympus CK2 ULWCD | Olympus | Microscope | |
| P10 | Gilson | F144802 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| P200 | Gilson | F123601 | |
| Preseparation Filters (30 µm) | Miltenyi biotec | Miltenyi biotec130-041-407 | |
| Shaking water bath | GFL | 1083 | |
| Silicon plate | RubberBV | 3530 | Dissection board |
| Software and packages | |||
| Cell ranger | V4.0.0 | ||
| R programming | V4.1.1 | ||
| R sudio | V1.3.1073 | ||
| Seurat | V4.0 | ||
| tydiverse | V1.3.1 | ||
| Animals | |||
| B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | JAX stock #022501 | |
| B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J mouse | The Jackson Laboratory | JAX stock #007576 | |
| C57BL/6J mice | Charles River | ||
| Code for the data analysis | |||
| https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE |
References
- McCorry, L. K.
- Li, C. -Y., Li, Y. -G. Cardiac sympathetic nerve sprouting and susceptibility to ventricular arrhythmias after myocardial infarction. Cardiology Research and Practice. 2015, 698368 (2015).
- Ajijola, O. A., et al. Extracardiac neural remodeling in humans with cardiomyopathy. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 5 (5), 1010 (2012).
- Nguyen, B. L., et al. Acute myocardial infarction induces bilateral stellate ganglia neural remodeling in rabbits. Cardiovascular Pathology. 21 (3), 143-148 (2012).
- Ajijola, O. A., et al. Remodeling of stellate ganglion neurons after spatially targeted myocardial infarction: Neuropeptide and morphologic changes. Heart Rhythm. 12 (5), 1027-1035 (2015).
- Han, S., et al. Electroanatomic remodeling of the left stellate ganglion after myocardial infarction. Journals of the American College of Cardiology. 59 (10), 954-961 (2012).
- Zeisel, A., et al. Molecular architecture of the mouse nervous system. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Svensson, V., Vento-Tormo, R., Teichmann, S. A. Exponential scaling of single-cell RNA-seq in the past decade. Nature Protocols. 13 (4), 599-604 (2018).
- Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26 (8), 967 (2016).
- Kokubun, S., et al. Distribution of TRPV1 and TRPV2 in the human stellate ganglion and spinal cord. Neuroscience Letters. 590, 6-11 (2015).
- Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communication. 10 (1), 2832 (2019).
- Petrany, M. J., et al. Single-nucleus RNA-seq identifies transcriptional heterogeneity in multinucleated skeletal myofibers. Nature Communication. 11 (1), 6374 (2020).
- Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. Journal of the American Society of Nephrology. 30 (1), 23-32 (2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), 0209648 (2018).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907 (2019).
- Zandstra, T. E., et al. Asymmetry and heterogeneity: part and parcel in cardiac autonomic innervation and function. Frontiers in Physiology. 12, 665298 (2021).
- Lewis, A. E., Vasudevan, H. N., O'Neill, A. K., Soriano, P., Bush, J. O. The widely used Wnt1-Cre transgene causes developmental phenotypes by ectopic activation of Wnt signaling. Developmental Biology. 379 (2), 229-234 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. bioRxiv. , (2018).
- Avraham, O., et al. Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons. Nature Communications. 11 (1), 4891 (2020).
- Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
- Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7 (1), 11022 (2016).
- Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).
- Grindberg, R. V., et al.
