Summary
Allogene huid transplantatie is een standaard model voor het testen van gastheer T-cel responsen aan MHC-ongelijksoortige donor antigenen. Deze video-artikel geeft een visuele handleiding van iedere stap die betrokken zijn bij het uitvoeren van een BALB/c--> C57BL / 6 huid transplantatie.
Abstract
Als een van de strengste en minst technisch uitdagende modellen, huid transplantatie is een standaard methode voor het testen van gastheer T-cel responsen aan MHC-ongelijksoortige donor antigenen. Het doel van deze video-artikel is om de kijker te voorzien van een stap-voor-stap visuele demonstratie van de huid transplantatie met de muis model. Het protocol is onderverdeeld in vijf hoofdonderdelen: 1) het oogsten van donorhuid, 2) het opstellen ontvanger voor transplantatie; 3) huid transplantatie; 4) bandage verwijdering en het toezicht op afstoting van het transplantaat; 5) nuttige tips. Eenmaal bedreven, moet de procedure zelf te nemen <10 min. uit te voeren.
Protocol
Voorafgaand aan de start van het experiment:
- Verkrijgen van goedkeuring IACUC
- Steriliseer chirurgische instrumenten en Q-tips
I. Harvest donorweefsel
- Euthanaseren donor muis (in overeenstemming met SOP instelling)
- Natte haar terug uit het oor met alcohol
- Oogst donorhuid door te snijden oor af aan de basis
- Plaats weefsel in plaat op ijs
- Split oor: knijp ventrale en dorsale zijde van het weefsel op de basis van het oor met de rat-tand tang; voorzichtig uit elkaar te trekken weefsel; zweven dorsale weefsel, inwendig oppervlak naar beneden, in PBS op ijs en schenk collagene ventrale klep
II. Bereid ontvanger voor transplantatie
- Verdoven muis met behulp van goedgekeurde procedure
- Beheren pijnstillende voor post-op pijnbestrijding (dat wil zeggen 0,05-0,1 mg / g Bupernex ip)
- Plaats de muis in de laterale positie
- Voer teen knijpen om ervoor te zorgen dier is voldoende verdoofd
- Natte haren met alcohol en scheren thorax
- Veeg gebied schoon met alcoholdoekje
III. Skin Transplant
- Maak ~ 1 cm incisie: tent huid met rat-tand tang en snijd ~ 0,25-0,5 cm onder tang
- Verwijder de donorhuid van PBS, plaats bovenop graft bed (met interne oppervlak van het oor de huid naar graft bed), en verwijder overtollig PBS met een steriele Q-tip
- Voorzichtig weg trimmen overtollige donorhuid, zodat de transplantatie ligt vlak binnen de graft bed (zorg ervoor dat de graft kanten zijn gekruld onder en dat de transplantatie niet kater op stam ontvanger huid)
- Wikkel ontvanger in steriel verband (met de niet-klevende gaasje segment geplaatst over de huidtransplantatie)
- Zorg ervoor dat de bandage niet te strak wordt (te beoordelen dier ademen) en dat de armen zijn vrij mobiel
- Veilige bandage met een 2-0 zijden hechtdraad
- Plaats van dieren in een schone kooi (onder verhitting lamp tot dier is voldoende hersteld van anesthesie)
- Monitor ontvanger 1-2/day op tekenen van nood en beheren pijnstiller nodig is voor pijnbestrijding
IV. Bandage Removal (6-7 dagen na transplantatie)
- Verdoven muis met behulp van goedgekeurde procedure
- Knippen en verwijder zijden hechtdraad
- Met behulp van stompe uiteinde een schaar, knip voorzichtig door bandage (zorg ervoor dat niet te enten verstoren) en verwijder voorzichtig
- Keer terug muis te reinigen kooi
- Controleer graft ~ 8 uur na het verwijderen bandage op tekenen van korstvorming of inkrimping. Indien aanwezig, kan transplantaat niet hebben vascularize en moet worden beschouwd als een technische storing.
- Monitor dagelijks op tekenen van afwijzing (meestal gedefinieerd als ~ 80% necrose van de donor weefsel)
- Allogene huidtransplantaties zal meestal weigeren tussen d8-12 na de operatie
V. Handige tips
- Oogsten donorweefsel dicht bij de basis van het oor wil: 1) te maximaliseren ent grootte, en 2) zorgen voor een ongelijke ventrale overhang dat zal vergemakkelijken splitsen
- Gebruik altijd een nieuw scheermesje voor het scheren ontvanger
- Als pijnstiller wordt gegeven ip, alvorens toe te dienen aan de procedure transplantatie aan post-op het hanteren een minimum te beperken (minimaliseren kans op het verstoren van de graft)
- Indien mogelijk, verwijder handschoenen voor het aanbrengen van het verband. Handschoenen hebben de neiging om het verband stok en de toepassing bemoeilijken
- Het plaatsen van een enkele hechting aan het verband einde zal minimaliseren voortijdige verwijdering
- Wrap bandage zo strak als is toegestaan en beoordelen van de ademhaling VOORDAT het plaatsen van hechtdraad. Als pleister te strak is, zal dier stoppen met ademen. Als bandage te los is, zal dier verwijderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zoals aangetoond in deze video-artikel, de huid transplantatie model is een snelle en eenvoudige methode voor de controle allogene T-cel responsen. Allogene huid transplantatie heeft een breed scala aan toepassingen en is gebruikt voor het testen van de efficiëntie van een verscheidenheid van immunosuppressiva en tolerantie-inductie-protocollen, evenals het onderzoeken van de biologische effecten van de verschillende blokkerende antilichamen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
NIH Immunologie Training Grant T32 AI 60.573 (KRG) en NIH subsidie GM 41.514 (MDC)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-dissecting forceps (curved) | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Rat-tooth forceps (1x2 teeth, straight) | Fine Science Tools | 11053-10 | n=2 |
| Strabismus scissors (blunt end) | Fine Science Tools | 14074-11 | |
| Iris forceps (curved) | Fine Science Tools | 11065-07 | |
| Spring scissors (angled) | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Halsey micro needle holder | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| 10 cm plates | Corning | 430167 | |
| PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Bupernex (Buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser | 517201 | |
| Insulin syringes (29 Ga) | Monoject | 8881 600145 | |
| Q-tips | Solon Manufacturing Company | 362 | |
| Single edge razor blades (#9) | Smith & Nephew Inc. | 67-0238 | |
| Silk suture (2-0; PS-2) | Ethicon Inc. | 583H |
