Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

יישום טומוגרפיה של קוהרנטיות אופטית למודל עכבר של רטינופתיה

Published: January 12, 2022 doi: 10.3791/63421
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2,3, 1
1Joint Shantou International Eye Center, Shantou University and the Chinese University of Hong Kong, 2Shantou University Medical College, 3Department of Ophthalmology and Visual Sciences, the Chinese University of Hong Kong
* These authors contributed equally

Summary

כאן אנו מתארים טכניקת הדמיה in vivo באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית כדי להקל על האבחון והמדידה הכמותית של רטינופתיה בעכברים.

Abstract

טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT) מציעה שיטה לא פולשנית לאבחון רטינופתיה. מכונת OCT יכולה ללכוד תמונות חתך רשתית שמהן ניתן לחשב את עובי הרשתית. למרות OCT נמצא בשימוש נרחב בפועל קליני, היישום שלה במחקר בסיסי אינו נפוץ כמו, במיוחד בבעלי חיים קטנים כגון עכברים. בגלל גודלם הקטן של גלגלי העיניים שלהם, מאתגר לערוך בדיקות הדמיית פונדוס בעכברים. לכן, נדרשת מערכת הדמיית רשתית מיוחדת כדי להתאים להדמיית OCT על בעלי חיים קטנים. מאמר זה מדגים מערכת ספציפית לבעלי חיים קטנים עבור הליכי בדיקת OCT ושיטה מפורטת לניתוח תמונה. מוצגות התוצאות של בדיקת OCT ברשתית של עכברי קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה מאוד (Vldlr) ועכברי C57BL/6J. תמונות ה-OCT של עכברי C57BL/6J הראו שכבות רשתית, ואילו אלה של עכברי Vldlr נוקאאוט הראו ניאו-וסקולריזציה תת-רשתית ודילול רשתית. לסיכום, בדיקת OCT יכולה להקל על זיהוי ומדידה לא פולשניים של רטינופתיה במודלים של עכברים.

Introduction

טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT) היא טכניקת הדמיה שיכולה לספק ברזולוציה גבוהה in vivo והדמיית חתך עבור רקמות 1,2,3,4,5,6,7,8, במיוחד עבור בדיקה לא פולשנית ברשתית 9,10,11,12 . זה יכול לשמש גם כדי לכמת כמה סמנים ביולוגיים חשובים, כגון עובי הרשתית ועובי שכבת סיבי עצב הרשתית. העיקרון של OCT הוא רפלקטומטריית קוהרנטיות אופטית, המקבלת מידע על רקמת חתך מקוהרנטיות האור המוחזרת מדגימה וממירה אותו לצורה גרפית או דיגיטלית באמצעות מערכת מחשב7. OCT נמצא בשימוש נרחב במרפאות עיניים ככלי חיוני לאבחון, מעקב וניהול עבור מטופלים עם הפרעות ברשתית. זה יכול גם לספק תובנה לגבי הפתוגנזה של מחלות רשתית.

בנוסף ליישומים קליניים, OCT שימש גם במחקרים בבעלי חיים. למרות שפתולוגיה היא תקן הזהב של אפיון מורפולוגי, ל- OCT יש את היתרון של הדמיית in vivo לא פולשנית ומעקב אורכי. יתר על כן, הוכח כי OCT מתואם היטב עם היסטופתולוגיה במודלים של חיות רטינופתיה 11,13,14,15,16,17,18,19,20. העכבר הוא החיה הנפוצה ביותר במחקרים ביו-רפואיים. עם זאת, גלגלי העיניים הקטנים שלו מהווים אתגר טכני לביצוע הדמיית OCT בעכברים.

בהשוואה ל-OCT ששימש לראשונה להדמיית רשתית בעכברים21,22, OCT בבעלי חיים קטנים עבר כעת אופטימיזציה ביחס למערכות חומרה ותוכנה. לדוגמה, OCT, בשילוב עם הגשש, מקטין באופן משמעותי את יחס האות לרעש; שדרוגי מערכת תוכנת OCT מאפשרים לזהות שכבות רשתית רבות יותר באופן אוטומטי; וקרן DLP המשולבת מסייעת להפחית את תוצרי התנועה.

קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה מאוד (Vldlr) הוא חלבון טרנס-ממברנה בתאי אנדותל. הוא מתבטא על תאי אנדותל של כלי הדם ברשתית, תאי אפיתל פיגמנט רשתית, וסביב הממברנה המגבילה החיצונית23,24. ניאו-וסקולריזציה תת-קרקעית היא הפנוטיפ של עכברי הנוקאאוט של Vldlr 23. לכן, עכברי נוקאאוט Vldlr משמשים לחקור את הפתוגנזה ואת הטיפול הפוטנציאלי של neovascularization subretinal. מאמר זה מדגים את היישום של הדמיית OCT לזיהוי נגעים ברשתית בעכברי נוקאאוט Vvldler, בתקווה לספק התייחסות טכנית למחקר רטינופתיה במודלים של בעלי חיים קטנים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הניתוחים בוצעו בעקבות ההצהרה על השימוש בבעלי חיים במחקרי עיניים וראייה של האגודה לחקר הראייה והעיניים. תכנון הניסוי אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית לבעלי חיים (ועדת האתיקה הרפואית של JSIEC, EC 20171213(4)-P01). במחקר זה נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J בני חודשיים ובעכברי נוקאאוט Vldler. בכל קבוצה היו 7 עכברים, כולם נקבות ושקלו 20 גרם עד 24 גרם.

