Summary
Hier beschreiben wir eine in vivo bildgebende Technik mittels optischer Kohärenztomographie, um die Diagnose und quantitative Messung der Retinopathie bei Mäusen zu erleichtern.
Abstract
Die optische Kohärenztomographie (OCT) bietet eine nichtinvasive Methode zur Diagnose der Retinopathie. Das OCT-Gerät kann Netzhautschnittbilder erfassen, aus denen die Netzhautdicke berechnet werden kann. Obwohl die OCT in der klinischen Praxis weit verbreitet ist, ist ihre Anwendung in der Grundlagenforschung nicht so verbreitet, insbesondere bei Kleintieren wie Mäusen. Aufgrund der geringen Größe ihrer Augäpfel ist es schwierig, Fundusbildgebungsuntersuchungen bei Mäusen durchzuführen. Daher ist ein spezielles Netzhautbildgebungssystem erforderlich, um die OCT-Bildgebung an kleinen Tieren zu ermöglichen. Dieser Artikel zeigt ein kleintierspezifisches System für OCT-Untersuchungsverfahren und eine detaillierte Methode zur Bildanalyse. Die Ergebnisse der retinalen OCT-Untersuchung von Vldlr-Knockout-Mäusen (Very-Low-Density Lipoprotein Receptor) und C57BL/6J-Mäusen werden vorgestellt. Die OCT-Bilder von C57BL/6J-Mäusen zeigten Netzhautschichten, während die von Vldlr-Knockout-Mäusen subretinale Neovaskularisation und Netzhautausdünnung zeigten. Zusammenfassend könnte die OCT-Untersuchung den nichtinvasiven Nachweis und die Messung von Retinopathie in Mausmodellen erleichtern.
Introduction
Die optische Kohärenztomographie (OCT) ist ein bildgebendes Verfahren, das in vivo hochauflösende und Querschnittsbildgebung für Gewebe 1,2,3,4,5,6,7,8 liefern kann, insbesondere für die nichtinvasive Untersuchung in der Netzhaut 9,10,11,12 . Es kann auch verwendet werden, um einige wichtige Biomarker wie die Netzhautdicke und die Dicke der retinalen Nervenfaserschicht zu quantifizieren. Das Prinzip der OCT ist die optische Kohärenzreflektometrie, die aus der Kohärenz des von einer Probe reflektierten Lichts Gewebequerschnittsinformationen erhält und diese über ein Computersystem in eine grafische oder digitale Form umwandelt7. OCT wird häufig in Augenkliniken als wesentliches Werkzeug für Diagnose, Nachsorge und Management von Patienten mit Netzhauterkrankungen eingesetzt. Es kann auch Einblicke in die Pathogenese von Netzhauterkrankungen geben.
Neben klinischen Anwendungen wurde OCT auch in Tierversuchen eingesetzt. Obwohl die Pathologie der Goldstandard der morphologischen Charakterisierung ist, hat die OCT den Vorteil der nichtinvasiven In-vivo-Bildgebung und der longitudinalen Nachsorge. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die OCT gut mit der Histopathologie in Retinopathie-Tiermodellenkorreliert ist 11,13,14,15,16,17,18,19,20. Die Maus ist das am häufigsten verwendete Tier in biomedizinischen Studien. Seine kleinen Augäpfel stellen jedoch eine technische Herausforderung für die Durchführung von OCT-Bildgebung bei Mäusen dar.
Im Vergleich zur OCT, die erstmals für die Netzhautbildgebung bei Mäusen verwendet wurde21,22, wurde die OCT bei Kleintieren nun hinsichtlich Hard- und Softwaresystemen optimiert. Zum Beispiel reduziert OCT in Kombination mit dem Tracker das Signal-Rausch-Verhältnis erheblich; System-Upgrades der OCT-Software ermöglichen die automatische Erkennung weiterer Netzhautschichten. und der integrierte DLP-Beamer hilft, die Bewegungsartefakte zu reduzieren.
Der Very-Low-Density-Lipoproteinrezeptor (Vldlr) ist ein Transmembranprotein in Endothelzellen. Es wird auf retinalen vaskulären Endothelzellen, retinalen Pigmentepithelzellen und um die äußere Grenzmembran23,24 exprimiert. Subretinale Neovaskularisation ist der Phänotyp von Vldlr-Knockout-Mäusen 23. Daher werden Vldlr-Knockout-Mäuse verwendet, um die Pathogenese und mögliche Therapie der subretinalen Neovaskularisation zu untersuchen. Dieser Artikel demonstriert die Anwendung der OCT-Bildgebung zur Erkennung von Netzhautläsionen bei Vldlr-Knockout-Mäusen, in der Hoffnung, eine technische Referenz für die Retinopathieforschung in Kleintiermodellen zu liefern.
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Protocol
Die Operationen wurden nach der Erklärung über die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung der Association for Research in Vision and Ophthalmology durchgeführt. Das Versuchsdesign wurde von der institutionellen Tierethikkommission (Medical Ethics Commission of JSIEC, EC 20171213(4)-P01) genehmigt. In dieser Studie wurden zwei Monate alte C57BL/6J-Mäuse und Vldlr-Knockout-Mäuse verwendet. Es gab 7 Mäuse in jeder Gruppe, die alle weiblich waren und 20 g bis 24 g wogen.
1. Versuchsbedingungen
- Ordnen Sie die Mäuse zwei Gruppen zu: einer experimentellen Gruppe, die aus Vldlr-Knockout-Mäusen besteht, und einer Kontrollgruppe, die aus C57BL/6J-Mäusen besteht.
