Summary
Аллогенная пересадка кожи является стандартной модели для анализа хост Т-клеток ответы на MHC-антигенов разных доноров. Это видео-статья предусматривает визуальный учебник каждого шага, участвующих в выполнении BALB/c--> C57BL / 6 кожи трансплантации.
Abstract
Как один из самых строгих и наименее технически сложных моделей, пересадки кожи является стандартным методом для анализа хост Т-клеток ответы на MHC-антигенов разрозненных донора. Целью этого видео-статья является предоставление зрителю шаг за шагом, наглядной демонстрации пересадки кожи с помощью мыши модели. Протокол состоит из 5 основных компонентов: 1) заготовка донорской кожи, 2) подготовка получателя для трансплантации, 3) пересадка кожи, 4) снятие повязки и отторжение трансплантата мониторинга, 5) полезные советы. Как только опытными, сама процедура должна занять <10 мин для выполнения.
Protocol
До начала эксперимента:
- Получить одобрение IACUC
- Стерилизовать хирургических инструментов и Q-советы
И. Урожай донорской ткани
- Эвтаназии доноров мыши (в соответствии с SOP учреждения)
- Влажные волосы назад от основания уха с алкоголем
- Урожай донорской кожи, сокращая ухо у основания
- Место ткани в пластину на льду
- Сплит ухо: щепотку брюшной и спинной сторонах ткани у основания уха с крысами зуб щипцами, осторожно потяните за исключением тканей; плавать спинной ткани внутренней поверхности вниз, в ФСБ на льду; отказаться коллагеновых вентральной лоскут
II. Подготовка получателей для трансплантации
- Анестезию мыши с использованием утвержденных процедур
- Администрирование анальгетик для послеоперационной боли (например, 0,05-0,1 мг / г Bupernex ф)
- Наведите в боковом положении
- Выполните палец щепотку обеспечить животному достаточно седативные
- Мокрые волосы с алкоголем и бриться грудной клетки
- Протрите место в чистоте с тампоном, смоченным спиртом
III. Кожа трансплантации
- Сделать ~ 1 см разрез: палатка кожу крыс зуб щипцами и сократить ~ 0,25-0,5 см ниже щипцы
- Удалить донорской кожи от PBS, место на вершине трансплантата кровать (с внутренней поверхности уха кожи перед трансплантата кровать), и удалить избыток PBS стерильным Q-Tip
- Аккуратно обрежьте избыток кожи донора, так что пересадка лежит прямо в постели трансплантата (убедившись, что трансплантат края не свернулся под и, что трансплантат не похмелье на стволе кожи получателя)
- Оберните получателя в стерильную повязку (с неклейкой марли сегмент располагается над кожного лоскута)
- Убедитесь, что повязка не слишком плотно (оценка дыхания животного), а руки свободно мобильных
- Безопасные повязку с одного шва 2-0 шелковые
- Место животных в чистой клетке (при нагревании лампы пока животное достаточно оправилась от наркоза)
- Монитор получателя 1-2/day признаки дистресса и администрировать болеутоляющее при необходимости для облегчения боли
IV. Бинты удаления (6-7 дней после трансплантации)
- Анестезию мыши с использованием утвержденных процедур
- Вырезать и удалить шелковых шва
- Использование тупыми ножницами конца, аккуратно разрезать бинт (убедитесь, чтобы не нарушать трансплантата) и осторожно удалите
- Вернуться мышь чистить клетку
- Проверьте трансплантата ~ 8 часов после удаления повязки на наличие признаков струпьев или сокращения. Если присутствует, взяточничество, возможно, не удалось vascularize и должны рассматриваться как техническая неисправность.
- Монитор ежедневно на наличие признаков отторжения (как правило, определяется как ~ 80% некроз тканей донора)
- Аллогенных трансплантатов кожи, как правило, отвергают между d8-12 послеоперационной
В. Полезные советы
- Сбор донорской ткани близко к основанию уха будет: 1) максимального размера трансплантата, и 2) обеспечивают неравномерное вентральной навес, который будет способствовать расщеплению
- Всегда используйте новые лезвия для бритья получателя
- Если обезболивающее должно быть уделено IP, администрирование до пересадки процедура для минимизации послеоперационной обработки (минимизировать возможность срыва трансплантата)
- Если возможно, снимите перчатки перед применением повязку. Перчатки имеют тенденцию придерживаться повязку и осложнить применение
- Размещение одного шва на конец бинта позволит свести к минимуму досрочном освобождении
- Оберните бинт туго, как разрешается и оценить дыхание перед размещением шва. Если повязка слишком туго, животное остановится дыхание. Если повязка слишком свободно, животное будет его удалить.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Как показано в этом видео-статьи, модель кожи пересадка быстрый и простой метод для мониторинга аллогенных Т-клеточной реакции. Аллогенная пересадка кожи имеет широкий спектр применения и была использована для анализа эффективности различных иммуносупрессивных препаратов и терпимости индукции протоколов, а также для исследования биологических эффектов различных блокирующих антител.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
NIH иммунологии Обучение Грант T32 А.И. 60573 (КРП) и NIH грант GM 41514 (MDC)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-dissecting forceps (curved) | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Rat-tooth forceps (1x2 teeth, straight) | Fine Science Tools | 11053-10 | n=2 |
| Strabismus scissors (blunt end) | Fine Science Tools | 14074-11 | |
| Iris forceps (curved) | Fine Science Tools | 11065-07 | |
| Spring scissors (angled) | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Halsey micro needle holder | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| 10 cm plates | Corning | 430167 | |
| PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Bupernex (Buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser | 517201 | |
| Insulin syringes (29 Ga) | Monoject | 8881 600145 | |
| Q-tips | Solon Manufacturing Company | 362 | |
| Single edge razor blades (#9) | Smith & Nephew Inc. | 67-0238 | |
| Silk suture (2-0; PS-2) | Ethicon Inc. | 583H |