1. תנאי ניסוי

  1. הקצה את העכברים לשתי קבוצות: קבוצת ניסוי המורכבת מעכברי נוקאאוט Vldlr וקבוצת ביקורת המורכבת מעכברי C57BL/6J.
  2. האכילו את העכברים במזון ובמים באופן קונבנציונלי.
  3. הגדילו את העכברים במעבדת החיות בתנאים יציבים של טמפרטורת החדר (22 מעלות צלזיוס), לחות (50-60%), מחזור אור-חושך (12 שעות עד 12 שעות) ועוצמת האור בחדר (350-400 לוקס).
  4. הכן את ציוד הניסוי: טומוגרפיה קוהרנטית אופטית עם אופתלמוסקופ לייזר סריקה קונפוקלית (cSLO) עבור חיות קטנות (איור 1A).
  5. הכינו את כל החומרים הדרושים לניסוי (איור 1B) ושקלו את העכברים (איור 1C).

2. רשומות מידע

  1. תעד את המידע: קבוצה, קוד, תאריך לידה, גיל, מין, משקל ומינון הרדמה.

3. הפעלה ובדיקה של מכשירים

  1. הפעל את המחשב והפעל את התוכנה.
  2. לחץ על לחצן בדוק תוכנית כדי להשלים את תוכנית הבדיקה.
  3. מפעילים את התרמוסטט ומחממים אותו לטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  4. התחל את הליך מודול OCT לאחר בדיקת התוכנית.
  5. צור נושא חדש ומלא את פרטי העכבר.
  6. מחממים מראש את השמיכה החשמלית ומכסים אותה במגבות כירורגיות.

4. הרדמה

  1. השתמש אבקת הרדמה lyophilized המכיל Tiletamine ו Zolazepam כדי להכין את תערובת ההרדמה.
    הערה: עקוב אחר המלצות ועדת האתיקה המקומית לבעלי חיים לבחירה, מינון ומסלול מתן הרדמה. להרדים את החיה עם הרדמה שתספק חוסר תנועה ואובדן תפיסת כאב במשך שעה לפחות, ולאחר מכן החיה מתאוששת במהירות. המינון צריך להתבסס על משך זמן הניסוי, משקל בעלי החיים וגורמים אחרים.
  2. הרדימו את החיה באמצעות תערובת ההרדמה המוכנה. הקפד לשמור על החיה חמה במהלך כל ההליך עד ההתאוששות.

5. יישום של טיפות mydriatic

  1. השג ריסון ידני של העכבר על ידי השפשוף, הפוך את גלגל העין לבלוט מעט, וסובב את ראש העכבר כשעין אחת פונה כלפי מעלה.
  2. מרחו את הטיפות המידריאטיות כדי להרחיב את האישונים (איור 2A).
  3. בדוק את התרחבות האישון לאחר 10 דקות.

6. מיקום העכבר

  1. הניחו עכבר על משטח שמיכה חשמלית.
  2. מצפים את שתי העיניים בג'ל נתרן היאלורונאט רפואי (איור 2B).
  3. הברג עדשה כדורית כפולה 60 D (עדשה מוגדרת מראש) בהתקן cSLO (איור 1A-5, 6).
  4. הניחו עדשת מגע 100 D על קרנית העכבר כשהצד הקעור נוגע בג'ל נתרן היאלורונאט על פני הקרנית (איור 2C, D ואיור 3A-II).
  5. הניחו את העכבר על פלטפורמת בעלי החיים הקטנה בטמפרטורה קבועה והרחיקו את העין 1-2 מ"מ מהעדשה של מכשיר ה-cSLO (איור 3A).
  6. התאם את זווית עדשת המגע באמצעות מלקחיים כדי לשמור על האישון במרכז העדשה.
  7. כוונן את ההתאמות לראש כדי לגרום לעין לפנות ישר קדימה.

7. סריקה קונפוקלית לייזר אופתלמוסקופ (cSLO)

  1. לחץ על לחצן OCT , בחר את מודול העכבר והפעל את תוכנית cSLO (איור 4B).
  2. בחר את מצב IR (מקור אור: אור אדום), והתאם את הפרמטר (טווח: 2047, איור 4D).
  3. בחר את העין לבדיקה (עין ימין: איור 4C-1; עין שמאל: איור 4C-2).
  4. שלטו בידית והזיזו את העדשה המוגדרת מראש לכיוון עדשת המגע באיטיות.
  5. התאימו את ערך הדיופטר עד שהדמיית הקוטב האחורי תהיה ברורה (איור 4E).
  6. בצע התאמות נוספות כדי ליישר את התמונה של הקוטב האחורי של הרשתית, ומרכזו בראש עצב הראייה.

8. טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT)

  1. הפעל את תוכנית OCT (איור 4G).
  2. לחץ על מד ההתקדמות למעלה ולמטה עד שתמונת ה-OCT תופיע (איור 4H).
  3. התאמת פרמטרים: טווח מינימום (איור 4I) = 0-20, טווח מרבי (איור 4J) = 40-60.
  4. התאם את המרחק וכיוון המיקום המוגדרים מראש של העדשה עד לקבלת תמונת OCT אידיאלית.
  5. בחר את מיקום הסריקה על-ידי הזזת הקו הרגיל ב-cSLO (איור 4M).
  6. התחל לסרוק מראש עצב הראייה.
  7. אסוף תמונות באותו סדר עבור כל עין: קו אופקי: ראש עצב הראייה → מעולה → נחות; קו אנכי: ראש עצב הראייה → האף → טמפורלי.
  8. אסוף תמונות מארבעה כיוונים.
  9. לחצו על ' ממוצע' כדי לכסות את אותות התמונה cSLO ו-OCT (איור 4F ואיור 4O).
  10. לחץ על לחצן הצילום כדי להשיג את תמונת SLO-OCT (איור 4P).
  11. שמור וייצא את כל התמונות (איור 4Q, R).