- Füttern Sie die Mäuse konventionell mit Futter und Wasser.
- Aufziehen der Mäuse im Tierlabor unter stabilen Bedingungen von Raumtemperatur (22 °C), Luftfeuchtigkeit (50-60%), Hell-Dunkel-Zyklus (12 h-12 h) und Raumlichtintensität (350-400 Lux).
- Vorbereitung der experimentellen Ausrüstung: optische Kohärenztomographie mit konfokalem Scanning-Laserophthalmoskop (cSLO) für Kleintiere (Abbildung 1A).
- Bereiten Sie alle für das Experiment erforderlichen Materialien vor (Abbildung 1B) und wiegen Sie die Mäuse (Abbildung 1C).
2. Informationsunterlagen
- Notieren Sie die Informationen: Gruppe, Code, Geburtsdatum, Alter, Geschlecht, Gewicht und Anästhesiedosierung.
3. Inbetriebnahme und Testen des Instruments
- Schalten Sie den Computer ein und starten Sie die Software.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Testprogramm, um das Testprogramm abzuschließen.
- Schalten Sie den Thermostat ein und heizen Sie ihn auf die Temperatur von 37 °C vor.
- Starten Sie das OAT-Modul nach dem Programmtest.
- Erstellen Sie einen neuen Betreff und füllen Sie die Mausinformationen aus.
- Heizen Sie die Heizdecke vor und decken Sie sie mit OP-Handtüchern ab.
4. Anästhesie
- Verwenden Sie lyophilisiertes Anästhesiepulver, das Tiletamin und Zolazepam enthält, um die Anästhesiemischung herzustellen.
HINWEIS: Befolgen Sie die Empfehlungen der örtlichen Tierethikkommission für die Auswahl, Dosierung und den Weg der Anästhesieverabreichung. Betäuben Sie das Tier mit einem Anästhetikum, das für mindestens 1 Stunde für Immobilität und Verlust der Schmerzwahrnehmung sorgt, wonach sich das Tier schnell erholt. Die Dosierung sollte auf der Länge der Experimentzeit, dem Tiergewicht und anderen Faktoren basieren. - Betäuben Sie das Tier mit der vorbereiteten Anästhesiemischung. Stellen Sie sicher, dass das Tier während des gesamten Verfahrens bis zur Genesung warm bleibt.
5. Anwendung von mydriatischen Tropfen
- Erreichen Sie eine manuelle Zurückhaltung der Maus durch den Scruff, lassen Sie den Augapfel leicht hervorstehen und drehen Sie den Mauskopf mit einem Auge nach oben.
- Tragen Sie die mydriatischen Tropfen auf, um die Pupillen zu erweitern (Abbildung 2A).
- Überprüfen Sie die Pupillenerweiterung nach 10 min.
6. Platzierung der Maus
- Legen Sie eine Maus auf eine Heizdecke.
- Beschichten Sie beide Augen mit medizinischem Natriumhyaluronat-Gel (Abbildung 2B).
- Schrauben Sie eine doppelte sphärische 60-D-Linse (voreingestellte Linse) auf das cSLO-Gerät (Abbildung 1A-5, 6).
- Legen Sie eine 100 D Kontaktlinse auf die Maushornhaut, wobei die konkave Seite das Natriumhyaluronat-Gel auf der Hornhautoberfläche berührt (Abbildung 2C, D und Abbildung 3A-II).
- Platzieren Sie die Maus auf der kleinen Tierplattform mit konstanter Temperatur, und halten Sie das Auge 1 bis 2 mm vom Objektiv des cSLO-Geräts entfernt (Abbildung 3A).
- Stellen Sie den Winkel der Kontaktlinse mit einer Pinzette ein, um die Pupille in der Mitte der Linse zu halten.
- Passen Sie die Einstellungen am Kopf an, damit das Auge geradeaus zeigt.
7. Konfokales Scanning-Laser-Ophthalmoskop (cSLO)
- Klicken Sie auf die Schaltfläche OAT , wählen Sie das Mausmodul aus, und starten Sie das cSLO-Programm (Abbildung 4B).
- Wählen Sie den IR-Modus (Lichtquelle: rotes Licht) und passen Sie den Parameter an (Bereich: 2047, Abbildung 4D).
- Wählen Sie das zu untersuchende Auge aus (rechtes Auge: Abbildung 4C-1; linkes Auge: Abbildung 4C-2).
- Steuern Sie den Hebel und bewegen Sie die voreingestellte Linse langsam in Richtung Kontaktlinse.
- Stellen Sie den Dioptrienwert ein, bis die hintere Polbildgebung klar ist (Abbildung 4E).
- Nehmen Sie weitere Anpassungen vor, um das Bild des retinalen hinteren Pols auszurichten und ihn am Sehnervenkopf zu zentrieren.
8. Optische Kohärenztomographie (OCT)
- Starten Sie das OAT-Programm (Abbildung 4G).
- Klicken Sie auf den Statusbalken nach oben und unten, bis das OAT-Bild angezeigt wird (Abbildung 4H).
- Passen Sie die Parameter an: Bereich Min (Abbildung 4I) = 0-20, Bereich Max (Abbildung 4J) = 40-60.
- Passen Sie den voreingestellten Objektivabstand und die Positionsrichtung an, bis ein ideales OAT-Bild erhalten wird.
- Wählen Sie die Scanposition aus, indem Sie die Standardzeile im cSLO verschieben (Abbildung 4M).
- Beginnen Sie mit dem Scannen vom Sehnervenkopf.
- Sammeln Sie Bilder in der gleichen Reihenfolge für jedes Auge: horizontale Linie: Sehnervenkopf → überlegen → minderwertig; vertikale Linie: Sehnervenkopf → nasal → temporal.
- Sammeln Sie Bilder aus vier Richtungen.
- Klicken Sie auf Mittelwert, um die cSLO- und OAT-Bildsignale zu überlagern (Abbildung 4F und Abbildung 4O).
- Klicken Sie auf die Aufnahmeschaltfläche , um das SLO-OCT-Bild aufzunehmen (Abbildung 4P).
- Speichern und exportieren Sie alle Bilder (Abbildung 4Q, R).
9. Das Ende des Experiments (nach der OCT-Untersuchung)
- Legen Sie die Maus auf die Heizdecke, um sie warm zu halten, bis sie aufwacht.
HINWEIS: Die Maus sollte überwacht werden, bis sie wieder ein ausreichendes Bewusstsein erlangt, um die sternale Liege aufrechtzuerhalten. Die postoperative Exposition gegenüber hellem Licht sollte minimiert werden. - Entfernen Sie die Kontaktlinse 100 D.
- Tragen Sie das Levofloxacin-Augengel auf, um die Hornhaut zu schützen.
- Setzen Sie die Maus nach dem Aufwachen wieder in den Käfig.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die untersuchte Maus nicht in die Gesellschaft anderer Mäuse zurückgebracht wird, bis sie vollständig genesen ist. - Schalten Sie die Software aus und schalten Sie den Computer aus.
- Reinigen Sie die Kontaktlinse 100 D mit Wasser; Trocknen Sie die Linse.
- Reinigen und desinfizieren Sie die Umgebung.
10. Bildanalyse
- Vergleichen Sie die OCT-Bilder von Vldlr-Knockout-Mäusen mit denen von C57BL/6J-Mäusen.
- Beobachten Sie mehrere Positionen: vertikale und horizontale Scans, die durch die optische Papille verlaufen; überlegene, minderwertige, nasale und zeitliche Scans; und abnormale Reflexionsstellenscans.
- Beobachten Sie die Dicke, Form, Schichtung und abnormale Reflexionsläsionen der Netzhaut in jedem Bild sowie die Glaskörperschnittstelle der Netzhaut und des Glaskörpers.
- Notieren Sie die Orte, Merkmale und Anzahl der Läsionen.
11. Korrektur der Netzhautschichtung
- Klicken Sie auf der OAT-Benutzeroberfläche auf Load Examination (Prüfung laden) (Abbildung 5A).
- Rufen Sie die OAT-Bilder einer Maus aus einem Popupfenster auf.
- Bilder auswählen: Scannen von OAT-Bildern durch die optische Papille, horizontal oder vertikal.
- Doppelklicken Sie auf das Bild im Mediencontainer , um es auf dem Bildschirm anzuzeigen (Abbildung 5C).
- Klicken Sie auf Layer Detection (Ebenenerkennung ), um die automatische Schichtung auf der Netzhaut abzuschließen (Abbildung 5D).
- Wählen Sie die Trennlinien auf beiden Seiten der für die Analyse vorbereiteten Schicht aus (Abbildung 6D-10).
- Wählen Sie eine separate Trennlinie aus (Abbildung 6B-6), und klicken Sie auf Edit Layer (Layer bearbeiten) (Abbildung 6A-1), um die Linie zu aktivieren, wenn ein roter Kreis angezeigt wird (Abbildung 6B-7).
- Passen Sie den Abstand (Abbildung 6A-4, z. B. 50) und den Grenzbereich (Abbildung 6A-5, z. B. 50) an.
- Ändern Sie die Trennlinie, indem Sie den roten Kreis verschieben (vergleichen Sie die grüne Trennlinie in Abbildung 6B und Abbildung 6C; Abbildung 6C zeigt das modifizierte Ergebnis).
12. Netzhautlaminierungsdicke
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Measure Marker (Marker messen) (Abbildung 6D-9).
- Wählen Sie die Trennlinie der zu analysierenden Schicht aus (z. B. wählen Sie in der äußeren Kernschicht die 4. und 5. Trennlinie in der Liste aus), um die Begrenzung der Schicht auf dem OCT-Bild anzuzeigen (Abbildung 6D-10).
- Wählen Sie Connect with Layer (Mit Layer verbinden) (Abbildung 6D-11) und Stay Connected on Move (Bei Bewegung verbunden bleiben) (Abbildung 6D-12).
- Wählen Sie den Bereich aus, in dem die Ergebnisse angezeigt werden sollen (die ausgewählte Spalte ist farbig, Abbildung 6D-13).
- Klicken Sie auf die zu analysierende Position im OAT-Bild, damit die Messlinie angezeigt wird (senkrecht zur horizontalen Achse und konsistent mit der Farbe des resultierenden Bereichs) (Abbildung 6D-14).
- Klicken Sie auf die nächste Spalte für die nächste Messung und zeigen Sie die vorherigen Daten an (Abbildung 6E-15).
- Lesen Sie den Vert-Wert (Dicke der gemessenen Position) in der Zeile Länge in μm (Gewebe) ab (Abbildung 6E, rotes Rechteck).
- Klicken Sie auf Delete Marker (Delete Marker (Abbildung 6E-16) und New Marker (Abbildung 6E-17), um erneut zu testen, damit die Ergebnisse die Originaldaten abdecken (falls eine erneute Messung erforderlich ist).