9. סוף הניסוי (לאחר בדיקת OCT)

  1. הניחו את העכבר על השמיכה החשמלית כדי לשמור על חום גופה עד שיתעורר.
    הערה: יש לעקוב אחר העכבר עד שהוא חוזר להכרה מספקת כדי לשמור על יציבות החזה. יש למזער את החשיפה לאחר הניתוח לאור בהיר.
  2. הסר את עדשת המגע 100 D.
  3. יש למרוח את ג'ל העיניים levofloxacin כדי להגן על הקרנית.
  4. החזירו את העכבר לכלוב לאחר שהוא מתעורר.
    הערה: ודא שהעכבר הנבדק אינו מוחזר לחברתם של עכברים אחרים עד להחלמה מלאה.
  5. כבה את התוכנה וכבה את המחשב.
  6. נקה את עדשת המגע 100 D עם מים; לייבש את העדשה.
  7. לנקות ולחטא את הסביבה.

10. ניתוח תמונות

  1. השווה את תמונות ה-OCT של עכברי הנוקאאוט של Vldlr לאלה של עכברי C57BL/6J.
  2. שימו לב למספר מיקומים: סריקות אנכיות ואופקיות העוברות דרך הפפילה האופטית; סריקות עליונות, נחותות, אף וטמפורליות; וסריקות אתר השתקפות חריגות.
  3. שימו לב לעובי, לצורה, לשכבות ולנגעי ההשתקפות החריגים של הרשתית בכל תמונה, כמו גם לממשק הזגוגי של הרשתית והגוף הזגוגי.
  4. תעד את המיקומים, המאפיינים והמספרים של הנגעים.

11. תיקון ריבוד הרשתית

  1. לחץ על בדיקת עומס בממשק OCT (איור 5A).
  2. קרא את תמונות ה- OCT של עכבר מחלון מוקפץ.
  3. בחר תמונות: סריקת תמונת OCT דרך הפפילה האופטית, אופקית או אנכית.
  4. לחץ פעמיים על התמונה בגורם המכיל של המדיה כדי להציג אותה על המסך (איור 5C).
  5. לחצו על ' זיהוי שכבות' כדי להשלים את השכבות האוטומטיות על הרשתית (איור 5D).
  6. בחרו את הקווים המפרידים משני צידי השכבה שהוכנה לניתוח (איור 6D-10).
  7. בחרו קו מפריד נפרד (איור 6B-6) ולחצו על 'ערוך שכבה' (איור 6A-1) כדי להפעיל את הקו כשמופיע עיגול אדום (איור 6B-7).
  8. התאם את המרווח (איור 6A-4, לדוגמה, 50) ואת טווח הגבולות (איור 6A-5, לדוגמה, 50).
  9. שנה את הקו המפריד על-ידי הזזת העיגול האדום (השווה את הקו המפריד הירוק באיור 6B ובאיור 6C; איור 6C מציג את התוצאה שהשתנתה).

12. עובי למינציה רשתית

  1. לחצו על הלחצן 'סמן מדידה' (איור 6D-9).
  2. בחרו את הקו המפריד של השכבה לניתוח (לדוגמה, בשכבה הגרעינית החיצונית, בחרו את הקו המפרידה-4 וה-5 ברשימה) כדי להציג את גבול השכבה בתמונת OCT (איור 6D-10).
  3. בחרו 'התחבר לשכבה' (איור 6D-11) ו'הישאר מחובר תוך כדי תנועה' (איור 6D-12).
  4. בחר את האזור כדי להציג את התוצאות (העמודה שנבחרה צבועה, איור 6D-13).
  5. לחצו על המיקום שיש לנתח בתמונת OCT כדי לגרום לקו המדידה להיראות (בניצב לציר האופקי ועקבי לצבע האזור המתקבל) (איור 6D-14).
  6. לחץ על העמודה הבאה למדידה הבאה וגלה את הנתונים הקודמים (איור 6E-15).
  7. קרא את הערך Vert (עובי המיקום הנמדד) בשורה אורך במיקרומטר (רקמה) (איור 6E, מלבן אדום).
  8. לחצו על 'מחק סמן' (איור 6E-16) ועל 'סמן חדש' (איור 6E-17) כדי לבדוק שוב כך שהתוצאות יכסו את הנתונים המקוריים (אם יש צורך במדידה מחדש).
  9. לחץ על Print Scr בלוח המקשים כדי לשמור צילומי מסך, או לחץ על שמור בדיקה כדי לשמור ישירות (איור 5H).
  10. הזן את הנתונים לגיליון אלקטרוני או לתוכנה סטטיסטית לצורך ניתוח סטטיסטי.

13. מדידת עובי רשתית מלא

  1. בחר קו 1 (ILM, קרום מגביל פנימי, איור 7B) וקו 7 (OS-RPE, OS: מקטעי פוטורצפטור חיצוניים; RPE: שכבת אפיתל פיגמנט רשתית, איור 7C) ברשימה בפינה הימנית העליונה.
    הערה: עובי הרשתית המלא פירושו עובי שכבת הנויריפיתליום ברשתית, שהיא הרשתית בין ILM ל-OS-RPE ב-OCT).
  2. מדוד את עובי הרשתית משני צידי הפפילה האופטית במרווח מסוים.
    1. לדוגמה: ממראה מבנה הרשתית בקצה הפפילה האופטית, מדוד 4 ערכים עם מרווח של 200 מיקרומטר של הסרגל האופקי (איור 7G, H).
  3. הקלט את כל הערכים הנמדדים בגיליון אלקטרוני.
  4. השתמש במספר מבחני t (אחד בכל שורה) כדי להשוות את הערכים הנמדדים של כל מיקום מתאים בשתי הקבוצות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הודות לסריקות ברזולוציה גבוהה של OCT, ניתן לראות את שכבות רשתית העכבר, וניתן לזהות השתקפויות חריגות ומיקומן המדויק. תמונות ה-OCT של הרשתית של עכברי נוקאאוט Vldlr ועכברי C57BL/6J הושוו במחקר זה. תמונות ה-OCT של כל עכברי C57BL/6J הראו שכבות רשתית שונות עם רפלקטיביות שונה, והתיחום היה ברור (איור 8D). לעומת זאת, כל עכברי הנוקאאוט של Vldlr הראו נגעים חריגים והיפר-רפלקטיביים בתמונות ה-OCT (איור 8B).

ניתוק זגוגית לא שלם (PVD) בעכברי נוקאאוט Vldlr

תוצאות ה-OCT הראו כמה פסים מחזירי אור אמצעיים על משטחי הרשתית של עכברי נוקאאוט Vldlr (איור 8B, חיצים אדומים). הפסים המחזירים האמצעיים האלה נדבקו לכלי הרשתית (איור 8B, חץ ירוק), בהתאם לתמונת cSLO (איור 8A, חץ ירוק). תכונות אלה עולות בקנה אחד עם מאפייני OCT של ניתוק זגוגית לא שלם.

ניאו-וסקולריזציה תת-קרקעית בעכברי נוקאאוט Vldlr

התוצאות הראו כי לניאו-וסקולריזציה תת-קרקעית היו שני מצבי התפתחות בעכברי הנוקאאוט של Vldlr .

עם מעורבות של השכבה הגרעינית החיצונית

נגע היפר-רפלקטיבי, עם צורה משולשת מלמטה למטה על תמונת OCT, הופיע בחלל התת-קרקעי והתפשט לשכבה הגרעינית החיצונית. הנגע לא פרץ את שכבת הפרספקס החיצונית (איור 8B, חץ לבן).

הופעת ה-OCT של סוג זה של ניאו-וסקולריזציה תת-קרקעית עלתה בקנה אחד עם הממצאים הפתולוגיים המוצגים באיור 9A. החלק הפתולוגי הראה כי ניאו-וסקולריזציה (איור 9A, חץ ירוק עבה) פרצה דרך ה-RPE, המקטעים הפנימיים/החיצוניים של הפוטורצפטור (IS/OS) והממברנה המגבילה החיצונית (ELM). הוא פלש לשכבה הגרעינית החיצונית (ONL) אך לא פרץ את שכבת הפרספקס החיצונית (OPL).

ללא מעורבות של השכבה הגרעינית החיצונית

רצועה של נגע היפר-רפלקטיבי הופיעה בתמונת OCT, שהייתה ממוקמת בחלל התת-קרקעי (איור 8B, חץ צהוב). תמונת cSLO הראתה את המיקום המתאים (איור 8A, חץ צהוב). הסריקות הנוספות של הרשתית סביב המיקום הזה (איור 8A, חץ צהוב) הראו את אותם ממצאים.

בהתאם לנגע (איור 10A, חץ כחול עבה) בחלק הפתולוגי, הניאו-וסקולריזציה התת-קרקעית הזו לא פרצה דרך ה-ELM (איור 10A, חץ צהוב דק) אלא כללה באופן חלקי את הפוטורצפטור IS/OS.

תוצאות עובי הרשתית

עובי הרשתית של עין ימין של כל העכברים התקבל באמצעות פונקציית הריבוד והעובי האוטומטית של OCT. עובי הרשתית של עכברי נוקאאוט Vldlr (200.94 ± 14.64 מיקרומטר) היה נמוך משמעותית מזה של עכברי C57BL/6J (217.46 ± 10.21 מיקרומטר, P < 0.001, t-test , 7 עיניים ימניות / קבוצה). ההשוואה של עובי הרשתית בארבעת הכיוונים (טמפורלי, אף, עליון ונתח) של הקוטב האחורי בין שתי הקבוצות מוצגת באיור 11.