- Drücken Sie Print Scr auf der Tastatur, um Screenshots zu speichern, oder klicken Sie auf Save Examination (Untersuchung speichern), um direkt zu speichern (Abbildung 5H).
- Geben Sie die Daten zur statistischen Analyse in eine Tabellenkalkulation oder Statistiksoftware ein.
13. Messung der vollen Netzhautdicke
- Wählen Sie Zeile 1 (ILM, innere Begrenzungsmembran, Abbildung 7B) und Zeile 7 (OS-RPE, OS: äußere Photorezeptorsegmente; RPE: retinale Pigmentepithelschicht, Abbildung 7C) in der Liste in der oberen rechten Ecke.
HINWEIS: Die volle Netzhautdicke bedeutet die Dicke der retinalen Neurepithelschicht, die die Netzhaut zwischen ILM und OS-RPE auf OCT ist). - Messen Sie die Netzhautdicke auf beiden Seiten der optischen Papille in einem bestimmten Intervall.
- Zum Beispiel: Messen Sie aus dem Aussehen der Netzhautstruktur am Rand der optischen Papille 4 Werte mit einem Abstand von 200 μm des horizontalen Lineals (Abbildung 7G, H).
- Notieren Sie alle Messwerte in einer Tabelle.
- Verwenden Sie mehrere t-Tests (einen pro Zeile), um die Messwerte jeder entsprechenden Position in beiden Gruppen zu vergleichen.
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Representative Results
Dank der hochauflösenden Scans von OCT können die Schichten der Netzhaut der Maus beobachtet und abnormale Reflexionen und deren genaue Positionen identifiziert werden. Die retinalen OCT-Bilder von Vldlr-Knockout-Mäusen und C57BL/6J-Mäusen wurden in dieser Studie verglichen. Die OCT-Bilder aller C57BL/6J-Mäuse zeigten verschiedene Netzhautschichten mit unterschiedlicher Reflektivität, und die Abgrenzung war klar (Abbildung 8D). Im Gegensatz dazu zeigten alle Vldlr-Knockout-Mäuse abnormale, hyperreflektierende Läsionen auf den OCT-Bildern (Abbildung 8B).
Incomplete Glaskörperablösung (PVD) in Vldlr-Knockout-Mäusen
Die OCT-Ergebnisse zeigten einige mittlere reflektierende Bänder auf den Netzhautoberflächen von Vldlr-Knockout-Mäusen (Abbildung 8B, rote Pfeile). Diese mittleren reflektierenden Bänder hafteten am Netzhautgefäß (Abbildung 8B, grüner Pfeil), entsprechend dem cSLO-Bild (Abbildung 8A, grüner Pfeil). Diese Merkmale stimmen mit den OCT-Merkmalen der unvollständigen Glaskörperablösung überein.
Subretinale Neovaskularisation bei Vldlr-Knockout-Mäusen
Die Ergebnisse zeigten, dass die subretinale Neovaskularisation bei den Vldlr-Knockout-Mäusen zwei Entwicklungsmodi aufwies.
Unter Beteiligung der äußeren Kernschicht
Eine hyperreflektierende Läsion mit einer dreieckigen Form von unten nach unten auf dem OCT-Bild erschien auf dem subretinalen Raum und breitete sich auf die äußere Kernschicht aus. Die Läsion durchbrach die äußere plexiforme Schicht nicht (Abbildung 8B, weißer Pfeil).
Das OCT-Auftreten dieser Art der subretinalen Neovaskularisation stimmte mit den in Abbildung 9A gezeigten pathologischen Befunden überein. Der pathologische Abschnitt zeigte, dass die Neovaskularisation (Abbildung 9A, dicker grüner Pfeil) das RPE, die inneren / äußeren Segmente des Photorezeptors (IS/OS) und die externe limitierende Membran (ELM) durchbrach. Es drang in die äußere Kernschicht (ONL) ein, durchbrach aber nicht die äußere plexiforme Schicht (OPL).
Ohne Beteiligung der äußeren Kernschicht
Auf dem OCT-Bild, das sich im subretinalen Raum befand, erschien ein Band hyperreflektierender Läsionen (Abbildung 8B, gelber Pfeil). Das cSLO-Bild zeigte die entsprechende Position (Abbildung 8A, gelber Pfeil). Die zusätzlichen Scans der Netzhaut um diese Stelle (Abbildung 8A, gelber Pfeil) zeigten die gleichen Ergebnisse.
In Übereinstimmung mit der Läsion (Abbildung 10A, dicker blauer Pfeil) im pathologischen Abschnitt durchbrach diese subretinale Neovaskularisation das ELM nicht (Abbildung 10A, dünner gelber Pfeil), sondern betraf teilweise den Photorezeptor IS/OS.
Ergebnisse der Netzhautdicke
Die Netzhautdicke des rechten Auges aller Mäuse wurde mit der automatischen Schichtungs- und Dickenmessfunktion von OCT ermittelt. Die Netzhautdicke von Vldlr-Knockout-Mäusen (200,94 ± 14,64 μm) war signifikant niedriger als die von C57BL/6J-Mäusen (217,46 ± 10,21 μm, P < 0,001, t-Test, 7 rechte Augen/Gruppe). Der Vergleich der Netzhautdicke in den vier Richtungen (temporal, nasal, superior und inferior) der posterioren Polarlinie zwischen den beiden Gruppen ist in Abbildung 11 dargestellt.