Figure 1
איור 1: הכנת חומרי ניסוי ובעלי חיים. (A) ציוד: 1. מכשיר cSLO/OCT להדמיית רשתית של בעלי חיים קטנים, 2. מחשב וצג, 3. פלטפורמת בעלי חיים קטנה בטמפרטורה קבועה, 4. תרמוסטט, 5. עדשה מוגדרת מראש, 6. התקנת העדשה המוגדרת מראש. (B) תרופות ופריטים קטנים: I. povidone-יוד, II. מיקרו-מזרק, III. תמיסת תערובת הרדמה, IV. טיימר, V. טיפות עיניים מידריאטיות, VI. מלקחיים, VII. ג'ל נתרן היאלורונאט רפואי, VIII. צמר גפן רפואי, IX. משחת עיניים אנטיביוטית, X. 100 D עדשות מגע (שתיים). (C) מדידת משקל באיזון דיגיטלי. קיצורים: cSLO = סריקה קונפוקלית לייזר אופתלמוסקופ; OCT = טומוגרפיה קוהרנטית אופטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: הכנה לפני בדיקת OCT של עכברים . (A) מריחת טיפות עיניים Mydriasis, (B) ציפוי ג'ל נתרן היאלורונאט על הקרנית, (C, D) מיקום של עדשת מגע 100 D, עם משטח קעור שבא במגע עם הקרנית. קיצור: OCT = טומוגרפיה קוהרנטית אופטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: הליכי בדיקת OCT . (A) מיקום העכבר, I. עדשה מוגדרת מראש, II. עדשות מגע, III. פלטפורמת בעלי חיים קטנה בטמפרטורה קבועה. (B) הפעלת מכונת cSLO/OCT, IV. מנוף הפעלה, V. מנוף הטיה, VI. מכשיר cSLO. קיצורים: cSLO = סריקה קונפוקלית לייזר אופתלמוסקופ; OCT = טומוגרפיה קוהרנטית אופטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: תהליך הדמיית OCT. א. מצב מדידה , B. התחל Laser של לייזר IR, C. בחירת עיניים (C-1-OD; C-2-OS), D. טווח של לייזר IR, E. הדיופטר, F. שכבת-על של תמונת cSLO, G. OCT סריקת כפתור התחלה/עצירה H. הפניה של תמונת OCT, I. טווח מינימום: 0-20, J. טווח מרבי: 50-60, K. עוצמת האות של התמונה, L. כיוון סריקה (למשל, סריקה אנכית), M. מיקום סריקה שנבחר על ידי הזזת קו הייחוס הירוק (למשל, סריקה אנכית דרך הפפילה האופטית), N. תצוגה בזמן אמת של תמונת OCT, O. שכבת-על של תמונת OCT, P. Shot: רכישת תמונה, Q. SLO-OCT תמונות שנרכשו, R. Save Examination: שמירת תוצאת הבדיקה. סרגלי קנה מידה = 200 מיקרומטר. קיצורים: cSLO = סריקה קונפוקלית לייזר אופתלמוסקופ; OCT = טומוגרפיה קוהרנטית אופטית; IR = אינפרא אדום; OD = עין ימין; OS = עין שמאל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: ממשק הדלפה אוטומטי של הרשתית במערכת OCT. A. לחצן בדיקת טעינה , B. מיכל מדיה, המציג את כל תמונות ה- OCT, C. תמונת OCT נבחרת לניתוח, D. לחצן זיהוי שכבה לשכבות רשתית אוטומטיות, E. רשימת קווים מפרידים, F. delamination אוטומטי על הרשתית, G. לחצן 'ערוך שכבה' לתיקון שכבות , H. שמור בדיקה לשמירת התוצאות. סרגלי קנה מידה = 200 מיקרומטר. קיצור: OCT = טומוגרפיה קוהרנטית אופטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: תיקון שכבות (A-C) ומדידת עובי (D-E). (A) ממשק הפעלת עריכה שכבתי: 1. לחצן ערוך שכבה, 2. רשימת קווים מפרידים (לדוגמה, בחירת כל השורות), 3. הפעלת קווים מפרידים, 4. התאמת ריווח, 5. התאמת טווח הגבלה. (B) הפעלת קו מפריד (לדוגמה, קו 3 ב-A), 6. קו 3, הקו בין שכבת הפרספקס הפנימית לשכבת הגרעין הפנימית, 7. דוגמה לשגיאת שכבות. (ג) שינוי שגיאת שכבות, 8. את העיגול האדום לשינוי. (D) דוגמה למדידת עובי למלר הרשתית, 9. לחצן 'סמן מדידה', 10. קווים מפרידים של השכבה הגרעינית החיצונית, 11. התחברו לשכבה (המדידה תתחבר לשכבה בהתאם לקווים המפרידים), 12. הישאר מחובר בתנועה (מיקום המדידה הוא המקום שבו נשארת הלחיצה הידנית), 13. המיקום של תצוגת התוצאה, 14. קו המדידה (בניצב לציר האופקי). (E) רכישת תוצאות מדידה, 15. תוצאות המדידה (מלבן אדום: ערך Vert הוא תוצאת העובי), 16. לחצן 'מחק סמן' למחיקת רשומת מדידה, 17. לחצן Marke r חדשלמדידה מחדש (התוצאה החדשה תחליף את הרשומה המקורית). סרגלי קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: מדידת עובי רשתית מלא. A. לחצן 'סמן מדידה', 'B' שורה 1 (ILM) ו- C. בחירת שורה 7 (OS-RPE) להצגת גבולות הרשתית בעובי מלא, D. התחבר עם בחירת שכבה, E. הישאר מחובר בבחירת הזזה, F. סרגל סרגל (פסי סרגל אנכיים ואופקיים, שניהם באורך 200 מיקרומטר), G. קווי מדידה על הרשתית (4 קווים עם 200 מיקרומטר של אורך סרגל אופקי כמרווח בכל צד של הפפילה האופטית), H. תוצאות המדידה (התוצאות נבדלות בצבעים שונים ותואמות את צבע קווי המדידה על הרשתית), I. חילוץ נתונים מערך Vert בשורה אורך ב- μm (רקמה). סרגלי קנה מידה = 200 מיקרומטר. קיצורים: ILM = קרום מגביל פנימי; OS-RPE = מקטע חיצוני של פוטורצפטור של אפיתל פיגמנט הרשתית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 8