Abbildung 1: Vorbereitung von Versuchsmaterialien und Tieren. (A) Ausrüstung: 1. cSLO/OCT-Gerät für die Netzhautbildgebung von Kleintieren, 2. Computer und Monitor, 3. Kleine Tierplattform mit konstanter Temperatur, 4. Thermostat, 5. voreingestellte Linse, 6. Installation der voreingestellten Linse. (B) Arzneimittel und kleine Gegenstände: I. Povidon-Jod, II. Mikrospritze, III. Anästhesiemischungslösung, IV. Timer, V. mydriatische Augentropfen, VI. Pinzette, VII. medizinisches Natriumhyaluronat-Gel, VIII. medizinisches Wattestäbchen, IX. antibiotische Augensalbe, X. 100 D Kontaktlinse (zwei). (C) Gewichtsmessung auf einer digitalen Waage. Abkürzungen: cSLO = konfokales Scanning-Laser-Ophthalmoskop; OCT = optische Kohärenztomographie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Vorbereitung vor OCT-Untersuchung von Mäusen . (A) Mydriasis-Augentropfen-Anwendung, (B) Natriumhyaluronat-Gel-Beschichtung auf der Hornhaut, (C, D) Platzierung einer 100 D Kontaktlinse, mit konkaver Oberfläche Kontakt zur Hornhaut. Abkürzung: OCT = optische Kohärenztomographie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: OCT-Untersuchungsverfahren . (A) Platzierung der Mausposition, I. voreingestellte Linse, II. Kontaktlinse, III. Kleine Tierplattform mit konstanter Temperatur. (B) Bedienung des cSLO/OCT-Geräts, IV. Betätigungshebel, V. Kipphebel, VI. cSLO-Gerät. Abkürzungen: cSLO = konfokales Scanning-Laser-Ophthalmoskop; OCT = optische Kohärenztomographie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: OCT-Bildgebungsverfahren. A. Messmodus , B. Start Laser des IR-Lasers, C. Augenauswahl (C-1-OD; C-2-OS), D. Bereich des IR-Lasers, E. die Dioptrien, F. Überlagerung des cSLO-Bildes, G. OCT-Scanning-Start/Stopp-Lasertaste H. Referenz des OCT-Bildes, I. Bereich Min: 0-20, J. Reichweite Max: 50-60, K. Signalintensität des Bildes, L. Abtastrichtung (z. B. vertikaler Scan), M. Scanposition durch Verschieben der grünen Referenzlinie ausgewählt (z. B. vertikaler Scan durch die optische Papille), N. Echtzeitanzeige des OCT-Bildes, O. Überlagerung des OCT-Bildes, P. Shot: Bildaufnahme, Q. SLO-OCT-Bilder, die aufgenommen wurden, R. Prüfung speichern: Speichern des Untersuchungsergebnisses. Maßstabsbalken = 200 μm. Abkürzungen: cSLO = konfokales Scanning-Laser-Ophthalmoskop; OCT = optische Kohärenztomographie; IR = Infrarot; OD = rechtes Auge; OS = linkes Auge. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Automatische Netzhautdelaminationsschnittstelle auf dem OAT-System . A. Schaltfläche " Untersuchung laden ", B. Medienbehälter mit allen OAT-Bildern, C. OCT-Bild, das für die Analyse ausgewählt wird, D. Schaltfläche " Layer-Erkennung " für automatisches Netzhautschichten, E. Trennlinienliste, F. automatische Delaminierung auf der Netzhaut, G. Schaltfläche "Ebene bearbeiten " für Schichtkorrektur, H. Prüfung speichern zum Speichern der Ergebnisse. Maßstabsbalken = 200 μm. Abkürzung: OCT = optische Kohärenztomographie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Schichtkorrektur (A-C) und Dickenmessung (D-E). (A) Layered Edit Aktivierungsschnittstelle: 1. Schaltfläche "Ebene bearbeiten", 2. Trennlinienliste (z.B. Auswahl aller Linien), 3. aktivierte Trennlinien, 4. Abstandsanpassung, 5. Einstellung des Grenzbereichs. (B) Aktivierung einer Trennlinie (z. B. Zeile 3 in A), 6. Linie 3, die Linie zwischen der inneren plexiformen Schicht und der inneren Kernschicht, 7. Ein Beispiel für einen Layering-Fehler. (C) Änderung des Layering-Fehlers, 8. Der rote Kreis zur Änderung. (D) Ein Beispiel für die Messung der Netzhautlamellendicke, 9. Schaltfläche "Marker messen", 10. Trennlinien der äußeren Kernschicht, 11. Mit Schicht verbinden (die Messung verbindet sich mit der Schicht gemäß den Trennlinien), 12. Bleiben Sie bei Bewegung verbunden (die Messposition ist der Ort, an dem der manuelle Klick bleibt), 13. Die Position der Ergebnisanzeige, 14. die Messlinie (senkrecht zur horizontalen Achse). (E) Erfassung der Messergebnisse, 15. die Messergebnisse (rotes Rechteck: Vert-Wert ist das Dickenergebnis), 16. Schaltfläche "Marker löschen" zum Löschen des Messdatensatzes, 17. Neue Marker-Schaltfläche zur Neumessung (das neue Ergebnis überschreibt den ursprünglichen Datensatz). Maßstäbe = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Messung der vollen Netzhautdicke. A. Marker-Schaltfläche messen, B. Zeile 1 (ILM) und C. Zeile 7 (OS-RPE) zur Anzeige der Grenzen der Netzhaut in voller Dicke, D. Mit Ebenenauswahl verbinden, E. Bei Bewegung verbunden bleiben, F. Linealleiste (vertikale und horizontale Linealbalken, beide 200 μm lang), G. Messlinien auf der Netzhaut (4 Linien mit 200 μm horizontaler Lineallänge als Abstand auf jeder Seite von B. die optische Papille), H. die Messergebnisse (die Ergebnisse werden durch verschiedene Farben unterschieden und entsprechen der Farbe der Messlinien auf der Netzhaut), I. Datenextraktion aus dem Vert-Wert in der Zeile Länge in μm (Gewebe). Maßstabsbalken = 200 μm. Abkürzungen: ILM = innere begrenzende Membran; OS-RPE = Photorezeptor äußeres Segment des retinalen Pigmentepithels. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 8: Vergleich von cSLO- und OCT-Bildern von Vldlr-Knockout- und C57BL/6J-Mäusen. cSLO (A) und OCT (B) Bilder von Vldlr Knockout-Mäusen im Vergleich zu den cSLO (C) und OCT (D) Bildern von C57BL/6J Mäusen. Merkmale der OCT bei Vldlr-Knockout-Mäusen (B): 1) Mittlere reflektierende Linie (B, rote Pfeile) auf der inneren Oberfläche der Netzhaut mit Adhäsion am Netzhautgefäß (B, grüner Pfeil). 2) Hyperreflektierende Läsionen, die sich im subretinalen Raum befinden, mit (B, weißer Pfeil) oder ohne (B, gelber Pfeil) Beteiligung der äußeren Kernschicht. Die Pfeile auf dem cSLO-Bild (A) stellen die Positionen der entsprechenden Farbpfeile auf dem OAT-Bild (B) dar. Maßstabsbalken = 200 μm. Abkürzungen: cSLO = konfokales Scanning-Laser-Ophthalmoskop; OCT = optische Kohärenztomographie; Vldlr = very-low-density lipoprotein receptor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 9: Modus 1: retinale Paraffinschnitte mit Hämatoxylin-Eosin-Färbung in Vldlr-Knockout und C57BL/6J-Maus. (A) Ein Beispiel für eine subretinale Neovaskularisation, die in die äußere Kernschicht eindringt (dicker grüner Pfeil), der sich im mittleren Teil der Netzhaut einer Vldlr-Knockout-Maus befindet. (B) Normale Steuerung, der mittlere Teil der Netzhaut einer C57BL/6J-Maus. Maßstabsbalken = 50 μm. Abkürzungen: Vldlr = very-low-density lipoprotein receptor; ILM = innere begrenzende Membran; NFL = retinale Nervenfaserschicht; GCL = retinale Ganglienzellschicht; IPL = innere plexiforme Schicht; INL = innere Kernschicht; OPL = äußere plexiforme Schicht; ONL = äußere Kernschicht; ELM = externe Begrenzungsmembran; IS = Photorezeptor inneres Segment; OS = äußeres Segment des Photorezeptors; RPE = retinale Pigmentepithelschicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 10: Modus 2: retinale Paraffinschnitte mit Hämatoxylin-Eosin-Färbung in Vldlr-Knockout und C57BL/6J-Maus. (A) Ein Beispiel für eine subretinale Neovaskularisation ohne Beteiligung der äußeren Kernschicht (dicker blauer Pfeil) und mit intaktem ELM (dünner gelber Pfeil), das sich in der mittleren Peripherie der Netzhaut bei einer Vldlr-Knockout-Maus befindet. (B) Normale Steuerung, die mittlere Peripherie Netzhaut einer C57BL/6J Maus. Maßstabsbalken = 50 μm. Abkürzungen: VLDR = very-low-density lipoprotein receptor; ILM = innere begrenzende Membran; NFL = retinale Nervenfaserschicht; GCL = retinale Ganglienzellschicht; IPL = innere plexiforme Schicht; INL = innere Kernschicht; OPL = äußere plexiforme Schicht; ONL = äußere Kernschicht; ELM = externe Begrenzungsmembran; IS = Photorezeptor inneres Segment; OS = äußeres Photorezeptorsegment; RPE = retinale Pigmentepithelschicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 11: Vergleich der Netzhautdicke zwischen C57BL/6J-Mäusen und Vldlr-Knockout-Mäusen (alle Daten vom rechten Auge). (A) Netzhautdicke (μm) durch die Sehnervenpapille durch horizontales OCT-Scannen. (B) Netzhautdicke (μm) durch die Sehnervpapille durch vertikales OCT-Scannen. Die horizontale Koordinate stellt die Messpositionen mit einem Abstand von 200 μm dar.*: P < 0,05, **: P < 0,01, ***: P < 0,001. Abkürzungen: T = Temporal; P = Optische Papille; N = Nasal; S = Überlegen; I = minderwertig; OCT = optische Kohärenztomographie; VLDR = Very-Low-Density-Lipoproteinrezeptor; OD = rechtes Auge. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
In dieser Studie wurde die OCT-Bildgebung mit einem kleintierischen Netzhautbildgebungssystem angewendet, um Netzhautveränderungen bei Vldlr-Knockout-Mäusen zu bewerten, die eine unvollständige hintere Glaskörperablösung, subretinale Neovaskularisation und Netzhautdickenverdünnung zeigen. OCT ist ein nichtinvasives bildgebendes Verfahren, um den Zustand der Netzhaut in vivo zu untersuchen. Die meisten OCT-Geräte sind für die Untersuchung des menschlichen Auges konzipiert. Die Größe der Hardwareausstattung, die Einstellung der Brennweite, die Einstellung der Systemparameter und die Positionierungsanforderungen des Prüflings richten sich nach dem menschlichen Auge. Änderungen der Linsen- und Systemeinstellungen sind erforderlich, um Kleintiere mit humanspezifischen OCT-Geräten zu untersuchen. In diesem Beitrag werden OCT-Untersuchungsverfahren für Kleintiere vorgestellt.
Die Brennweite ist beim Scannen verschiedener Kleintiere mit unterschiedlich großen Augäpfeln unterschiedlich. Dieser Unterschied in der Brennweite ist kritisch und muss behoben werden, um klare und genaue Fundusbilder zu erhalten. Eine effektive Methode ist der Ersatz der Objektivlinse durch Linsen mit unterschiedlichen Krümmungen. Aufgrund ihres kleinen Augapfels benötigt die Maus neben der doppelt kugelförmigen 60 D Preset-Linse der OCT-Geräte eine Kontaktlinse von 100 D vor der Hornhaut.
Das OCT kann nur Zeilenscans liefern, die nur einen begrenzten Bereich der Netzhaut abdecken. Daher ist es wichtig, das Protokoll der OCT-Scans für den qualitativen und quantitativen Vergleich von OCT-Befunden in verschiedenen Gruppen zu standardisieren. Hier wurden drei horizontale und drei vertikale Scans durchgeführt. Dieses System liefert ein cSLO-Echtzeit-Image zur Überwachung der Position des OAT-Scans, sodass die Position des Scans genau und bequem angepasst werden kann. Zusätzliche Scans können hinzugefügt werden, wenn eine abnormale Reflexion gefunden wird.
Die Parameter der Bildaufnahme müssen sorgfältig angepasst werden. Hier wird empfohlen, dass der Bereich Min 0-20 und der Bereich Max 50-60 beträgt (Abbildung 4I, J). Wenn die Parameter übereingestellt werden, wird der Signalkontrast des Bildes erhöht, und das reflektierte Signal der Netzhaut mit geringer Reflexion wird niedriger oder sogar schwarz, und einige morphologische Informationen gehen verloren.
Im Folgenden finden Sie einige Tipps, um eine Verschlechterung der Bildqualität zu vermeiden: 1. Legen Sie unmittelbar nach der Narkose eine Kontaktlinse vor die Augen, um Katarakte zu vermeiden; 2. Stellen Sie sicher, dass die voreingestellte Linse und Kontaktlinse sauber sind. 3. Vermeiden Sie, dass Haare zwischen die Hornhaut und die Kontaktlinse gelangen. 4. Stellen Sie sicher, dass Doppler, Kontrast und Helligkeit in den OAT-Parametern entsprechend eingestellt sind.
Die OCT-Bilder können verwendet werden, um Läsionen qualitativ zu erkennen und Metriken wie die Netzhautdicke quantitativ zu messen. Hier wird eine Methode vorgeschlagen, um die Netzhautdicke an mehreren Stellen zu messen, und der Durchschnitt kann als mittlere Netzhautdicke berechnet werden. Dies wird durch die automatische Schichtungsfunktion des OCT-Systems erreicht. Daher kann auch die Dicke der Netzhautlaminierungen gemessen werden. Die Messmethode ist einfach und genau (Abbildung 6 und Abbildung 7). Die Ergebnisse zeigten, dass die Netzhautdicke bei Vldlr-Knockout-Mäusen niedriger war als bei C57BL/6J-Mäusen, was mit der Literatur übereinstimmt25. Der Unterschied in der Netzhautdicke zwischen den beiden Gruppen kann durch eine Grafik deutlich dargestellt werden, die aus den Messungen an mehreren Stellen generiert wird (Abbildung 11). Ähnliche Methoden der Retinopathieanalyse und Netzhautdicke wurden auch im Stargardt-Mausmodell26 beschrieben. Es ist jedoch erwähnenswert, dass die hyperreflektierenden Bänder an der Glaskörpergrenzfläche der Netzhaut nicht zum Netzhautgewebe gehören und bei der Schichtung entfernt werden sollten. Wenn subretinale Läsionen in die Netzhaut eindringen, sollte die Dickenmessung den eingedrungenen Teil umfassen.
Dieses retinale Bildgebungssystem für kleine Tiere hat einige Einschränkungen. Obwohl es beispielsweise klare Bilder des hinteren Pols innerhalb von 35° liefern kann, ist die Bildaufnahme der peripheren Netzhaut immer noch eine Herausforderung. Darüber hinaus bildet cSLO ein Graustufenbild, das nicht so gut ist wie ein Farbfundusbild, um Fundusläsionen (Pigmentierung, Blutung, Exsudation) zu erkennen. Daher sind weitere Verbesserungen erforderlich. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die OCT-Untersuchung durch das cSLO-Gerät die nichtinvasive Erkennung und Messung von Retinopathie in Mausmodellen erleichtern könnte.