איור 8: השוואה בין תמונות cSLO ו-OCT של עכברי Vldlr נוקאאוט ועכברי C57BL/6J. תמונות cSLO (A) ו-OCT (B) של עכברי נוקאאוט של Vldlr בהשוואה לתמונות cSLO (C) ו-OCT (D) של עכברי C57BL/6J. מאפיינים של OCT בעכברי נוקאאוט Vldlr (B): 1) קו מחזיר אור אמצעי (B, חיצים אדומים) על פני השטח הפנימיים של הרשתית עם הידבקות לכלי הרשתית (B, חץ ירוק). 2) נגעים היפררפלקטיביים, הממוקמים בחלל התת-קרקעי, עם (B, חץ לבן) או ללא מעורבות (B, חץ צהוב) של שכבה גרעינית חיצונית. החצים בתמונת cSLO (A) מייצגים את המיקומים של חצי הצבע המתאימים בתמונת OCT (B). סרגלי קנה מידה = 200 מיקרומטר. קיצורים: cSLO = סריקה קונפוקלית לייזר אופתלמוסקופ; OCT = טומוגרפיה קוהרנטית אופטית; Vldlr = קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה מאוד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 9
איור 9: מצב 1: מקטעי פרפין ברשתית עם צביעת המטוקסילין-אוזין בנוקאאוט Vldlr ועכבר C57BL/6J. (A) דוגמה לניאו-וסקולריזציה תת-רשתית הפולשת לשכבה הגרעינית החיצונית (חץ ירוק עבה), הממוקמת בחלק האמצעי של הרשתית של עכבר נוקאאוט Vldlr. (B) שליטה רגילה, החלק האמצעי של הרשתית של עכבר C57BL/6J. סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: Vldlr = קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה מאוד; ILM = קרום מגביל פנימי; NFL = שכבת סיבי עצב הרשתית; GCL = שכבת תאי גנגליון ברשתית; IPL = שכבת פלקסיפורם פנימית; INL = שכבה גרעינית פנימית; OPL = שכבת פרספקס חיצונית; ONL = שכבה גרעינית חיצונית; ELM = קרום מגביל חיצוני; IS = מקטע פנימי של פוטורצפטור; OS = מקטע חיצוני של פוטורצפטור; RPE = שכבת אפיתל פיגמנט רשתית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 10
איור 10: מצב 2: מקטעי פרפין ברשתית עם כתם המטוקסילין-אוזין בנוקאאוט Vldlr ובעכבר C57BL/6J. (A) דוגמה לניאו-וסקולריזציה תת-קרקעית ללא מעורבות של שכבה גרעינית חיצונית (חץ כחול עבה) ועם ELM שלם (חץ צהוב דק), הממוקם ברשתית הפריפריה האמצעית בעכבר נוקאאוט Vldlr. (B) בקרה רגילה, הרשתית הפריפרית האמצעית של עכבר C57BL/6J. סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: VLDR = קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה מאוד; ILM = קרום מגביל פנימי; NFL = שכבת סיבי עצב הרשתית; GCL = שכבת תאי גנגליון ברשתית; IPL = שכבת פלקסיפורם פנימית; INL = שכבה גרעינית פנימית; OPL = שכבת פרספקס חיצונית; ONL = שכבה גרעינית חיצונית; ELM = קרום מגביל חיצוני; IS = מקטע פנימי של פוטורצפטור; מערכת הפעלה = קטע פוטורצפטור חיצוני; RPE = שכבת אפיתל פיגמנט רשתית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 11
איור 11: השוואה של עובי הרשתית בין עכברי C57BL/6J לעכברי Vldlr נוקאאוט (כל הנתונים מעין ימין). (A) עובי הרשתית (μm) דרך הפפילה של עצב הראייה על ידי סריקה אופקית OCT. (B) עובי הרשתית (μm) דרך הפפילה של עצב הראייה על ידי סריקה אנכית של OCT. הקואורדינטות האופקיות מייצגות את מיקומי המדידה עם ריווח של 200 מיקרומטר.*: P < 0.05, **: P < 0.01, ***: P < 0.001. קיצורים: T = זמני; P = פפילה אופטית; N = האף; S = מעולה; I = נחות; OCT = טומוגרפיה קוהרנטית אופטית; VLDR = קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה מאוד; OD = עין ימין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במחקר זה, הדמיית OCT באמצעות מערכת הדמיית רשתית של בעלי חיים קטנים יושמה כדי להעריך שינויים ברשתית בעכברי Vldlr knockout, אשר מדגימים ניתוק זגוגית אחורית לא שלם, ניאו-וסקולריזציה תת-רשתית והידלדלות עובי הרשתית. OCT היא שיטת הדמיה לא פולשנית לבחינת מצב הרשתית in vivo. רוב מכשירי OCT מיועדים לבדיקת עיניים אנושיות. גודל ציוד החומרה, הגדרת אורך המוקד, הגדרת הפרמטרים של המערכת ודרישות המיקום של הנבחן מבוססים כולם על העין האנושית. שינויים של העדשה והגדרות המערכת נדרשים כדי לבחון בעלי חיים קטנים עם ציוד OCT ספציפי לאדם. מאמר זה מציג נהלי בדיקת OCT של בעלי חיים קטנים.

אורך המוקד שונה במהלך סריקת תמונה של בעלי חיים קטנים שונים עם גדלים שונים של גלגלי עיניים. הבדל זה באורך המוקד הוא קריטי ויש לפתור אותו כדי לקבל תמונות פונדוס ברורות ומדויקות. שיטה יעילה אחת היא החלפת העדשה האובייקטיבית בעדשות בעלות עקמומיות שונה. בשל גלגל העין הקטן שלו, העכבר זקוק לעדשת מגע של 100 D מול הקרנית בנוסף לעדשה הכפולה הכדורית 60 D מוגדרת מראש של ציוד OCT.

ה-OCT יכול לספק רק סריקות קו שמכסות רק אזור מוגבל של הרשתית. לכן, חיוני לתקנן את פרוטוקול סריקות OCT להשוואה איכותית וכמותית של ממצאי OCT בקבוצות שונות. בוצעו כאן שלוש סריקות אופקיות ושלוש סריקות אנכיות. מכשיר זה מספק תמונת cSLO בזמן אמת כדי לנטר את מיקום סריקת ה-OCT כך שניתן יהיה לכוונן את מיקום הסריקה באופן מדויק ונוח. ניתן להוסיף סריקות נוספות כאשר נמצאה השתקפות חריגה.

הפרמטרים של רכישת תמונה צריך להיות מותאם בזהירות. כאן, מומלץ שהטווח Min יהיה 0-20 והטווח המרבי יהיה 50-60 (איור 4I, J). כאשר הפרמטרים מותאמים יתר על המידה, ניגודיות האות של התמונה תשתפר, והאות המוחזר של הרשתית עם השתקפות נמוכה הופך נמוך יותר או אפילו שחור, וכמה מידע מורפולוגי יאבד.

להלן כמה טיפים כדי למנוע הידרדרות באיכות התמונה: 1. מניחים עדשת מגע מול העיניים מיד לאחר ההרדמה כדי למנוע קטרקט; 2. ודא שהעדשה ועדשות המגע המוגדרות מראש נקיות; 3. הימנע מהזנת שיער בין הקרנית לעדשת המגע; 4. ודא שהדופלר, הניגודיות והבהירות בפרמטרים של OCT מוגדרים כראוי.

ניתן להשתמש בתמונות OCT כדי לזהות נגעים באופן איכותי ולמדוד באופן כמותי מדדים כגון עובי הרשתית. כאן מוצעת שיטה למדידת עובי הרשתית במספר מקומות, וניתן לחשב את הממוצע כעובי הרשתית הממוצע. זה מושג באמצעות פונקציית הריבוד האוטומטית של מערכת OCT. לכן, ניתן למדוד גם את עובי הלמינציות ברשתית. שיטת המדידה פשוטה ומדויקת (איור 6 ואיור 7). התוצאות הראו כי עובי הרשתית היה נמוך יותר בעכברי נוקאאוט Vldlr מאשר בעכברי C57BL/6J, בהתאם לספרות25. ההבדל בעובי הרשתית בין שתי הקבוצות יכול להיות מוצג בבירור על ידי גרף שנוצר מהמדידות במספר מיקומים (איור 11). שיטות דומות לניתוח רטינופתיה ומדידת עובי הרשתית דווחו גם במודל26 של עכבר מחלת סטארגרדט. עם זאת, ראוי לציין כי להקות hyperreflective בממשק הזגוגית של הרשתית אינם שייכים לרקמת הרשתית ויש להסיר אותם במהלך הריבוד. בנוסף, אם נגעים subretinal לפלוש הרשתית, מדידת העובי צריכה לכלול את החלק הפולש.

למערכת הדמיית הרשתית של בעלי חיים קטנים יש כמה מגבלות. לדוגמה, למרות שהוא יכול לספק תמונות ברורות של הקוטב האחורי בטווח של 35°, רכישת תמונה של הרשתית ההיקפית עדיין מאתגרת. בנוסף, cSLO יוצר תמונה בקנה מידה אפור, אשר אינו טוב כמו תמונת פונדוס צבע כדי לזהות נגעים פונדוס (פיגמנטציה, דימום, exudation). לפיכך, נדרשים שיפורים נוספים. לסיכום, בדיקת OCT על ידי מכונת cSLO יכולה להקל על זיהוי ומדידה לא פולשניים של רטינופתיה במודלים של עכברים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים פוטנציאלי.

Acknowledgments

מקור הפרויקט: הקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג (2018A0303130306). המחברים רוצים להודות למעבדה לחקר העיניים, למרכז העיניים הבינלאומי המשותף של שנטאו באוניברסיטת שנטאו ולאוניברסיטה הסינית של הונג קונג על המימון והחומרים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100-Dpt contact lens Volk Optical,Inc, Mentor, OH Accessory belonging to the RETImap
Double aspheric 60-Dpt glass lens Volk Optical,Inc, Mentor, OH Accessory belonging to the RETImap
Electric heating blanket POPOCOLA CW-DRT-01 50 x 35 cm
Injection syringe (1 mL) Kaile 0.45 x 16RWLB
Levofloxacin Hydrochloride Eye Gel EBE PHARMACEUTICAL Co.LTD 5 g: 0.015 g
Medical sodium hyaluronate gel Alcon 16H01E
Microliter syringes Shanghai high pigeon industry and trade co., LTD Q31/0113000236C001-2017 50 µL
Povidone iodine solution Guangdong medihealth pharmaceutical Co.,LTD 100 mL
RETImap ROLAND CONSULT 19-99_50-2.1_1.2E cSLO/ERG/VEP/FA/OCT/GFP
Small animal ear studs OSMO POCKET OT110 INS1005-1S
Tropicamide Phenylephrine Eye Drops Santen Pharmaceutical Co.,LTD 5 mg/mL
Xylazin Sigma X1251-5G 5 g
Zoletil 50 Virbac.S.A 7FRPA Tiletamine 125 mg + Zolazepam 125 mg