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Disclosures
Die Autoren erklären keinen potenziellen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Projektquelle: Natural Science Foundation of Guangdong Province (2018A0303130306). Die Autoren danken dem Ophthalmic Research Laboratory, dem Joint Shantou International Eye Center der Shantou University und der Chinese University of Hong Kong für die Finanzierung und Materialien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100-Dpt contact lens | Volk Optical,Inc, Mentor, OH | Accessory belonging to the RETImap | |
| Double aspheric 60-Dpt glass lens | Volk Optical,Inc, Mentor, OH | Accessory belonging to the RETImap | |
| Electric heating blanket | POPOCOLA | CW-DRT-01 | 50 x 35 cm |
| Injection syringe (1 mL) | Kaile | 0.45 x 16RWLB | |
| Levofloxacin Hydrochloride Eye Gel | EBE PHARMACEUTICAL Co.LTD | 5 g: 0.015 g | |
| Medical sodium hyaluronate gel | Alcon | 16H01E | |
| Microliter syringes | Shanghai high pigeon industry and trade co., LTD | Q31/0113000236C001-2017 | 50 µL |
| Povidone iodine solution | Guangdong medihealth pharmaceutical Co.,LTD | 100 mL | |
| RETImap | ROLAND CONSULT | 19-99_50-2.1_1.2E | cSLO/ERG/VEP/FA/OCT/GFP |
| Small animal ear studs | OSMO POCKET OT110 | INS1005-1S | |
| Tropicamide Phenylephrine Eye Drops | Santen Pharmaceutical Co.,LTD | 5 mg/mL | |
| Xylazin | Sigma | X1251-5G | 5 g |
| Zoletil 50 | Virbac.S.A | 7FRPA | Tiletamine 125 mg + Zolazepam 125 mg |
References
- Frombach, J., et al. Serine protease-mediated cutaneous inflammation: characterization of an ex vivo skin model for the assessment of dexamethasone-loaded core multishell-nanocarriers. Pharmaceutics. 12 (9), 862 (2020).
- Osiac, E., Săftoiu, A., Gheonea, D. I., Mandrila, I., Angelescu, R. Optical coherence tomography and Doppler optical coherence tomography in the gastrointestinal tract. Journal of Gastroenterology. 17 (1), 15-20 (2011).
- Xiong, Y. Q., et al. Diagnostic accuracy of optical coherence tomography for bladder cancer: A systematic review and meta-analysis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 298-304 (2019).
- Andrews, P. M., et al. Optical coherence tomography of the aging kidney. & Clinical Transplantation. 14 (6), 617-622 (2016).
- Terashima, M., Kaneda, H., Suzuki, T. The role of optical coherence tomography in coronary intervention. The Korean Journal of Internal Medicine. 27 (1), 1-12 (2012).
- Avital, Y., Madar, A., Arnon, S., Koifman, E. Identification of coronary calcifications in optical coherence tomography imaging using deep learning. Scientific Reports. 11 (1), 11269 (2021).
- Huang, D., et al.
- Tsai, T. H., et al. Optical coherence tomography in gastroenterology: a review and future outlook. Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-17 (2017).
- Chen, J., et al. Relationship between optical intensity on optical coherence tomography and retinal ischemia in branch retinal vein occlusion. Scientific Reports. 8 (1), 9626 (2018).
- Chen, X., et al. Quantitative analysis of retinal layer optical intensities on three-dimensional optical coherence tomography. Investigative Opthalmology & Visual Science. 54 (10), 6846-6851 (2013).
- Cruz-Herranz, A., et al. Monitoring retinal changes with optical coherence tomography predicts neuronal loss in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 203 (2019).
- Podoleanu, A. G.
- Augustin, M., et al. Optical coherence tomography findings in the retinas of SOD1 knockout mice. Translational Vision Science & Technology. 9 (4), 15 (2020).
- Berger, A., et al. Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoS One. 9 (5), 96494 (2014).
- Burns, M. E., et al. New developments in murine imaging for assessing photoreceptor degeneration in vivo. Advances in Experimental Medicine & Biology. 854, 269-275 (2016).
- Jagodzinska, J., et al. Optical coherence tomography: imaging mouse retinal ganglion cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: Jove. (127), e55865 (2017).
- Kocaoglu, O. P., et al. Simultaneous fundus imaging and optical coherence tomography of the mouse retina. Investigative Opthalmology & Visual Science. 48 (3), 1283-1289 (2007).
- Tode, J., et al. Thermal stimulation of the retina reduces Bruch's membrane thickness in age related macular degeneration mouse models. Translational Vision Science & Technology. 7 (3), 2 (2018).
- Wang, R., Jiang, C., Ma, J., Young, M. J. Monitoring morphological changes in the retina of rhodopsin-/- mice with spectral domain optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3967-3972 (2012).
- Xie, Y., et al. A spectral-domain optical coherence tomographic analysis of Rdh5-/- mice retina. PLoS ONE. 15 (4), 0231220 (2020).
- Li, Q., et al. Noninvasive imaging by optical coherence tomography to monitor retinal degeneration in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42 (12), 2981-2989 (2001).
- Horio, N., et al. Progressive change of optical coherence tomography scans in retinal degeneration slow mice. Archives of Ophthalmology. 119 (9), 1329-1332 (2001).
- Hu, W., et al. Expression of VLDLR in the retina and evolution of subretinal neovascularization in the knockout mouse model's retinal angiomatous proliferation. Investigative Opthalmology & Visual Science. 49 (1), 407-415 (2008).
- Wyne, K. Expression of the VLDL receptor in endothelial cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 16 (3), 407-415 (1996).
- Augustin, M., et al. In vivo characterization of spontaneous retinal neovascularization in the mouse eye by multifunctional optical coherence tomography. Investigative Opthalmology & Visual Science. 59 (5), 2054-2068 (2018).
- Fang, Y., et al. Fundus autofluorescence, spectral-domain optical coherence tomography, and histology correlations in a Stargardt disease mouse model. The FASEB Journal. 34 (3), 3693-3714 (2020).