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frombach, J., et al. Serine protease-mediated cutaneous inflammation: characterization of an ex vivo skin model for the assessment of dexamethasone-loaded core multishell-nanocarriers. Pharmaceutics. 12 (9), 862 (2020).
  2. Osiac, E., Săftoiu, A., Gheonea, D. I., Mandrila, I., Angelescu, R. Optical coherence tomography and Doppler optical coherence tomography in the gastrointestinal tract. Journal of Gastroenterology. 17 (1), 15-20 (2011).
  3. Xiong, Y. Q., et al. Diagnostic accuracy of optical coherence tomography for bladder cancer: A systematic review and meta-analysis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 298-304 (2019).
  4. Andrews, P. M., et al. Optical coherence tomography of the aging kidney. & Clinical Transplantation. 14 (6), 617-622 (2016).
  5. Terashima, M., Kaneda, H., Suzuki, T. The role of optical coherence tomography in coronary intervention. The Korean Journal of Internal Medicine. 27 (1), 1-12 (2012).
  6. Avital, Y., Madar, A., Arnon, S., Koifman, E. Identification of coronary calcifications in optical coherence tomography imaging using deep learning. Scientific Reports. 11 (1), 11269 (2021).
  7. Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
  8. Tsai, T. H., et al. Optical coherence tomography in gastroenterology: a review and future outlook. Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-17 (2017).
  9. Chen, J., et al. Relationship between optical intensity on optical coherence tomography and retinal ischemia in branch retinal vein occlusion. Scientific Reports. 8 (1), 9626 (2018).
  10. Chen, X., et al. Quantitative analysis of retinal layer optical intensities on three-dimensional optical coherence tomography. Investigative Opthalmology & Visual Science. 54 (10), 6846-6851 (2013).
  11. Cruz-Herranz, A., et al. Monitoring retinal changes with optical coherence tomography predicts neuronal loss in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 203 (2019).
  12. Podoleanu, A. G. Optical coherence tomography. Journal of Microscopy. 247 (3), 209-219 (2012).
  13. Augustin, M., et al. Optical coherence tomography findings in the retinas of SOD1 knockout mice. Translational Vision Science & Technology. 9 (4), 15 (2020).
  14. Berger, A., et al. Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoS One. 9 (5), 96494 (2014).
  15. Burns, M. E., et al. New developments in murine imaging for assessing photoreceptor degeneration in vivo. Advances in Experimental Medicine & Biology. 854, 269-275 (2016).
  16. Jagodzinska, J., et al. Optical coherence tomography: imaging mouse retinal ganglion cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: Jove. (127), e55865 (2017).
  17. Kocaoglu, O. P., et al. Simultaneous fundus imaging and optical coherence tomography of the mouse retina. Investigative Opthalmology & Visual Science. 48 (3), 1283-1289 (2007).
  18. Tode, J., et al. Thermal stimulation of the retina reduces Bruch's membrane thickness in age related macular degeneration mouse models. Translational Vision Science & Technology. 7 (3), 2 (2018).
  19. Wang, R., Jiang, C., Ma, J., Young, M. J. Monitoring morphological changes in the retina of rhodopsin-/- mice with spectral domain optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3967-3972 (2012).
  20. Xie, Y., et al. A spectral-domain optical coherence tomographic analysis of Rdh5-/- mice retina. PLoS ONE. 15 (4), 0231220 (2020).
  21. Li, Q., et al. Noninvasive imaging by optical coherence tomography to monitor retinal degeneration in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42 (12), 2981-2989 (2001).
  22. Horio, N., et al. Progressive change of optical coherence tomography scans in retinal degeneration slow mice. Archives of Ophthalmology. 119 (9), 1329-1332 (2001).
  23. Hu, W., et al. Expression of VLDLR in the retina and evolution of subretinal neovascularization in the knockout mouse model's retinal angiomatous proliferation. Investigative Opthalmology & Visual Science. 49 (1), 407-415 (2008).
  24. Wyne, K. Expression of the VLDL receptor in endothelial cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 16 (3), 407-415 (1996).
  25. Augustin, M., et al. In vivo characterization of spontaneous retinal neovascularization in the mouse eye by multifunctional optical coherence tomography. Investigative Opthalmology & Visual Science. 59 (5), 2054-2068 (2018).
  26. Fang, Y., et al. Fundus autofluorescence, spectral-domain optical coherence tomography, and histology correlations in a Stargardt disease mouse model. The FASEB Journal. 34 (3), 3693-3714 (2020).

Tags

רפואה גיליון 179
יישום טומוגרפיה של קוהרנטיות אופטית למודל עכבר של רטינופתיה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mai, X., Huang, S., Chen, W., Ng, T. … More

Mai, X., Huang, S., Chen, W., Ng, T. K., Chen, H. Application of Optical Coherence Tomography to a Mouse Model of Retinopathy. J. Vis. Exp. (179), e63421, doi:10.3791/63421 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter